TWI282282B - Method for treating pain by peripheral administration of a neurotoxin - Google Patents

Description

1282282 五 、發明説明（ Α7 Β7 本發明是有關治療疼痛之方法。特言之，本發明是有 關，以周邊投予神經性毒素以治療疼痛之方法。. 身體上的許多失調’若非大多數，均會引起疼痛。當構 成皮膚中以及某些内部組織憎痛受體的自由態神經末梢 接受到機械，熱，化學或其他有害刺激時，通常會感覺到 疼痛。疼痛受體可沿著傳入神經元將訊號傳送至中央神經 系統，且因此到達腦部。 疼痛的原因包括發乂，傷害，疾病，肌肉的痙攣及神經 病里狀況或症狀之發作。治療無效的疼痛，可因限制功 能，減少移動性，更複雜之睡眠及劇烈地干擾生活品質而 更加禍害到患者。 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 ii---丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

*1T 肌肉痙攣會導致機械敏感性疼痛受體之刺激，由是造成 疼痛的感知。因此疼痛可肇因自或可起因於肌肉痙攣。另 外，痙攣可因壓縮至血管而間接刺激疼痛受體，造成組織 中絕血，其可再釋出疼痛謗生物質，其刺激疼痛受體可造 成疼痛的感知。再者，肌肉痙攣可造成局部ΡΗ値減低， 其可被感知，或可發生疼痛訊號。因此，疼痛可以是肌肉 痙攣或肌肉張力過強的繼發事件。 當組織受損時可發生發炎性疼痛，也可始自手術或有害 的物理，化學或熱量事件，或因生物性作用物感染所致: 當組織受損時，可自受損組織中釋出内源性疼痛謗生物質 之宿主，如血管舒緩激肽及組織胺。疼痛謗生物質可與感 覺神經末端上之受體結合，由是啓動傳入疼痛訊號。 -4- 1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2 ) 另外，疼痛謗生物質可自感受傷害的傳入末端釋出，且 自感覺末端釋出之神經肽可加重發炎反應。因此在發炎 中，可能有肽能周邊纖維之長出及肽量之增加，.且許多纖 維顯π出有物質P (SP)及降血鈣素基因相關肽（CGRp)之共 存現象。物質P可謗生内皮細胞之收縮，其再造成血漿之 外溢，’以令其他物質（舒緩激肽，ATp組織胺）可趨近受傷 部位及傳入神經末端。由感覺神經末端所釋出之物質P也 可使肥大細胞去粒化。此過程被視爲是神經源性發炎中的 個重要因素，此乃因發炎性介體，如如組織胺及5瘦色 胺之釋出，及蛋白水解酵素之釋出，其可催化舒缓激肽之 產製。CGRP顯然不會產生血漿外溢，但是一種有力的血 管擴張劑，且也可與SP及其他發炎性介體協同地作用以 加強血漿外溢。上列的所有介體或可敏化感受傷害受體或 可產生疼痛。 在一級感覺傳入神經元活化之後，感覺訊號轉導的下一 步驟可爲射出神經元之活化，其經由脊髓腦幹將訊號攜至 中樞神經系統更高邵份，如間腦核。這些神經元之細胞體 (和顧神經有關不同的）位在脊柱之背角。在此吾等可在一 級傳入及射出神經元間發現胞突接合。背角組織成平板系 列，其可層疊，其中I號平板最背側繼之是Π號平板， 等。不同類型的一級傳入在不同平板中形成胞突接合。於 角質一級傳入方面，C-纖維可在I及π號平板中製成胞 突接合，Α δ-纖維在I，II及V號平板，而Α β-纖維在 III，IV及V號平板。較深平板（ν-νπ，X)涉及由由較 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1282282 A7 P-—___B7 五、發明説明（3 ) 冰部組織，如肌肉及内藏，到之感覺路徑。 在一級傳入神經元及射出神經元間之胞突接合處，主要 的神經遞質是物質P，穀胺醯胺，CGRP及神經肽γ。這 些胞突接合之傳遞效率，可經由下降路徑及在脊柱中局部 内部神經元而改變。這些調控神經元可釋出許多介體，其 或具.抑制性（如類鴉片肽，甘胺酸）或具刺激性（如氧化 氮，激膽囊肽），以加強或減低對感覺知曉之機制。 當受損組織修復，或疼痛謗生刺激物除去時，雖然發炎 疼痛通常是可逆的及消退的，本發明治療發炎疼痛的方^ 仍有許多的缺點及缺失。因此，治療疼痛症狀的鎮痛藥物 或治療發炎疼痛肇因之抗生素，典型的口服，腸外或局部 投予，可造成藥物廣泛的全身性分佈及非欲求的副作用。 此外，目前對發炎疼痛之治療常有藥物效力期過短之苦， • 必需依賴經常的再投藥，可能會造成藥物抗性，抗體生成 及/或藥物依賴性及成瘾性，其均令人不滿意。再者，藥 物投予頻繁增加病人療程費用，而且病人必須記得給藥程 序。 治潦發炎及肌肉疼痛之實例包括非類固醇抗炎藥 (NSAIDS)，包括阿司匹靈及異丁苯丙酸；及類鴉片 啡。 NSAIDs經由抑制受損組織釋出之前列腺f之產| ^ 舒緩疼痛。已W前列腺素是疼痛及發炎的周邊之介體， 如在關節炎疾病中，且其濃度之減低可對病人提供舒 已有建議指出’前列腺涉及於脊柱及腦中疼痛之調介，且 -6- 本纸張尺度適用中國國家標準^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4 可解釋在某些不涉及發炎或周邊組織損害的疼痛狀況下， NSAIDS _痛作用。然而，前列腺素只是疼痛數個U介體 中（-。如此，NSAIDs #一個活性上限，超過.此再增加 劑量也不再舒緩疼痛。再者，因有副作用也限制了應用 性。例如，NSAIPs會引起胃腸道之刺激，長期使用會造. 成腸道廣泛⑽的生成。此點在經常以NSAms治療其關 節炎狀況的老年患者中特別顯著。 類鴆片之治療作用是在脊柱。類鸦片可抑制，級感覺傳 入（王要疋C-纖維）及射出神經元間神經傳送之效率。其 可經由延長這些胞突接合各元素之過度極化作用而完成:、 在舒緩急性疼痛及慢性惡性疼痛大多數型式上，類稿片之 使用是有效的。然而，仍有許多的慢性惡性疼痛狀況，其 對類鴉片鎮痛是部份或完全有抵抗力的，特別在因腫瘤形 成所致之神經壓迫上特別是如&。不幸地，類牙鳥片也有不 良的副作用’包括：（1)呼吸系統之抑制；（2)便秘，及（3) 包括鎮靜及欣快感之精神活性作用。這些副作用發生之劑 量和產生鎮痛的類似，且因此限制可投予至病人之劑量。 另外，類鴉片如嗎啡及海洛因爲熟知之成癮性藥物，其會 造成身體的依賴性，也涉及耐性之生成。因有耐性之生 成爲了產生相同鎮痛作用所必需之藥物劑量會隨時間而 增加。此可造成一種狀況，就是爲了舒緩疼痛所必要的劑 里，由於先前所提及之副作用是致命的。 雖然由發炎及肌肉痙攣所致之疼痛可由一級感覺神經元 游離末端之機械或化學刺激所啓動，神經病變性疼痛並不 I VI— - I- m -------------- ll _ d (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

1282282 - A7 B7 五、發明説明（5 ) 需對周邊游離神經末端有啓動刺激。神經病變性疼痛是一 種持續性或慢性疼痛狀況，其可由對神經系，周邊神經， 背根神經節，背根，或中樞神經系統之傷害而造成。 神經病變性疼痛症狀包括痛覺異常，各種神經痛如疽療 後神經痛及三叉神經痛，假痛，及複雜的區域性疼痛症 狀，如反射交感營養不良及灼痛。灼痛常有之特徵是自發 性的灼傷疼痛伴有痛覺過敏及痛覺異常。 悲慘的此中對已確立之神經病變疼痛，並無適當，可預 言的及特異的治療方法（Woolf C. et al·，Neuropathic Pain: Aetiology, Symptoms, Mechanisms, and Management, Lancet 1999; 353: 1959-64)，因爲目前對神經病變性疼痛之治療方法僅 試圖幫助病人克服心理學或職業療法，而非減低或消除所 經歷到之疼痛。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，目前治療神經病變性疼痛的方法包括針對起點， 周邊神經，神經叢，背根，及交感神經系，投予局部麻醉 劑阻斷。然而，這些治療僅有短的抗感受傷害作用。另 外，長效的鎮痛處理方法，如經由驗注射或冷康療法之阻 斷方式，均會造成不可逆功能破壞之大危險性。再者，長 期硬膜外或椎管内（總稱爲π椎管内π )投予藥物，如可樂寧 (clonidine)，類固醇，類牙烏片或米峻蘭（midazolam)具有顯著 ,的副作用及可置疑的效力。 肉毒样菌毒素 厭氧，革蘭氏陽性菌肉毒梭菌（肉毒样菌），可產生強力 的多肽神經毒素，肉毒毒素，其可在人類及動物中造成神 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 Δ7 _ A 7 B7 五、發明説明（6 ) 經麻痒性疾病，稱爲肉毒样菌病。肉毒桿菌的胞子見於土 壤中，且可在家用罐頭未適度滅菌及密封之食物容器中生 長，此爲許多肉毒菌病例之病因。肉毒菌病的影響通常在 吃下爲肉毒桿菌培養物或孢子所感染之食物後18至36小 時出現。肉毒毒素可表觀上未減弱下通過腸道内襯，並侵 犯周邊運動神經元。肉毒毒素中毒之症狀，可由難以行 走，呑嚥及説話進展至呼吸道肌肉之麻痒及死亡。 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 已知A型肉毒毒素是人類已知最致命性之天然生物作用 物。約50微微克市售的A型肉毒毒素（經純化的神經毒素 複合物）1，是老鼠的LD5。（即1單位）。（單位的BOTOX® 含有約50微微克的A型肉毒毒素複合物。令人感興趣 的，就莫耳濃度基礎而言，A型肉毒毒素的致死率約爲白 喉的1.8兆倍，較氰化鈉致死率強約600百萬倍，較眼鏡 蛇毒素強約30百萬倍，較霍亂又強約12百萬倍。Singh， Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, pages 63-84 (chapter 4) of Natural Toxins II, edited by B.R. Singh et al.? Plenum Press, New York (1976)(其中所陳述的0.3毫微克A型肉毒毒素 LD5〇相當於1單位，是針對約0·05毫微克BOTOX®等於1 單位之事實而校正的）。將1單位的肉毒毒素定義爲，將 其腹膜内注入各重約18至20克之雌性，Swiss Webster老 ,鼠時之LD50値。 1 可自 Allergan，Inc·，of Irvine，California 取得，商標品稱爲 BOTOX® (100 單位 vials) 0 可鑑疋出七種免疫學上不同的肉毒神經毒素，這些分別 -9- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7五、發明説明（7 ) 是A，B，C，D，E，F及G肉毒神經毒素血清型， 其各自可由型式一特異的抗體中和所區別。不同的肉毒毒 素血清型因受害動物種類不同而異，且所涉及之麻瘤嚴重 性及作用期也有異。例如，已有所決定知，A型肉毒毒素 較B型強500倍，可由在大鼠中產生麻痺之速率來偵測。 另外，，已決定知B型肉毒毒素在480單位/公斤之劑量下 於靈長類是無毒的，其是A型肉毒毒素靈長類LD5〇的約 12倍。肉毒毒素可以高親和力表觀上結合至膽鹼能運動 神經元，可轉位至神經元並阻斷乙ai膽驗之釋出。 估不論血清型，毒素中毒之分子機制似乎是相似的，且 涉及至三個步驟或階段。在第一步驟時，毒素經由重鏈， Η鏈，及細胞表面受體間之特異交互作用，結合至標的神 經元之突觸前膜上；受體在不同的肉毒毒素型式上各異且 破傷風毒素也不同。Η鏈之羧基末端片段，Hc，在毒素 對準至細胞表面上十分重要。 在第二步驟，毒素可穿越中毒細胞之漿膜。毒素先經由 受體一調介之細胞攝粒作用而吸進，再形成含有毒素之内 囊胞。毒素再由内囊胞脱逃至細胞之胞質。此步驟被視爲 由Η鏈之胺基末端片段所調介，HN，其可在約5.5以下 之pH下反應而啓動毒素之構型變化。已知内囊胞具有一 ,個質子泵，其可減低内囊胞内之pH値。構型的轉移可曝 露出毒素中之疏水性殘基，令毒素本身可包埋在内囊胞膜 之内。毒素（或最少是輕鏈）再經由内囊胞膜轉位至胞質之 内0 -10- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) d. 訂

