PT1604680E

PT1604680E - Utilização de uma toxina botulínica no tratamento de dor nevrálgica

Info

Publication number: PT1604680E
Application number: PT05006624T
Authority: PT
Inventors: Kei Roger Aoki; Minglei Cui; Stephen Jenkins
Original assignee: Allergan Inc
Priority date: 2000-04-14
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2010-02-11
Also published as: NZ521535A; US20060039916A1; US20040018214A1; EP1576963B1; ES2347792T3; DK1576963T3; EP1576963A3; AU2001251546B9; KR20030009431A; EP1272207B1; AR030209A1; CY1109972T1; PT1272207E; CY1108065T1; ES2338238T3; ES2353878T3; ES2287117T3; US20040018212A1; US6869610B2; TWI282282B

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE UMA TOXINA BOTULÍNICA NO TRATAMENTO DE DOR NEVRÁLGICA" A presente invenção refere-se a uma toxina botulinica para utilização em métodos de tratamento da dor. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos para o tratamento da dor por administração periférica da toxina botulinica.

Muitos, se não a maior parte, dos padecimentos do corpo causam dor. Em geral, a dor é sentida quando as extremidades de nervos livres que constituem os receptores de dor na pele, bem como em certos tecidos internos, são sujeitas a estímulos mecânicos, térmicos, quimicos ou outros estímulos prejudiciais. Os receptores da dor podem transmitir sinais ao longo de neurónios aferentes para o sistema nervoso central e daí para o cérebro.

As causas da dor podem incluir inflamação, lesão, doença, espasmos musculares e início de um acontecimento neuropático ou síndroma. A dor tratada de forma ineficaz pode ser devastadora para a pessoa que a sente, limitando a função, reduzindo a mobilidade, complicando o sono e interferindo dramaticamente na qualidade de vida.

Um espasmo muscular pode conduzir à estimulação de receptores de dor sensíveis a estímulos mecânicos, desse modo causando uma sensação de dor. Assim, a dor pode surgir ou dever-se a um espasmo muscular. Adicionalmente, o espasmo pode estimular indirectamente os receptores de dor ao comprimir vasos sanguíneos, o que causa isquemia no 2 tecido que, por sua vez, liberta substâncias indutoras de dor que estimulam os receptores de dor a causar sensações de dor. Além disso, um espasmo muscular pode ocasionar uma redução localizada de pH, que pode ser sentido como sinais de dor ou pode induzi-los. Assim, a dor pode ser um efeito secundário de um espasmo muscular ou hipertonicidade muscular.

Pode ocorrer dor inflamatória quando o tecido é danificado, tal como pode resultar de cirurgia ou dever-se a um acontecimento físico, químico ou térmico adverso ou a infecção causada por um agente biológico. Quando um tecido é danificado, um grande número de substâncias indutoras de dor endógenas, por exemplo, bradiquinina e histamina, pode ser libertado do tecido lesionado. As substâncias indutoras de dor podem ligar-se a receptores presentes nos terminais dos nervos sensoriais e, desse modo, iniciar sinais aferentes de dor.

Adicionalmente, substâncias indutoras de dor podem ser libertadas de terminais aferentes nociceptivos, e neuropéptidos libertados de terminais sensoriais podem acentuar uma resposta inflamatória. Assim, durante uma inflamação pode ocorrer um brotamento de fibras periféricas peptidérgicas e um teor acrescido de péptidos, em que muitas fibras exibem uma coexistência de substância P (SP) e péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP). A substância P pode induzir contracção de células do endotélio, o que, por sua vez, causa extravasamento do plasma para permitir que outras substâncias (bradiquinina, ATP, histamina) tenham acesso ao local da lesão e aos terminais dos nervos aferentes. A libertação de substância P pelos terminais dos nervos sensoriais também pode 3 desgranular mastócitos. Este processo foi considerado um factor importante em inflamação neurogénica, devido à libertação de mediadores inflamatórios, como histamina e serotonina, e à libertação de enzimas proteolíticas que catalisam a produção de bradiquinina. Aparentemente, o CGRP não produz extravasamento do plasma, mas é um vasodilatador poderoso e também actua sinergeticamente com a SP e outros mediadores inflamatórios para aumentar o extravasamento do plasma. Todos os mediadores inflamatórios listados acima podem sensibilizar nociceptores ou produzir dor.

Após a activação dos neurónios aferentes sensoriais primários, o passo seguinte da transdução de sinais sensoriais pode consistir na activação de neurónios de projecção, que transportam o sinal, via o tracto espinotalâmico para partes superiores do sistema nervoso central, como os núcleos talâmicos. Os corpos celulares destes neurónios (que não são os relacionados com os nervos cranianos) estão localizados no corno dorsal da espinal-medula. Também aqui se podem encontrar as sinapses entre os aferentes primários e os neurónios de projecção. 0 corno dorsal está organizado numa série de lâminas que estão empilhadas, em que a lâmina I é a mais dorsal, seguida da lâmina II, etc. As diferentes classes de aferentes primários formam sinapses em diferentes lâminas. Para aferentes primários cutâneos, fibras C formam sinapses nas lâminas I e II, fibras A-delta nas lâminas I, II e V e fibras A-beta nas lâminas III, IV e V. Pensa-se que as lâminas mais profundas (V-VII, X) estejam envolvidas nas vias sensoriais que chegam de tecidos mais profundos, como músculos e as vísceras. 4

Os neurotransmissores predominantes nas sinapses entre neurónios aferentes primários e neurónios de projecção são substância P, glutamato, CGRP e neuropéptido Y. A eficiência da transmissão destas sinapses pode ser alterada através de vias descendentes e por interneurónios locais da espinal-medula. Estes neurónios moduladores podem libertar alguns mediadores que são inibidores (por exemplo, péptidos opióides, glicina) ou excitadores (por exemplo, óxido nítrico, colecistoquinina), proporcionando um mecanismo para aumentar ou reduzir a percepção de sensações.

Apesar da dor inflamatória ser geralmente reversível e diminuir quando o tecido lesionado tiver sido reparado ou os estímulos indutores da dor terem sido removidos, os métodos actuais para tratar dor inflamatória têm muitas desvantagens e deficiências. Assim, a administração oral, parentérica ou tópica típica de um fármaco analgésico para tratar os sintomas de dor, ou, por exemplo, de um antibiótico para tratar factores causadores de dor inflamatória, pode dar origem a distribuição sistémica disseminada do fármaco e a efeitos secundários indesejáveis. Adicionalmente, a terapia corrente para dor inflamatória tem a desvantagem de duração curta da eficácia do fármaco, que requer novas e frequentes administrações do fármaco com possíveis efeitos resultantes de resistência ao fármaco, desenvolvimento de anticorpos e/ou dependência do fármaco, que são insatisfatórios. Suplementarmente, a administração frequente do fármaco aumenta o custo económico do regime para o paciente e pode necessitar que o paciente se lembre de aderir a uma calendarização da dosagem. 5

Exemplos de tratamentos para inflamação e dor muscular incluem fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDS), incluindo aspirina e ibuprofeno, e opióides, como morfina.

Os NSAIDS atenuam a dor inibindo a produção de prostaglandinas libertadas por tecidos danificados. Verificou-se que as prostaglandinas são mediadores periféricos de dor e inflamação, como em doenças artríticas, e uma redução da sua concentração proporciona alívio aos pacientes. Foi sugerido que as prostaglandinas estão envolvidas na mediação de dor na espinal-medula e no cérebro, o que poderá explicar os efeitos analgésicos de NSAIDS em alguns estados de dor que não envolvem inflamação nem danos em tecidos periféricos. No entanto, as prostaglandinas são apenas um de vários mediadores da dor. Como tal, os NSAIDS têm um limite superior de actividade, acima do qual doses crescentes não proporcionam mais alívio da dor. Suplementarmente, têm efeitos secundários que limitam a sua utilidade. Por exemplo, os NSAIDS podem causar irritação no tracto gastrointestinal, e a utilização prolongada pode conduzir ao desenvolvimento de ulceração extensa dos intestinos. Isto acontece particularmente em pacientes mais idosos, que tomam frequentemente NSAIDS para os seus estados de artrite.

As acções terapêuticas dos opióides dão-se ao nível da espinal-medula. Os opióides inibem a eficiência da neurotransmissão entre os aferentes sensoriais primários (principalmente fibras C) e os neurónios de projecção. Fazem-no causando uma hiperpolarização prolongada de ambos os elementos destas sinapses. A utilização de opióides é eficaz na atenuação da maior parte dos tipos de dor aguda e 6 dor maligna crónica. No entanto, há alguns estados de dor maligna crónica que são parcialmente ou completamente refractários à analgesia opióide, particularmente aqueles que envolvem compressão de nervos, por exemplo, por formação de tumor. Infelizmente, os opióides também têm efeitos secundários indesejados, que incluem: (1) depressão do sistema respiratório, (2) obstipação e (3) efeitos psicoactivos, incluindo sedação e euforia. Estes efeitos secundários ocorrem em doses semelhantes às que produzem analgesia e, em consequência, limitam as doses que podem ser administradas a pacientes. Adicionalmente, opióides como morfina e heroina são drogas bem conhecidas que conduzem a dependência física, que também envolve o desenvolvimento de tolerância. Com o desenvolvimento de tolerância, a dose necessária de um fármaco para produzir o mesmo efeito analgésico aumenta ao longo do tempo. Isto pode conduzir a um estado em que as doses necessárias para atenuar a dor constituem risco de vida, devido aos efeitos secundários previamente mencionados.

Apesar da dor originária de inflamação e espasmos musculares poder ser iniciada por estimulação mecânica ou quimica dos terminais livres de neurónios sensoriais primários, a dor neuropática não requer um estímulo inicial dos terminais livres de nervos periféricos. A dor neuropática é uma síndroma de dor persistente ou crónica que pode resultar de danos no sistema nervoso, nos nervos periféricos, no gânglio da raiz dorsal, raiz dorsal ou no sistema nervoso central. Síndromas de dor neuropática incluem alodinia, várias neuralgias, como neuralgia pós-herpética e neuralgia trigeminal, dor fantasma e síndromas de dor regional 7 complexa, como distrofia simpática reflexa e causalgia. A causalgia é muitas vezes caracterizada por dor de queimadura espontânea combinada com hiperalgesia e alodinia.

Tragicamente, não existe nenhum método para tratar dor neuropática de forma adequada, previsível e específica estabelecida (Woolf, C., et al., "Neuropathic Pain: Aetiology, Symptoms, Mechanisms, and Management" Lancet 1999; 353: 1959-64), pois os métodos de tratamento actuais de dor neuropática consistem meramente em tentar ajudar o paciente através de terapia psicológica ou ocupacional em vez de reduzir ou eliminar a dor sentida.

