RS50344B - Stabilne tečne formulacije botulinskog otrova - Google Patents

Abstract

Stabilna, spremna za upotrebu, tečna farmaceutska formulacija koja obuhvata serumski albumin. farmaceutski prihvatljiv puferisani slani rastvor koji obezbedjuje puferisani pH opsega izmedju pH 5 i pH 6, i izolovani botulinski otrov koji je stabilan u formulaciji najmanje jednu godinu na temperaturi izmedju 0° and 10° C, ili najmanje 6 meseci na temperaturi izmedju 10° i 30° C. Prijava sadrži još 1 nezavisan i 20 zavisnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

Pronalazak se odnosi na terapeutske formulacije botulinskog otrova koje su stabilne za čuvanje u tečnom obliku na 0-10°C za periode od najmanje jedne do dve godine.

Osnova pronalaska

Botulinski otrov je polipeptidni proizvod anaerobne bakterije Clostridium botulinum. Otrov prouzrokuje paralizu mišića kod sisara blokiranjem presinaptičkog oslobađanja neurotransmitera acetilholina kod neuromuskulame veze (sinapse). Pošto je otrov dugo bio povezan sa smrtonosnim botulizmom, poslednjih godina se koristi terapeutski za lečenje izvesnih poremećaja sa nevoljnim mišićnim pokretima uključujući fokalne distonije (kao što su strabizam, esencijalna blefarospazma i hemifacijalni spazam), kao i segmentalne distonije (kao što su tortikolis, oromandibularna distonija i spazmična disfonija) i spasticiteti. Pronađena je korisnost otrova kod različitih kozmetičkih indikacija, kao što je nehirurška redukcija bora na licu, kao i u lečenju hiperhidrolize (ekscesivna perspiracija).

Obično postoje dva preparata botulinskog otrova (tipa A) koja su se pokazala u terapeutskoj upotrebi kod ljudi - "BOTOX" (reg. žig) (Oculinum (reg. žig; Allergan Inc., Irvine, CA) i "DYSPORT" (reg. žig) (Spexwood Pharmaceuticals, Ltd.; UK).

Obe formulacije su obezbeđene za kliničke lekare u liofilizovanom obliku (sušene na temperaturama ispod 0°C) za rekonstruisanje neposredno pre upotrebe.

Usled varijacija u potrebnim dozama od pacijenta do pacijenta, doziranje koje je potrebno za svakog pacijenta ponaosob može značajno da varira. Međutim, za izvesne indikacije klinički lekari mogu da primene samo malu frakciju sadržaja dobijene bočice tokom produženog vremenskog perioda, koji može biti nekoliko časova. Iako je jedna objavljena studija pokazala da se tečne formulacije botulinskog otrova mogu ponovo zamrznuti i odmrznuti sa substancijalnom retencijom aktivnosti (Schantz and Kautter, 1978), skorije studije koje procenjuju aktivnost rekonstruisanog otrova pokazuju da BOTOX (reg. žig) gubi najmanje 44% svoje moći kada se ponovo obrazuje i čuva u standardnom frižideru 12 sati (na približnoj temperaturi od 4°C). Povrh toga, kada se rekonstruisana formulacija čuva u zamrzivaču na niskim temperaturama od -70°C, ona nakon dve nedelje gubi oko 70% svoje moći (Gartlan i Hoffman, 1993). Iz ovih razloga je preporučljivo da se takve kompozicije ne koriste duže od 4 sata po ponovnom obrazovanju. Ovo može da rezultuje značajan gubitak leka, kao i troškova pacijenata.

Stoga postoji potreba za tečnom formulacijom botulinskog otrova spremnom za korišćenje, a koja se povoljno može utovariti, čuvati i koristiti kao što je to i potrebno kliničkim lekarima. Dati pronalazak obezbeđuje takvu formulaciju.