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 A7 B7 五、發明説明（8 ) 肉毒毒素活性機制的最後步驟似乎涉及連接重鏈，Η 鏈，及輕鏈，L鏈之二硫化物鍵之還原作用。肉毒毒素及 破傷風毒素之整個毒性活性是包含在完全毒素之L鏈上； L鏈是鋅（Ζη++)肽内酶，其可選擇性解離爲確認所必要之 蛋白質，並將含有神經遞質之小囊停置在漿膜之胞質表 面，.並與漿膜融合。破傷風神經毒素，肉毒毒素/B/D ， /F ，及/G可造成突觸短素（synaptobrevin)(也稱爲與囊胞有 關之膜蛋白質（VAMP))的降解，其爲一種突觸體膜蛋白。 存在於突觸囊胞質表面的大部份VAMP，可爲這些解離作 用中任一種所移去。血清A型及E型可解離SNAP-25 。 Ci型最初被認爲可解離syntaxin ，結果發現可解離 syntaxin及SNAP-25。各種毒素特異地解離不同的键結（除 了破傷風及B型是例外，二者解離相同的键）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 肉毒毒素在臨床定位上被用於治療特徵爲活動過度之骨 骼肌之神經肌肉失調症。A型肉毒毒素已爲FAD許可可 用於治療險痙攣，斜視及半面痙攣。非A型肉毒毒素血清 型和A型比較下，前者顯然具有較低強度及/或較短的活 性作用期。A型肉毒毒素之周邊肌内臨床作用，通常可在 注射後一週内看出來。A型肉毒毒素單一劑肌内注射後症 狀舒緩的典型作用期平均約三個月。 雖然所有的肉毒毒素血清型均可在神經肌肉接合處抑制 神經遞質乙醯膽鹼之釋出，其之所以如此是因影響不同的 神經分泌性蛋白質及/或在不同位置解離這些蛋白質所 致。例如，A及E型肉毒毒素均可解離25 kD之突觸體相 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1282282 - A 7 B7 五、發明説明（9 ) 關蛋白質（SNAP-25)，但其係對準此蛋白質内不同的胺基 酸序列。B，D，F及G型肉毒毒素作用在與囊胞相關 之蛋白質上（VAMP ，也稱突觸短素），但每一血清型解離 不同位置的蛋白質。最後，（^型肉毒毒素已知可解離 syntaxin及SNAP-25二者。這些作用機制之差異可影響各 種肉毒毒素血清型之相對強度及/或作用期。顯著地，已 知胰臟蘭氏小島B細胞之胞液，至少含有SNAP-25 (Biochem J 1;339 (pt 1): 159-65 (April 1999 年 4 月）及突觸短素 (Mov Disord 1995 年 5 月；10(3): 376) 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 肉毒毒素蛋白質分子之分子量，就所有已知之七種血清 型而言，是約150 kD 。令人感興趣的，由梭菌釋出之肉 毒毒素是呈複合物型式，含有150 kD之肉毒毒素蛋白質 分子加上相關之非毒素蛋白質。因此，A型肉毒毒素可以 900 kD，500 kD及300 kD等型式爲梭菌所產製。B及Q 型肉毒毒素大體上僅以500 kD複合物型式產生。D型則 是300 kD及500 kD複合物二種。最後，E及F型僅以約 300 kD複合物型式產生。咸信複合物（即大於約150 kD分 子量之分子）含有一個非毒素之血球凝集素蛋白質，及非 毒素及非毒性之非血球凝集素蛋白質。此二非毒素蛋白質 (其加上毒素分子包括相關的神經毒素複合物）可作用而提 ，供毒素分子對抗變性作用之穩定性，且當毒素被攝入時可 保護使免於水解酸之作用。另外，也可能，較大的（大於 約（50 kD分子量）毒素複合物可造成肉毒毒素距複合物肌 内注射部位遠處較緩慢之擴散速率。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 - A7 B7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於試管内之研究也顯示，肉毒毒素可抑制由鉀離子所謗 生之乙醯膽鹼及正腎上腺素由腦幹組織之原生細胞培養物 中之釋出。另外’也有報告指出’肉毒毒素可抑制脊柱神 經元之初生培養物中甘胺酸及穀胺醯胺所唤起之釋出，且 在腦突觸體製劑中肉毒毒素可抑制神經遞質乙醯膽驗，多 巴胺，，正腎上腺素，CGRP及穀胺醯胺各自之釋出。

A型肉毒毒素可由醱酵槽中設立及培養肉毒梭菌培養 物’再依據已知步驟收獲及純化已鏺酵混合物而得。所有 的肉毒毒素最初均以不活化之單一鏈蛋白質被合成，必需 以蛋白酶解離或使成缺口才可成爲具神經活性。可製成肉 毒毒素血清A及G型之細菌菌株，具有内源的蛋白酶， 因此血清A及G型可主要呈活性型式自細菌培養中回 收。相反的’肉毒毒素血清Ci ’ D及E型係由非蛋白水 解之菌株所合成，且因此當自培養物中回收時通常是無活 性的。血清B及F型係由蛋白水解及非蛋白水解株所產 製，因此可以活性或非活性型式被回收。然而，即使蛋白 水解菌株可產生如B型肉毒毒素，但也僅解離所產生毒素 的一部份。有缺口對無缺口分子之確實比例依培養之時間 長短及溫度而定。因此’任何製劑，如B型肉毒毒素，之 特定比例可能是無活性的，可能可歸因於B型肉毒毒素有 較A型顯著低之強度。在臨床製劑中無活性肉毒毒素分子 之存在可造成製劑整體蛋白質之負荷，其與增加之抗原性 有關，而不歸因至其臨床效力。另外，已知B型肉毒毒素 一旦採肌内注射，有較短之活性期且在相同劑量下應較A -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2IOX297公釐） 丨 v] _-------Aw------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 1282282 A7 - A 7 B7 五、發明説明（11 ) 型肉毒毒素強度爲低。 高品質之晶狀A型肉毒毒素，可自肉毒梭菌之Hall A株 中產生，其特性爲23x107單位/毫升，A26q/A278少於 0.60 ，及在凝膠電泳上呈現不同的帶狀型式。已知之

Shantz方法可用來獲得晶型A型肉毒毒素，如Shantz E. J.， et al^ Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev· 56: 80-99 (1992)。一般 而言，A型肉毒毒素複合物可由培養A型肉毒梭菌於適 合的培養基中，再自厭氧的醱酵中分離及純化。一旦分出 非毒素之蛋白質，可使用已知方法獲得純的肉毒毒素， 如：純化的A型肉毒毒素具有約150 kD的分子量，比強 度l-2xl08 LD5。單位/毫克以上；經純化的B型肉毒毒素， 具有約156 kD分子量，比強度l_2xl08 LD5〇單位/毫克以 上，及經純化的F型肉毒毒素，具有約155 kD分子量， 比強度1·2χ107 LD5〇單位/毫克以上。 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肉毒毒素及/或肉毒毒素複合物可得自List Biological Laboratorie，Inc.，Campbell，California; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osaka, Japan)，Metabiologics (Madison，Wisconsin)以及來自 Sigma Chemicals of St Louis，Missouri 0 純的肉毒毒素也是不安定的，其通常不用於製備藥學組 成物。再者，肉毒毒素複合物，如a型肉毒毒素複合物， 也極易感受表面變性，熱及鹼性條件之變性作用。失去活 性之毒素可形成類毒素蛋白質，其可具免疫原性。生成的 ___ - 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 1282282 A7 B7 五、發明説明（12 ) 抗體使病人可抵抗毒素排斥。 至於與酵素之關係，通常肉毒毒素的生物活性（其爲細 胞内肽酶）是有關於，至少是部份有關，其三度空間構 型。因此，肉毒毒素A型可以加熱，各種化學表面伸張及 表面乾燥消毒。另外，已知以已知之培養，醱酵及純化所 得之.毒素複合物稀釋至藥學組成物組份所用之較低的毒素 濃度，除非適當的穩定劑存在，是會造成毒素快速的消 毒。將毒素由數毫克稀釋至每毫升含有毫微克之溶液有顯 著的困難，因爲在此大量稀釋下會快速喪失比毒性。由於 一旦調和成含有毒素之藥學組成物之後，毒素可使用達數 月或數年，因此毒素必須以穩定劑穩定之。針對此目的， 唯一成功的穩定劑是由動物衍生的蛋白質，如白蛋白及明 膠。且如所陳述的，若在最終調和物中存在有由動物衍生 之蛋白質則會出現潛在的問題，即經由供者常來的某些穩 定的病毒，prions或其他感染性或致病性化合物，可能會 污染毒素。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 再者，冷凍乾燥或吸空乾燥含有肉毒毒素之藥學組成物 或爲毒素船運及貯存型式（即可爲醫師使用或重組之型式） 所必要之粗略pH値，溫度及濃度範圍條件中任一者均可 某程度的消毒毒素。因此，由動物衍生的或供者匯集的蛋 白質，如明膠及血清白蛋白，在穩定肉毒毒素上均可有某 些程度的成功。 市售含有肉毒毒素之藥學組成物，商品名爲BOTOX® (可購自 Allergan，Inc.，of Irvine，California)。BOTOX® 包括 -15 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 五、發明説明（I3 ) A7 B7