Por exemplo, métodos correntes para tratar dor neuropática incluem administração de blocos de anestesia local dirigidos para pontos de desencadeamento, nervos periféricos, plexos, raízes dorsais e para o sistema nervoso simpático. No entanto, estes tratamentos têm apenas efeitos antinociceptivos de curto prazo. Adicionalmente, métodos de tratamento analgésico de duração mais prolongada, como blocos por injecção de fenol ou crioterapia, fazem surgir um risco considerável de enfraquecimento funcional irreversível. Suplementarmente, a administração epidural ou intratecal (colectivamente "intra-espinal") crónica de fármacos como clonidina, esteróides, opióides ou midazolam tem efeitos secundários significativos e eficácia questionável.

Toxina Botulínica A bactéria anaeróbica e gram-positiva Clostridium botulinum produz uma neurotoxina polipeptídica potente, toxina botulínica, que causa uma doença neuroparalítica em 8 humanos e animais, referida como botulismo. Os esporos de Clostridium botulinum estão presentes no solo e podem crescer em recipientes de alimentos inapropriadamente esterilizados e selados de instalações domésticas de conservas, sendo a causa de muitos dos casos de botulismo. Os efeitos do botulismo aparecem tipicamente 18 até 36 horas depois de comer os alimentos infectados com uma cultura ou esporos de Clostridium botulinum. Aparentemente, a toxina botulinica pode passar pelo revestimento dos intestinos sem ser atenuada e atacar neurónios motores periféricos. Os sintomas de intoxicação com toxina botulinica podem progredir desde dificuldade em andar, engolir e falar até à paralisia dos músculos respiratórios e morte. A toxina botulinica do tipo A é o agente biológico natural mais letal conhecido do homem. Cerca de 50 picogramas de uma toxina botulinica do tipo A comercialmente disponível (complexo de neurotoxina purificada) é uma LD50 em ratinhos (isto é, 1 unidade). Uma unidade de BOTOX® contém cerca de 50 picogramas do complexo de toxina botulinica do tipo A. É interessante notar que, numa base molar, a toxina botulinica do tipo A é cerca de 1,8 milhares de milhões de vezes mais letal do que difteria, cerca de 600 milhões de vezes mais letal do que cianeto de sódio, cerca de 30 milhões de vezes mais letal do que toxina de cobra e cerca de 12 milhões de vezes mais letal do que cólera. Singh, "Criticai Aspects of Bacterial Protein Toxins", páginas 63-84 (capítulo 4) de "Natural Toxins II", editado por B. R. Singh et al.f Plenum Press, Nova Iorque (1976) (onde a LD50 apresentada da toxina botulinica do tipo A de 0,3 ng igualar 1 U está corrigida quanto ao facto de cerca de 0,05 ng de BOTOX® igualar 1 9 unidade). Uma unidade (U) de toxina botulinica é definida como a LD50 por injecção intraperitoneal em ratinhos Swiss Webster fêmeas pesando 18 até 20 gramas cada. 1 Disponibilizado por Allergan, Inc., de Irvine, Califórnia, com a marca registada BOTOX® em frascos de 100 unidades.

Foram caracterizadas sete neurotoxinas botulinicas imunologicamente distintas, que são, respectivamente, os serótipos de neurotoxina botulinica A, B, Clf D, E, Fe G, cada um dos quais se distingue por neutralização com anticorpos específicos para o tipo. Os diferentes serótipos da toxina botulinica variam quanto às espécies de animais que afectam e gravidade e duração da paralisia que suscitam. Por exemplo, foi determinado que a toxina botulinica do tipo A é 500 vezes mais potente, medida pela taxa de paralisia produzida no rato, do que a toxina botulinica do tipo B. Adicionalmente, determinou-se que a toxina botulinica do tipo B não é tóxica em primatas a uma dose de 480 U/kg, que é cerca de 12 vezes a LD50 em primatas para a toxina botulinica do tipo A. Aparentemente, a toxina botulinica liga-se com afinidade elevada a neurónios motores colinérgicos, é relocalizada para o interior dos neurónios e bloqueia a libertação de acetilcolina.

Independentemente do serótipo, o mecanismo molecular de intoxicação pela toxina parece ser semelhante e envolver pelo menos três passos ou fases. No primeiro passo do processo, a toxina liga-se à membrana pré-sináptica do neurónio alvo por uma interacção específica entre a cadeia pesada, cadeia H, e um receptor da superfície celular; 10 pensa-se que o receptor seja diferente para cada tipo de toxina botulinica e para a toxina tetânica. O segmento da extremidade carboxilo da cadeia H, Hc, parece ser importante para dirigir a toxina para a superfície celular.

No segundo passo, a toxina atravessa a membrana do plasma da célula envenenada. A toxina é primeiramente encerrada pela célula através de endocitose mediada pelo receptor, formando-se um endossoma que contém a toxina. Em seguida, a toxina sai do endossoma para o citoplasma da célula. Pensa-se que este passo seja mediado pelo segmento da extremidade amino da cadeia H, HN, que desencadeia uma alteração conformacional da toxina em resposta a um pH de cerca de 5,5 ou inferior. Sabe-se que os endossomas possuem uma bomba de protões que diminui o pH intra-endossomal. A alteração conformacional expões resíduos hidrófobos da toxina, o que permite à toxina implantar-se na membrana endossomal. Em seguida, a toxina (ou, no mínimo, a cadeia leve) é relocalizada através da membrana endossomal para o citoplasma. O último passo do mecanismo da actividade da toxina botulinica parece envolver redução da ligação dissulfureto que liga a cadeia pesada, cadeia H, e a cadeia leve, cadeia L. Toda a actividade tóxica das toxinas botulinica e tetânica está contida na cadeia L da holotoxina; a cadeia L é uma endopeptidase de zinco (Zn++) que procede à clivagem selectiva de proteínas essenciais para o reconhecimento e ancoragem de vesículas que contêm neurotransmissores à superfície citoplasmática da membrana do plasma e para a fusão das vesículas à membrana do plasma. A neurotoxina tetânica, toxina botulínica/B/D/F e /G causam degradação da sinaptobrevina (também denominada proteína membranar 11 associada a vesículas (VAMP)), uma proteína membranar sinaptossomal. A maior parte da VAMP presente na superfície citoplasmática da vesícula sináptica é removida em resultado de qualquer um destes acontecimentos de clivagem. Os serótipos A e E procedem à clivagem de SNAP-25. Originalmente pensou-se que o serótipo Ci procedia à clivagem da sintaxina, tendo-se verificado que procede à clivagem de sintaxina e SNAP-25. Cada toxina cliva especificamente uma ligação diferente (exceptuando a tetânica e do tipo B, que procedem à clivagem da mesma ligação).

As toxinas botulínicas têm sido utilizadas em cenários clínicos para o tratamento de perturbações neuromusculares caracterizadas por músculos esqueléticos hiperactivos. A toxina botulínica do tipo A foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para o tratamento de blefarospasmo, estrabismo e espasmo hemifacial. Serótipos da toxina botulínica não do tipo A têm, aparentemente, menor potência e/ou duração da actividade mais curta em comparação com a toxina botulínica do tipo A. os efeitos clínicos de toxina botulínica do tipo A intramuscular periférica são habitualmente observados num período de uma semana após a injecção. A duração típica da atenuação sintomática devido a uma única injecção intramuscular de toxina botulínica do tipo A tem uma média de cerca de três meses.

Apesar de todos os serótipos de toxinas botulínicas aparentemente inibirem a libertação do neurotransmissor acetilcolina na junção neuromuscular, fazem-no afectando diferentes proteínas neurossecretoras e/ou por clivagem destas proteínas em sítios diferentes. Por exemplo, toxinas botulínicas dos tipos A e E procedem à clivagem da proteína 12 associada a sinaptossomas de 25 KiloDalton (kD) (SNAP-25), mas abordam selectivamente diferentes sequências de aminoácidos nesta proteína. As toxinas botulínicas dos tipos B, D, F e G actuam na proteína associada a vesículas (VAMP, também denominada sinaptobrevina), em que cada serótipo procede à clivagem da proteína num sítio diferente. Por fim, foi mostrado que a toxina botulínica do tipo Ci procede à clivagem de sintaxina e SNAP-25. Estas diferenças do mecanismo de acção podem afectar a potência e/ou duração de acção relativas dos vários serótipos de toxinas botulínicas. É importante notar que se sabe que o citosol de células B de ilhéus pancreáticos contém pelo menos SNAP-25 (Biochem. J. 1; 339 (parte 1) : 159-65 (Abril de 1999)) e sinaptobrevina (Mov. Disord. Maio de 1995; 10 (3) : 376) . O peso molecular da molécula proteica da toxina botulínica, para os sete serótipos conhecidos da toxina botulínica, é cerca de 150 kD. É interessante notar que as toxinas botulínicas são libertadas por bactérias Clostridium na forma de complexos que compreendem a molécula proteica da toxina botulínica de 150 kD juntamente com proteínas associadas que não são toxinas. Assim, o complexo da toxina botulínica do tipo A pode ser produzido por bactérias Clostridium em formas de 900 kD, 500 kD e 300 kD. A toxina botulínica dos tipos B e Ci é aparentemente produzida apenas como um complexo de 500 kD. A toxina botulínica do tipo D é produzida na forma de complexos de 300 kD e 500 kD. Por fim, as toxinas botulínicas dos tipos E e F são produzidas apenas como complexos de aproximadamente 300 kD. Crê-se que os complexos (isto é, pesos moleculares superiores a cerca de 150 kD) contêm uma proteína hemaglutinina que não é uma toxina e uma proteína 13 diferente de hemaglutinina que não é uma toxina e não é tóxica. Estas duas proteínas que não são toxinas (que, juntamente com a molécula da toxina botulínica, compreendem o complexo relevante de neurotoxina) podem actuar de modo a conferir estabilidade à molécula da toxina botulínica contra desnaturação e protecção contra ácidos digestivos quando a toxina é ingerida. Adicionalmente, é possível que os complexos maiores da toxina botulínica (peso molecular superior a cerca de 150 kD) possam resultar numa taxa de difusão menor da toxina botulínica para longe de um sítio de injecção intramuscular de um complexo da toxina botulínica.

Estudos in vitro indicaram que a toxina botulínica inibe a libertação induzida pelo catião potássio de acetilcolina e norepinefrina de culturas de células primárias de tecido do tronco cerebral. Adicionalmente, foi relatado que a toxina botulínica inibe a libertação suscitada de glicina e glutamato em culturas primárias de neurónios da espinal-medula e que, em preparações de sinaptossomas do cérebro, a toxina botulínica inibe a libertação de cada um dos neurotransmissores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP e glutamato.

