CN1436085A - 通过外周给予神经毒素治疗疼痛的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种通过外周给予患者治疗有效量的神经毒素例如肉毒杆菌毒素治疗非痉挛引起的疼痛的方法。

Description

通过外周给予神经毒素治疗疼痛的方法
                          背景
本发明涉及治疗疼痛的方法。具体地说，本发明涉及通过外周给予神经毒素治疗疼痛的方法。
即使不是大多数机体的疾病都引起疼痛，但许多疾病引起疼痛。一般而言，当构成皮肤中以及某些内部组织中痛感受器的游离神经末梢经受机械、热、化学或其它伤害刺激时经历疼痛。痛感受器可以将信号沿传入神经元传送到中枢神经系统，由此传送至大脑。
疼痛的原因可以包括炎症、损伤、疾病、肌肉痉挛和神经病性事件或综合征的发作。无效治疗的疼痛对于经历疼痛的人而言可能是破坏性的，因为限制机能、降低可动性、影响睡眠并且显著影响生活质量。
肌肉痉挛可以引起对力敏感痛感受器的刺激，从而引起痛觉。因此，疼痛可以因肌肉痉挛引起。另外，痉挛可以通过压迫血管，引起所述组织中局部缺血，进而释放疼痛诱导物质，所述物质刺激痛感受器引起痛觉，间接地刺激痛感受器。此外，肌肉痉挛可以引起局部pH降低，所述pH降低可以作为疼痛信号而被感知，或可以产生疼痛信号。因此，疼痛可以是肌肉痉挛或肌肉过度紧张的次级效应。
当组织损伤时可以发生炎性疼痛，疼痛也可以因手术或不利的物理、化学或热事件引起，或因生物因子感染引起。当组织损伤时，许多内源疼痛诱导物质例如缓激肽和组胺可以从受伤组织中释放出来。所述疼痛诱导物质可以结合于感觉神经末梢上的感受器，从而启动传入疼痛信号。
另外，疼痛诱导物质可以从伤害性传入末梢释放，从感觉末梢释放的神经肽可以加重炎症反应。因此，在炎症期间可能有肽能外周纤维芽生以及肽含量增加，许多纤维表现出P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)共存。P物质可以诱导内皮细胞收缩，这进而引起血浆外渗，使得其它物质(缓激肽、ATP、组胺)可以进入损伤部位和所述传入神经末梢。感觉神经末梢释放P物质，也可以引起肥大细胞脱粒。这一过程一直被认为是神经原性炎症的重要因素，因为释放出炎性介质例如组胺和5-羟色胺并且释放出催化缓激肽产生的蛋白水解酶。CGRP显然不引起血浆外渗，但却是一种强有力的血管舒张剂，并且也与SP和其它炎性介质协同作用，增强血浆外渗。所有以上所列的炎性介质或者可以使伤害性感受器致敏，或者可以引起疼痛。
在初级感传入神经元激活后，感觉信号转导中的下一步可以是激活投射神经元，投射神经元携带该信号通过脊髓丘脑前束，抵达中枢神经系统更高的部分，例如丘脑核。这些神经元(不是与脑神经相关的神经元)的胞体位于脊髓的背角。在此人们也可以发现初级传入和投射神经元之间的突触。背角组构成一系列堆积的层，层I大多数背接层II等等。不同类别的初级传入在不同层形成突触。对于皮肤初级传入而言，C纤维在层I和层II中形成突触，Aδ纤维在层I、II和V中形成突触，而Aβ纤维在层III、IV和V中形成突触。较深的层(V-VII、X)被认为参与从较深组织例如肌肉抵达的感觉通路，反之亦然。
初级传入神经元和投射神经元之间突触上的主要神经递质是P物质、谷氨酸、CGRP和神经肽Y。这些突触的传递效能可以通过下行通路和脊髓中的局部中间神经元而被改变。这些调节神经元可以释放许多或者抑制性(例如阿片样肽、甘氨酸)或者兴奋性(例如一氧化氮、缩胆囊素)的递质，以提供增强或降低感觉觉知的机制。
虽然炎性疼痛一般是可逆的，并且当受害组织被修复或者疼痛诱导刺激被去除后消退，但目前用于治疗炎性疼痛的方法有许多缺点和缺陷。因此，典型的口服、胃肠外或局部给予镇痛药以治疗疼痛症状或者给予例如抗生素以治疗炎性疼痛致病因子，可能导致所述药物广泛的系统性分布和不想要的副作用。另外，目前用于炎性疼痛的疗法的药效持续时间短，这需要频繁地重新给药，有可能产生抗药性、产生抗体和/或药物依赖和药瘾，所有这些都是令人不满意的。此外，频繁给药增加了患者治疗方案的费用，并且可能要求患者记住坚持给药方案。
用于炎症疼痛和肌肉疼痛的疗法的实例包括非类固醇消炎药(NSAID)，包括阿司匹林和布洛芬；和阿片样物质，例如吗啡。
NSAID通过抑制损伤组织释放的前列腺素的产生而缓解疼痛。已经表明前列腺素是疼痛和炎症的外周介质，也是关节炎性疾病中的介质，其浓度的降低为患者提供疼痛缓解。已有提示，前列腺素参与脊髓和大脑中疼痛的介导，这可以解释NSAID在不涉及炎症或外周组织损伤的某些疼痛状态中的镇痛效应。然而，前列腺素仅仅是若干疼痛介质中的一种。NSAID有一个活性上限，高于此上限，增加剂量不引起更强的疼痛缓解。此外，它们有副作用，这限制了其应用性。例如，NSAID可以引起胃肠道的刺激，延长的应用可能导致发生广泛的消化道溃疡。在频繁应用NSAID治疗其关节炎病症的老年患者中尤为如此。
阿片样物质的治疗作用位于脊髓中。阿片样物质抑制初级感觉传入(主要是C纤维)和投射神经元之间的神经传递效能。它们通过引起两种组分的这些突触延长超极化来达到这一点。应用阿片样物质在缓解大多数类型的急性疼痛和慢性恶性肿瘤性疼痛方面是有效的。然而，有许多慢性恶性肿瘤性疼痛病症对于阿片样镇痛药部分或完全不应，尤其是涉及神经压迫、例如由于形成肿瘤所致的神经压迫的病症。遗憾的是，阿片样物质也有不想要的副作用，包括：(1)抑制呼吸系统，(2)便秘，和(3)心理活性效应，包括镇静和兴奋。这些副作用在与产生镇痛的相似剂量下发生，因此限制了可以给予患者的剂量。另外，阿片样物质例如吗啡和海洛因是众所周知的导致机体依赖性的滥用药物，这也涉及产生耐受性。由于产生耐受性，所以产生同样镇痛效应所需的药物剂量随时间增加。由于有前述的副作用，这可能引起其中缓解疼痛所需的剂量是威胁生命的病症。
虽然由炎症和肌肉痉挛引起的疼痛可以通过对初级感觉神经元游离末梢的机械刺激或化学刺激而引发，但神经病性疼痛不需要对外周游离神经末梢的原始刺激。神经病性疼痛是一种持续的或慢性疼痛综合征，可以由于神经系统、周围神经、背根神经节、背根或中枢神经系统的损伤而引起。
神经病性疼痛综合征包括异常性疼痛、各种神经痛例如疱疹后神经痛和三叉神经痛、幻痛和复杂性区域疼痛综合征，例如反射交感性营养不良和灼痛。灼痛的特征通常为自发性灼痛与痛觉过敏和异常性疼痛。
不幸的是，没有适当地、可预测地且特异性地治疗已建立的神经病性疼痛的现有方法(Woolf C.等，Neuropathic Pain：Aetiology，Symptoms，Mechanisms，and Management，Lancet 1999；353：1959-64)，因为目前用于神经病性疼痛的治疗方法仅包括试图帮助患者适应心理疗法或职业疗法，而不是减轻或消除所经历的疼痛。
例如，目前用来治疗神经病性疼痛的方法包括给予靶向触发点、周围神经、神经丛、背根和交感神经系统的局部麻醉阻滞药。然而，这些疗法仅有短寿的抗伤害效应。另外，持续较长的镇痛疗法例如通过注射苯酚或冷疗法的阻滞，带来了不可逆功能受损的相当大的危险。此外，长期硬膜外或鞘内(统称“脊柱内”)给予诸如可乐定、类固醇、阿片样物质或咪哒唑仑的药物有显著的副作用和不可靠的功效。肉毒杆菌毒素
厌氧性革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生一种有效的多肽神经毒素-肉毒杆菌毒素，这种毒素在人类和动物中引起神经麻痹性疾病，称为肉毒中毒。在土壤中发现有肉毒梭菌的孢子，其孢子可以在基于家庭的罐头工厂的不适当灭菌和密封的食品容器中生长，这是许多肉毒中毒病例的病因。肉毒中毒的效应通常在食用感染肉毒梭菌培养物或孢子的食品后18-36小时出现。肉毒杆菌毒素显然可以不减毒地通过肠衬层，从而攻击周围运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以从难以行走、吞咽和说话进行至呼吸肌麻痹和死亡。
A型肉毒杆菌毒素是已知的对于人类而言最强的致死性天然生物因子。约50皮克市售的A型肉毒杆菌毒素(纯化的神经毒素复合物)1是小鼠中的LD50(即1单位)。一单位的BOTOX含有约50皮克A型肉毒杆菌毒素复合物。有趣的是，以摩尔浓度计，A型肉毒杆菌毒素的致死力比白喉毒素强约1.8×109倍，比氰化钠强约600×106倍，比眼镜蛇毒素强约30×106倍，而比霍乱毒素强约12×106倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，Natural Toxins II，第63-84页(第4章)，B.R.Singh等编著，Plenum Press，New York(1976)(其中根据约0.05ng BOTOX等于1单位的事实，所述的A型肉毒杆菌毒素的0.3ng的LD50校正为等于1U)。当腹膜内注射到每只重约18-20克的雌性Swiss Webster小鼠体内时，1单位(U)的肉毒杆菌毒素被定义为LD50。