經純化的A型肉毒毒素複合物，白蛋白及氣化鈉包裝在無 菌，吸空乾燥型式下。肉毒毒素A型由肉毒梭菌HaU株 生長在含有N-Z胺及酵母浸膏之培養基中所製成。a型肉 毒毒素複合物自培養物溶液中以一系列酸沈澱純化，成由 活性高分子量毒素蛋白質及相關之血球凝集素蛋白質所組 成之晶狀複合物。晶狀複合物再溶於含有食鹽水及白蛋白 之溶液中，在吸空乾燥前先無菌過濾（〇·2微米）。 BOTOX®可以典菌，未加保藏劑之食鹽水重組，以供肌内 注射之用。各小瓶的BOTOX®含有約100單位（u)的A型 梭菌肉毒毒素經純化之神經毒素複合物，0.5毫克的人類 血清白蛋白，及0.9毫克的氯化鈉，於無菌且經吸空乾 燥，無保藏劑之型式。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了重組不加保藏劑之經吸空乾燥的BOTOX®無菌生理 食鹽水，於是使用0.9氯化鈉注射液，係在適當大小的注 射器内吸出適量的稀釋劑。由於咸信，BOTOX®可由通入 氣體或類似的劇烈震動使變性之，稀釋劑需緩缓加至小瓶 内。BOTOX®應在重組後4小時内投予。在此時間内，經 重組之BOTOX®貯於冰箱中（2。至8 °C )。經重組的 BOTOX®是澄清，無色的，且不含微粒物質。經吸空乾燥 之產物貯於低於-5 °C之冷凍下。在小瓶自冷凍中移出並重 組後4小時内要投予BOTOX®。在此4、小時中，重組之 BOTOX®可貯於冰箱中（2 〇C至8 〇C )。經重組之BOTOX® 是澄清，無色且無微粒物質的。 已有報告指出，A型肉毒毒素具有如下之臨床定位用 -16- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） 麵濟部中夬榡準局員工消費合作衽印製 l282282 A7 —______B7_ 五、發明説明（H ) 法·· (1) 每次肌内注射約75_125單位的BOTOX® (多處肌肉） 以治療頸部肌緊張不足； (2) 每次肌内注射5-10單位的BOTOX®以治療眉間線（額 溝）（肌内注射5單位至棱錐肌，及肌内注射1〇單位至各 皺眉肌）； (3) 約30-80單位的Βοτοχ®可治療便秘，係由括約肌内 注入恥骨肛門肌； (4) 每條肌肉肌内注射約1-5單位的BOTOX®以治療瞼痙 攣，係注入上眼瞼之側瞼板前之眼輪市肌，及下眼瞼之侧 險板前眼輪市肌。 (5) 爲治療斜視，眼外肌由肌内注入約1-5單位的 BOTOX®，注入之量依欲注射之肌肉尺寸及欲求之肌肉麻 痺程度而定（即欲校正之折光量）。 (6) 可治療中風後之上肢痙攣性，係將BOTOX®肌内注 入五種不同的上肢屈肌，如下： (a) 屈和深肌：7.5早位至30單位 (b) 屈指淺肌：7·5單位至30單位 (c) 尺側屈腕肌：1〇單位至4〇單位 (d) 橈側屈腕肌：15單位至60單位 (e) 胲二頭肌：50單位至200單位，五種所示之肌肉 各自在相同的處理期間下注射，如此在各處理期間，由肌 内〉主射病人可接受90-360單位之上肢屈肌BbTOX®。 (7) 可治療偏頭痛，顱周注射（全身性注入眉間，額及顳 __ ·_ -17- 本紙張中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公餐 --- -i Ρ__n *1 I n I I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1282282 A7 B7 五、發明説明（I5) 肌）25單位的BOTOX®已示出在作爲偏頭痛預防性處理上 益處較溶媒爲顯著，此可由偏頭痛頻率，最大嚴重度，相 關之嘔吐及急性藥物應用，在注入25單位後3個月期間 内程度減低而測知。 已知，A型肉毒毒素可有效力長達12個月（European J· Neurology 6 (Supp 4): SI 11-SI 150:1999 ，及在某些狀況下可 長達 27 個月（The Laryngoscope 109: 1344-1346:1999)。然而， Botox®肌内注射的一般作用期是約3至4個月。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如先前所示，某些肉毒毒素已被用來治療各種移動失調 症，如痙攣的肌肉症狀，造成疼痛之舒緩。例如，已知使 用肉毒毒素可治療肌肉痙攣，且結果使痙攣的肌肉過度活 性及由於或歸因於痙攣的肌肉活性而生長之二次疼痛均得 到舒缓。例如，Cheshire et al Pain 1994; 59(1):65-69 報告指 出有肌筋膜疼痛症狀之病人，在注射A型肉毒毒素至引發 實可感受到疼痛的減少。也見WO 94/15629。咸信，A型 肉毒毒素可減少疼痛，係減少造成第一所在實質疼痛之持 續的肌肉收縮減少。因此，造成或伴隨肌肉痙攣之疼痛可 歸因於痙攣所致之較低的，局部的pH値。由肉毒毒素所 謗生之弛緩肌麻痒之間接作用是令pH値回復至生理水 平，由是由於運動終板膽鹼能神經切除之二次作用造成疼 痛減少，而此神經之切除作用可由周邊肉毒毒素投予所 致0 肉毒毒素可用來治療與肌肉痙攣，血管失調，神經痛及 神經病變有關之偏頭痛。Binder U.S· Patent No. 5,714,468， -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（16 ) 其揭示以全文列爲本案參考。値得注意，肌肉痙攣疼痛， 高張肌肉疼痛，肌筋膜疼痛及偏頭痛均可歸因於，或至少 部份可歸因於，在肌肉張力或收縮增加期間，一種以上感 受傷害物質之產生及釋出所致。 A型肉毒毒素治療各種臨床狀況之成功，已造成對其他 肉毒，毒素血清型之興趣。對於市售A型肉毒毒素製劑二種 (BOTOX®及Dysport® )及B型及F型製劑（二者均得自Wako Chemicals，Japan )之研究已可用來決定局部肌肉衰弱效力， 安全性及抗原強度。肉毒毒素製劑注入右腓腸肌頭部（0.5-200.0單位/公斤），再利用老鼠趾外展計分分析（DAS)評估 肌肉虛弱性。由劑量反應曲線可估計出ed50値。另外的 老鼠肌内注射以決定ld50劑量。以LD50/ED50估算出治療 指數。不同的老鼠組別以BOTOX® ( 5.0-10.0單位/公斤）或 B型肉毒毒素（50.0-400單位/公斤）注入後肢，再進行肌肉 虛弱性及耗水增加之測試，後者爲口乾之推想模式。抗原 性強度之評估以每月肌内注射兔子進行（1.5或6.5毫微克/ 公斤B型肉毒桿菌或0.15毫微克/公斤於BOTOX®)。肌肉 虛弱性高♦及作用期對所有血清型而言均和劑量有關。 DASED50 値 1 單位/公斤）如下：BOTOX②:6.7 ，Dysport⑧:24.7 ，B型肉毒毒素：27.0-244.0 ，F型肉毒毒素：4.3 。 BOTOX®較B型或F型肉毒毒素有更長的作用期。治療指 數値如下：BOTOX®:10.5 ，Dysport®:6.3 ，B 型肉毒毒 素：3.2 。注射B型肉毒毒素之老鼠，其耗水率大於 ΒΟΊΌΧ®，然而B型肉毒毒素在減弱肌肉力上較無效力。 • 19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） :/·— 1!· —· ·«--— I 1- 1-- ― I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（I7 ) 兔子注射後4個月，4隻中的2雙（其中以1·5毫微克/公 斤治療）及4隻中的4隻（其中以6.5毫微克/公斤治療）可 發展成拮抗Β型肉毒毒素之抗體。在另一組中，投予 BOTOX®的兔子9隻中並無一隻可生成拮抗Α型肉毒毒素 之抗體。DAS結果顯示，A型肉毒毒素之相對強度高峰 相當於F型肉毒毒素，且F型毒素大於B型。關於作用 期，A型肉毒毒素較B型爲長，且B型較F型長。由治 療指數値示出，肉毒毒素的二種市售製劑（BOTOX®及 Dysport®)是不同的。後肢注入B型肉毒毒素後可觀察到耗 水行爲之增加，顯示此血清型有相當大量會進入鼠類之全 身循環。結果也顯示，爲了達到可與A型肉毒毒素比得上 之效力，受檢之其他血清型必需增量投予。再者，於兔子 中，B型之抗原性較強於BOTOX®，可能是由於爲了達成 B型肉毒毒素有效劑量而注入較高蛋白質負荷之故。Eur J Neurol 1999 Nov;6(Suppl 4):S3-S10 〇 爲了在周邊有藥理作用，肉毒毒素也可在中樞神經系中 有抑制作用。Work by Weigand et al，Nauny-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, and Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch· Pharmacol· 1974; 281，47-56 顯示，肉毒 毒素可由逆行運送上昇至脊柱。如此，肉毒毒素注在周邊 , 位置，如肌内，可逆行運送至脊柱。然而，所示文件之作 者無法證明經放射標記之物質是完整的肉毒毒素。 如上文所討論的，與肌肉失調症有關之疼痛，如肌肉痙 攣疼痛，及與血管失調有關之頭痛，神經痛及神經病變可 〜_' -20- 尺度適用中國國家;CNS ) A4規格（210X297公釐1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i#. 、π