Pode obter-se a toxina botulínica do tipo A estabelecendo e desenvolvendo culturas de Clostridium botulinum num fermentador e depois recolhendo e purificando a mistura fermentada de acordo com procedimentos conhecidos. Todos os serótipos da toxina botulínica são inicialmente sintetizados como proteínas inactivas de cadeia única, que devem ser clivadas ou cortadas por proteases para se tornarem neuroactivas. As estirpes bacterianas que produzem os serótipos A e G da toxina 14 botulínica possuem proteases endógenas e, assim, os serótipos A e G podem ser recuperados de culturas bacterianas predominantemente na sua forma activa. Em contraste, os serótipos Ci, D e E da toxina botulínica são sintetizados por estirpes não proteolíticas e, em consequência, estão tipicamente inactivados quando são recuperados da cultura. Os serótipos B e F são produzidos por estirpes proteolíticas e não proteolíticas e, assim, podem ser recuperados na forma activa ou inactiva. Todavia, mesmo as estirpes proteolíticas que produzem, por exemplo, o serótipo do tipo B da toxina botulínica apenas procedem à clivagem de uma porção da toxina produzida. A proporção exacta entre moléculas cortadas e moléculas não cortadas depende da extensão da incubação e da temperatura da cultura. Em consequência, é provável que uma certa percentagem de qualquer preparação, por exemplo, da toxina botulínica do tipo B seja inactiva, possivelmente sendo responsável pela conhecida potência significativamente mais baixa da toxina botulínica do tipo B em comparação com a toxina botulínica do tipo A. a presença de moléculas inactivas de toxina botulínica numa preparação clínica contribuirá para a carga proteica global da preparação, que foi ligada a antigenicidade acrescida, sem contribuir para a sua eficácia clínica. Adicionalmente, sabe-se que a toxina botulínica do tipo B, por injecção intramuscular, tem uma duração menor da actividade e também é menos potente do que a toxina botulínica do tipo A ao mesmo nível de dose.

Pode produzir-se toxina botulínica do tipo A cristalina de qualidade elevada a partir da estirpe Hall A de

Clostridium botulinum com características de > 3 X 107 U/mg, uma razão Α260Μ278 inferior a 0,60 e um padrão 15 distinto de formação de bandas em electroforese em gel. Pode utilizar-se o conhecido processo de Shantz para obter toxina botulinica do tipo A cristalina, como apresentado em Shantz, E. J., et al. "Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine" Microbiol. Rev. 5_6: 80-99 (1992). Em geral, o complexo da toxina botulinica de tipo A pode ser isolado e purificado de uma fermentação anaeróbica por cultura de Clostridium botulinum do tipo A num meio adequado. Os processos conhecidos também podem ser utilizados, por separação das proteínas diferentes de toxinas, para obter toxinas botulinicas puras, tais como, por exemplo: toxina botulinica do tipo A purificada com um peso molecular de aproximadamente 150 kD com uma potência especifica de 1-2 X 108 LD50 U/mg ou superior; toxina botulinica do tipo B purificada com um peso molecular de aproximadamente 156 kD com uma potência especifica de 1-2 X 108 LD50 U/mg ou superior, e toxina botulinica do tipo F purificada com um peso molecular de aproximadamente 155 kD com uma potência especifica de 1-2 X 107 LD50 U/mg ou superior.

As toxinas botulinicas e/ou complexos de toxinas botulinicas podem ser obtidos da List Biological Laboratories, Inc., Campbell, Califórnia, do Centre for Applied Microbiology and Research, porton Down, R.U., Wako (Osaka, Japão), Metabiologics (Madison, Wisconsin), bem como da Sigma Chemicals de St. Louis, Missouri. A toxina botulinica pura é tão instável que geralmente não é utilizada para preparar uma composição farmacêutica. Suplementarmente, os complexos de toxinas botulinicas, como o complexo da toxina do tipo A, também são extremamente susceptiveis a desnaturação devido a desnaturação da 16 superfície, calor e condições alcalinas. A toxina inactivada forma proteínas toxóides que podem ser imunogénicas. Os anticorpos resultantes podem tornar um paciente refractário à injecção de toxinas.

Tal como com enzimas em geral, as actividades biológicas das toxinas botulínicas (que são peptidases intracelulares) dependem, pelo menos em parte, da sua conformação tridimensional. Assim, a toxina botulínica do tipo A é submetida a destoxificação pelo calor, vários agentes químicos de estiramento da superfície e secagem da superfície. Adicionalmente, sabe-se que a diluição do complexo da toxina, obtido pelos procedimentos conhecidos de cultura, fermentação e purificação, para as concentrações da toxina muito, muito inferiores utilizadas para a formulação de composições farmacêuticas resulta em destoxificação rápida da toxina, a menos que esteja presente um agente estabilizador adequado. A diluição da toxina de quantidades de miligramas para uma solução que contenha nanogramas por mililitro apresenta dificuldades significativas, devido à perda rápida de toxicidade específica ao ser feita uma diluição tão grande. Uma vez que a toxina pode ser utilizada meses ou anos após a formulação da composição farmacêutica que contém a toxina, a toxina deve ser estabilizada com um agente estabilizador. Os únicos agentes estabilizadores bem sucedidos para esta finalidade têm sido as proteínas derivadas de animais albumina e gelatina. E, tal como indicado, a presença de proteínas derivadas de animais na formulação final apresenta problemas potenciais, pois certos vírus, priões ou outros compostos infecciosos ou patogénicos estáveis provenientes dos dadores podem contaminar a toxina. 17

Suplementarmente, qualquer uma das condições severas de pH, temperatura e gama de concentrações necessárias para liofilizar ou secar com vácuo uma composição farmacêutica contendo toxina botulínica num formato de distribuição e armazenamento da toxina (pronto a ser utilizado ou reconstituído por um médico) pode proceder à destoxificação de alguma toxina. Assim, proteínas derivadas de animais ou de reuniões de dadores, como gelatina e albumina do soro, têm sido utilizadas com algum êxito para estabilizar a toxina botulínica.

Uma composição farmacêutica que contém toxina botulínica comercialmente disponível é vendida com a marca registada BOTOX® (disponibilizada pela Allergan, Inc., de Irvine, Califórnia). 0 BOTOX® consiste num complexo purificado de toxina botulínica do tipo A, albumina e cloreto de sódio, empacotado em forma esterilizada e seca com vácuo. A toxina botulínica do tipo A é preparada a partir de uma cultura da estirpe Hall de Clostridium botulinum que cresceu num meio que continha N-Z amina e extracto de levedura. 0 complexo da toxina botulínica do tipo A é purificado da solução de cultura por uma série de precipitações ácidas, formando um complexo cristalino que consiste na proteína toxina activa de elevado peso molecular e uma proteína hemaglutinina associada. 0 complexo cristalino é novamente dissolvido numa solução que contém solução salina e albumina e é esterilizado com filtração (0,2 mícrones) antes da secagem com vácuo. O BOTOX® pode ser reconstituído com solução salina esterilizada sem conservantes antes da injecção intramuscular. Cada frasco de BOTOX® contém cerca de 100 unidades (U) de complexo de neurotoxina purificado de toxina de Clostridium botulinum do tipo A, 0,5 miligramas 18 de albumina do soro humano e 0,9 miligramas de cloreto de sódio numa forma esterilizada e seca com vácuo sem conservantes.

Para reconstituir BOTOX® seco com vácuo utiliza-se solução salina normal esterilizada sem um conservante, Injecção de Cloreto de Sódio 0,9%, recolhendo a quantidade apropriada de diluente numa seringa de dimensão apropriada. Uma vez que se crê que o BOTOX® é desnaturado pelo acto de borbulhar ou agitação violenta semelhante, o diluente é suavemente injectado no frasco. O BOTOX® deve ser administrado num período de quatro horas após a reconstituição. Durante este período de tempo, o BOTOX® reconstituído é armazenado num frigorífico (2o até 8°C). O BOTOX® reconstituído é límpido, incolor e não tem matéria em partículas. O produto seco com vácuo é armazenado num congelador a uma temperatura igual ou inferior a -5°C. O BOTOX® é administrado num período de quatro horas depois do frasco ser removido do congelador e ser reconstituído. Durante estas quatro horas, o BOTOX® reconstituído pode ser armazenado num frigorífico (2o até 8°C) . O BOTOX® reconstituído é límpido, incolor e não tem matéria em partículas.

Foi relatado que a toxina botulínica do tipo A tem sido utilizada em cenários clínicos do modo seguinte: (1) cerca de 75-125 unidades de BOTOX® por injecção intramuscular (músculos múltiplos) para tratar distonia cervical; (2) 5-10 unidades de BOTOX® por injecção intramuscular para tratar linhas glabelares (rugas profundas entre as sobrancelhas) (5 unidades injectadas intramuscularmente no 19 músculo prócero e 10 unidades injectadas intramuscularmente em cada músculo corrugador do supercílio); (3) cerca de 30-80 unidades de BOTOX® para tratar obstipação por injecção intra-esfíncter no músculo puborrectal; (4) cerca de 1-5 unidades por músculo de BOTOX® injectado intramuscularmente para tratar blefarospasmo, por injecção no músculo orbicular ocular pré-tarsal lateral da pálpebra superior e no orbicular ocular pré-tarsal lateral da pálpebra inferior; (5) para tratar estrabismo, os músculos extraoculares receberam uma injecção intramuscular contendo entre cerca de 1-5 unidades de BOTOX®, em que a quantidade injectada varia com base na dimensão do músculo a receber a injecção e na extensão desejada da paralisia do músculo (isto é, quantidade desejada de correcção de dioptrias); (6) para tratar espasticidade do membro superior após acidente vascular cerebral, por injecções intramusculares de BOTOX® em cinco músculos flexores diferentes do membro superior, do modo seguinte:

(a) flexor digitorum profundus: 7,5 U até 30 U

(b) flexor digitorum sublimus: 7,5 U até 30 U

(c) flexor carpi ulnaris: 10 U até 40 U

(d) flexor carpi radialis: 15 U até 60 U (e) bíceps brachii: 50 U até 200 U. Cada um dos cinco músculos indicados recebeu uma injecção na mesma sessão de tratamento, de modo que o paciente recebe desde 90 U até 360 U de BOTOX® nos músculos flexores do membro superior por injecção intramuscular em cada sessão de tratamento; (7) para tratar enxaqueca, uma injecção pericraniana (injectada simetricamente nos músculos glabelar, frontal e temporal) de 25 U de BOTOX® demonstrou exercer um benefício 20 significativo como tratamento profiláctico de enxaqueca em comparação com veiculo, como revelado por medições decrescidas da frequência e gravidade máxima da enxaqueca, vómitos associados e utilização de medicação aguda durante o período de três meses após a injecção de 25 U.

Sabe-se que a toxina botulínica do tipo A pode ter eficácia durante um período até 12 meses (European J. Neurology 6 (Sup. 4): S111-S1150; 1999), e, nalgumas circunstâncias, durante 27 meses {The Laryngoscope 109: 1344-1346, 1999) . Contudo, a duração usual de uma injecção intramuscular de Botox® é tipicamente cerca de 3 até 4 meses.