已经表征了7种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素，这些毒素分别是A、B、C1、D、E、F和G血清型肉毒杆菌神经毒素，其中每种根据用型特异性抗体中和来鉴别。不同血清型的肉毒杆菌毒素所影响的动物种不同，以及它们所引发的麻痹的严重程度和持续时间也不同。例如，已经确定，根据在大鼠中引起的麻痹率来测定，A型肉毒杆菌毒素比B型肉毒杆菌毒素强500倍。另外，已经确定B型肉毒杆菌毒素在480U/kg剂量下在灵长类中无毒，该剂量是A型肉毒杆菌毒素的灵长类LD50的约12倍。肉毒杆菌毒素显然以高亲和性与胆碱能运动神经元结合，被转运到所述神经元内，阻断乙酰胆碱的释放。1可得自Allergan，Inc.，of Irvine，California，商品名为BOTOX，每个管形瓶100单位)
无论是何种血清型，毒素中毒的分子机制看来都是相似的，涉及至少三个步骤或阶段。在该过程的第一步中，毒素通过重链H链与细胞表面受体之间的特异性相互作用，结合于与靶神经元的突触前膜；据认为，对于每种肉毒杆菌毒素和破伤风毒素而言，所述受体是不同的。H链的羧基末端区段HC看来对于所述毒素靶向所述细胞表面是重要的。
在第二步中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用被所述细胞吞入，形成含有所述毒素的内体。然后毒素从内体逃脱到细胞的胞质中。这一步被认为是由H链的氨基末端区段HN介导的，该区段触发毒素对约5.5或更低的pH作出反应而改变构象。已知内体具有一个降低内体内pH的质子泵。构象变化暴露出毒素内的疏水性残基，这使得毒素将其自身包埋在内体膜中。然后，毒素(或至少轻链)通过内体膜转位到胞质中。
肉毒杆菌毒素活性机制的最后一个步骤看来涉及连接重链H链和轻链L链的二硫键的还原。肉毒杆菌毒素和破伤风毒素的全部毒素活性包含在全毒素的L链中；L链是一种锌(Zn++)内肽酶，它选择性地切割识别含神经递质的小泡及将其质膜的胞质表面对接以及使所述小泡与质膜融合所必需的蛋白质。破伤风神经毒素、肉毒杆菌毒素/B/D、/F和/G引起突触小体膜蛋白-小突触泡蛋白(也称为小泡相关膜蛋白(VAMP))降解。突触小泡胞质表面存在的大多数VAMP由于任何一种这些切割事件而被去除。A和E血清型切割SNAP-25。C1血清型最初被认为切割突触融合蛋白，但发现切割突触融合蛋白和SNAP-25。每种毒素特异性地切割一种不同的键(除了破伤风毒素和B型毒素，它们切割相同的键)。
肉毒杆菌毒素已经在临床环境中用于治疗特征为骨骼肌机能亢进的神经肌肉疾病。A型肉毒杆菌毒素已经被美国食品及药品管理局批准用于治疗睑痉挛、斜视和一侧面痉挛。与A型肉毒杆菌毒素相比，非A型肉毒杆菌毒素血清型显然具有较低的效力和/或较短的活性持续时间。外周肌内A型肉毒杆菌毒素的临床效应通常在注射1周内观测到。通常一次肌内注射A型肉毒杆菌缓解症状的持续时间平均约为3个月。
虽然所有的肉毒杆菌毒素血清型看来抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接头的释放，它们通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同位点切割这些蛋白，而达到所述抑制。例如，A型和E型肉毒杆菌切割25千道尔顿(kD)突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但它们靶向该蛋白内不同的氨基酸序列。B型、D型、F型和G型肉毒杆菌毒素作用于小泡相关蛋白(VAMP，也称为小突触泡蛋白)，每种血清型在不同位点切割该蛋白。最后，已经表明C1型肉毒杆菌毒素既切割突触融合蛋白，也切割SNAP-25。这些作用机制的差异可能影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效力和/或作用时间。重要的是，已知胰岛B细胞的胞质溶胶至少含有SNAP-25(Biochem J 1；339(pt1)：159-65(1999年4月))和小突触泡蛋白(Mov Disord 1995年5月；10(3)：376)。
对于所有7种已知的肉毒杆菌毒素血清型而言，肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子量约为150 kD。有趣的是，肉毒杆菌毒素由梭菌以包含所述150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子和缔合的无毒蛋白的复合体释放。因此，A型肉毒杆菌毒素复合体可以由梭菌以900kD、500kD和300kD形式产生。B型和C1型肉毒杆菌毒素看来仅产生500kD复合体。D型肉毒杆菌毒素以300kD和500kD复合体产生。最后，E型和F型肉毒杆菌毒素仅以约300kD复合体产生。据认为所述复合体(即分子量高于约150kD)含有一种无毒血凝素蛋白和一种无毒和无毒性非血凝素蛋白。这两种无毒蛋白(它们与所述相关肉毒杆菌毒素分子一起构成所述缔合的神经毒素复合体)可以起作用，以当毒素被摄入时为所述肉毒杆菌毒素分子提供抗变性的稳定性和保护其抵抗消化性酸。另外，有可能较大(高于约150kD分子量)的肉毒杆菌毒素复合体可能导致肉毒杆菌毒素扩散离开肉毒杆菌毒素复合体肌内注射部位的速率较慢。
体外研究已经表明，肉毒杆菌毒素抑制钾阳离子诱导的从脑干组织的原代细胞培养物释放乙酰胆碱和去甲肾上腺素。另外，已有报道，肉毒杆菌毒素在脊髓神经元原代培养物中抑制引发的甘氨酸和谷氨酸的释放，并且在脑突触小体制备物中肉毒杆菌毒素抑制神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸中每种的释放。
A型肉毒杆菌毒素可以通过以下方法获得：建立肉毒梭菌培养物，并在发酵罐中培养，然后依照已知方法收获并纯化所述发酵混合物。所有的肉毒杆菌毒素血清型最初都作为无活性单链蛋白合成，所述单链蛋白必须经蛋白酶切割或产生缺口，以变为神经活性蛋白。制造A和血清G型肉毒杆菌毒素的细菌菌株具有内源蛋白酶，因此A和G血清型可以从细菌培养物中以主要为其活性形式回收。相反，C1、D和E血清型肉毒杆菌毒素由非蛋白水解性菌株合成，因此在从培养物中回收时通常未活化。B和F血清型由蛋白水解性菌株和非蛋白水解性菌株产生，因此，可以以活性形式或无活性形式回收。然而，甚至产生例如B型血清型肉毒杆菌毒素的蛋白水解性菌株也仅切割一部分所产生的毒素。有缺口分子与无缺口分子的实际比例取决于孵育的时间长度和培养温度。因此，一定百分比的例如肉毒杆菌毒素B型毒素的任何制剂可能是无活性的，这可能解释了与A型肉毒杆菌毒素相比，已知B型肉毒杆菌毒素的功效显著更低。临床制剂中存在无活性肉毒杆菌毒素分子将影响与抗原性增加有关的所述制剂的总蛋白负荷，而不影响其临床功效。另外，已知与相同剂量水平的A型肉毒杆菌毒素相比，B型肉毒杆菌毒素在肌内注射时活性时间较短，并且效力也较低。
高质量的结晶A型肉毒杆菌毒素可以用肉毒梭菌Hall A菌株生产，其特征为≥3×107U/mg，A260/A278低于0.60，并且在凝胶电泳时有独特的带型。可以用已知的Shantz方法获得结晶A型肉毒杆菌毒素，如Shantz，E.J.等，Properties and use of Botulinum toxin and OtherMicrobial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.56：80-99(1992)中所述。一般而言，可以通过在合适的培养基中培养A型肉毒梭菌，从厌氧发酵中分离和纯化A型肉毒杆菌毒素复合体。在分离出所述无毒蛋白后，也可以使用所述已知的方法，以获得纯的肉毒杆菌毒素，例如：分子量约150kD、比效力(specific potency)为1-2×108LD50 U/mg或更高的纯化A型肉毒杆菌毒素；分子量约156kD、比效力为1-2×108LD50U/mg或更高的纯化B型肉毒杆菌毒素；和分子量约155kD、比效力为1-2×107LD50U/mg或更高的纯化F型肉毒杆菌毒素。
肉毒杆菌毒素和/或肉毒杆菌毒素复合体可以得自List BiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，California；the Centre for AppliedMicrobiology and Research，Porton Down，U.K.；Wako(Osaka，Japan)，Metabiologics(Madison，Wisconsin)以及Sigma Chemicals of St Louis，Missouri。
纯肉毒杆菌毒素是如此的不稳定，以致于一般不用来制备药用组合物。此外，所述肉毒杆菌毒素复合体例如A型毒素复合体也对由于表面变性、热和碱性条件所致的变性极为敏感。无活性毒素形成可能具有免疫原性的类毒素蛋白。所产生的抗体可以使得患者对毒素注射不应。