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1282282 _ Α7 --—----------一___^_____ 五、發明説明（18 ) " 一 — 使用肉毒毒性有效地治療。然而，在治療其他疼痛型式排 列的可運用万法中，在此仍有明顯的缺失。此類疼痛包括 與肌肉失凋供關之疼痛，非頭痛型神經痛，及神經病變型 疼痛，組織發炎疼痛，關節發炎疼痛，組織發炎疼痛，癌 症疼痛，手術後的疼痛，撕裂疼痛，絕血性疼痛等。 在此企圖強調這些其他的疼痛型式，但其可能的成功及 可能的臨床用途在此時是不確定的。如，卩⑽以以虬込 U.S· Patent No· 5,989,545 (已全文列爲本案參考）揭示，梭 菌神經毒素，較好是肉毒毒素，化學上共軛或重組地稠合 至特定標的部份，可用來治療疼痛。 乙醯膽鹼 一般而言在哺乳動物神經系統中，各型式之神經元僅釋 出單一型式之小分子神經遞質。神經遞質乙醯膽鹼，爲腦 中許多區域之神經元所分泌，但特別的是運動皮質中大的 錐體細胞，基礎神經節中數種不同的神經元，與骨骼肌神 經支配之運動神經元，自主神經系之神經節前神經元（交 感及副交感二種均有），副交感神經系之神經節後神經 元，及交感神經系某些神經節後神經元。基本上，僅有到 汗腺之神經節後交感神經纖維，豎毛肌及一些血管是膽鹼 能的，因爲大多數的交感神經系神經節後神經元分泌的是 '神經遞質正腎上腺素。在大多數例子中，乙醯膽鹼具有刺 激作用。然而，已知乙醯膽鹼在某些周邊副交感神經終端 具有抑制作用，如迷走神經對心跳速率之抑制作用。 自主神經系之傳出訊號，可經由交感神經系或副交感神 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） '~~' '-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -_

1282282 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（I9 ) 經系傳遞至全身。叉感神經系統之神經節前神經元，由位 在脊柱中間及外側角之神經節前交感神經元細胞體處延 伸。由細胞體處延伸之神經節前交感神經纖維，·與位在副 脊椎交感神經節或脊椎前神經部之神經節後神經元胞突接 合。由於交感及副交感神經系的神經節前神經元均是膽鹼 能，將乙醯膽鹼應用至神經結可刺激交感及副交感神經節 後之神經元。 乙醯膽鹼可活化二種受體，蕈毒鹼及菸鹼受體。蕈毒鹼 丈體見於所有由副交感神經系之神經節後神經元所刺激之 效應物細胞，以及由交感神經系神經節後膽鹼能神經元所 刺激之細胞。於鹼受體見於交感及副交感神經系二者之神 經節前及神經節後神經元間之胞突。菸鹼受體也存在於神 經肌肉關節處骨骼肌纖維的許多膜上。 當小的，澄清的細胞内囊胞與突觸前神經元細胞膜融合 時，乙醯膽鹼可自膽鹼能神經元中釋出。各樣的非神經元 分泌細胞，如腺上腎髓質（以及PC 12細胞株）及胰臟蘭氏 小島細胞，可自大的稠密核心囊胞中分別釋出茶兒酚胺及 田1J甲狀腺激素。PC 12細胞株是大鼠嗜鉻細胞瘤細胞之純 系，被充份充作組織培養模式使用，用於交感神經腎上腺 發展之研究。肉毒毒素可抑制試管内二種細胞型式對二種 '化合物之釋出，使通透（如利用電泳脈動）或將毒素注入切 去神經之細胞中。也已知肉毒毒素可阻斷皮質突觸體細胞 釋出神經遞質穀胺醯胺。 骨路肌中神經肌肉接合之形成係因軸索接近肌肉細胞之 • 22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） C请先閱讀背面之注意事項鼻填寫本貢)

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1282282 五、發明説明（2〇 故由神經系傳送之訊號可造成末端軸索之作用電勢，邛 '離子道’並k成神經遞質乙酿膽驗自神經元内之突觸 囊胞之釋出，例如在神經肌肉接合之運動終板處。乙酿膽 鹼可穿越細胞外空間，與在肌肉終板表面之乙醯膽鹼受體 蛋白質結合。一旦發生充份的結合，肌肉細胞之作用電勢 可造成特異的膜離子道變化，造成肌細胞收縮。乙醯膽鹼 再自肌肉細胞中釋出，並由細胞外空間之乙醯膽鹼酶所代 謝。代謝物再循環回到末端軸索，以可再處理成進一步的 乙醯膽鹼。 、因此在此需要的是有效，長效，非外科方法之治療疼痛 法’特別是與肌肉失調症或頭痛無關之疼痛。 要點 本發明符合此需求，並提出治療疼痛的有效，長效，非 外科方法，特別是與肌肉失調症或頭痛無關之疼痛。 在本發明治療疼痛的方法中，.包括周邊投予神經毒素至 哺乳動物之步驟。接受治療之疼痛和肌肉失調症無關，如 肌肉痙攣，因爲咸信本發明之操作機制是經由在周邊，感 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 n t I 1- i 0 : I— - ·*-- — 1— m I I -(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

覺傳入疼痛神經元上之抗感受傷害作用，和在運動神經元 上具有的作用相反。 神經毒t包括實質i神經毒素天然具有之神經元結合部 份。神經毒素可以是肉毒毒素，如肉毒毒素A ， B ， C! ’ D ’ E ’ F或G型中任一者。較好肉毒毒素是八型 肉毒毒素。 神經毒素可以是經修飾的神經毒素，其至少有一個胺基 -23· 良紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（21 ) 酸被删除，修飾或取代。另夕卜，神經毒t至少可部份由重 組體方法所製成。 神氬母素投予之劑量可介於約〇 〇1單位/公斤及純35單 位/公斤之間’且受治療之疼痛可在約厂個月及約27個月 間實質上得到舒缓，如由約！個月至約6個月之間。 神經毒素之周邊投予，可在感受傷害事件開始之前或病 人經驗到症狀時進行。另外，神經毒素之周邊投予可在病 人經驗到感受傷害事件開始之後接著進行。 在本發明範園内方法之詳細具體實例包括肉毒毒素周邊 投予至人體，由是可舒緩疼痛，丨中疼痛與肌肉痙攀或頭 痛無關。 在本發明範圍内的進-步方法包括對哺乳動物周邊投予 神經毒素，其中神經毒素是—種多肽，包括：⑷_個第

-胺基酸序列區，含有野生型神經元結合部份，實質上完 全衍生自選自下列之神經毒素，包括a，B E ’ F ’ G型肉毒毒素及其混合物；(b) 一個第二胺基酸 序列區域，可有效地將多肽或其部份 位，及(C)第三個胺基酸序列區，各 ’膜而轉 田釋出至標的細胞之胞 質時具有，冶療活性，其中疼痛與肌肉痙攣是無關的。 多肽I第-胺基酸序列區域可包括由神經毒素衍生之重 鏈羧基末端，且神經毒素可爲肉毒表 素，如A型肉毒毒 多肽的第二胺基酸序列區域，可 、有由 A ，B ，Ci ， D，E，F，G型及其混合之肉毒毒 素所選出之神經毒素 24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公餐 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、π

1282282 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（22) 衍生之重鏈胺基末端。値得注意，多肽之第二胺基酸序列 區域可包括由A型肉毒毒素衍生之毒素重鏈胺基末端。 最後，多肽之第三胺基酸序列區域可包括由選自下列之 神經毒素衍生之毒素輕鏈，包括：beratti毒素；丁酸毒 素；破傷風毒素；A，B，C!，D，E，F，G型肉毒 毒素.及其混合物。多肽之第三胺基酸序列區域可包括由A 型肉毒毒素衍生之毒素輕鏈。 本發明也包括改善病人功能之方法，方法包括對經驗到 非肌肉失調症一相關疼痛之病人，周邊投予肉毒毒素，由 是可改善病人的功能，其改善可由下列一種以上因素之改 善而決定：疼痛減低，臥床時間減少，聽力改進，步行力 增加’較健康的態度及更有變化的生活形態。 很重要的，在本發明範圍内之神經毒素，包括與神經元 細胞表面受體具特異親和力之天然的或野生型結合部份。 在本發明範圍内之神經毒素，排除神經元標的部份，其非 神經毒素先天具有的，因爲吾等發現本發明在必需所用 之神經毒素天然的或野生型結合部份進行任何修飾或刪除 下即可有效地實行。 因此’使用具有一種以上非天然，標的部份人工物或構 體之神經毒素因爲是非必要的，故排除在本發明範圍之 '外’因爲如所陳述的，吾等驚訝地發現依據本發明周邊投 予神經毒素可提供顯著的疼痛缓和，即使神經毒素不含有 非天然的神經元標的部份。因此吾等發現神經毒素，如A 型肉毒毒素，一旦周邊投予可提供疼痛之舒緩，即使神經 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ——«βιϋ f^K 1· «11 11-_1 I ^inr i_l c请先閱讀背面之注意事項真填寫本寅〕 tr J#.. 1282282 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（23 ) 毒素未人工地或手動地調和非天然神經元標的部份之任何 黏附作用。 令人驚訝地，吾等發現，神經毒素如梭菌神經毒素，具 有野生型神經元結合部份，可周邊投予至哺乳動物以治療 疼痛。野生型神經元結合部份原先爲神經毒素的一部份。 例如.，A型肉毒毒素，加有其原先的野生型神經元結合部 伤’可以約0·01單位/公斤至約35單位/公斤間之劑量周 邊投了 ’以舒緩哺乳動物所經驗到之疼痛，如人類患者。 較好，所用的肉毒毒素以約〇·1單位/公斤至約3單位/公 斤I劑量周邊投予。令人驚訝地，本發明方法之疼痛舒緩 作用可持續平均Κ個月，而在某些狀況下更長。已有報 告指出，肉毒毒素在投藥後之作用可持續達27個月。 在另一具體實例中，治療疼痛之方法包括對哺乳動物投 予神、纟工母素，如梭菌神經毒素，其中神經毒素與自然生成 之神經毒素有至少一個胺基酸之差異。神經毒素也具有一 個野生型神經元結合部份。 ，在另-具體實例中，治療疼痛的方法包括對哺乳動物投 予神經毒素，如梭菌神經毒素，其中神經毒素具有另—神 經毒素亞型之野生型神經元結合部份。 本發明也包括治療㈣後疼痛之方法，其巾疼痛是進行 ，子術步驟之結果(即疼痛至少部份是由於所製成之切開所 致）°万法包括周邊投予有效劑量之肉毒毒素，係在手術 步驟之前（即手術前長達1〇天），手術中或之後（即手術後 不超過約⑷小時），由是可舒緩或顯著地舒緩手術後之 -26- 本紙張尺度ϋ财關家2 w 丨 rLl.---_ —丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) 疼痛。吾等發明範圍不包括其中手術步驟是用來治療肌肉 痙攣之方法。 吾等的發明也包括治療内臟疼痛之方法，方法包括以有 效劑量的肉毒毒素非全身性局部投予，以舒緩肉臟之疼 痛。肉臟疼痛是病人由内臟部位生成之疼痛，即在消化 道，·呼吸道，泌尿生殖及内分泌系統中之器官，以及在脾 臟，心臟及/或血管。因此，肉臟疼痛包括在胰臟，腸， 胃，及腹部肌肉處之疼痛。 在本發明範圍内治療疼痛的較佳方法，包括對哺乳動物 周邊投予神經毒素。受治療的疼痛實質上是由肌肉痙攣所 致，因爲吾等驚訝地發現，在本發明範圍内之神經毒素可 用來治療非繼發於肌肉痙攣之疼痛。因此，本發明可應用 至不論有或無肌肉失調症（如肌肉痙攣）所致 外，本發明也可應用至且也包括非繼發於肌：=之： 痛。因此，病人可能有痙攣性或強直的肌肉，且也經驗到 非繼發之疼痛，其並不歸因於或並不生自肌肉痙攣。例 如，病人可能有痙攣性四肢肌肉，同時在軀幹經歷到疼 痛，如背痛。在此實例中，在本發明範圍内的方法可用來 治療背痛，即在病人的背部周邊（即皮下）投予神經毒素。 定義 、 提出以下定義並應用於此： "輕鏈"表示梭菌神經毒素之輕鏈。其可具有約5〇奶& 之分子量’且稱爲L鏈，L或梭菌神經毒素之蛋白水解區 域（胺基酸序列）。 (請先閲讀背面之注意事項 I n I 再填寫本瓦) 訂