Como apresentado, certas toxinas botulínicas têm sido utilizadas para tratar várias perturbações do movimento, como estados de músculos espasmódicos, resultando em atenuação da dor. Por exemplo, é conhecida a utilização de uma toxina botulínica para tratar espasmos musculares, resultando em atenuação da hiperactividade do músculo espasmódico e da dor que surge de modo secundário em resultado ou devido à actividade do músculo espasmódico. Por exemplo, Cheshire et al., Pain 1994; 59(1): 65-69, relataram que pacientes com síndroma da dor miofascial sentiram menos dor após injecções de toxina botulínica do tipo A em pontos de desencadeamento. Ver também WO 94/15629. Crê-se que a toxina botulínica A consegue reduzir dor ao reduzir a contracção do músculo sustentado que inicialmente causou ou causou substancialmente a dor. Assim, a dor que pode resultar ou que pode acompanhar um espasmo muscular pode dever-se ao pH local mais baixo causado pelo espasmo. Um efeito indirecto da paralisia de músculos flácidos induzida por uma toxina botulínica 21 consiste em permitir que o pH regresse a um nivel fisiológico, desse modo reduzindo a dor como efeito secundário da denervação colinérgica da placa terminal motora que pode resultar da administração periférica da toxina botulinica. A toxina botulinica pode ser utilizada para tratar dor de cabeça devido a enxaqueca associada a espasmos musculares, perturbações vasculares, neuralgia e neuropatia 0 documento de Binder, Patente U.S. N° 5 714 468 é aqui incorporado na sua totalidade a titulo de referência. De forma notável, dor associada a espasmos musculares, dor associada a músculo hipertónico, dor miofascial e dor de cabeça devido a enxaqueca podem dever-se, pelo menos em parte, à produção e libertação de uma ou mais substâncias nociceptivas a partir dos próprios músculos durante períodos de tensão ou contracção muscular acrescida. 0 sucesso da toxina botulinica do tipo A para tratar uma variedade de estados clínicos conduziu a interesse noutros serótipos da toxina botulinica. Realizou-se um estudo de duas preparações de toxina botulinica do tipo A comercialmente disponíveis (BOTOX® e Dysport®) e de preparações de toxinas botulínicas dos tipos B e F (ambas obtidas da Wako Chemicals, Japão) para determinar a eficácia, segurança e potencial antigénico de enfraquecimento de músculos locais. As preparações de toxina botulinica foram injectadas na cabeça do músculo gastrocnémio direito (0,5 até 200,0 unidades/kg), tendo-se avaliado o enfraquecimento muscular utilizando o ensaio de pontuação da abdução digital (DAS) de ratinho. Calcularam-se valores ED50 a partir de curvas de resposta à dose. Ratinhos adicionais receberam injecções intramusculares 22 para determinar doses LD50. Calculou-se o índice terapêutico na forma de LD5o/ED5o. Grupos separados de ratinhos receberam injecções no membro traseiro de BOTOX® (5,0 até 10,0 unidades/kg) ou de toxina botulínica do tipo B (50,0 até 400,0 unidades/kg) e foram testados quanto ao enfraquecimento muscular e consumo acrescido de água, em que o último é um modelo putativo de boca seca. Avaliou-se o potencial antigénico por injecções intramusculares mensais em coelhos (1,5 ou 6,5 ng/kg para a toxina botulínica do tipo B ou 0,15 ng/kg para BOTOX®). O enfraquecimento muscular máximo e duração estavam relacionados com a dose para todos os serótipos. Os valores ED5o (unidades/kg) do ensaio DAS foram os seguintes: BOTOX®: 6,7, Dysport®: 24,7, toxina botulínica do tipo B: 27,0 até 244,0, toxina botulínica do tipo F: 4,3. O BOTOX® exibiu uma duração da acção maior do que a toxina botulínica do tipo B ou toxina botulínica do tipo F. Os valores do índice terapêutico foram os seguintes: BOTOX®: 10,5, Dysport®: 6,3, toxina botulínica do tipo B: 3,2. O consumo de água foi maior em ratinhos que receberam injecção de toxina botulínica do tipo B do que com BOTOX®, apesar da toxina botulínica do tipo B ter sido menos eficaz no enfraquecimento muscular. Após quatro meses de injecções, 2 em 4 (tratados com 1,5 ng/kg) e 4 em 4 (tratados com 6,5 ng/kg) coelhos desenvolveram anticorpos contra a toxina botulínica do tipo B. Num estudo separado, 0 em 9 coelhos tratados com BOTOX® demonstraram ter anticorpos contra a toxina botulínica do tipo A. Os resultados do ensaio DAS indicam que as potências máximas relativas da toxina botulínica do tipo A são iguais às da toxina botulínica do tipo F, e que as da toxina botulínica do tipo F são maiores do que as da toxina botulínica do tipo B. Relativamente à duração do efeito, a da toxina 23 botulínica do tipo A foi maior do que a da toxina botulínica do tipo B, e a duração do efeito da toxina botulínica do tipo B foi maior do que a da toxina botulínica do tipo F. Como mostrado pelos valores do índice terapêutico, as duas preparações comerciais de toxina botulínica do tipo A (BOTOX® e Dysport®) são diferentes. 0 comportamento de maior consumo de água observado após injecção de toxina botulínica do tipo B no membro traseiro indica que quantidades clinicamente significativas deste serótipo entraram na circulação sistémica murina. Os resultados também indicam que, para atingir uma eficácia comparável à da toxina botulínica do tipo A, é necessário aumentar as doses dos outros serótipos examinados. Uma dosagem aumentada pode comprometer a segurança. Suplementarmente, em coelhos, o tipo B foi mais antigénico do que o BOTOX®, possivelmente devido à maior carga de proteínas injectada para atingir uma dose eficaz de toxina botulínica do tipo B. Eur. J. Neurol. Novembro de 1999; 6 (Supl. 4): S3-S10.

Para além de exercerem acções farmacológicas na localização periférica, as toxinas botulínicas também podem exercer efeitos inibidores no sistema nervoso central. Trabalhos realizados por Weigand et al., Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, e Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56, mostraram que a toxina botulínica consegue ascender até à área espinal por transporte retrógrado. Como tal, uma toxina botulínica injectada numa localização periférica, por exemplo, intramuscularmente, pode ser transportada de forma retrógrada até à espinal-medula. No entanto, os autores dos artigos citados não conseguiram demonstrar que 24 o material etiquetado de forma radioactiva consistia em toxina botulinica intacta.

Como discutido acima, dor associada a perturbação muscular, por exemplo, dor devido a espasmos musculares, e dor de cabeça associada a perturbações vasculares, neuralgia e neuropatia podem ser eficazmente tratadas utilizando toxina botulinica. Contudo, há uma deficiência clara nos meios disponíveis para o tratamento de uma série de outros tipos de dor. Essa dor inclui, por exemplo, dor não associada a perturbação muscular, dor associada a neuralgia e neuropatia diferente de dor de cabeça, dor associada a inflamação de tecidos, dor associada a inflamação das articulações, dor associada a inflamação de tecidos, dor associada a cancro, dor pós-operatória, dor associada a laceração, dor isquémica, etc.

Fizeram-se tentativas para abordar estes diferentes tipos de dor, mas o seu êxito potencial e possível utilização clínica são incertos nesta altura. Por exemplo, Foster et al., na Patente U.S. N° 5 989 545 (incorporado na sua totalidade no presente documento a título de referência) revelam que uma neurotoxina de Clostridium, preferivelmente uma toxina botulinica, quimicamente conjugada ou fundida de modo recombinante a uma fracção particular de abordagem selectiva pode ser utilizada para tratar dor.

Acetilcolina

Tipicamente, só um tipo único de neurotransmissor na forma de uma molécula pequena é libertado por cada tipo de neurónio no sistema nervoso de mamíferos. 0 neurotransmissor acetilcolina é segregado por neurónios em muitas áreas do cérebro, mas especificamente pelas células 25 piramidais gigantes do córtex motor, por vários neurónios diferentes dos gânglios basais, pelos neurónios motores que inervam os músculos esqueléticos, pelos neurónios pré-ganglionares do sistema nervoso autónomo (simpático e parassimpático), pelos neurónios pós-ganglionares do sistema nervoso parassimpático e por alguns dos neurónios pós-ganglionares do sistema nervoso simpático. Essencialmente, apenas as fibras nervosas simpáticas pós-ganglionares para as glândulas sudoríparas, os músculos de piloerecção e alguns vasos sanguíneos são colinérgicos, pois a maior parte dos neurónios pós-ganglionares do sistema nervoso simpático segregam o neurotransmissor norepinefrina. Em muitos casos, a acetilcolina tem um efeito excitador. No entanto, sabe-se que a acetilcolina exerce efeitos inibidores nalgumas extremidades dos nervos periféricos parassimpáticos, como inibição do batimento cardíaco pelo nervo vago.

Os sinais eferentes do sistema nervoso autónomo são transmitidos para o corpo através do sistema nervoso simpático ou do sistema nervoso parassimpático. Os neurónios pré-ganglionares do sistema nervoso simpático estendem-se desde os corpos celulares de neurónios simpáticos pré-ganglionares localizados no corno intermédio-lateral da espinal-medula. As fibras nervosas simpáticas pré-ganglionares, que se estendem desde o corpo celular, fazem sinapses com neurónios pós-ganglionares localizados num gânglio simpático paravertebral ou num gânglio pré-vertebral. Uma vez que os neurónios pré-ganglionares dos sistemas nervosos simpático e parassimpático são colinérgicos, a aplicação de acetilcolina nos gânglios excitará neurónios pós-ganglionares simpáticos e parassimpáticos. 26 A acetilcolina activa dois tipos de receptores, receptores muscarinicos e nicotinicos. Os receptores muscarinicos estão presentes em todas as células efectoras estimuladas pelos neurónios pós-ganglionares do sistema nervoso parassimpático, bem como nas estimuladas pelos neurónios colinérgicos pós-ganglionares do sistema nervoso simpático. Os receptores nicotinicos estão presentes nas sinapses entre os neurónios pré-ganglionares e pós-ganglionares dos sistemas nervosos simpático e parassimpático. Os receptores nicotinicos também estão presentes em muitas membranas de fibras do músculo-esquelético na junção neuromuscular. A acetilcolina é libertada de neurónios colinérgicos quando pequenas vesículas limpidas intracelulares se fundem à membrana de células neuronais pré-sinápticas. Uma grande variedade de células secretoras não neuronais, tais como células da medula adrenal (bem como a linha de células PC12) e de ilhéus pancreáticos, liberta catecolaminas e hormona paratiróide, respectivamente, a partir de vesículas grandes de núcleos densos. A linha de células PC12 é um clone de células de feocromocitoma de rato extensamente utilizada como modelo de cultura de tecidos para estudos do desenvolvimento simpatoadrenal. A toxina botulínica inibe a libertação de ambos os tipos de compostos a partir de ambos os tipos de células in vitro, permeabilizadas (tal como por electroporação) ou por injecção directa da toxina na célula submetida a denervação. Também se sabe que a toxina botulínica bloqueia a libertação do neurotransmissor glutamato de culturas de células de sinaptossomas corticais. 27

Uma junção neuromuscular forma-se no músculo-esquelético pela proximidade entre axónios e células musculares. Um sinal transmitido através do sistema nervoso resulta num potencial de acção no axónio terminal, com activação de canais iónicos e libertação resultante do neurotransmissor acetilcolina a partir de vesículas sinápticas intraneuronais, por exemplo, na placa terminal motora da junção neuromuscular. A acetilcolina atravessa o espaço extracelular para se ligar a proteínas receptoras de acetilcolina na superfície da placa terminal do músculo. Depois de ter ocorrido ligação suficiente, um potencial de acção da célula muscular provoca alterações específicas no canal iónico membranar, que resultam em contracção da célula muscular. A acetilcolina é então libertada das células musculares e é metabolizada por colinesterases no espaço extracelular. Os metabolitos são novamente reciclados no axónio terminal para reprocessamento em mais acetilcolina.