关于酶，一般而言，肉毒杆菌毒素的生物活性(它们是胞内肽酶)至少部分依赖于其三维构象。因此，A型肉毒杆菌毒素可通过热、各种化学药品表面伸展(surface stretching)和表面干燥而被解毒。另外，已知通过已知培养、发酵和纯化至药用组合物制剂所用的低得多的毒素浓度而达到的所述毒素复合体的稀释，导致所述毒素被快速解毒，除非存在合适的稳定剂。所述毒素从每毫升毫克量稀释为每毫升含有纳克量的溶液，因为这种大量稀释时比毒性快速丧失而表现出显著的困难。由于所述毒素在含所述毒素的药用组合物配制后可能使用数月或数年，所以所述毒素必须用稳定剂来稳定。用于此目的的唯一成功的稳定剂一直是动物来源的蛋白白蛋白和明胶。正如所指出的，在最终的制剂中存在动物来源的蛋白引起潜在的问题，因为从供体携带的某些稳定的病毒、朊病毒或其它感染性化合物或致病化合物可能污染所述毒素。
此外，将含肉毒杆菌毒素的药用组合物冻干(冷冻干燥)或真空干燥为毒素运输和贮存形式(即用型或由医师重建)所要求的严酷的pH、温度和浓度范围条件中的任何一种，都可能使一些所述毒素解毒。因此，动物来源或供体库蛋白例如明胶和血清白蛋白一直用来稳定肉毒杆菌毒素，并且获得一定的成功。
市售的含肉毒杆菌毒素药用组合物以商品名BOTOX出售(可得自Allergan，Inc.，of Irvine，California)。BOTOX由无菌真空干燥形式包装的纯化A型肉毒杆菌毒素复合体、白蛋白和氯化钠组成。A型肉毒杆菌毒素由在含N-Z胺和酵母膏的培养基中生长的肉毒梭菌Hall菌株的培养物制备。通过一系列酸沉淀，从培养溶液中将A型肉毒杆菌毒素复合体纯化为由活性高分子量毒素蛋白和一种缔合的血凝素蛋白组成的A型肉毒杆菌毒素结晶复合体。将所述结晶复合体重新溶于含有盐水和白蛋白的溶液中，并且在真空干燥之前过滤除菌(0.2微米)。BOTOX可以在肌内注射之前用无菌无防腐剂的盐水重建。每个BOTOX管形瓶含有无菌真空干燥形式的约100单位(U)的A型肉毒梭菌毒素纯化神经毒素复合体、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，而无防腐剂。
为了重建无防腐剂的真空干燥BOTOX无菌生理盐水，通过用合适大小的注射器吸取适量的稀释剂，使用0.9％氯化钠注射液。由于据认为BOTOX由于冒泡或相似的剧烈搅拌而被变性，所以将稀释剂轻轻地注射到管形瓶中。BOTOX在重建后应该在4小时内给予。在此期间，将重建的BOTOX贮存于冰箱(2℃至8℃)。重建的BOTOX是透明无色的，并且无颗粒状物质。将真空干燥的制品贮存于冰箱中5℃或5℃以下。BOTOX在从冰箱中取出管形瓶并重建之后，在4小时内给予。在这4小时期间，可以将重建的BOTOX贮存于冰箱(2℃至8℃)。重建的BOTOX是透明无色的，并且无颗粒状物质。
已有报道，A型肉毒杆菌毒素已经如下用于临床环境：
(1)每剂肌内注射(多块肌肉)约75-125单位的BOTOX，以治疗宫颈张力障碍；
(2)每剂肌内注射约5-10单位的BOTOX，以治疗眉间线(眉部皱纹)(肌内注射5单位到降眉间肌中，以及肌内注射10单位到每块皱眉肌中)；
(3)约30-80单位BOTOX，以通过括约肌内注射耻骨直肠肌治疗便秘；
(4)每块肌肉肌内注射约1-5单位BOTOX，以通过注射上眼睑睑板前侧眼轮匝肌和下眼睑睑板前侧眼轮匝肌治疗睑痉挛。
(5)为了治疗斜视，在外眼肌中肌内注射约1-5单位BOTOX，注射的量基于待注射肌肉的大小和所需肌肉麻痹的程度(即所需的屈光度矫正的量)。
(6)通过在如下5块不同的上肢屈肌中肌内注射BOTOX，治疗中风后上肢强直：
(a)指深屈肌：7.5U至30U
(b)指浅屈肌：7.5U至30U
(c)尺侧腕屈肌：10U至40U
(d)桡侧腕屈肌：15U至60U
(e)肱二头肌：50U至200U。每块上述5种肌肉在同一治疗期间注射，使得通过肌内注射在每个治疗期间患者接受90U至360U的上肢屈肌BOTOX。
(7)为了治疗偏头痛，通过在注射25U后三个月期间偏头痛频率、最大严重程度、相关呕吐和急性药物应用的减少测定，已经表明与溶媒相比，颅骨膜注射(对称注射到眉间肌、额肌和颞肌)25UBOTOX作为偏头痛预防性治疗有显著益处。
已知A型肉毒杆菌毒素在多达12个月内有功效(European J.Neurology 6(Supp 4)：S111-S1150：1999)，以及在某些情况下其功效可长达27个月(The Laryngoscope 109：1344-1346：1999)。然而，常用的肌内注射Botox的时间通常约为3-4个月。
如上所述，已经使用某些肉毒杆菌毒素来治疗各种运动障碍例如痉挛性肌肉病症，导致疼痛缓解。例如，已知应用肉毒杆菌毒素治疗肌肉痉挛，导致痉挛性肌肉反应过强和由于痉挛性肌肉反应继发性产生的疼痛都得到缓解。例如，Cheshire等Pain 1994；59(1)：65-69报道了，肌筋膜疼痛综合征患者在注射A型肉毒杆菌毒素到触发点后疼痛减轻。也参见WO94/15629。据认为，肉毒杆菌毒素A可以通过减轻首先引起或持续引起疼痛的持续肌肉收缩而减轻疼痛。因此，可以由肌肉痉挛或可以伴随肌肉痉挛的疼痛可能是由于所述痉挛引起的局部pH较低所致。肉毒杆菌毒素诱导的面部肌肉麻痹的间接效应是使得所述pH恢复至生理水平，从而作为可能由于外周肉毒杆菌毒素给予所致的运动终板胆碱能去神经支配的继发结果，引起疼痛减轻。
可以用肉毒杆菌毒素治疗与肌肉痉挛、血管障碍、神经痛和神经病相关的偏头痛。Binder的美国专利第5,714,468号，其公开内容通过引用全部结合到本文中。值得注意的是，肌肉痉挛疼痛、过度紧张性肌痛、肌筋膜痛和偏头痛可能全都至少部分由于增加的肌肉紧张或收缩期间肌肉本身产生和释放一种或多种伤害性物质引起的。
A型肉毒杆菌毒素成功地治疗各种各样的临床病症，已经引起了对其它肉毒杆菌毒素血清型的兴趣。已经进行了一项对两种市售A型肉毒杆菌制剂(BOTOX和Dysport)和B型肉毒杆菌毒素和F型肉毒杆菌毒素制剂(都得自Wako Chemicals，Japan)的研究，以测定局部肌肉弱化功效、安全性和抗原性潜力。将肉毒杆菌毒素制剂注射到右侧腓肠肌头中(0.5-200.0单位/kg)，然后采用小鼠足趾外伸记录评分测定(DAS)评价肌肉的弱化。从剂量反应曲线计算ED50值。给另外的小鼠肌内注射，以测定LD50剂量。治疗指数以LD50/ED50计算。不同组小鼠接受后肢注射BOTOX(5.0-10.0单位/kg)或B型肉毒杆菌毒素(50.0-400.0单位/kg)，然后测试肌肉的弱化和增加的水消耗量，后者是推定的口干燥模型。通过每月一次在兔中肌内注射(对于B型肉毒杆菌毒素为1.5ng/kg或6.5ng/kg，或者对于BOTOX为0.15ng/kg))，评价抗原性潜力。对于所有血清型而言，肌肉弱化峰值和持续时间都是剂量相关的。DAS ED50值(单位/kg)如下：BOTOX：6.7，Dysport：24.7，B型肉毒杆菌毒素：27.0-244.0，F型肉毒杆菌毒素：4.3。BOTOX的作用时间比B型肉毒杆菌毒素或F型肉毒杆菌毒素要长。治疗指数值如下：BOTOX：10.5，Dysport：6.3，B型肉毒杆菌毒素：3.2。注射B型肉毒杆菌毒素的小鼠的水消耗量比注射BOTOX的小鼠的水消耗量大，虽然B型肉毒杆菌毒素在弱化肌肉方面效力较低。4只兔子(其中用1.5ng/kg治疗)中的2只以及4只兔子(其中用6.5ng/kg治疗)中的4只在注射4个月后，产生抗B型肉毒杆菌毒素的抗体。在一项单独的研究中，9只BOTOX治疗的兔子中的0只显示出抗A型肉毒杆菌毒素的抗体。DAS结果表明，A型肉毒杆菌毒素的相对峰效能与F型肉毒杆菌毒素相同，而F型肉毒杆菌毒素的相对峰效能比B型肉毒杆菌毒素的相对峰效能大。关于效应的持续时间，A型肉毒杆菌毒素要比B型肉毒杆菌毒素的持续时间长，而B型肉毒杆菌毒素比F型肉毒杆菌毒素的持续时间长。正如治疗指数值所表明，两种商业A型肉毒杆菌毒素制剂(BOTOX和Dysport)是不同的。在后肢注射B型肉毒杆菌毒素后观测到水消耗行为增加，表明临床有效量的这种血清型进入鼠系统循环中。所述结果也表明，为了达到与A型肉毒杆菌毒素相当的效能，必需增加所检查的其它血清型的剂量。增加的剂量可能构成安全性问题。此外，在兔中，B型比BOTOX的抗原性大，可能是由于为达到B型肉毒杆菌毒素的有效量所注射的蛋白质负载较大。Eur JNeurol 1999 Nov；6(Suppl 4)：S3-S10。
肉毒杆菌毒素除了在外周位置具有药理作用之外，也可能在中枢神经系统中有抑制效应。Weigand等Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1976；292，161-165和Habermann，Nauny-Schmiedeberg’sArch.Pharmacol.1974；281，47-56的研究表明，肉毒杆菌毒素能够通过逆向运输上行至脊髓区。因此，在外周位置(例如肌内)注射的肉毒杆菌毒素可以逆向运输至脊髓。然而，所引用论文的作者没能证明所述放射性标记物质是完整的肉毒杆菌毒素。
如上所述，与肌肉病症相关的疼痛例如肌肉痉挛疼痛和与血管障碍、神经痛和神经病相关的头痛可以利用肉毒杆菌毒素得到有效治疗。然而，在用于治疗一系列其它类型疼痛的可利用的方法有明显缺陷。这种疼痛包括例如与肌肉病症无关的疼痛、非头痛性神经痛和神经病性疼痛、组织炎症性疼痛、关节炎症性疼痛、组织炎症性疼痛、癌痛、术后疼痛、撕裂痛、局部缺血性疼痛等。