-27- 1282282 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（25) "重鏈"表示梭菌神經毒素之重鏈。其可有約1〇〇 kDa之 分子量，且可稱之爲Η鏈或Η。 ’ΉΝ"表示可具有分子量約50 kDa之一段，係衍自梭菌神 經毒素之Η鏈，且大約相當於η鏈之胺基末端片段，或 相當於完整Η鏈片段之部份。咸信其含有涉及於l鏈穿越 細胞·内内囊胞膜而轉位之天然的或野生型梭菌神經毒素部 份0 ”HC"表示由梭菌神經毒素η鏈衍生之片段（純5〇 kDa)， 其大約相等於Η鏈之羧基末端片段，或相當於完整H鏈 片段之部份。咸信具有免疫原性，且含有涉及於與運動神 經元高親和力，突觸前結合之天然或野生型梭菌神經毒素 部份。 野生型神經元結合郅份"表示爲神經毒素先天之神經毒 素部份，且對神經元上之受體展現特異的結合親和力。因 此，野生型或天然的神經元結合部份排除神經毒素非先天 之結合部份。 ••標的部份”表示對細胞表面受體具有幹異結合親和力之 分子。標的部份並非梭菌神經毒素Hc，或由&衍生具有 至少一個胺基酸刪除，修飾或取代之肽。標的部份是非梭 菌神經毒素之分子，如可以是舒緩激肽。 / "局部投藥"表示在患部，失調症或感受疼痛位置鄰近 處，非全身性路徑之投藥。 週邊投藥"表示利用非全身性路徑對哺乳動物之周邊所 在投藥。周邊所在通常表示在皮膚下方或注入骨骼肌内。 _一!__^ A__^____-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 28- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1282282 A? ^ ___B7 多、發明説明（26) 周邊投藥包括周邊肌内，腺體内，及皮下投藥路徑，但排 除靜脈内或口服，且進一步排除對中樞神經系統任何直接 之投藥。 P# 本發明的這些及其他特色，方面及優點，由以下説明， 申請專利範圍及附圖可更加被了解，其中在圖1及2中， "注射"表示周邊注射或投藥。 圖1是劑量反應圖，表示本發明範圍内之方法可在大鼠 福馬林模式中舒緩所謗生之發炎疼痛達至少5天。X軸表 示大鼠福馬林模式開始後，按分鐘計之時間。y軸爲在7 單位/公斤（n=8)，IS單位/公斤（n=5)及3〇單位/公斤（n=4) 之濃度下，使用對照組（食鹽水，n=7 )及BOTOX® (肉毒 毒素A型經純化之神經毒素複合物），抬起及舔舐經注射 有福馬林之腳掌所花費之時間。BOTOX®在施以福馬林開 始前5天時注入。 圖2爲劑量反應圖，表示在本發明範圍内之方法可在大 鼠福馬林模式中舒緩所謗生之發炎疼痛，達至少12天。 X軸表示大鼠福馬林模式開始後按分鐘計之時間。Y轴是 在3.5單位/公斤（n=7)及7單位/公斤（n=8)濃度下，使用對 照組（食鹽水，n=3)及BOTOX® (A型肉毒毒素純化之神 ，經毒素複合物），抬起及舔舐經注射有福馬林之腳掌所花 費之時間。BOTOX®在施以福馬林開始前12天時注入。 説明 本發明係基於以下發現，即周邊投予神經毒素可對慢性 ____ - 29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉M規格(2丨Gx297公楚）—- "—- jr—u-1 - -r-_ n_i IK --- - n (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