Em consequência, é necessário um método eficaz, de longa duração e não cirúrgico para tratar dor, particularmente dor não associada a uma perturbação muscular ou dor de cabeça. SUMÁRIO A presente invenção supre esta necessidade e proporciona um método eficaz, de longa duração e não cirúrgico para tratar dor, particularmente dor não associada a uma perturbação muscular ou dor de cabeça. A presente invenção fornece uma toxina botulínica para utilização num método para alívio da dor nevrálgica ou num 28 método para o tratamento da dor causado por nevralgia, conforme definido nas reivindicações em anexo.

Acredita-se que um mecanismo através do qual a presente invenção funcione, assenta no efeito antinocicépticos sobre os neurónios periféricos sensoriais que aferem a dor, ao contrário de um efeito sobre os neurónios motores. A toxina botulinica pode ser um dos tipos de toxinas botulinicas A, B, Ci, D, E, F ou G. Preferivelmente, a toxina botulinica é toxina botulinica do tipo A. A toxina botulinica pode ser uma neurotoxina modificada que tem pelo menos um aminoácido deletado, modificado ou substituído. Adicionalmente, a toxina botulinica pode ser preparada, pelo menos em parte, por um processo recombinante. A toxina botulinica pode ser administrada numa quantidade entre cerca de 0,01 U/kg e cerca de 35 U/kg, e a dor tratada pode ser substancialmente atenuada durante um período de tempo entre cerca de 1 mês e cerca de 27 meses, por exemplo, desde cerca de 1 mês até cerca de 6 meses. A administração periférica da toxina botulinica pode ser feita antes do início de um acontecimento nociceptivo ou síndroma experimentado por um paciente. Adicionalmente, a administração periférica da toxina botulinica pode ser feita subsequentemente ao início de um acontecimento nociceptivo experimentado por um paciente. É importante notar que as toxinas botulinicas do âmbito da presente invenção compreendem uma fracção de ligação 29 nativa ou de tipo selvagem com afinidade especifica para um receptor da superfície da célula neuronal. As toxinas botulínicas utilizadas no âmbito da presente invenção excluem fracções de abordagem selectiva neuronal que não sejam nativas da toxina botulínica, pois verificámos que a presente invenção pode ser eficazmente implementada sem ser necessário fazer quaisquer modificações ou deleções na fracção de ligação nativa ou de tipo selvagem das toxinas botulínicas utilizadas.

Assim, a utilização de uma toxina botulínica com um ou mais artefactos ou construções da fracção de abordagem selectiva não nativos está excluída do âmbito da presente invenção por ser desnecessária, uma vez que, como afirmámos, descobrimos surpreendentemente que a administração periférica de uma toxina botulínica de acordo com a presente invenção proporciona atenuação significativa da dor mesmo que a toxina botulínica não compreenda uma fracção de abordagem selectiva neuronal não nativa. Assim, descobrimos que uma toxina botulínica, como toxina botulínica do tipo A, pode, por administração periférica, proporcionar atenuação de dor mesmo que não tenha sido ligada à toxina botulínica, de forma artificial ou por manipulação, uma fracção de abordagem selectiva neuronal não nativa.

Surpreendentemente, descobrimos que uma toxina botulínica com uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem pode ser administrada perifericamente a um mamífero para tratar dor. A fracção de ligação neuronal de tipo selvagem é parte originária da toxina botulínica. Por exemplo, a toxina botulínica do tipo A, com a sua fracção de ligação neuronal de tipo selvagem original, pode ser 30 administrada perifericamente, em quantidades entre cerca de 0,01 U/kg e cerca de 35 U/kg, para atenuar dor sentida por um mamífero, como um paciente humano. Preferivelmente, a toxina botulínica utilizada é administrada perifericamente numa quantidade entre cerca de 0,1 U/kg e cerca de 3 U/kg. É importante notar que o efeito de atenuação da dor dos métodos presentemente revelados pode persistir durante um período de tempo médio de 1-6 meses e mesmo mais, nalgumas circunstâncias. Foi relatado que o efeito de uma toxina botulínica pode persistir durante um período de tempo até 27 meses após a administração.

Noutra especificação, o método de tratamento de dor compreende administrar a um mamífero uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica difere de uma toxina botulínica de ocorrência natural pelo menos num aminoácido. A toxina botulínica também tem uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem.

Noutra especificação, o método de tratamento de dor compreende administrar a um mamífero uma toxina botulínica, em que a toxina botulínica tem uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem de outro subtipo de neurotoxina.

Um método preferido de tratamento de dor compreende o passo de administrar perifericamente uma toxina botulínica a um mamífero. Pois descobrimos surpreendentemente que uma toxina botulínica a ser utilizada de acordo com o âmbito da presente invenção pode ser utilizada para tratar dor que não seja secundária a um espasmo muscular. Assim, a presente invenção é aplicável ao tratamento de dor que surge independentemente da presença ou ausência de uma perturbação muscular, como um espasmo muscular. 31

Adicionalmente, a presente invenção também é aplicável, e inclui-se no seu âmbito, ao tratamento de dor que não é secundária a um espasmo muscular. Em consequência, um paciente pode ter um músculo espasmódico ou hipertónico e também experimentar dor que não é secundária, isto é, que não surge nem se deve ao espasmo muscular. Por exemplo, um paciente pode ter um músculo espasmódico num membro e, concomitantemente, sentir dor no tronco, como dor nas costas. Neste exemplo, um método dentro do âmbito da presente invenção, pode tratar a dor nas costas por administração periférica (isto é, subcutânea) de uma toxina botulinica nas costas do paciente.

Definições

Apresentam-se as definições seguintes, que se aplicam aqui. "Cadeia leve" designa a cadeia leve de uma toxina botulinica de Clostridium. Pode ter um peso molecular de cerca de 50 kDa e pode ser referida como cadeia L, L ou domínio (sequência de aminoácidos) proteolítico de uma toxina botulinica. "Cadeia pesada" designa a cadeia pesada de uma toxina botulinica. Pode ter um peso molecular de cerca de 100 kDa e pode ser referida aqui como cadeia H ou como H. "Hn" designa um fragmento que pode ter um peso molecular de cerca de 50 kDa, é derivado da cadeia H de uma toxina botulinica de Clostridium e é aproximadamente equivalente ao segmento do terminal amino da cadeia H, ou à porção correspondente a esse fragmento na cadeia H intacta. Crê-se que contém a porção da neurotoxina de Clostridium 32 natural ou de tipo selvagem envolvida na relocalização da cadeia L através de uma membrana endossomal intracelular. "Hc" designa um fragmento (cerca de 50 kDa) derivado da cadeia H de uma toxina botulinica que é aproximadamente equivalente ao segmento do terminal carboxilo da cadeia H, ou à porção correspondente a esse fragmento na cadeia H intacta. Crê-se que é imunogénico e que contém a porção da toxina botulinica natural ou de tipo selvagem envolvida na ligação pré-sináptica de afinidade elevada a neurónios motores. "Fracção de ligação neuronal de tipo selvagem" designa a porção de uma toxina botulinica que é nativa da toxina botulinica e que exibe uma especificidade de ligação especifica para um receptor presente num neurónio. Assim, fracção de ligação neuronal de tipo selvagem ou nativa exclui uma fracção de ligação que não seja nativa da toxina botulinica. "Fracção de abordagem selectiva" designa uma molécula com afinidade de ligação especifica para um receptor da superfície celular. A fracção de abordagem selectiva não é uma Hc de neurotoxina de Clostridium, nem péptidos derivados da Hc com pelo menos um dos seus aminoácidos deletados, modificados ou substituídos. A fracção de abordagem selectiva é uma molécula que não é uma toxina botulinica; por exemplo, pode ser uma bradiquinina. "Administração local" designa administração por uma via não sistémica no local ou na vizinhança do sítio de um padecimento, perturbação ou dor sentida. 33 "Administração periférica" designa administração por uma via não sistémica numa localização periférica de um mamífero. Uma localização periférica significa geralmente sob a pele ou num músculo-esquelético. Administração periférica inclui as vias de administração periférica intramuscular, intraglandular e subcutânea, mas exclui administração intravenosa ou oral e também exclui qualquer administração directa no sistema nervoso central.

FIGURAS

Estas e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção podem compreender-se melhor a partir da seguinte descrição, reivindicações e figuras adjuntas, em que, nas Figuras 1 e 2 abaixo, "injecção" designa injecção ou administração periférica. A Figura 1 é um gráfico de resposta à dose que mostra que um medicamento que pode ser obtido pela presente invenção atenua dor inflamatória induzida no modelo de formalina de rato durante pelo menos cinco dias. 0 eixo X apresenta tempo em minutos após o início do modelo de formalina em ratos. 0 eixo Y apresenta o tempo gasto a levantar e lamber a pata injectada com formalina, utilizando injecções de controlo (solução salina, n=7) e de BOTOX® (complexo de neurotoxina purificado de toxina botulínica do tipo A) às concentrações de 7 U/kg (n=8), 15 U/kg (n=5) e 30 U/kg (n=4). O BOTOX® foi injectado 5 dias antes do início da provocação com formalina. A Figura 2 é um gráfico de resposta à dose que mostra que um método atenua dor inflamatória induzida no modelo de formalina de rato durante pelo menos doze dias. O eixo X apresenta tempo em minutos após o início do modelo de 34 formalina em ratos. 0 eixo Y apresenta o tempo gasto a levantar e lamber a pata injectada com formalina, utilizando injecções de controlo (solução salina, n=3) e de BOTOX® (complexo de neurotoxina purificado de toxina botulinica do tipo A) às concentrações de 3,5 U/kg (n=7) e 7 U/kg (n=8) . O BOTOX® foi injectado 12 dias antes do inicio da provocação com formalina.

DESCRIÇÃO A presente invenção baseia-se na descoberta de que a administração periférica de uma toxina botulinica pode proporcionar tratamento eficaz de dor crónica. De notar que a toxina botulinica tem uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem ou nativa. A dor tratada não se deve a um espasmo muscular, nem é uma dor de cabeça. A dor crónica é tratada devido ao efeito antinociceptivo de longa duração das toxina botulinica utilizadas. 0 componente da fracção de ligação neuronal da neurotoxina é uma fracção de ligação neuronal que é nativa da neurotoxina seleccionada, pois descobrimos que a presente invenção pode ser implementada sem substituir a fracção de ligação neuronal de tipo selvagem por uma fracção de abordagem selectiva que não seja nativa nem de tipo selvagem. 0 tratamento de dor de cabeça não pertence ao âmbito da presente invenção porque os sítios preferidos de administração periférica de uma toxina botulinica de acordo com a presente invenção excluem a cabeça e o pescoço.