已经尝试解决这些其它类型的疼痛，但此时其潜在的成功和可能的临床应用尚不确定。例如，Foster等在美国专利第5,989,545号(通过引用全部结合到本文中)公开了与特定靶向部分化学缀合或重组融合的梭菌神经毒素、最好是肉毒杆菌毒素可以用来治疗疼痛。乙酰胆碱
通常，在哺乳动物神经系统中的每种类型神经元仅释放一种类型的小分子神经递质。神经递质乙酰胆碱由脑的许多区中的神经元分泌，但由运动皮质的大锥体细胞、基底神经节中的几种不同的神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统(交感和副交感神经系统)的节前神经元、副交感神经系统的节后神经元和交感神经系统的某些节后神经元特异性地分泌。实质上，仅通向汗腺、竖毛肌(piloerectormuscles)和少数血管的节后交感神经纤维是胆碱能的，因为交感神经系统的大多数节后神经元分泌神经递质去甲肾上腺素。在大多数情况下，乙酰胆碱有兴奋效应。然而，已知乙酰胆碱在某些周围副交感神经末梢有抑制效应，例如迷走神经抑制心搏率。
自主神经系统的传出信号或者通过交感神经系统或者通过副交感神经系统传递至躯体。交感神经系统的节前神经元从位于脊髓的中间外侧角中的节前交感神经元胞体发出。从所述胞体发出的节前交感神经纤维与或者位于椎旁交感神经节中或者位于椎前神经节中的节后神经元形成突触。由于交感神经系统和副交感神经系统的节前神经元都是胆碱能的，因此乙酰胆碱应用于所述神经节将使交感和副交感节前神经元兴奋。
乙酰胆碱激活两种类型的受体-毒蕈碱性受体和烟碱性受体。毒蕈碱性受体存在于受副交感神经系统节后神经元刺激的所有效应细胞中以及存在于受交感神经系统节后胆碱能神经元刺激的效应细胞中。烟碱性受体存在于交感和副交感神经系统节前神经元和节后神经元之间的突触中。烟碱性受体也存在于神经肌接头的许多骨骼肌纤维的膜中。
当小而透明的胞内小泡与突触前神经元细胞膜融合时，从胆碱能神经元中释放出乙酰胆碱。各种各样的非神经元分泌细胞例如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细胞从大的含有致密中心的囊泡分别释放儿茶酚胺和甲状旁腺激素。PC12细胞系是一种大鼠嗜铬细胞瘤细胞克隆，被广泛用作研究交感肾上腺发育的组织培养物模型。肉毒杆菌毒素通过透化(如通过电穿孔)或者通过直接注射所述毒素到所述去神经细胞中，在体外抑制两种类型的细胞释放两种类型的化合物。也已知肉毒杆菌毒素阻断神经递质谷氨酸从皮质突触小体细胞培养物释放。
通过轴突接近肌细胞，在骨骼肌中形成神经肌肉接头。通过神经系统的信号传递在末端轴突形成动作电位，激活离子通道，引起从神经元内突触囊泡中释放神经递质乙酰胆碱，例如在神经肌肉接头的运动终板。乙酰胆碱穿过胞外区而与肌肉终板表面的乙酰胆碱受体蛋白结合。一旦发生了足够的结合，则肌细胞的动作电位引起特定的膜离子通道变化，导致肌细胞收缩。然后，乙酰胆碱从所述肌细胞中释放，并且被胞外区中的胆碱酯酶代谢。代谢物再循环回末端轴突中，以供再加工为其它乙酰胆碱。
因此，需要一种有效的长效的非外科方法来治疗疼痛，尤其是与肌肉病症或头痛无关的疼痛。
                          概述
本发明满足了这种需要，提供一种有效的长效非外科方法来治疗疼痛，尤其是与肌肉病症或头痛无关的疼痛。
本发明范围内的一种治疗疼痛的方法可以包括将神经毒素外周给予哺乳动物的步骤。所治疗的疼痛与肌肉病症无关，例如肌肉痉挛，因为认为本发明发挥作用的机制是通过对外周感觉传入疼痛神经元的抗伤害性效应，而与对运动神经元的效应不同。
所述神经毒素可以包含一个对所述神经毒素基本天然的神经元结合部分。所述神经毒素可以是肉毒杆菌毒素，例如A、B、C1、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素之一。所述肉毒杆菌毒素最好是A型肉毒杆菌毒素。
所述神经毒素可以是具有至少一个氨基酸缺失、修饰或取代的经修饰的神经毒素。另外，所述神经毒素可以至少部分通过重组方法制备。
所述神经毒素的给药量可以为约0.01U/kg和约35U/kg之间的量，所治疗的疼痛在约1个月至约27个月、例如约1个月至约6个月内可以基本上得到缓解。
所述神经毒素的外周给予可以在患者经历的伤害性事件或综合征发作之前进行。另外，所述神经毒素的外周给予可以在患者经历的伤害性事件发作之后进行。
本发明范围内方法的一个详细实施方案可以包括将肉毒杆菌毒素外周给予人类患者从而缓解疼痛的步骤，其中所述疼痛与肌肉痉挛或头痛无关。
本发明范围内的另一方法可以包括将神经毒素外周给予哺乳动物的步骤，其中所述神经毒素是一种多肽，所述多肽包含：(a)一个第一氨基酸序列区，所述序列区包含一个野生型神经元结合部分，所述结合部分基本上完全来源于选自A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素及其混合物的神经毒素；(b)一个第二氨基酸序列区，所述序列区可将所述多肽或其部分有效地转运穿过内体膜；和(c)一个第三氨基酸序列区，所述序列区当被释放到靶细胞的胞质中时具有治疗活性，其中所述疼痛与肌肉痉挛无关。
所述多肽的第一氨基酸序列区可以包含来源于所述神经毒素的重链羧基末端，并且所述神经毒素可以是肉毒杆菌毒素，例如A型肉毒杆菌毒素。
所述多肽的第二氨基酸序列区可以具有来源于选自A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素及其混合物的神经毒素的重链氨基末端。值得注意的是，所述多肽的第二氨基酸序列区可以包括来源于A型肉毒杆菌毒素的毒素重链的氨基末端。
最后，所述多肽的第三氨基酸序列区可以包含来源于选自以下的的神经毒素的毒素轻链：巴氏梭菌(Clostridium beratti)毒素；丁酸梭菌(Clostridium butyricum)毒素；破伤风梭菌(Clostridium tetani)毒素；肉毒梭菌A、B、C1、D、E、F、G型毒素及其混合物。所述多肽的第三氨基酸序列区可以包含来源于A型肉毒杆菌毒素的毒素轻链。
本发明也包括一种改善患者机能的方法，所述方法包括以下步骤：将肉毒杆菌毒素外周给予经历非肌肉病症相关疼痛的患者，从而如根据以下一种或多种因素的改善测定改善患者机能：疼痛减轻、卧床时间减少、听力改善、走动增加、体态更健康以及生活方式有更多的变化。
重要的是，本发明范围内的神经毒素包含一个对神经元细胞表面受体具有特异性亲和性的天然或野生型的结合部分。本发明范围内的神经毒素不包括对于所述神经毒素非天然的神经元靶向部分，因为我们发现，本发明可以有效地实施，而不必对所用的神经毒素的天然或野生型结合部分进行任何修饰或缺失。
因此，在本发明范围内不必要排除应用具有一种或多种非天然靶向部分人工产物或构建体的神经毒素，因为如前所述，我们意外地发现，外周给予依照本发明的神经毒素，即使所述神经毒素不包含非天然神经元靶向部分也可提供显著的疼痛缓解。因此，我们发现了，神经毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)可以在外周给予时，即使所述神经毒素并未人工或操作性地给予任何非天然神经元靶向部分的连接，也提供疼痛的缓解。
出乎意料的是，我们发现，具有野生型神经元结合部分的神经毒素(例如梭菌神经毒素)可以外周给予哺乳动物以治疗疼痛。所述野生型神经元结合部分本来是所述神经毒素的部分。例如，具有其原始野生型神经元结合部分的A型肉毒杆菌毒素可以以约0.01U/kg至约35U/kg的量外周给予，以缓解哺乳动物患者(例如人类患者)经历的疼痛。所用的肉毒杆菌毒素最好以约0.1U/kg至约3U/kg的量外周给予。重要的是，本发明所公开方法的疼痛缓解效应可以平均持续1-6个月，在某些情况下持续更长时间。已报道肉毒杆菌毒素的效应在给予后可以持续多达27个月。
在另一实施方案中，所述治疗疼痛的方法包括给予哺乳动物一种神经毒素，例如梭菌神经毒素，其中所述神经毒素与天然存在的神经毒素至少有一个氨基酸不同。所述神经毒素也具有一个野生型神经元结合部分。
在另一实施方案中，所述治疗疼痛的方法包括给予哺乳动物一种神经毒素，例如梭菌神经毒素，其中所述神经毒素具有一个另一神经毒素亚型的野生型神经元结合部分。
本发明也包括治疗术后疼痛的方法，其中所述疼痛是所实施的外科手术的结果(即所述疼痛至少部分是由于所产生的切口所致)。所述方法可以包括下述步骤：在外科手术之前(即手术前至多10天)、期间或紧接外科手术之后(即不迟于手术后6-12小时)，外周给予有效量的肉毒杆菌毒素，从而缓解或显著缓解术后疼痛。我们的发明范围不包括其中实施外科手术以治疗肌肉痉挛的方法。
我们的发明也包括一种治疗内脏疼痛的方法，包括非系统的局部给予有效量的肉毒杆菌毒素，从而缓解所述内脏疼痛。内脏疼痛是由患者感知的从内脏(即消化系统、呼吸系统、泌尿系统和内分泌系统的器官以及脾、心脏和/或血管)部位发出的疼痛。因此，内脏疼痛包括胰腺、肠、胃和腹肌的疼痛。