1282282 A7 B7 五、發明説明（27 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 疼痛提供有效的治療。値得注意的是，神經毒素具有野生 型或天然的神經元結合部份β接受治療之疼痛並非由於肌 肉痙攣所致，也非頭痛方面之疼痛。慢性疼痛被治療是因 爲所使用之神經毒素具有長期的抗感知傷害作用。神經毒 素之神經元結合部份組份是一種神經元結合部份，其爲所 選擇之神經毒素先天的，因爲吾等發現，本發明可在未以 非天然或非野生型標的部份取代野生型神經元結合部份下 予以實行。頭痛之治療不在本發明範園之内，因爲依據本 發明神，經毒素之周邊投予較佳輕係排除頭及頸部的。 在吾等之發現前，神經毒素如肉毒毒素已被用於治療盈 各種肌肉失調症有關之疼痛H已知肌肉失調症，如 痙攣性肌肉，可造成疼痛且經過治療，痙攣之疼痛是可被 舒緩的。Foster |人揭神經毒素被鍵結上標的部份以 用於治療頭痛，即梭菌神經毒素之野生型結合部份可被完 全移去，並以標的部份取代之。 令人驚訝地吾等發現，未被共軛，黏附，附著或稠合以 神經7L標的部份之神經毒素，依據本發明方法可周邊投予 以治療疼痛。較好，所治療之疼痛並非由肌肉痙攣所致， 即疼痛並非由繼發性結果而直接造成的。吾等之發明可用 來治療疼痛，其始因自各種神經病變，發炎，癌症及外傷 狀況。 在吾等發明之前，並未知神經毒素，如肉毒毒素，可有 效地用來治療疼痛，其中疼痛並非由肌肉痙攣或高張之肌 肉狀況所致。神經毒素周邊投予可造成疼痛長期舒緩之生 ί m IT— ml ml ·ϋϋ I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Jmm I ί Hr · • - · 30. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 !282282 A7 B7 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 發明説明（28 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 理機制是不清楚的。吾等注意到，賴由於肌肉痙攀或高 張肌肉狀況所致之疼痛可產生減低的局部PH値，但吾= 之發明並不停留於此點，且並不需提高局部低的PH :水 平。另外，雖然肌肉痙攣或高張之肌肉狀況可由神經毒素 之抗膽鹼能作用所舒緩，如肉毒毒素，且此作用係在運動 神經元上，然吾等之發明並不預測對運動神經元有所作 用。不欲爲理論所縛，吾等假設依據本發明，周邊投予神 經毒素，如肉毒毒素，的一個作用可能是對周邊感覺傳入 神經元之抗感受傷害作用。顯著地，在吾等之發明中，疼 痛之舒缓是周邊投予神經毒素，如肉毒毒素，原發性之作 用，和繼發性是不同的。 因此，本發明至少有部份是根據於下列的發現，即具有 野生型神經元結合邵份之神經毒素，可周邊投予至哺乳動 物以舒緩疼痛。依據本發明之神經毒素並不偶合至非天然 的標的部份。依據本發明之野生型結合部份，可爲梭菌神 t母素自然存在之Hc片段，或是實質上完全衍生自梭菌 神經毒素Hc片段之胺基酸序列。 如下文所用的，胺基酸序列（如野生型結合部份，，，衍生 自••另一胺基酸序列，如Hc片段，表示所生成之胺基酸序 列與其所衍生出處之胺基酸序列確實地重疊；或所生成之 胺基酸序列和其所衍生出處之胺基酸序列有至少一個胺基 酸之刪除，修飾或取代。 依據本發明較廣之方面，在此提出治療疼痛的方法，包 括對哺乳動物投予有效劑量之神經毒素，如梭菌神經毒 •31-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1282282 A7 B7 五、發明説明（29 ) 素，其具有野生型神經元結合部份，在一個具體實例中， 方法包括對哺乳動物投予具有野生型神經元結合部份之神 經毒素，其原先即已是神經毒素的一部份。例如，此神經 毒素可選自下列包括beratti毒素及丁酸毒素，其各自已具 有神經元結合部份。神經元毒素也可以是破傷風毒素，也 具有野生型神經元結合部份。較好，投予至哺乳動物之神 經毒素係選自下列包括A，B，Ci，D，E，F或G型 肉毒毒素，其各自有其本身原來的野生型神經元結合部 份。較好，方法包括投予具有其原先野生型神經元結合部 份之A型肉毒毒素。方法也包括投予上述二種以上的神經 毒素混合物至哺乳動物以治療疼痛。 在另一具體實例中，方法包括對哺乳動物投予神經毒 素，如梭菌神經毒素，其中神經毒素與自然生成之神經毒 素僅至少一個胺基酸之差異。例如，A型肉毒毒素之變化 型式揭示於 Biochemistry 1995，34，pages 15175-15181 ，及 Eur. J. Biochem, 1989, 185, pages 197-203 (己全文列爲本案參 考），可投予至哺乳動物中以治療非痙攣相關之疼痛。這 些變化型也具有野生型神經元結合部份。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一具體實例中，提出投予神經毒素至哺乳動物以治 療非痙攣引起之疼痛之方法，其中神經毒素具有另一種神 經毒素之野生型神經元結合部份。例如，方法中包括對哺 乳動物投予具有B型肉毒毒素野生型神經元結合部份之A 型肉毒毒素。所有此種組合均包括在本發明範圍之内。 在另一較廣泛之具體實例中，本發明治療非痙攣相關疼 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（3〇 ) 痛之方法包括局部，周邊投予神經毒素至哺乳動物確實的 或感受疼痛之所在。在一個具體實例中，神經毒素皮下或 近感受疼痛之所在處投予，如在慢性疼痛之關節處或近 處。在另一具體實例中，神經毒素肌内或在疼痛所在近處 投予，如在哺乳動物之贅瘤上或其近處。在另一具體實例 中，.神經毒素係直接注入哺乳動物關節，以治療或舒緩造 成疼痛之關節異狀況。同時，神經毒素經常，重覆地注入 或輸注至周邊疼痛所在，也是在本發明範圍之内的。然 而，本發明既有長效之治療作用，神經毒素經常之注射或 輸注是不必要的。例如實行本發明可在每次注射時提供長 達2個月以上之鎮痛作用，如在人類是7個月。 本發明不欲爲任何機制或操作理論所縛，咸信當神經毒 素局部投予至周邊所在，其可抑制神經物質，如物質P自 周邊一級感覺末端之釋出。如上文所討論的，由周邊一級 感覺末端釋出之物質P，可造成或至少擴大疼痛之傳送過 程。因此，其在周邊一級感覺末端釋出之抑制作用，可減 弱疼痛傳送過程。 本發明方法除了在投予之周邊所在具有藥理作用之外， 也由於自周邊位置（即皮下）逆行運送神經毒素至中樞神經 系統，其也具有抗感受傷害之作用。吾等決定，A型肉毒 毒素可由投予之周邊位置逆行運送回脊柱之背角。可推測 逆行運送係經由一級之傳入神經。此發現和Weigand et al， Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165 及 Habermann, Nauny-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1974; 281， -33- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1282282 - A7 B7 五、發明説明（31 ) 47-56之研究是一致的，其顯示出肉毒毒素可由逆送運送 上昇至脊柱區域。因此，有報告指出，肌内注射A型肉毒 毒素，可由周邊一次感覺末端逆行運送至中樞一次感覺末 端。 吾等的發現和在上文所示文件中所討論的顯著的不同。 吾等.發現，在大鼠周邊，皮下投予肉毒毒素之後，其會集 中在動物之背角，即在C纖維胞突接合之所在。皮下注射 是注射在許多偶極感受傷害之神經纖維之所在。這些感覺 纖維由周邊繞至脊柱之背角。相反的，在上列所示的一個 以上文件中，在肌内注射後，可在腹根部發現某些經放射 標記之肉毒毒素。脊柱之腹根是單極傳出（送出）之運動神 經元所在。因此，在技藝中有以下之預期，即周邊肌肉痙 攣預期是肉毒毒素由周邊逆行運送至脊柱所在之結果。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此精藝者咸信，哺乳動物脊柱中神經毒素之存在，如 肉毒毒素，可⑴在受者中謗生顯著的痙攣性，及；（2)可 促進在脊柱及腦功能上之有害作用。因此，關於所示之有 害作用（1):其係報告於 Williamson et al·，in Clostridial Neurotoxins and Substrate Proteolysis in Intact Neurons, J. of Biological Chemistry 271:13; 7694-7699 (1996)其中破傷風毒素 及肉毒毒素A型均可抑制胎鼠脊柱細胞培養物中神經遞質 甘胺酸及穀胺酸之釋出，而由Hagenah et al·，in Effects of Type A Botulinum Toxin on the Cholinergic Transmission at Spinal Renshaw Cells and on the Inhibitory Action at la Inhibitory Interneurones，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch· Pharmacol· 299，267- -34- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282 A7 B7 五、發明説明（32) 272 (1977)，在實驗地準備且麻醉之貓中，將A型肉毒毒 素於脊柱内直接注射可抑制CNS Renshaw細胞活性。中樞 甘胺酸及穀胺酸神經遞質釋出之抑制作用，以及Renshaw 細胞活性之反向調控，推測二者均可於活體内造成顯著運 動神經元過度活性之促進作用，並確保周邊肌肉之痙攣 性。. 關於有害作用（2):咸信破傷風神經毒素在中樞（脊柱） 之存在，經由破傷風毒素沿著CNS神經元之逆行移動， 可對脊柱及腦功能展現顯著的負面作用，由是對有相關神 經毒素之任何欲求有所禁忌，如肉毒毒素出現（如經由逆 行運送）在脊柱中。値得注意的，肉毒毒素及破傷風毒素 均由梭菌所產生，然是不同的梭菌。顯著的，某些研究者 已報告指出，肉毒毒素與破傷風毒素共有，至少達某種程 度，値得注意的神經上昇特性。如見Habermann E·，125I-Labeled Neurotoxin from Clostridium Botulinum A: Preparation， Binding to Synaptosomes and Ascent in the Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 281, 47-56 (1974) ° 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 吾等之發明令人驚訝地遭遇到的既非有害作用（1)也非 (2)，且本發明所揭示之周邊（皮下）投藥方法可被實行， 以對疼痛提供有效且長效之舒緩，其並非因肌肉痙攣所 致，且對於患者之生活品質可有大體上的改進。病人經歷 到的疼痛可能是由於受傷，手術，感染，意外或疾病所致 (包括癌症及糖尿病），包括神經病變性疾病及失調症，其 中疼痛並非主要由肌肉痙攣或高張之肌肉狀況所致。 -35- 本纸張尺度1^用中國國家系準（€奶）八4規格（210/297公楚) 1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（33 ) 一旦在脊柱背角所在之中樞一次感覺末端，神經毒素可 進一步抑制負貴傳送疼痛訊號之神經遞質之釋出，如物質 P。此抑制作用可避免脊髓與丘腦徑中投射神經元之活化 作用，由是可舒緩疼痛。因此，神經毒素之周邊投予，由 於其目前被發現之中樞抗感知痛覺作用，可作用中樞（即 脊柱内）投予鎮痛劑之另一方法，由是減少與鎮痛劑中樞 投予時有關之併發症。 再者，Habermann Experientia 1988; 44:224-226 示出，肉毒 毒素可抑制正腎上腺素及GABA自腦勻漿物中之釋出。此 發現可推知，肉毒毒素可進入腎上腺能交感神經終端及 GABA神經終端。如此，肉毒毒素可投予至交感神經系提 供疼痛長期的阻斷及舒緩，如神經病變的疼痛。神經毒素 之投予，較好是A型神經毒素，可提供長期阻斷之益處， 無永久功能受損之危險性，此點是目前使用藥物不可能達 到的。 投予之神經毒素劑量可依受治療之特定失調症，其嚴重 度及其他各種病人變數包括：體型，體重，年齡及對治療 之反應性等而變化。例如，周邊疼痛之區域程度，咸信與 注入神經毒素量成比例，而在大多數劑量範圍下，鎮痛之 量與注入之神經毒素濃度或比例。再者，神經毒素投予之 , 特定所在依欲治療之疼痛所在而定。 一般而言，所投予之神經毒素劑量，依年齡，目前狀況 及體重而變化。也要考慮神經毒素之強度。 依據本發明的一個具體實例，神經毒素如A型肉毒毒 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1282282 A7 B7 五、發明説明（34) 素，在周邊所在之治療有效劑量介於約0.01單位/公斤及 約35單位/公斤之間。投予具有野生型神經元結合部份之 神經毒素之較佳範圍，如A型肉毒毒素，如在病人中達到 抗感受傷害作用是由約〇.〇1單位/公斤至約35單位/公 斤。周邊投予神經毒素的較佳範圍，如A型肉毒毒素，以 在病人中達到抗感受傷害作用是由約1單位/公斤至約15 單位/公斤。低於0.1單位/公斤所造成之欲求治療作用不 如最佳或最長的可能作用期，而多於約2單位/公斤仍可 造成某些肌肉弛緩之症狀。周邊投予神經毒素之最佳範 圍，如A型肉毒毒素，以在病人中達到抗感受傷害作用是 由約0.1單位/公斤至約1單位/公斤。 雖然提出投藥路徑及劑量實例，然適合的投藥路徑及劑 量通常按各病例由主治醫師所決定。此決定爲一般精藝者 例行可決定的（如見 Harrison’s Principles of Internal Medicine (1998)，edited by Anthony Fauci et al·，14th edition，published by McGraw Hill )。例如，投予神經毒素之路徑及劑量，依據 本發明揭示，可依以下準則加以選擇，如所選用之神經毒 素之溶解度特性，以及所感受到之疼痛強度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本發明另一廣義具體實例中，在此提出治療與非一痙 攣相關之疼痛之方法，此方法包括投予有效劑量之神經毒 素，其中神經毒素和先前所述之二-多肽不同，屬單-多 肽。 在一個具體實例中，神經毒素是具有三個胺基酸序列區 域之單-多肽。第一胺基酸序列區域包括一個神經元結合 •37- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1282282

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 部份，其實質上完全衍生自選自下列之神經毒素，包括： benmi毒素；丁酸毒素；破傷風毒素；a，b ，q， E F及G型肉母毒素。較好，第—胺基酸.序列區域 係衍自毒素重鏈之羧基末端，Hc ^較好，第一胺基酸序 列區域係衍生自A型肉毒毒素之jjc。 第二胺基酸序列區域，可有效地將多肽或其部份穿越内 囊胞膜轉位至神經元之胞質内。在一個具體實例中，多肽 的第二胺基酸序列區含有一個重鏈之胺基末端，Hn，由 選自下列之神經毒素所衍±，包括：beratti毒素；丁酸毒 素；破傷風毒素；A ’ B，q，D，E，F及G型肉毒 毒素β較好，多肽的第二胺基酸序列區包括一個毒素重鏈 之胺基末端，ΗΝ，由Α型肉毒毒素所衍生。 第二胺基酸序列區具有治療活性，此係當其釋出至標的 細胞或神經元之胞質内時而言。在一個具體實例中，多肽 的第二胺基酸序列區包括一個毒素輕鏈，L，由選自下列 I神經毒素所衍生，包括：beratti毒素；丁酸毒素；破傷 風母素，A，B，Ci，D，E，F及G型肉毒毒素。較 好’ ^肽的第二胺基酸序列區包括一個毒素輕鏈，L，衍 生自A型肉毒毒素。 在一個具體實例中，多肽包括由破傷風毒素Hc衍生之 第一胺基酸序列區，由B型肉毒毒素取衍生之第二胺基 酸序列區，及由A型肉毒毒素l鏈衍生之第三胺基酸序列 區。在一個較佳具體實例中，多肽包括由B型肉毒毒素 Hc衍生之第一胺基酸序列區，由a型肉毒毒素衍生之 -38- — ΙΊ I Jr I I n I n _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) m m i n n ·