Antes da nossa descoberta, uma toxina botulinica tinha sido utilizada para tratar dor associada a várias perturbações musculares. Assim, sabe-se que uma perturbação muscular, como um músculo espasmódico, pode causar dor e que, ao tratar o espasmo, a dor também pode ser atenuada. 35

Foster et al. revelam que a neurotoxina deve ser ligada a uma fracção de abordagem selectiva para utilização no tratamento de dor, isto é, que a fracção de ligação de tipo selvagem de uma neurotoxina de Clostridium deve ser removida completamente e substituída por uma fracção de abordagem selectiva.

Surpreendentemente, descobrimos que uma toxina botulínica que não tenha sido conjugada, ligada, que não tenha aderido ou que não tenha sido fundida a uma fracção neuronal de abordagem selectiva pode ser administrada perifericamente, de acordo com os métodos da presente invenção, para tratar dor. Preferivelmente, a dor tratada não se deve, isto é, a dor não surge directamente como resultado secundário de um espasmo muscular. A nossa invenção pode ser utilizada para tratar dor resultante de uma grande variedade de estados neuropáticos, inflamatórios, cancerosos e de traumatismo.

Antes da nossa invenção não era conhecido que uma toxina botulínica, como uma toxina botulínica, podia ser utilizada para tratar dor eficazmente, em que a dor não se deve a um espasmo muscular nem a um estado de músculo hipertónico. 0 mecanismo fisiológico pelo qual a administração periférica de uma neurotoxina pode resultar em atenuação de dor de longa duração não é claro. Notamos que, enquanto a dor devida a um espasmo muscular ou estado de músculo hipertónico pode produzir um pH local reduzido, a nossa invenção não se baseia e não requer aumento de um nível baixo de pH local. Adicionalmente, enquanto um espasmo muscular ou estado de músculo hipertónico pode ser atenuado por um efeito anticolinérgico de uma toxina botulínica, como uma toxina botulínica, em neurónios 36 motores, a nossa invenção não se baseia num efeito em neurónios motores. Sem pretendermos ficar restringidos pela teoria, pomos a hipótese de um efeito da administração periférica de uma toxina botulinica, de acordo com a presente invenção, poder ser um efeito antinociceptivo num neurónio periférico aferente e sensorial. É importante notar que, na nossa invenção, a atenuação da dor é um efeito primário, em oposição a secundário, da administração periférica de uma toxina botulinica, como uma toxina botulinica.

Assim, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que uma neurotoxina com uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem pode ser administrada perifericamente a um mamífero para atenuar dor. A toxina botulinica de acordo com esta invenção não é acoplada a uma fracção de abordagem selectiva não nativa. Uma fracção de ligação de tipo selvagem de acordo com a presente invenção pode ser um segmento Hc naturalmente existente de uma toxina botulinica ou uma sequência de aminoácidos completamente derivada, de forma substancial, do segmento Hc da toxina botulinica.

Tal como utilizado daqui em diante, uma sequência de aminoácidos, por exemplo, uma fracção de ligação de tipo selvagem, "derivada de" outra sequência de aminoácidos, por exemplo, o segmento Hc, significa que a sequência de aminoácidos resultante é duplicada exactamente como a sequência de aminoácidos de onde deriva, ou então a sequência de aminoácidos resultante tem pelo menos um aminoácidos deletado, modificado ou substituído em comparação com a sequência de aminoácidos de onde deriva. 37

De acordo com um aspecto amplo da invenção, são proporcionados métodos de tratamento de dor que compreendem administrar a um mamifero doses eficazes de uma toxina botulinica, por exemplo, uma neurotoxina de Clostridium, que tem uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem. Numa especificação, os métodos incluem administrar a um mamifero uma toxina botulinica com uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem que originalmente já faz parte da toxina botulinica. Preferivelmente, a toxina botulinica administrada ao mamifero é seleccionada de um grupo que consiste em toxinas botulinicas dos tipos A, B, Ci, D, E, F ou G, cada uma das quais tem a sua própria fracção de ligação neuronal de tipo selvagem original. Mais preferivelmente, os métodos incluem a administração de toxina botulinica do tipo A com a sua fracção de ligação neuronal de tipo selvagem original. Os métodos também incluem a administração a um mamifero de uma mistura de duas ou mais das toxinas botulinicas apresentadas acima para tratar dor.

Noutra especificação, os métodos compreendem a administração de uma toxina botulinica a um mamífero em que a neurotoxina difere de uma neurotoxina de ocorrência natural em pelo menos um aminoácido. Por exemplo, variantes da toxina botulinica do tipo A reveladas em Biochemistry 1995, 34_, páginas 15175-15181, e Eur. J. Biochem. 1989, 185, páginas 197-203 (incorporados aqui na sua totalidade por referência) podem ser administradas a um mamífero para tratar dor não relacionada com espasmos. Estas variantes também têm fracções de ligação neuronal de tipo selvagem.

Noutra especificação, são proporcionados métodos para administrar uma toxina botulinica a um mamífero com a 38 finalidade de tratar dor não causada por espasmos, em que a neurotoxina tem uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem de outra toxina botulinica. Por exemplo, o método inclui o passo de administrar a um mamífero toxina botulinica do tipo A com uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem da toxina botulinica do tipo B. Todas as outras combinações semelhantes estão incluídas no âmbito da presente invenção.

Noutra especificação ampla, métodos para tratar dor não relacionada com espasmos incluem administração local e periférica da toxina botulinica numa localização de dor real ou sentida do mamífero. Numa especificação, a toxina botulinica é administrada subcutaneamente no sítio ou perto da localização da dor sentida, por exemplo, num sítio ou perto de uma articulação cronicamente dolorosa. Noutra especificação, a toxina botulinica é administrada intramuscularmente no sítio ou perto da localização de dor, por exemplo, no sítio ou perto de um neoplasma do mamífero. Noutra especificação, a toxina botulinica é injectada directamente numa articulação de um mamífero para tratar ou atenuar estados artríticos causadores de dor. Também pertencem ao âmbito da presente invenção injecções ou infusões repetidas e frequentes da neurotoxina numa localização de dor periférica. No entanto, devido aos efeitos terapêuticos de longa duração da presente invenção, poderão não ser necessárias injecções ou infusões frequentes da neurotoxina. Por exemplo, a prática da presente invenção pode proporcionar um efeito analgésico em humanos, por injecção, durante 2 meses ou mais, por exemplo, 7 meses. 39

Sem pretender limitar a invenção a um mecanismo ou teoria de operação, crê-se que, quando a toxina botulinica é administrada localmente numa localização periférica, inibe a libertação de neuro-substâncias, por exemplo, substância P, a partir dos terminais sensoriais primários periféricos. Como discutido acima, a libertação de substância P pelos terminais sensoriais primários periféricos pode causar, ou pelo menos amplificar, o processo de transmissão de dor. Em consequência, a inibição da sua libertação nos terminais sensoriais primários periféricos irá amortecer o processo de transmissão de dor.

Para além de exercer acções farmacológicas numa localização de administração periférica, um método também pode exercer um efeito antinociceptivo devido ao transporte retrógrado da toxina botulinica desde o sitio da injecção periférica (isto é, subcutânea) até ao sistema nervoso central. Determinámos que a toxina botulinica do tipo A pode ser transportada de forma retrógrada desde o sítio de administração periférica até ao corno dorsal da espinal-medula. Presumivelmente, o transporte retrógrado dá-se via o nervo aferente primário. Esta descoberta é consistente com os trabalhos de Weigand et al., Nauny-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, e de Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56, que mostraram que a toxina botulinica é capaz de ascender até à área espinal por transporte retrógrado. Assim, foi relatado que a toxina botulinica do tipo A injectada intramuscularmente pode ser transportada de forma retrógrada desde os terminais sensoriais primários periféricos até aos terminais sensoriais primários centrais. 40 A nossa descoberta difere significativamente das discussões apresentadas nos artigos citados no parágrafo acima. Descobrimos que, no rato, após administração subcutânea periférica, a toxina botulinica estava localizada no corno dorsal do animal, isto é, na localização das sinapses das fibras C. Uma injecção subcutânea é uma injecção numa localização onde estão presentes muitas fibras de nervos nociceptivos bipolares. Estas fibras sensoriais vão desde a periferia até ao corno dorsal da espinal-medula. Em contrário, num ou mais dos artigos citados no parágrafo acima, depois de ter sido efectuada uma injecção intramuscular de toxina, verificou-se que alguma toxina botulinica etiquetada de forma radioactiva estava localizada nas raízes ventrais. A raiz ventral da espinal-medula é o sítio onde estão localizados neurónios motores eferentes (de saída de tráfego) monopolares. Assim, a área conduz à expectativa de se poder esperar espasticidade dos músculos periféricos em resultado do transporte retrógrado de uma toxina botulinica desde a periferia até uma localização na espinal-medula.

Assim, os experimentados na área criam que o aparecimento de uma toxina botulinica na espinal-medula de um mamífero teria o efeito de: (1) induzir espasticidade significativa no receptor, e (2) promover efeitos prejudiciais nas funções da espinal-medula e do cérebro. Em consequência, no que se refere ao efeito prejudicial (1) citado: foi relatado, como exemplos, em Williamson et al., em "Clostridial Neurotoxins and Substrate Proteolysis in Intact Neurons", J. of Biological Chemistry 271: 13, 7694-7699 (1996), que tanto a toxina tetânica como a toxina botulinica do tipo A inibem a libertação induzida dos neurotransmissores glicina e glutamato a partir de culturas 41 de células da espinal-medula de ratinhos fetais, ao passo que Hagenah et al., em "Effects of Type A Botulinum Toxin on the Cholinergic Transmission at Spinal Renshaw Cells and on the Inhibitory Action at Ia Inhibitory Interneurones", Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 299, 267-272 (1977), relataram que a injecção intra-espinal directa de toxina botulinica do tipo A em gatos experimentalmente preparados e anestesiados inibe a actividade de células de Renshaw no SNC. A inibição da libertação central dos neurotransmissores glicina e glutamato e a regulação negativa da actividade de células de Renshaw podem presumivelmente resultar in vivo na promoção de hiperactividade significativa de neurónios motores, com espasticidade subsequente dos músculos periféricos.