本发明范围内的一种治疗疼痛的优选方法包括将神经毒素外周给予哺乳动物的步骤。所治疗的疼痛基本上不是由于肌肉痉挛所致，因为我们意外地发现，本发明范围内的神经毒素可以用来治疗非肌肉痉挛继发性的疼痛。因此，本发明适用于治疗其原因与肌肉病症(例如肌肉痉挛)存在与否无关的疼痛。另外，本发明也适用于并且在本发明范围内包括治疗非肌肉痉挛继发性的疼痛。因此，患者的肌肉可以是痉挛性的或是反应过强，并且患者也经历非肌肉痉挛继发性的、即不是由于肌肉痉挛所引起的疼痛。例如，患者的肢体肌肉可能是痉挛性的，并且患者同时经历躯干疼痛，例如背痛。在该实施例中，本发明范围内的方法可以通过将神经毒素外周(即皮下)给予所述患者的背部而治疗背痛。定义
提供以下定义，所述定义适用于本文：
“轻链”是指梭菌神经毒素的轻链。它可以具有约50kDa的分子量，所述轻链可以称为梭菌神经毒素的L链、L或蛋白水解结构域(氨基酸序列)。
“重链”是指梭菌神经毒素的重链。它可以具有约100kDa的分子量，可以称为H链或H。
“HN”是指分子量可以约为50kDa、来源于梭菌神经毒素H链、并且大约相当于所述H链的氨基末端区段、或对应于所述完整H链中所述片段的部分的片段。认为它包括天然或野生型梭菌神经毒素中参与L链转运穿过胞内内体膜的部分。
“HC”是指来源于梭菌神经毒素H链、大约相当于所述H链的羧基末端区段、或对应于所述完整H链中所述片段的部分的片段(约50kDa)。认为它具有免疫原性，并且包括天然或野生型梭菌神经毒素中参与高亲和性的与运动神经元的突触前结合的部分。
“野生型神经元结合部分”是指所述神经毒素天然的、对神经元上受体表现出特异性结合亲和性的神经毒素的部分。因此，野生型或天然神经元结合部分不包括所述神经毒素非天然的结合部分。
“靶向部分”是指对细胞表面受体具有特异性结合亲和性的分子。所述靶向部分不是梭菌神经毒素的HC或衍生于HC且具有至少一个其氨基酸缺失、修饰或取代的肽。所述靶向部分是非梭菌神经毒素的分子，例如可以是一种缓激肽。
“局部给予”是指通过非系统性途径在痛苦、障碍或感知的疼痛部位或其附近给予。
“外周给予”是指通过非系统性途径给予哺乳动物的外周位置。外周位置一般是指在皮肤下或在骨骼肌内。外周给予包括外周肌内、腺内和皮下给药途径，但不包括静脉给药或口服给药，还不包括任何对中枢神经系统的直接给药。
                             附图
根据以下描述、权利要求书和附图，可以更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中在以下图1和图2中，“注射”是指外周注射或给药。
图1是一剂量反应曲线，显示了本发明范围内的一种缓解在大鼠福尔马林模型中诱发性炎性疼痛达至少5天的方法。X轴表示大鼠中福尔马林模型开始后以分钟计的时间。Y轴表示应用对照(盐水，N＝7)和注射7U/kg(n＝8)、15U/kg(n＝5)和30U/kg(n＝4)浓度的BOTOX(A型肉毒杆菌毒素纯化神经毒素复合物)后抬起并舔注射福尔马林的爪所需的时间。在福尔马林攻击开始之前5天注射BOTOX。
图2是一剂量反应曲线，显示了本发明范围内的一种缓解在大鼠福尔马林模型中诱发性炎性疼痛达至少12天的方法。X轴表示大鼠中福尔马林模型开始后以分钟计的时间。Y轴表示应用对照(盐水，N＝3)和注射3.5U/kg(n＝7)和7U/kg(n＝8)浓度的BOTOX(A型肉毒杆菌毒素纯化神经毒素复合物)后抬起并舔注射福尔马林的爪所需的时间。在福尔马林攻击开始之前12天注射BOTOX。
                           描述
本发明基于这样一个发现：外周给予神经毒素可以达到有效治疗慢性疼痛。值得注意的是，所述神经毒素具有一个野生型或天然神经元结合部分。所治疗的疼痛不是由于肌肉痉挛所致，也不是由于头痛所致。因为所用的神经毒素的长期抗伤害性效应，所以慢性疼痛得以治疗。所述神经毒素的神经元结合部分组分是所选神经毒素天然的神经元结合部分，因为我们发现，本发明可以实施，而无需用非天然或非野生型靶向部分取代野生型神经元结合部分。头痛的治疗不在本发明的范围内，因为外周给予依照本发明的神经毒素的优选部位不包括头部和颈部。
在我们的发现之前，已经应用神经毒素(例如肉毒杆菌毒素)来治疗与各种肌肉病症相关的疼痛。因此，已知肌肉病症(例如肌肉痉挛)可以引起疼痛，并且通过治疗痉挛，也可以缓解所述疼痛。Foster等公开了将与靶向部分连接的神经毒素用于治疗疼痛，也就是说，将梭菌神经毒素的野生型结合部分完全除去，并且用一个靶向部分取代。
我们意外地发现，尚未与神经元靶向部分缀合、连接、结合或融合的神经毒素可以依照本发明的方法外周给予，来治疗疼痛。所治疗的疼痛最好是不是由于肌肉痉挛所致，也就是说所述疼痛不是作为肌肉痉挛的继发性结果而直接引起的。我们的发明可以用来治疗由各种各样的神经病性病症、炎性病症、癌性病症和外伤病症引起的疼痛。
在本发明之前，并不了解神经毒素(例如肉毒杆菌毒素)可以用来有效地治疗不是由于肌肉痉挛或肌肉反应过强性病症引起的疼痛。外周给予神经毒素可以导致疼痛的长期缓解的生理机制尚不清楚。我们注意到，尽管由于肌肉痉挛或肌肉反应过强性病症所致的疼痛可以导致局部pH较低，但本发明却不依赖于并且不需要将局部的低pH水平升高。另外，尽管肌肉痉挛或肌肉反应过强性病症可以由于神经毒素(例如肉毒杆菌毒素)对运动神经元的抗胆碱能效应而得到缓解，但预期本发明对运动神经元没有效应。虽然不希望受限于理论，但我们假设，依照本发明外周给予神经毒素例如肉毒杆菌毒素的一个效应可能是对周围感觉传入神经元的抗伤害性效应。重要的是，在本发明中，疼痛缓解是外周给予神经毒素例如肉毒杆菌毒素时的基本效应，而不是次级效应。
因此，本发明至少部分基于这样一个发现：具有野生型神经元结合部分的神经毒素可以外周给予哺乳动物，以缓解疼痛。依照本发明的神经毒素不与非天然靶向部分偶联。依照本发明的野生型结合部分可以是梭菌神经毒素天然存在的HC区段或基本上完全来源于所述梭菌神经毒素的HC区段的氨基酸序列。
下文所用的“来源于”另一氨基酸序列的氨基酸序列例如野生型结合部分例如HC区段，是指所产生的氨基酸序列完全照其所来源的氨基酸序列复制；或者所产生的氨基酸序列与其所来源的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸缺失、修饰或取代。
依照本发明的一个广泛方面，提供治疗疼痛的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的具有野生型神经元结合部分的神经毒素，例如梭菌神经毒素。在一个实施方案中，所述方法包括给予哺乳动物具有野生型神经元结合部分的神经毒素，所述神经元结合部分是所述神经毒素的原始存在的部分。例如，这种神经毒素可以选自已经具有神经元结合部分的巴氏梭菌毒素和丁酸梭菌毒素。所述神经毒素也可以是破伤风毒素，所述破伤风毒素也具有一个野生型神经元结合部分。给予哺乳动物的神经毒素最好选自具有其自身原始野生型神经元结合部分的A、B、C1、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素。所述方法更优选包括给予具有其原始野生型神经元结合部分的A型肉毒杆菌毒素。所述方法也包括给予哺乳动物两种或更多种上述神经毒素的混合物，以治疗疼痛。
在另一实施方案中，所述方法包括给予哺乳动物一种神经毒素，例如梭菌神经毒素，其中所述神经毒素与天然存在的神经毒素至少一个氨基酸不同。例如，可以将如Biochemistry 1995，34，第15175-15181页和Eur.J.Biochem，1989，185，第197-203页(通过引用全部结合到本文中)中公开的A型肉毒杆菌毒素的变异体给予哺乳动物，以治疗非痉挛相关疼痛。这些变异体也具有野生型神经元结合部分。
在另一实施方案中，提供用于给予哺乳动物神经毒素以治疗非痉挛引起的疼痛的方法，其中所述神经毒素具有另一种神经毒素的野生型神经元结合部分。例如，所述方法包括给予哺乳动物具有B型肉毒杆菌毒素的野生型神经元结合部分的A型肉毒杆菌毒素的步骤。所有其它这类组合都包括在本发明范围内。
在另一广泛的实施方案中，本发明治疗非痉挛相关疼痛的方法包括将所述神经毒素局部外周给予所述哺乳动物实际的或感知的疼痛位置。在一个实施方案中，所述神经毒素皮下给予所感知疼痛位置或其附近，例如慢性疼痛关节或其附近。在另一实施方案中，将所述神经毒素肌内给予所述哺乳动物的疼痛位置或其附近，例如肿瘤或其附近。在另一实施方案中，将所述神经毒素直接注射到哺乳动物关节中，以治疗或缓解引起疼痛的关节炎病症。另外，频繁地重复注射或输注所述神经毒素至外周疼痛位置也在本发明范围内。然而，已知本发明的治疗效应长期持续，所以可能不必频繁注射或输注所述神经毒素。例如，本发明的实施可以通过每次注射为人类提供镇痛效应达2个月或更长时间，例如7个月。
虽然不希望将本发明限于任何操作机制或理论，但认为当局部给予所述神经毒素至外周位置时，它抑制神经递质例如P物质从外周初级感觉末梢释放。如上所述，外周初级感觉末梢释放P物质，可能引起或至少放大疼痛传递过程。因此，抑制其在外周初级感觉末梢的释放将减弱疼痛传递过程。