1' - I In - == 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇χ297公釐） 1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（36 ) 第二胺基酸序列區，及由A型肉毒毒素L鏈衍生之第三胺 基酸序列。所有此種其他組合均包括在本發明範圍内。 在另一具體實例中，多肽包括由A型肉毒毒素Hc衍生 之第一胺基酸序列區，其中胺基酸序列具有至少一個胺基 酸之刪除，修飾或取代；由A型肉毒毒素HN衍生之第二 胺基酸序列區，及由A型肉毒毒素L鏈衍生之第三胺基酸 序列。所有其他的此組合均包括在本發明範圍内。 如上示，這些多肽爲單鏈，且可能不如欲求之強力。爲 了增加其強度，第三胺基酸序列區可以蛋白水解酶，如胰 蛋白酶’解離移去。獨立的第三胺基酸序列區可利用二硫 化物橋黏附至原先的多肽。在一個具體實施例中，第三胺 基酸序列區再於第一胺基酸序列區黏附至原先多肽。在較 佳具體實例中，第三胺基酸序列區係再黏附至第二胺基酸 序列區。 若欲以未經修飾之神經毒素以治療上述非痙攣之疼痛， 神經毒素可由培養適合的細菌菌株而得。例如，A型肉毒 毒素之獲得可在鏺酵槽中發展及生長肉毒梭菌之培養物， 再依已知步驟回收及純化醱酵混合物。所有的肉毒毒素均 先口成成…活性（單一鏈蛋白質，其必需以蛋白酶解離或 弄缺口才可成爲具有神經活性。可製成A及g血清型肉 '毒毒素之菌株具有内源的蛋白酶，因此…血清型大 多數可以其活性型式自菌株培養巾回收。相反的，^ ， D及E血清型肉毒毒辛传由 Μ v ^ 母常係由非蛋白水解菌株所合成，因此 备自培養物中回收時通常 右r生的。B及F血清型由蛋 石氏張尺度兩國國

-39· ><297^T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1282282 五、發明説明（37 白水解及非蛋白水解株所產生，因此或以活性或無活性型 式被回收。然而，即使是蛋白水解株產生B血清型肉毒毒 素，也僅解離所產生毒素的一部份。成缺口對無缺口分子 之確實比例依培育時間長短，培養溫度等而定。因此，如 B型肉毒毒素任何製劑之特定比例，仍似乎是無活性的， 可能已知與A型比較下B型肉毒毒素強度顯著較低之 故。在臨床製劑中存在有無法性之肉毒毒素分子，此可歸 因於製劑整體之蛋白質負荷，其和增加之抗原性有關，但 不歸因於其臨床效力。另外已知B型肉毒毒素，一旦於肌 内注射，其在相同劑量水平下有較A型更短之作用期且強 度也較弱些。 若經修飾的神經毒素依據本發明用來治療非痙攣相關之 疼痛，則可運用重組體技術來產生欲求之神經毒素。技術 包括自天然來源中獲得遺傳物質，或合成來源，其指導合 成神經元結合部份，可有效轉位神經毒素或其部份之胺基 酸序列，及當釋出至標的細胞，較好是神經元，之胞質時 具有治療活性之胺基酸序列。在一個較佳具體實例中，遺 傳物質係指導合成梭菌肉毒毒素之Hc，Hn & L鏈，經修 飾之梭菌神經毒素及其片段。遺傳構體納入宿主細胞 擴大之，係先將遺傳構體與選殖載體，如噬菌體或質體先 融合。之後，選殖載體嵌入宿主内，較好是E· c〇u。=組 基因在宿主細胞中之表現後，生成之蛋白質可利用傳統技 術分離。 雖然提出重組體技術以產製經修飾之神經毒触 •、 組體 -40· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --；---?--^------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

1282282 一 A7

技術也可用來產生未經料之神料素，例如A型 素，因其可天然地存在，也由於么型肉毒毒 = 是已知的。 艰得序列 以重組方式產製這些神經毒素在此有許多的優點。例 如，自厭氧的梭菌培養物中產製神經毒素是_段麻煩 時的過程，包括涉及數個蛋白質沈殿步骤之多㈣純化策 略及母素&長且重覆I結晶作用或g階段之管柱層析。 顯著地，產物之高毒性顯示此步驟必需在嚴荷限制；進行 ㈣。在撥酵過程中，折疊之單鏈神經毒素，由内源梭 菌蛋白酶經由稱之爲弄缺口之過程所活化。此涉及自單鍵 移去約H)個胺基酸殘基生成二鏈型式，纟中二個鏈經由 鏈内二硫鍵保持共鍵相鏈結。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 弄缺口之神經毒素較無缺口的更具活性。缺口之量及精 崔所在依產製毒素之細菌血清型而變化。單鏈神經毒素活 化作用之差異，及因此弄缺口毒素之產率，均由特定菌株 產生之蛋白水解活性型式及量而變化。例如99%以上的Α 型肉毒梭菌單鏈神經毒素由Hall Α肉毒梭菌所活化，而Β 及Ε型株產生活化作用量較低之毒素（依醱酵時間定由〇- 75% )。因此，成熟神經毒素之高毒性，在神經毒素作成 治療劑市售上扮演重要部份。 因此’經遺傳操作之梭菌毒素之活化作用程度，是製造 這些物質之重要考量。若如肉毒毒素及破傷風毒素之神經 母素’可以尚產率在快速生長之細菌中（如異質之Ec〇li細 胞）以相當無毒性之單鏈（或毒性減低之單鏈）重組地表

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1282282 A7 B7 五、發明説明（39 ) 一 現’則此將是十分有益的，因其可安全且容易地分離，並 可容易地轉化成完全具活性之型式。 由於安全性是主要的考量，先前的工作係集中在大腸桿 菌之表現及破傷風及肉毒毒素個別Η及L鏈之純化；這些 分離出之鏈本身是無毒的；見]^6{&1.，31〇(：11^11^81^ 33:7014- 7020 (1994); Zhou et al·，Biochemistry 34:15175-15181 (1995)， 由是納入本案參考。在這些肽鏈分別產製及在嚴格控制之 條件下，Η及L鏈可以氧化之雙硫鏈結組合以形成神經麻 痒的二-鏈。 已知因肌肉痙攣（即繼發性的）所致之手術後疼痛，可由 手術如注射Α型肉毒毒素予以舒緩。Developmental

Medicine & Child Neurology 42; 116_121:2000。相反的，吾等 的發明強調，以手術前或之中，周邊投予肉毒毒素治療手 術後疼痛，其中疼痛非由痙攣性肌肉所致。 因此’病人或可在手術中或手術前表達約10天（其中手 術與痙攣性肌肉狀況之矯正或治療無關）局部且周邊地投 予約20單位至約300單位肉毒毒素，如A型肉毒毒素， 之快速濃注，注入病人眞皮之預料到之傷患所在或其鄰 近。肉毒毒素之注射可以是皮下或肌内注射。所進行之手 術並非爲了舒緩因過度活性或高張肌肉所致之疼痛，因爲 ，吾等驚訝地發現，許多非歸因於或非始自肌肉痙攣之疼痛 型式，在實行本發明下均可有顯著的舒緩。 依據本發明，爲舒緩手術後之疼痛，針對腫瘤移除，骨 骼移植，骨骼置換，精密檢查手術，傷口縫合，美容手術 _______ -42- 本f張尺度適^中國國家標準（CNS ) A4規;2丨0><297公楚) '~*--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ

五、發明説明（4〇 ) :抽脂，或其他需-道以上的切開及/或經由病人眞皮之 任何可能的（非肌肉失調症之處理）手術步驟，在此預定手 術療程下之病人均可予以治療’依據本發明是周邊投予由 約〇別單位/公斤至約60單位/公斤之肉毒毒素，如A或 B型肉毒毒素。手術後病人顯著舒緩之作用期可由约2至 约6.個月以上。 、在本發明範園内之方法，可提供病人改善之功能。改善 心病人功能··可定義爲由因素測知之改善，如減少疼痛， 減少臥床時間，走動增加，較健康的態度，較多變化之生 活型悲及/或正常肌肉張力下許可之復原。改善之病人功 能和生活品質改善（簡寫或Q〇L)是同義的。q^l可利用 如已知之SF-12或SF-36健康檢查計分步驟來評估。SF_36 所評估的是病人在身體功能八個區域之身體及精神健康狀 況，由於身體問題所致之角色限制，社會功能，身體的疼 痛，一般精神健康狀況，由於情緒所致之角色限制，生命 力及一般健康認知。所得的分數可與各種大眾及病患已發 表的數値作比較。 實例 以下非限制實例之提出，供一般精藝者可以特別較佳的 方法來治療本發明範圍内之非痙攣性一相關之疼痛，且並 不因而限制本發明範圍。在以下實例中，神經毒素非全身 性投藥之各種模式均可進行。例如，經由肌内快速濃注， 多次皮下注入眞皮，在疼痛處及區域内，或經由植入受控 釋出之植入物。 -43- 本紙張尺度適财關家辟（CNS)A4規格（ 210X297公楚） 1282282 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（41 ) 實例1 以周邊投予A型肉毒毒素以舒緩疼痛 進行二種實驗，此中使用Sprague-Dawley大鼠（約300至 約350克）。二實驗中所用的神經毒素均爲BOTOX® (A型 肉毒毒素經純化之神經毒素複合物）。在第一實驗中有4 個處理（給藥）組；控制組（注入食鹽水）0=4)， 7單位 BOTOX⑧/公斤大鼠（n=8)， 15單位的BOTOX® /公斤大鼠 (n=5)及30單位BOTOX® /公斤大鼠（n=4)。在控制組大鼠 中，將25微升0.9%食鹽水溶液皮下注入動物後腳之摭表 面。BOTOX®之投予位置及路徑和食鹽水之控制組是相同 的0 在注入食鹽水或BOTOX®後5天，將50微升5%福馬林 注入四個處理組各大鼠上，不論其先前是否已注射有食鹽 水或BOTOX®均如此。再以5分鐘間隔記錄個體動物抬腳 /舐腳之狀況，歷1小時。 第二組實驗之策略和第一實驗相同。在第二實驗中有三 個處理組（給藥）、控制組大鼠（注入食鹽水）（n=3)，3.5單 位/公斤大鼠（n=7)及7单位/公斤大鼠（η=8);且福馬林試 驗在原先BOTOX®或食鹽水注射後第12天時進行。 以二實驗的結果分別示於圖1及2。前5至10分鐘可 ,指爲第1相，之後是第2相。如圖1及2所示，在注射後 第5及12天時，在BOTOX®處理組動物中，有顯著的劑量 依賴之疼痛舒緩作用。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