Relativamente ao efeito prejudicial (2) : crê-se que a presença central (espinal-medula) de uma neurotoxina do tétano exerce, por movimento retrógrado da toxina do tétano ao longo de neurónios do SNC, efeitos negativos importantes nas funções da espinal-medula e do cérebro, desse modo contra-indicando qualquer desejo de uma neurotoxina relacionada, como uma toxina botulinica, aparecer (tal como por transporte retrógrado) na espinal-medula. É de notar que a toxina botulinica e a toxina do tétano são ambas produzidas por bactérias Clostridium, apesar de por diferentes espécies de Clostridium. É importante referir que alguns investigadores relataram que a toxina botulinica partilha, pelo menos nalguma extensão, a caracteristica de ascensão neural notada da toxina tetânica. Ver, por exemplo, Habermann E., "125I-Labeled Neurotoxin from Clostridium Botulinum A: Preparation, Binding to Synaptosomes and Ascent in the Spinal Cord", Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 281, 47-56 (1974). 42

Surpreendentemente, a nossa invenção não apresenta nenhum dos efeitos prejudiciais (1) ou (2), e os métodos revelados de administração periférica (subcutânea) podem ser praticados para proporcionar uma atenuação eficaz e de longa duração de dor nevrálgica e para proporcionar uma melhoria geral da qualidade de vida sentida pelo paciente tratado. A dor sentida pelo paciente é dor nevrálgica ou dor causada pela nevralgia.

Depois de se encontrar nos terminais sensoriais primários centrais localizados no corno dorsal da espinal-medula, a toxina botulinica também pode inibir a libertação do neurotransmissor responsável pela transmissão de sinais de dor, por exemplo, substância P. Esta inibição evita a activação dos neurónios de projecção do tracto espinotalâmico, desse modo atenuando a dor. Em consequência, a administração periférica da toxina botulinica, devido ao seu efeito antinociceptivo central agora descoberto, é um método alternativo à administração central (isto é, intra-espinal) de um analgésico, desse modo eliminando as complicações associadas à administração central de um fármaco analgésico.

Suplementarmente, foi mostrado por Habermann, Experientia 1988; 4A_: 224-226, que a toxina botulinica pode inibir a libertação de noradrenalina e GABA a partir de homogenatos do cérebro. Esta descoberta sugere que a toxina botulinica pode entrar nos terminais dos nervos simpáticos adrenérgicos e terminais de nervos GABA. Como tal, a toxina botulinica pode ser administrada no sistema simpático para proporcionar bloqueio de longa duração e atenuar dor, por exemplo, dor neuropática. A administração de uma 43 neurotoxina, preferivelmente toxina botulínica do tipo A, proporciona um beneficio de bloqueio de longa duração sem o risco de enfraquecimento funcional permanente, o que não é possível com os agentes farmacêuticos correntemente utilizados. A quantidade administrada da toxina botulínica pode variar muito, de acordo com a perturbação particular a ser tratada, a sua gravidade e outras variáveis diferentes dos pacientes, incluindo estatura, peso, idade e sensibilidade à terapia. Por exemplo, crê-se que a extensão da área da dor periférica é proporcional ao volume da neurotoxina injectada, ao passo que se crê que a quantidade de analgesia, para a maior parte das gamas de doses, é proporcional à concentração da neurotoxina injectada. Suplementarmente, a localização particular da administração da toxina botulínica pode depender da localização da dor a ser tratada.

Em geral, a dose da neurotoxina a ser administrada irá variar com a idade, estado e peso do mamífero a ser tratado. Também a potência da toxina botulínica será considerada.

Numa especificação de acordo com esta invenção, as doses terapeuticamente eficazes de uma toxina botulínica, por exemplo, toxina botulínica do tipo A, numa localização periférica podem ser quantidades situadas entre cerca de 0,01 U/kg e cerca de 35 U/kg. Uma gama preferida para administração de uma toxina botulínica com uma fracção de ligação neuronal de tipo selvagem, como a toxina botulínica do tipo A, de modo a obter um efeito antinociceptivo no paciente tratado vai desde cerca de 0,01 U/kg até cerca de 44 35 U/kg. Uma gama mais preferida para administração periférica de uma toxina botulinica, como toxina botulinica do tipo A, de modo a obter um efeito antinociceptivo no paciente tratado vai desde cerca de 1 U/kg até cerca de 15 U/kg. Menos de cerca de 0,1 U/kg pode fazer com que o efeito terapêutico desejado seja inferior à duração óptima ou mais longa possível, ao passo que mais de cerca de 2 U/kg ainda pode resultar nalguns sintomas de flacidez muscular. Uma gama muito preferida para administração periférica de uma toxina botulinica, como a toxina botulinica do tipo A, de modo a obter um efeito antinociceptivo no paciente tratado vai desde cerca de 0,1 U/kg até cerca de 1 U/kg.

Apesar de se fornecerem exemplos de vias de administração e dosagens, a via de administração e dosagem apropriadas são geralmente determinadas caso a caso pelo médico. Essas determinações são rotineiras para o experimentado na área (ver, por exemplo, "Harrison's Principies of Internai Medicine" (1998), editado por Anthony Fauci et al., 14a edição, publicado pela McGraw Hill). Por exemplo, a via e dosagem para administração de uma neurotoxina apta a ser utilizada de acordo com a presente invenção revelada podem ser seleccionadas com base em critérios tais como as características de solubilidade da toxina botulinica escolhida e a intensidade da dor sentida.

Se uma toxina botulinica não modificada for utilizada para tratar dor não relacionada com espasmos como descrito aqui, a toxina botulinica pode ser obtida por cultura de uma espécie bacteriana apropriada. Por exemplo, pode obter-se toxina botulinica do tipo A estabelecendo e 45 desenvolvendo culturas de Clostridium botulinum num fermentador e depois recolhendo e purificando a mistura fermentada de acordo com procedimentos conhecidos. Todos os serótipos da toxina botulínica são inicialmente sintetizados na forma de proteínas de cadeia simples inactivas, que devem ser clivadas ou cortadas por proteases para se tornarem neuroactivas. As estirpes bacterianas que produzem os serótipos A e G da toxina botulínica possuem proteases endógenas; em consequência, os serótipos A e G podem ser recuperados de culturas bacterianas predominantemente na sua forma activa. Em contraste, os serótipos da toxina botulínica Ci, D e E são sintetizados por estirpes não proteolíticas; em consequência, estão tipicamente inactivados quando são recuperados da cultura. Os serótipos B e F são produzidos por estirpes proteolíticas e não proteolíticas; em consequência, podem ser recuperados na forma activa ou inactiva. No entanto, mesmo as estirpes proteolíticas que produzem, por exemplo, o serótipo da toxina botulínica do tipo B só procedem à clivagem de uma porção da toxina produzida. A proporção exacta entre moléculas cortadas e não cortadas depende da extensão da incubação e da temperatura da cultura. Consequentemente, é provável que uma certa percentagem de qualquer preparação, por exemplo, de toxina botulínica do tipo B, esteja inactiva, possivelmente sendo responsável pela conhecida potência significativamente inferior da toxina botulínica do tipo B em comparação com a toxina botulínica do tipo A. A presença de moléculas de toxina botulínica inactivas numa preparação clínica irá contribuir para a carga proteica global da preparação, que foi ligada a antigenicidade acrescida, sem contribuir para a sua eficácia clínica. Adicionalmente, sabe-se que, por injecção intramuscular, a toxina botulínica do tipo B tem uma 46 duração menor da actividade e também é menos potente do que a toxina botulínica do tipo A ao mesmo nível de dose.

Se uma toxina botulínica modificada for utilizada de acordo com esta invenção para tratar dor não relacionada com espasmos, podem utilizar-se técnicas recombinantes para produzir as toxinas botulínicas desejadas. A técnica inclui os passos de obter materiais genéticos de fontes naturais, ou fontes sintéticas, com códigos para uma fracção de ligação neuronal, uma sequência de aminoácidos eficaz para relocalizar a toxina botulínica, ou respectiva parte, e uma sequência de aminoácidos com actividade terapêutica quando libertada no citoplasma de uma célula-alvo, preferivelmente um neurónio. Numa especificação preferida, os materiais genéticos têm códigos para a Hc, HN e cadeia L das toxina botulínica, toxina botulínica modificadas e respectivos fragmentos. As construções genéticas são incorporadas em células-hospedeiro para amplificação fundindo primeiramente as construções genéticas a vectores de clonagem, como fagos ou plasmídeos. Em seguida, os vectores de clonagem são inseridos em hospedeiros, preferivelmente E. coli. Após as expressões dos genes recombinantes em células-hospedeiro, as proteínas resultantes podem ser isoladas utilizando técnicas convencionais.

Apesar das técnicas recombinantes serem empregues para produzir toxina botulínica modificadas, técnicas recombinantes também podem ser empregues para produzir toxina botulínica não modificadas, por exemplo, toxina botulínica do tipo A tal como existe naturalmente, uma vez que se conhece a sequência genética da toxina botulínica do tipo A. 47 Há muitas vantagens em produzir estas toxinas botulinicas de forma recombinante. Por exemplo, a produção de toxinas botulinicas a partir de culturas anaeróbicas de Clostridium é um processo pesado e demorado, que inclui um protocolo de purificação em múltiplos passos que envolve vários passos de precipitação de proteínas e cristalização prolongada e repetida da toxina ou várias fases de cromatografia em coluna. É importante notar que a toxicidade elevada do produto impõe que o procedimento deva ser realizado com contenção estrita (BL-3). Durante o processo de fermentação, as neurotoxinas de cadeia simples dobradas são activadas por proteases endógenas de Clostridium por um processo denominado corte. Este envolve a remoção de aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos da cadeia simples para criar a forma em di-cadeia, na qual as duas cadeias permanecem ligadas de modo covalente através da ligação dissulfureto intracadeias. A toxina botulínica cortada é muito mais activa do que a forma não cortada. A quantidade e localização precisa do corte variam com os serótipos das bactérias que produzem a toxina. As diferenças na activação da neurotoxina de cadeia simples e, assim, no rendimento da toxina cortada devem-se a variações do tipo e quantidade de actividade proteolítica produzidos por uma dada estirpe. Por exemplo, mais de 99% da neurotoxina de cadeia simples do tipo A de Clostridium botulinum são activados pela estirpe de Clostridium botulinum Hall A, ao passo que as estirpes dos tipos B e E produzem toxinas com quantidades de activação menores (0 até 75%, dependendo do tempo da fermentação). Assim, a toxicidade elevada da toxina botulínica madura desempenha um papel importante no fabrico comercial de toxinas botulinicas como agentes terapêuticos. 48

Em consequência, o grau de activação de toxina botulinica manipuladas é uma consideração importante para o fabrico destes materiais. Seria uma grande vantagem se toxina botulinica pudessem ser expressas, de modo recombinante e com um rendimento elevado, em bactérias de crescimento rápido (como células heterólogas de E. coli) na forma de cadeias simples relativamente não tóxicas (ou de cadeias simples com actividade tóxica reduzida), que são seguras, fáceis de isolar e simples de converter na forma completamente activa.