除了在外周给药位置有药理学作用外，本发明范围内的方法也可能由于将所述神经毒素从外周(即皮下)注射部位逆向运输至中枢神经系统而具有抗伤害性效应。我们已经确定，A型肉毒杆菌毒素可以从外周给药部位逆向运输至脊髓后角。推测所述逆向运输通过初级传入。这一发现与Weigand等，Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1976；292，161-165和Habermann，Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1974；281，47-56的研究一致，所述研究表明，肉毒杆菌毒素能够通过逆向运输上行至脊髓区。因此，据报道肌内注射的A型肉毒杆菌毒素可以从外周初级感觉末梢逆向运输至中枢初级感觉末梢。
我们的发现明显不同于上一段落中所引用论文中的讨论。我们已经发现，在大鼠中，在外周皮下给予肉毒杆菌毒素后，发现肉毒杆菌毒素位于动物的背角，这是C纤维形成突触的位置。皮下注射是在许多双极伤害性神经纤维所位于的位置注射。这些感觉纤维从外周伸展至脊髓的背角。相反，在以上段落中所引用的一篇或多篇论文中，在进行肌内注射毒素后，发现某些放射性标记的肉毒杆菌毒素位于前根。脊髓的前根是单极传出运动神经元所在的位置。因此，现有技术导致这样的预测：可以预测外周肌肉强直是肉毒杆菌毒素从外周逆向运输至脊髓位置的结果。
因此，本领域技术人员一直认为，神经毒素例如肉毒杆菌毒素在哺乳动物脊髓中的出现，将会：(1)在受体中诱导显著的强直，和(2)增进对脊髓和脑功能的有害效应。因此，关于所引述的有害效应(1)：据报道，例如在Williamson等，Clostridial Neurotoxins and SubstrateProteolysis in Intact Neurons，J.of Biological Chemistry 271：13；7694-7699(1996)中报道，破伤风毒素和和A型肉毒杆菌毒素都抑制激发的从胎鼠脊髓细胞培养物释放神经递质甘氨酸和谷氨酸，而Hagenah等，Effects of Type A Botulinum Toxin on the Cholinergic Transmission atSpinal Renshaw Cells and on the Inhibitory Action at Ia InhibitoryInterneurones，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.299，267-272(1977)报道，在实验室制备的麻醉猫中直接脊柱内注射A型肉毒杆菌毒素，抑制CNS闰绍细胞活性。中枢甘氨酸和谷氨酸神经递质释放的抑制以及闰绍细胞活性的负调节推定可能在体内都导致促进显著的运动神经元反应过强，并且跟着发生外周肌肉强直。
关于有害效应(2)：认为破伤风神经毒素通过沿CNS神经元逆向运输而存在于中枢(脊髓)，对脊髓和脑功能发挥显著的负面效应，从而禁忌对具有相关神经毒素、例如肉毒杆菌毒素出现(例如通过逆向运输)在脊髓中的任何要求。值得注意的是，肉毒杆菌毒素和破伤风毒素都由梭菌生产，虽然是由不同的梭菌菌种生产。重要的是，某些研究人员已经报道了肉毒杆菌毒素至少在一定程度上享有破伤风毒素的已注意到的神经元上行特性。参见例如Habermann E.，125I-LabeledNeurotoxin from Clostridium Botulinum A：Preparation，Binding toSynaptosomes and Ascent in the Spinal Cord，Naunyn-Schmiedeberg’sArch.Pharmacol.281，47-56(1974)。
本发明意外地没有遇到有害效应(1)或(2)，可以实施本发明公开的外周(皮下)给药方法，以达到有效且长效地缓解并非由肌肉痉挛所致的疼痛，以及达到普遍改善受治疗患者所经历的生活质量。所述患者经历的疼痛可以由于例如损伤、手术、感染、意外或疾病(包括癌症和糖尿病)引起的疼痛，包括神经病性疾病和疾患，其中所述疼痛主要不是由于肌肉痉挛或张力过强性肌肉病症引起的。
所述神经毒素一旦出现在位于脊髓背角的中枢初级感觉末梢中，则所述神经毒素可以进一步抑制负责传递疼痛信号的神经递质(例如P物质)的释放。这种抑制防止激活脊髓丘脑束中的投射神经元，从而缓解疼痛。因此，由于所述现在发现的所述神经毒素的中枢抗伤害性效应，外周给予所述神经毒素可用作中枢(即脊柱内)给予镇痛的替代方法，从而消除与中枢给予镇痛药相关的并发症。
此外，Habermann Experientia 1988；44：224-226表明，肉毒杆菌毒素可以抑制脑匀浆释放去甲肾上腺素和GABA。这一发现提示，肉毒杆菌毒素可以进入肾上腺素能交感神经末梢和GABA神经末梢。因此，可以将肉毒杆菌毒素给予交感神经系统，以达到长期阻断和缓解疼痛，例如神经病性疼痛。给予神经毒素、最好是A型肉毒杆菌毒素提供了长期阻断的益处，而无永久性功能损害的危险，这对于目前使用的药物而言是不可能的。
所述神经毒素的给药量可以根据待治疗的特定疾病、其严重程度和其它各种患者的变量(包括身高、体重、年龄和对治疗的反应)而在大范围内变动。例如，认为外周疼痛区的范围与神经毒素的注射体积成比例，而对于大多数剂量范围而言，认为镇痛药的量与所注射的神经毒素浓度成比例。此外，给予神经毒素的特定位置可以取决于待治疗的疼痛位置。
一般而言，神经毒素的给药剂量将随待治疗哺乳动物的年龄、出现的病症和体重而变。也会考虑所述神经毒素的功效。
在本发明的一个实施方案中，神经毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)在外周位置的治疗有效量可以为约0.01U/kg和约35U/kg之间的量。给予具有野生型神经元结合部分的神经毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)以在受治疗患者中达到抗伤害性效应的优选给药范围为约0.01U/kg至约35U/kg。外周给予神经毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)以在受治疗患者中达到抗伤害性效应的更优选给药范围为约1U/kg至约15U/kg。低于约0.1U/kg可能引起低于可能的最佳或最长作用时间的所需治疗效应，而高于约2U/kg可能仍引起肌肉松弛的某些症状。外周给予神经毒素(例如A型肉毒杆菌毒素)以在受治疗患者中达到抗伤害性效应的最优选给药范围为约0.1U/kg至约1U/kg。
尽管提供了给药途径和剂量的实例，但一般对于某个病例，由主治医师根据病例来确定合适的给药途径和剂量。这类决定对于本领域技术人员而言是常规技术(参见例如，Harrison’s Principles of InternalMedicine(1998)，Anthony Fauci等编著，第14版，McGraw Hill出版)。例如，依照公开的本发明的神经毒素的给予途径和剂量可以根据例如所选神经毒素的溶解特性以及所感知疼痛强度的标准来选择。
在本发明的另一广泛实施方案中，提供用于治疗非痉挛相关疼痛的方法，所述方法包括给予有效量的神经毒素，其中所述神经毒素是单一的多肽，而不是上述的双多肽。
在一个实施方案中，所述神经毒素是具有三个氨基酸序列区的单一多肽。所述第一氨基酸序列区包括基本完全来源于选自以下神经毒素的神经元结合部分：巴氏梭菌毒素；丁酸梭菌毒素；破伤风梭菌毒素；肉毒梭菌A、B、C1、D、E、F和G型毒素。所述第一氨基酸序列区最好来源于毒素重链的羧基末端HC。更优选所述第一氨基酸序列区来源于A型肉毒杆菌毒素的HC。
所述第二氨基酸序列区可有效地将所述多肽或其部分转运穿过内体膜而进入神经元的胞质。在一个实施方案中，所述多肽的第二氨基酸序列区包含来源于选自以下神经毒素的重链氨基末端HN：巴氏梭菌毒素；丁酸梭菌毒素；破伤风梭菌毒素；肉毒梭菌A、B、C1、D、E、F和G型毒素。所述多肽的第二氨基酸序列区最好包含来源于A型肉毒杆菌毒素的毒素重链的氨基末端HN。
所述第三氨基酸序列区在被释放到靶细胞或神经元的胞质中时具有治疗活性。在一个实施方案中，所述多肽的第三氨基酸序列区包含来源于选自以下神经毒素的毒素轻链L：巴氏梭菌毒素；丁酸梭菌毒素；破伤风梭菌毒素；肉毒梭菌A、B、C1、D、E、F和G型毒素。所述多肽的第三氨基酸序列区最好包含来源于A型肉毒杆菌毒素的毒素轻链L。
在一个实施方案中，所述多肽包含：一个来源于破伤风毒素HC的第一氨基酸序列区、一个来源于B型肉毒杆菌毒素HN的第二氨基酸序列区和一个来源于A型肉毒杆菌毒素L链的第三氨基酸序列区。在一个优选实施方案中，所述多肽包含：一个来源于B型肉毒杆菌毒素HC的第一氨基酸序列区、一个来源于A型肉毒杆菌毒素HN的第二氨基酸序列区和一个来源于A型肉毒杆菌毒素L链的第三氨基酸序列区。所有其它的这类组合都包括在本发明范围内。
在另一实施方案中，所述多肽包含：一个来源于A型肉毒杆菌毒素HC的第一氨基酸序列区，其中所述氨基酸序列具有至少一个氨基酸缺失、修饰或取代；一个来源于A型肉毒杆菌毒素HN的第二氨基酸序列区；和一个来源于A型肉毒杆菌毒素L链的第三氨基酸序列区。所有其它的这类组合都包括在本发明范围内。