1282282 A7 B7 五、 發明説明（42 ) 實例2 周邊投予肉毒毒素以钚鳝非痙攣性疼痛 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 46歲婦女由於關節炎，在三角區域出現疼痛。肌肉並 非在痙攣狀況下，也不呈現高張狀沉。病人以約50單位 及200單位間之A型肉毒毒素肌肉快速濃注治療。在投予 神缓毒素1-7天内，病人的疼痛可得到實質的舒緩。疼痛 顯著舒緩之作用期由約2至約6個月。由於骨質疏鬆症， 關節的固定，冠狀官能不足，頸部骨關節炎，局部肩膀疾 病，或由於長期臥床所致之肩，臂及手部之疼痛，均可類 似治療。 實例3 周邊投予神經毒素以治療治療後之神铤痛 治療後之神經痛是長期疼痛問題中最難處理的之一。有 此極難受疼痛過程的病人通常是較年長者，具有使衰弱之 疾病，且並不適合重大的介入性步骤。可由癌療癒合傷口 之出現及病史中可谷易地诊斷。病人是緊張且情緒上沮喪 的。治療後之神經痛可在任何地方發生，但最常見於胸 部〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一位76歲男性出現治療後疼痛。疼痛出現在腹部區 域。病人腹部皮下接受的50单位及200單位間A型肉毒 毒素之快速;辰注。彳又予神經母素後1 -7天内病人的疼痛可 實質地舒缓。顯著疼痛舒緩作用期是由約2至約6個月。 實例4 里_邊投予神經毒素以治療鼻咽腫瘤疼痛 -45- 本纸張尺度適财國園家標率（CNS ) M規格（210X297公羡） " " 1282282 A7 B7 五、發明説明（43 ) 這些腫瘤’最常是鱗狀細胞癌，通常在咽隱窩且會侵犯 頭顱基部。在面郅的疼痛是常有的。其本質上是連續，感 覺遲鈍的痠痛。 一位35歲男子出現鼻咽腫瘤型疼痛。據報告疼痛是在 下左頰。病人以約10單位及約35單位間之A型肉毒毒素 快速‘濃注’肌内注入頰中。在神經毒素投予至病人後U 天内’病人的疼痛可實質地舒緩。疼痛顯著舒緩之作用期 是由約2至約6個月。 實例5 周_逢我予神經毒素以治療長期發炎瘃痛 一位45歲病人在胸部出現長期發炎疼痛。病人以約5〇 單位及200單位間之A型肉毒毒素肌内快速濃注治療。投 予神經毒素後1 -7天内’病人的疼痛可實質上得到舒緩。 疼痛舒緩的顯著作用期是由約2至約6個月。 實例6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 周邊投予神經毒素以治療由灼傷引起的皮痛 一位51歲病人在經歷嚴重的且廣泛的手臂一級或二級 灼傷後感到疼痛。病人以約30單位至約200單位間之a 型肉毒毒素皮下快速濃注至手臂。在神經毒素投予至病人 後1-7天内，病人的疼痛可實質的舒緩。疼痛顯著舒緩的 作用期是由約2至约6個月。 實例7 神監姜素 一位63歲病人，由於關節炎而受關節疼痛之若。病人 1282282 經濟、那中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（44 ) 以約30單位及150單位間之A型肉毒毒素肌内快速濃注 至疼痛關節區域。在神經毒素投予後1-7天内，病人的疼 痛可實質地舒緩。疼痛顯著舒緩的作用期是由約2至約6 個月。 實例8 周邊投予神經毒素以治療手術德瘃痛 一位39歲病人，在手術前1小時至1〇天，局部且周邊 地快速濃注或皮下注入由約20單位至約3〇〇單位之肉毒 毒素，如A型肉毒毒素，注入病人眞皮預期傷口之所在或 鄰近。手術之進行並非爲了治療或舒緩肌肉失調症，如過 度活性或高張的肌肉。手術後病人疼痛顯著舒緩之作用期 是由2至約6個月。 實例9 投予神經毒素以治療内臟疚痛 一位46歲男性，出現未知病因之長期源自内臟之腹 痛。可假設有腫瘤或管道之收縮。將由約2〇單位至約3〇〇 單位之A型肉毒毒素皮下或器官内方式注入（注入預期疼 痛之所在）。在1至7天内疼痛可實質地舒緩。疼痛顯著 舒缓的作用期是由約2至約6個月。 雖然本發明已就某些較佳方法詳細説明，在本發明範圍 内的其他具體實例，版本及變化均是可能的。例如各種 神經毒素均可有效地應用於本發明中。 ^ 力r本發明包括 周邊投藥方法以舒緩非肌肉失調症相關的疼痛， 丹中二種 以上的神經毒素如二種以上的肉毒毒素， ” U呼或相繼投 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） m L^n m mnai mi i^n I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1282282 A7 B7 五、發明説明（45 ) 予。例如，可投予A型肉毒毒素直到喪失臨床反應或已有 中和抗體展開爲止，繼之投予E型肉毒毒素。另外，A-G 血清型肉毒毒素任二種以上的組合均可局部投予，以控制 欲求治療結果之開始及作用期。再者，在投予神經毒素之 前，同時或之後可投予非神經毒素化合物，以提供輔助作 用，.如在神經毒素（如肉毒毒素）開始展現其治療作用之 前，可加強或更快速地啓動去神經化作用。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -48- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（110X 297公釐）

Claims (1)

1. ♦ Hu

   年月η H S \、‘ 1282勒3〇1_37號專利申請案 A8 中文申請專利範圍替換本(94年8月）驾 ------ 〜 六、申請專利範圍 • 種肉毒毒素於製造用以治療哺乳動物疼痛之藥物之 用途’其中該藥物係供周邊投予，及該治療之疼痛係 慢性的、非肌肉痙攣性的且非頭痛性的疼痛。 2·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該肉毒毒素包 括神經元結合部份，其對該肉毒毒素係實質上天然 的。 3·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該肉毒毒素是 選自由A，B，Ci，D，E，F及G型肉毒毒素所組成 之群組。 4·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該肉毒毒素是 A型肉毒毒素。 5·根據申請專利範圍第丨項之用途，其中該肉毒毒素之 量係介於約0.01單位/公斤及約35單位/公斤之間。 6·根據申請專利範圍第i項之用途，其中該疼痛係實質 地舒緩達約1個月及約6個月之間。 7·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該周邊投予係 在哺乳動物經歷到感受傷害或疯狀開始之前進行。 8·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該周邊投藥係 在哺乳動物經歷到感受傷害事件開始之後進行。 9.根據申請專利範圍第1項之用途’其中該藥物係以舒 緩人類患者之疼痛。 10·根據申請專利範圍第9項之用途’其中該肉毒毒素是 選自由A，B，CpD，E，F及G型肉毒毒素所組成 之群組。 70019-940808.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公漦）

   装 訂

   1282282 A8 B8 C8 ----- ----D8 六、申請專利範園 1L根據申請專利範圍第1項之用途，其中該藥物係以治 療内臟疼癌，其經由非全身地局部投予，因而可舒緩 内臟疼痛。 12·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該疼痛係非繼 發於肌肉瘦攣。 以根據申請專利範圍第1項之用途，其中該投予係肌内投 予’直接於關節處投予，真皮内投予，真皮下投予或皮 下投予。 14_根據申請專利範圍第1 3項之用途，其中投予係皮下投 予。 15· —種肉毒毒素於製造用以治療哺乳動物神經疼痛之藥 物之用途，其中該藥物係供周邊投予，及該治療之疼 痛係與肌肉痙攣或頭痛無關的。 16·根據申請專利範圍第丨5項之用途，其中該疼痛係由三叉 神經痛所引起。 17·根據申請專利範圍第！ 5項之用途，其中該肉毒毒素是選 自包括由A，B，C〗，D，E，F及G型肉毒毒素之肉毒 毒素所組成之群組。 18·根據申請專利範圍第15項之用途，其中該肉毒毒素是a 型肉毒毒素》 19. 一種肉毒毒素於製造用以治療哺乳動物關節疼痛之藥 物之用途，其中該藥物係供周邊投予，及該治療之疼 痛係與肌肉痙攣或頭痛無關的。 、 20. 根據申請專利範圍第19項之用途，其中該肉毒毒素是選 自包括由A，B ’ Cl，D，E，…型肉毒毒素之肉毒 毒素所組成之群組。 70019-940808.DOC -2- 1282282 A8 B8 C8

   其中該肉毒毒素是A 其中該藥物係供肌内 其中該藥物係供疼痛 其中該關節疼痛係關 21·根據申請專利範圍第1 9項之用途， 型肉毒毒素。 22·根據申請專利範圍第1 9項之用途， 投予。 23·根據申請專利範圍第19項之用途， 關卽部位之肌内投予。 24·根據申請專利範圍第1 9項之用途， 節炎疼痛。 25. -種肉毒毒素於製造用以治療哺乳動物關節炎疼痛之 :物之用途’其中該藥物係於哺乳動物之關節炎關節 或關節炎關節部位供周邊投予，及該治療之疼俜盥 肌肉痙攣或頭痛無關的。 、 26.根據申請專利範圍第。項之用途，其 2 括由A，B，Ci，D，E，G„M;: = 毋素所組成之群組。 27·根據中料利範圍第25項之料，其中該肉毒毒素是A 型肉毒毒素。 28. -種肉毒毒素於製造用以治療哺乳動物發炎性疼痛之 樂物之用途，其中該藥物係供周邊投予，及該治療之 疼痛係與肌肉痙攣或頭痛無關的。 29. 根據申請專利範圍第28項之用途，其中該肉毒毒素是選 括由A’B，Cl’D，E，F__hW 毋素所組成之群組。 30. 根據中請專利範圍第28項之用途，其十該肉毒毒素是a 型肉毒毒素。 3L -種肉毒毒素於製造用以治療哺乳動物灼傷疼痛之藥 物之用途，其中該藥物係供周邊投予’及該治療之疼 70019-940808.DOC ^ ^ 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X297公釐〇 ---- 1282282

   痛係與肌肉痙攣或頭痛無關的。 32·根據申請專利範圍第3 1項之用途，其中該肉毒毒素是選 自包括由A，B，Ci，D ’E，F及G型肉毒毒素之内主 毒素所組成之群組。 33·根據申請專利範圍第3 1項之用途，其中該肉毒毒素是a 型肉毒毒素。 疋 34· —種肉毒毒素於製造用以治療哺乳動物腫瘤疼痛之藥 物之用途’其中該藥物係供周邊投予，及該治療之疼 痛係與肌肉痙攣或頭痛無關的。 35.根據申請專利範圍第3 4項之用途，其中該肉毒毒素是選 自包括由A，B，GV，D，E，F及G型肉毒毒素之肉毒 毒素所組成之群組。 36·根據申請專利範圍第34項之用途，其中該肉毒毒素是a 型肉毒毒素。 70019-940808.DOC 本紙張尺度適财@ g家標準(CNS) A4^(21GX 297公釐) ' --------