Sendo a segurança uma preocupação importante, trabalhos anteriores concentraram-se na expressão em E. coli e purificação de cadeias H e L individuais das toxinas tetânica e botulinica; estas cadeias isoladas, por si próprias, não são tóxicas; ver Li et al., Biochemistry 33: 7014-7020 (1994); Zhou et al., Biochemistry 34_: 15175-15181 (1995), deste modo aqui incorporados por referência. Após a produção separada destas cadeias peptídicas e em condições estritamente controladas, as cadeias H e L podem ser combinadas por ligação oxidativa de dissulfureto para formar as di-cadeias neuroparaliticas.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos não limitativos proporcionam aos habitualmente experimentados na área métodos específicos preferidos para tratar dor não relacionada com espasmos, não se pretendendo que limitem o âmbito da invenção. Nos exemplos seguintes podem empregar-se vários modos de administração não sistémica de uma toxina botulinica. Por exemplo, por injecção intramuscular de bolus, por múltiplas injecções subcutâneas em sítios dérmicos no local e na 49 região da dor ou por implantação de um implante de libertação controlada.

Exemplo 1 (referência)

Atenuação de Dor por Administração Periférica de Toxina Botulinica do Tipo A

Realizaram-se duas experiências. Utilizaram-se em ambas as experiências ratos Sprague-Dawley (cerca de 300 até cerca de 350 gramas). A toxina botulinica utilizada em ambas as experiências foi BOTOX® (complexo de neurotoxina purificado de toxina botulinica do tipo A) . Na primeira experiência formaram-se 4 grupos de tratamento (dose): ratos de controlo (injectados com solução salina) (n=4), ratos que receberam 7 U de BOTOX®/kg (n=8) , ratos que receberam 15 U de BOTOX®/kg (n=5) e ratos que receberam 30 U de BOTOX®/kg (n=4). Para os ratos de controlo, 25 microlitros de solução salina 0,9% foram injectados subcutaneamente na superfície plantar da pata traseira do animal. O sítio e a via de administração de BOTOX® foram iguais aos do grupo de controlo de injecção de solução salina.

Cinco dias após a injecção de solução salina ou BOTOX®, injectaram-se 50 microlitros de formalina 5% no sítio, de cada um dos ratos dos quatro grupos, onde tinha sido previamente injectada solução salina ou BOTOX®. Depois registou-se o acto de levantar/lamber o membro pelos animais em questão em intervalos de 5 minutos durante uma hora.

No segundo conjunto de experiências empregou-se o mesmo protocolo da primeira experiência. Na segunda experiência formaram-se três grupos de tratamento (dose): ratos de 50 controlo (injectados com solução salina) (n=3), ratos que receberam 3,5 U/kg (n=7) e ratos que receberam 7 U/kg (n=8); o teste de formalina foi conduzido no décimo segundo dia após a injecção original de BOTOX® ou solução salina.

Os resultados destas duas experiências estão apresentados nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Os primeiros 5 até 10 minutos podem ser referidos como fase 1, que é seguida da fase 2. Como mostrado nas Figuras 1 e 2, aos 5 dias e 12 dias após a injecção ocorreu atenuação significativa da dor dependente da dose nos animais tratados com BOTOX®.

Exemplo 2 (referência)

Administração Periférica de uma Toxina Botulínica para Atenuar uma Dor Não Causada por Espasmos

Uma mulher com 46 anos de idade sente dor localizada na região deltoide devido a um estado artrítico. O músculo não tem espasmos nem exibe um estado hipertónico. A paciente é tratada com uma injecção intramuscular de bolus de entre cerca de 50 Unidades e 200 unidades de toxina botulínica do tipo A. No período de 1-7 dias após a administração da neurotoxina, a dor sentida pela paciente é substancialmente atenuada. A duração da atenuação significativa da dor vai desde cerca de 2 até cerca de 6 meses. Pode tratar-se de modo semelhante uma dor no ombro, braço e mão devido a osteoporose, fixação de articulações, insuficiência coronária, osteoartrite cervical, doença no ombro localizada ou devido a um período prolongado de repouso na cama.

Exemplo 3

Administração Periférica de uma Neurotoxina para 51

Tratar Neuralgia Pós-Terapêutica A neuralgia pós-terapêutica é um dos problemas mais difíceis de tratar de dor crónica. Os pacientes que sofrem este processo excruciantemente doloroso são muitas vezes idosos, têm uma doença debilitante e são adequados para grandes procedimentos de intervenção. 0 diagnóstico é rapidamente feito pelo aparecimento das lesões cicatrizadas de herpes e pelo historial do paciente. A dor é intensa e emocionalmente desgastante. A neuralgia pós-terapêutica pode ocorrer em qualquer parte do corpo, mas mais frequentemente no tórax.

Um homem de 76 anos de idade sente uma dor do tipo pós-terapêutica. A dor está localizada na região do abdómen. 0 paciente é tratado com uma injecção de bolus de entre cerca de 50 Unidades e 200 unidades de toxina botulínica do tipo A subcutaneamente na região abdominal. No período de 1-7 dias após a administração da neurotoxina, a dor sentida pelo paciente é substancialmente atenuada. A duração da atenuação significativa da dor é desde cerca de 2 até cerca de 6 meses.

Exemplo 4 (referência)

Administração Periférica de uma Neurotoxina para Tratar Dor Devido a Tumor Nasofaringeo

Estes tumores, muito frequentemente carcinomas de células escamosas, localizam-se habitualmente na fossa de Rosenmuller e podem invadir a base do crânio. É comum ocorrer dor na face. Tem natureza de dor constante sem variações.

Um homem de 35 anos de idade sente dor do tipo tumor nasofaringeo. A dor é sentida na face esquerda inferior. O 52 paciente é tratado com uma injecção intramuscular na face de bolus de cerca de 10 unidades até cerca de 35 unidades de toxina botulinica do tipo A. No período de 1-7 dias após a administração da neurotoxina, a dor sentida pelo paciente é substancialmente atenuada. A duração da atenuação significativa da dor é desde cerca de 2 até cerca de 6 meses.

Exemplo 5 (referência)

Administração Periférica de uma Neurotoxina para Tratar Dor Inflamatória Crónica

Um paciente com 45 anos de idade sente dor inflamatória crónica na região do peito. O paciente é tratado com uma injecção intramuscular de bolus de cerca de 50 Unidades até 200 unidades de toxina botulinica do tipo A. No período de 1-7 dias após a administração da neurotoxina, a dor sentida pelo paciente é substancialmente atenuada. A duração da atenuação significativa da dor é desde cerca de 2 até cerca de 6 meses.

Exemplo 6(referência)

Administração Periférica de uma Neurotoxina para Tratar Dor Causada por Queimaduras

Um paciente de 51 anos de idade sente dor subsequente a queimaduras graves e extensas de primeiro ou segundo grau no braço. O paciente é tratado com uma injecção subcutânea no braço de bolus de cerca de 30 unidades até cerca de 200 unidades de toxina botulinica do tipo A. No período de 1-7 dias após a administração da neurotoxina, a dor sentida pelo paciente é substancialmente atenuada. A duração da atenuação significativa da dor é desde cerca de 2 até cerca de 6 meses. 53

Exemplo 7(referência)

Administração Periférica de uma Neurotoxina para Tratar Dor nas Articulações

Um paciente de 63 anos de idade sofre de dor numa articulação resultante de artrite. 0 paciente é tratado com uma injecção intramuscular de bolus de cerca de 30 Unidades até 150 unidades de toxina botulinica do tipo A na região da articulação dolorosa. No periodo de 1-7 dias após a administração da neurotoxina, a dor sentida pelo paciente é substancialmente atenuada. A duração da atenuação significativa da dor é desde cerca de 2 até cerca de 6 meses.

Exemplo 8(referência)

Administração Periférica de uma Neurotoxina para Tratar Dor Pós-Operatória A um paciente de 39 anos de idade, desde 1 hora até dez dias antes da cirurgia, é administrada localmente e perifericamente, por injecção de bolus ou injecção subcutânea, desde cerca de 20 unidades até cerca de 300 unidades de uma toxina botulinica, como toxina botulinica do tipo A, no local ou na vizinhança do sitio de incisão possível na derme do paciente. A injecção de toxina botulinica pode ser subcutânea ou intramuscular. A cirurgia não é realizada para tratar ou atenuar uma perturbação muscular, como um músculo hiperactivo ou hipertónico. A duração da atenuação significativa da dor pós-operatória é desde cerca de 2 até cerca de 6 meses.

Exemplo 9 (referência)

Tratamento de Dor Visceral por Administração de uma Neurotoxina 54

Um paciente do sexo masculino com 46 anos de idade sente dor abdominal crónica de origem visceral mas de etiologia desconhecida. Põe-se a hipótese de tumor ou constrição do dueto. Administra-se de forma subcutânea ou intra-órgão (no sitio da dor sentida) toxina botulinica, tal como desde cerca de 20 unidades até cerca de 300 unidades de uma toxina botulinica do tipo A. No período de um até sete dias a dor é substancialmente atenuada. A duração da atenuação significativa da dor é desde cerca de 2 até cerca de 6 meses.

Apesar da presente invenção ter sido descrita em pormenor relativamente a certos aspectos preferidos, são possíveis outras especificações, versões e modificações no âmbito da presente invenção. Por exemplo, uma grande variedade de toxinas botulínicas pode ser eficazmente utilizada na presente invenção. Adicionalmente, a presente invenção permite que métodos de administração periférica atenuem dor relacionada com uma perturbação não muscular, em que duas ou mais toxinas botulínicas, são administradas concomitante ou consecutivamente. Por exemplo, a toxina botulinica do tipo A pode ser administrada até ocorrer uma perda da resposta clínica ou até se desenvolveram anticorpos neutralizadores, seguida da administração de toxina botulinica do tipo E. Alternativamente, pode administrar-se localmente uma combinação de quaisquer dois ou mais dos serótipos das toxinas botulínicas A-G para controlar o início e duração do resultado terapêutico desejado. Suplementarmente, compostos que não sejam toxinas botulínicas podem ser administrados antes, concomitante ou subsequentemente à administração da neurotoxina para proporcionar um efeito adjunto, como início intensificado 55 ou mais rápido da denervação, antes da toxina botulinica, começar a exercer o seu efeito terapêutico.

Lisboa, 3 de Fevereiro de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma toxina botulínica para utilização num método de alivio da dor nevrálgica num ser humano, em que a toxina botulínica é perifericamente administrada e em que a for nevrálgica não está associada a uma dor de cabeça.

2. A toxina botulínica de acordo com a reivindicação 1, em que a toxina botulínica é seleccionada do grupo que consiste em toxinas botulínicas dos tipos A, B, Ci, D, E, F Θ G.

3. A toxina botulínica de acordo com a reivindicação 1, em que a toxina botulínica é do tipo A.

4. Uma toxina botulínica para utilização num método de tratamento de dor associada a nevralgia, em que a toxina botulínica é administrada perifericamente numa área afectada de um paciente.

5. A toxina botulínica de acordo com a reivindicação 4, em que a dor está nassocuada a nevralgia trigeminal.

6. A toxina botulínica de acordo com a reivindicação 4, em que a toxina botulínica é seleccionada do grupo que consiste em imunótipos A-G. Lisboa, 3 de Fevereiro de 2010