如上所述，这些多肽是单链，并且可能功效不如所需的那样强。为了提高其功效，可以用蛋白水解酶例如胰蛋白酶切下所述第三氨基酸序列区。可以将所述独立的第三氨基酸序列区通过一个二硫桥再连接于所述原始多肽。在一个实施方案中，所述第三氨基酸序列区在所述第三氨基酸序列区再连接于所述原始多肽。在一个优选实施方案中，将所述第三氨基酸序列区再连接于所述第二氨基酸序列区。
如果使用未经修饰的神经毒素来治疗如本文所述的非痉挛相关疼痛，则可以通过培养合适的细菌菌种来获得所述神经毒素。例如，可以通过建立肉毒梭菌的培养物并在发酵罐中培养所述培养物，然后依照已知方法收获并纯化发酵混合物，可以获得A型肉毒杆菌毒素。所有所述肉毒杆菌毒素血清型最初都作为无活性单链蛋白合成，所述单链蛋白必须经蛋白酶切割或产生缺口，以变为神经活性蛋白。生产肉毒杆菌毒素A和G血清型的细菌菌株具有内源蛋白酶，因此可以从细菌培养物中回收主要为其活性形式的A和G血清型。相反，肉毒杆菌毒素C1、D和E血清型是由非蛋白水解性菌株合成的，因此当从培养物中回收时通常是未活化的。B和F血清型既由蛋白水解性菌株生产，也由非蛋白水解性菌株生产，因此可以以活性形式或无活性形式回收。然而，即使是生产例如B型肉毒杆菌毒素的蛋白水解性菌株，也仅切割所生产毒素中的一部分。有缺口分子与无缺口分子的实际比例取决于孵育的时间长度和培养温度。因此，一定百分比的任何制剂、例如B型肉毒杆菌毒素制剂可能是无活性的，这可能解释了已知与A型肉毒杆菌毒素相比B型肉毒杆菌毒素的功效显著较低。临床制剂中存在无活性的肉毒杆菌毒素分子将影响与抗原性增加相关的所述制剂的总蛋白负荷，而不影响其临床功效。另外，已知与相同剂量水平的A型肉毒杆菌毒素相比，B型肉毒杆菌毒素在肌内注射时活性时间较短，并且功效也较低。
如果依照本发明使用经修饰的神经毒素来治疗非痉挛相关疼痛，则可以用重组技术来生产所需的神经毒素。所述技术包括下述步骤：从天然来源或合成来源获得遗传物质，所述遗传物质编码一个神经元结合部分、一个有效转运所述神经毒素或其部分的氨基酸序列和一个当被释放到靶细胞(最好是神经元)的胞质中时具有治疗活性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所述遗传物质编码梭菌神经毒素、经修饰的梭菌神经毒素及其片段的HC、HN和L链。通过首先将所述遗传构建体与一种克隆载体(例如噬菌体或质粒)融合，将所述遗传构建体掺入到宿主细胞中以进行扩增。然后将所述克隆载体插入到宿主最好是大肠杆菌中。在所述重组基因在宿主细胞中表达后，可以采用常规技术分离所产生的蛋白质。
尽管重组技术可供生产经修饰的神经毒素，但重组技术也可以用来生产未经修饰的神经毒素，例如天然存在的A型肉毒杆菌毒素，因为已知A型肉毒杆菌毒素的遗传序列。
重组生产这些神经毒素有许多好处。例如，用厌氧梭菌培养物生产神经毒素是一种烦琐且费时的方法，包括涉及几个蛋白沉淀步骤和延长且重复结晶所述毒素或者几个柱层析阶段的多步骤纯化方法。重要的是，产物的高毒性要求所述方法必须在严格防范下进行(BL-3)。在发酵过程中，内源梭菌蛋白酶通过所谓产生缺口的过程活化经折叠的单链神经毒素。这涉及从单链中除去大约10个氨基酸残基，产生其中两条链仍通过链内二硫键共价连接的双链形式。
有缺口的神经毒素比无缺口形式的活性高得多。缺口的量和精确位置随生产所述毒素的细菌的血清型而变。单链神经毒素活化的差异以及因此有缺口毒素的产量是由于特定菌株所产生的蛋白水解酶活性的类型和量的变异引起的。例如，99％以上的A型肉毒梭菌单链神经毒素被Hall A肉毒梭菌菌株活化，而B型和E型菌株产生活化量较低(根据发酵时间为0-75％)的毒素。因此，成熟神经毒素的高毒性在作为治疗药的神经毒素的商业生产中起重要作用。
因此，工程梭菌毒素的活化度是生产这些物质的一个重要考虑因素。如果神经毒素(例如肉毒杆菌毒素和破伤风毒素)能够在快速生长的细菌(例如异源大肠杆菌细胞)中作为相对无毒性单链(或毒性降低的单链)高产量地重组表达，然后将其安全、容易地分离并且简单地转化为全活性形式，则将会有很大的优势。
由于安全性是首要关注的因素，因此先前的研究集中在在大肠杆菌中表达并且纯化破伤风毒素和肉毒杆菌毒素的各个H链和L链；这些分离的链本身是无毒的；参见Li等，Biochemistry 33：7014-7020(1994)；Zhou等，Biochemistry 34：15175-15181(1995)，所述文献通过引用结合到本文中。在分别生产这些肽链后，可以在严格控制的条件下通过氧化二硫键，使所述H链和L链结合，形成神经麻痹性双链。
已知由肌肉痉挛引起的(即继发性的)术后疼痛可以通过术前注射A型肉毒杆菌毒素得到缓解。Developmental Medicine & ChildNeurology 42；116-121；2000。相反，本发明包括一种用于通过术前或围手术期外周给予肉毒杆菌毒素治疗术后疼痛的方法，其中所述疼痛不是因肌肉痉挛引起的。
因此，可以或者在手术期间或者在手术前至多约10天(其中所述手术与痉挛性肌肉病症的矫正或治疗无关)，通过在患者真皮中的预期切口部位或其附近大剂量注射约20单位至约300单位肉毒杆菌毒素例如A型肉毒杆菌毒素，局部外周给予患者肉毒杆菌毒素。所述肉毒杆菌毒素注射可以是皮下注射或肌内注射。所述手术的实施不是为了治疗或缓解由肌肉反应过强或张力过强引起的疼痛，因为我们已经意外地发现，不是由于肌肉痉挛引起的许多类型的疼痛可以通过实施我们公开的本发明得到显著的缓解。
按照本发明，为了缓解术后疼痛，可以按照本发明，通过外周给予约0.01U/kg至约60U/kg肉毒杆菌毒素(例如A或B型肉毒杆菌毒素)，治疗计划进行手术以除去肿瘤、骨移植、骨置换、探察性手术、伤口缝合、整容手术例如吸脂、或可能的需要在患者真皮和/或通过患者真皮产生一处或多处切口的各种各样其它类型(非肌肉疾病治疗)外科手术中任一种的患者。显著的术后疼痛缓解持续时间可以为约2个月至约6个月或更长时间。
本发明范围内的方法可以达到改善患者机能。“患者机能改善”可以定义为根据多种因素测量的改善，所述因素例如疼痛减轻、卧床时间减少、走动增加、体态更健康、生活方式有更多变化和/或可以通过正常肌肉张力得以愈合。患者机能改善与生活质量改善(QOL)同义。QOL可以用例如已知的SF-12或SF-36健康调查评分程序来评价。SF-36以下述八个项目评价患者的身体和精神健康状况：机体功能、由于机体问题引起的作用限制、社交功能、机体疼痛、总体心理健康状况、由于情感问题引起的作用限制、活力和总体健康感觉。可以将所获得的评分与可利用的关于各种一般群体和患者群体的公开数值进行比较。
                        实施例
以下非限制性实施例为本领域技术人员提供了本发明范围内的治疗非痉挛相关疼痛的具体优选方法，但这些实施例不是限制本发明的范围。在以下实施例中，可以进行神经毒素的各种模式的非系统给药。例如，通过肌内大剂量注射、通过在真皮的疼痛部位和疼痛区多次皮下注射或者通过植入控释植入物。
                        实施例1
          通过外周给予A型肉毒杆菌毒素缓解疼痛
进行两组实验。在两组实验中都使用Sprague-Dawley大鼠(约300-约350克)。两组实验中所用的神经毒素是BOTOX(A型肉毒杆菌毒素纯化神经毒素复合物)。在第一组实验中有4个治疗(剂量)组：对照(注射盐水)大鼠(n＝4)、7UBOTOX/kg大鼠(n＝8)、15UBOTOX/kg大鼠(n＝5)和30UBOTOX/kg大鼠(n＝4)。对于对照大鼠，在动物后爪足趾表面皮下注射25微升0.9％盐水溶液。BOTOX的给药部位和给药途径与注射盐水的对照组相同。
在或者注射盐水或者注射BOTOX后5天，在所有4组的每只大鼠先前注射盐水或BOTOX的部位，注射50微升5％福尔马林。然后以5分钟的间隔，记录1小时内受试动物抬起/舔肢体的情况。
第二组实验包括与第一组实验相同的方案。在所述第二组实验中有3个治疗(剂量)组：对照(注射盐水)大鼠(n＝3)、3.5U/kg大鼠(n＝7)和7U/kg大鼠(n＝8)；并且在最初注射BOTOX或盐水后第12天进行福尔马林试验。
这两组实验的结果分别示于图1和图2中。开始的5-10分钟可以被称为1期，然后是2期。如图1和图2中所示，在注射后5天和12天时，在BOTOX治疗动物中有显著的剂量依赖性疼痛缓解。
                       实施例2
         外周给予肉毒杆菌毒素以缓解非痉挛性疼痛
一位46岁的妇女在三角肌区出现由于关节炎性病症引起的局部疼痛。所述肌肉并未痉挛，也没有表现出张力过强性病症。该患者通过大剂量肌内注射约50单位至200单位的A型肉毒杆菌毒素进行治疗。在给予神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。显著的疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。在肩、臂和手由于骨质疏松、关节固定、冠状动脉闭锁不全、颈骨关节炎、局部性肩部疾病或者较长时间卧床休息引起的疼痛同样可以得到治疗。
                          实施例3
            外周给予神经毒素以治疗治疗后神经痛
治疗后神经痛是最为难治的慢性疼痛问题之一。经历这种折磨人的痛苦过程的患者常常是老年人，患有致虚弱性疾病，并且不适于主要的干涉操作。根据疱疹愈合病灶的外观以及患者的病史，可容易地进行诊断。所述疼痛是强烈的，并且在情感上是痛苦的。治疗后神经痛可以在任何部位发生，但最常发生于胸部。
一位76岁男性患有治疗后类型的疼痛。这种疼痛局限于腹部。该患者通过在腹部大剂量皮下注射约50单位至200单位的A型肉毒杆菌毒素进行治疗。在给予神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。显著的疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。
                        实施例4
           外周给予神经毒素以治疗鼻咽肿瘤疼痛
这些肿瘤最通常是鳞状细胞癌，通常位于咽隐窝中，并且可以侵袭颅底。面部的疼痛是经常性的。其性质上是时常的钝痛。
一位35岁男性患有鼻咽肿瘤类型的疼痛。据报告在左颊下部疼痛。该患者通过在所述颊部大剂量肌内注射约10单位至约35单位的A型肉毒杆菌毒素进行治疗。在给予神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。显著的疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。
                        实施例5
           外周给予神经毒素以治疗慢性炎性疼痛
一位45岁患者在胸部有慢性炎性疼痛。该患者通过大剂量肌内注射约50单位至200单位的A型肉毒杆菌毒素进行治疗。在给予神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。显著的疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。
                        实施例6
          外周给予神经毒素以治疗烧伤所致疼痛
一位51岁患者在手臂严重的广泛1度或2度烧伤后经历疼痛。该患者通过在手臂大剂量皮下注射约30单位至200单位的A型肉毒杆菌毒素进行治疗。在给予神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。显著的疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。
                        实施例7
          外周给予神经毒素以治疗关节疼痛
一位63岁患者患有关节炎引起的关节疼痛。该患者通过在疼痛的关节区中大剂量肌内注射约30单位至150单位的A型肉毒杆菌毒素进行治疗。在给予神经毒素后1-7天内，患者的疼痛得到显著缓解。显著的疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。
                        实施例8
         外周给予神经毒素以治疗术后疼痛
一位39岁患者从手术前1小时至10天，通过在预期的患者真皮切口部位或其附近大剂量注射或皮下注射，局部外周给予约20单位至约300单位的肉毒杆菌毒素、例如A型肉毒杆菌毒素。肉毒杆菌毒素注射可以是皮下注射或肌内注射。该手术的实施，不是为了治疗或缓解肌肉病症，例如肌肉反应过强或张力过强。显著的术后疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。
                        实施例9
               给予神经毒素以治疗内脏疼痛
一位46岁男性患者患有病因不明、发自内脏的慢性腹部疼痛。推测为肿瘤或导管狭窄。皮下或器官内(在感知疼痛的部位)给予肉毒杆菌毒素，例如约20单位至约300单位的A型肉毒杆菌毒素。在1-7天内，所述疼痛得到显著缓解。显著的疼痛缓解的持续时间约为2-6个月。
尽管已经在某些优选方法方面详细描述了本发明，但在本发明范围内的其它实施方案、形式和修改都是可行的。例如，各种各样的神经毒素可以有效地用于本发明方法。另外，本发明包括缓解非肌肉病症相关疼痛的外周给药法，其中两种或更多种神经毒素(例如两种或更多种肉毒杆菌毒素)可以同时或连续给予。例如，可以给予A型肉毒杆菌毒素直至丧失临床反应或产生中和抗体，然后给予E型肉毒杆菌毒素。或者，可以局部给予肉毒杆菌毒素A-G血清型中的任何两种或更多种的组合，以控制所需治疗效果的产生和持续时间。此外，可以在给予所述神经毒素之前、同时或之后给予证明有辅助效应的非神经毒素化合物，例如在所述神经毒素(例如肉毒杆菌毒素)开始发挥其治疗效应之前，增强或更快产生去神经作用。

Claims (27)

1.一种治疗疼痛的方法，所述方法包括将神经毒素外周给予哺乳动物的步骤，其中所治疗的疼痛与肌肉痉挛无关。
2.权利要求1的方法，其中所述神经毒素包含一个对于所述神经毒素基本为天然的神经元结合部分。
3.权利要求1的方法，其中所述神经毒素是一种肉毒杆菌毒素。
4.权利要求1的方法，其中所述神经毒素是选自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌毒素。
5.权利要求1的方法，其中所述神经毒素是A型肉毒杆菌毒素。
6.权利要求1的方法，其中所述神经毒素是具有至少一个氨基酸缺失、修饰或取代的经修饰的神经毒素。
7.权利要求1的方法，其中所述神经毒素至少部分通过重组方法生产。
8.权利要求1的方法，其中所述神经毒素的给药量为约0.01U/kg至约35U/kg。
9.权利要求1的方法，其中所述疼痛基本上缓解达约1个月至约6个月。
10.权利要求1的方法，其中所述外周给药步骤在所述哺乳动物经历的伤害性事件或综合征发生之前进行。
11.权利要求1的方法，其中所述外周给药在所述哺乳动物经历的伤害性事件发生之后进行。
12.一种缓解疼痛的方法，所述方法包括将肉毒杆菌毒素外周给予人类患者从而缓解疼痛的步骤，其中所述疼痛与肌肉病症无关。
13.权利要求12的方法，其中所述神经毒素是选自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌毒素。
14.一种治疗疼痛的方法，所述方法包括将神经毒素外周给予哺乳动物的步骤，其中所述神经毒素是一种多肽，所述多肽包含：
(a)一个第一氨基酸序列区，所述序列区包含一个野生型神经元结合部分，所述结合部分基本上完全来源于选自A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素及其混合物的神经毒素；
(b)一个第二氨基酸序列区，所述序列区可将所述多肽或其部分有效地转运穿过内体膜；和
(c)一个第三氨基酸序列区，所述序列区当被释放到靶细胞的胞质中时具有治疗活性，其中所述疼痛与肌肉痉挛无关。
15.权利要求14的方法，其中所述多肽的第一氨基酸序列区包含来源于所述神经毒素的重链的羧基末端。
16.权利要求14的方法，其中所述神经毒素是A型肉毒杆菌毒素。
17.权利要求14的方法，其中所述多肽的第二氨基酸序列区包含来源于选自A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素及其混合物的神经毒素的重链的氨基末端。
18.权利要求14的方法，其中所述多肽的第二氨基酸序列区包括来源于A型肉毒杆菌毒素的毒素重链的氨基末端。
19.权利要求14的方法，其中所述多肽的第三氨基酸序列区包含来源于选自以下的神经毒素的毒素轻链：巴氏梭菌(Clostridiumberatti)毒素；丁酸梭菌(Clostridium butyricum)毒素；破伤风梭菌(Clostridium tetani)毒素；A、B、C1、D、E、F、G型肉毒杆菌毒素及其混合物。
20.权利要求14的方法，其中所述多肽的第三氨基酸序列区包括来源于A型肉毒杆菌毒素的毒素轻链。
21.一种改善患者机能的方法，所述方法包括以下步骤：将肉毒杆菌毒素外周给予经历非肌肉病症相关疼痛的患者，从而根据以下一种或多种因素的改善而确定，改善患者机能：疼痛减轻、卧床时间减少、听力改善、走动增加、体态更健康以及生活方式有更多的变化。
22.一种治疗术后疼痛的方法，所述方法可以包括下述步骤：在外科手术之前、期间或紧接外科手术之后，外周给予有效量的肉毒杆菌毒素，从而缓解术后疼痛，其中所述外科手术的实施不是为了治疗肌肉痉挛。
23.一种治疗内脏疼痛的方法，所述方法包括非系统性地局部给予有效量的肉毒杆菌毒素、从而缓解内脏疼痛的步骤。
24.一种治疗疼痛的方法，所述方法包括将神经毒素外周给予哺乳动物的步骤，其中所述疼痛基本上不是由于肌肉痉挛引起的。
25.权利要求24的方法，其中所述神经毒素是一种肉毒杆菌毒素。
26.权利要求24的方法，其中所述疼痛不是肌肉痉挛继发的。
27.权利要求24的方法，其中所述外周给药是皮下给予所述神经毒素。
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