Sažetak pronalaska

Dati pronalazak upućuje na stabilne tečne formulacije botulinskog otrova za upotrebu u farmaceutskim preparatima. Prema datom pronalasku formulacije imaju prednost da su stabilne u tečnom obliku tokom čuvanja za produženi vremenski period (godinu dana ili duže) na standardnim temperaturama za frižider (približno 4±2°C, ili oko 2-8°C, ili još uopštenije u opsegu od 0-10°C). U odnosnom aspektu formulacije su stabilne u tečnom obliku tokom čuvanja na sobnoj temperaturi (oko 25°C, ili još opštenije u opsegu od 10-30°C) za najmanje šest meseci. Takve formulacije su naročito korisne kod stanja kojim se poboljšava redukcija ili inhibicija holinergičnog nerva koji se uvlači u region, naročito mišića ili grupe mišića, žlezda ili organa. Primeri za takva stanja su ovde opisani.

U jednom aspektu pronalazak obuhvata tečnu farmaceutsku formulaciju, koja uključuje izolovani botulinski otrov i pufer koji je sposoban da omogući opseg pH između pH 5 i pH 6. Prema ovom opštem izvođenju, toksin se meša u puferisanoj tečnosti da bi se dobila tečna formulacija koja ima pH između 5 i 6, naročito između pH 5.4 i pH 5.8, a po mogućstvu oko pH 5.5 - 5.6. Rezultujuća formulacija je stabilna najmanje godinu dana do barem dve godine na temperaturi u opsegu od 0-10°C, ili najmanje šest meseci na višim temperaturama kao što je to ranije opisano. Generalno, u saglasnosti sa pronalaskom bilo koji od poznatih serotipova botulinskog otrova (na primer, serotipovi A, B, C, D, E, F i G) ili drugi serotipovi sa ekvivalentnom biološkom aktivnošću, mogu biti inkorporirani u formulacije prema pronalasku. U poželjnim izvođenjima botulinski otrov koji se koristi u formulaciji je botulinski otrov serotipa A ili B izolovan iz Clostridium botulinum-a.

Poželjnim izvođenjem botulinski otrov tipa B je prisutan u formulaciji kao kompleks od 700 kilodaltona molekulske težine na koncentracijama od oko 100-20000 U/ml, a naročito između 1000-5000 U/ml. Kada se koristi tip A biće generalno prisutan u koncentraciji od oko 20-20000 U/ml, a naročito oko 100-1000 U/ml. Ukoliko se kombinacije različitih serotipova koriste u formulaciji, njihove korisne doze ili koncentracioni opsezi se mogu odrediti u proporciji sa dozama i koncentracijama koje su ovde date kroz primere prema njihovim odnosnim biološkim aktivnostima.

Puferi koji se mogu koristiti u formulaciji su fiziološki puferi koji se smatraju bezbednim za ubrizgavanje u tkivo sisara, a naročito ljudi.

Reprezentativni puferi obuhvataju. ali nisu ograničeni na fosfate: fosfat-citrat, sukcinat, acetat, citrat, akinitat, malat i puferske sisteme koji se baziraju na karbonatima. Po mogućstvu, formulacija takođe obuhvata ekscipijentni protein, kao što je humani serumski albumin ili želatin. Ocenjeno je da će se ekvivalenti za primere pufera i ekscipijentnih proteina prepoznati i koristiti od strane osoba koje su upućene u stanje tehnike. Formulacija otrova prema pronalasku može se spakovati u bilo koji od širokog spektra posuda ili bočica koje su poznate u stanju tehnike kako bi zadržale svoju moć.

U odnosnom aspektu pronalazak obuhvata postupak za lečenje pacijenata za potrebe ihibiranja holinergične transmisije, kao što su holinergična transmisija za izabrani mišić ili grupu mišića ili za specifični region žlezde, kao što su znojne žlezde, ili za poseban organ sa holinergičnom inervacijom. Pronalazak takođe obuhvata upotrebu formulacija prema pronalasku za dobijanje lekova za lečenje takvih indikacija. Primeri terapeutskih i kozmetičkih indikacija koje se mogu lečiti korišćenjem formulacije botulinskog otrova uključuju, ali nisu ograničeni na bleferospazam, strabizam, hemifacijalni spazam, upalu uha, spastični kolitis, anizmus, disinergiju urinaraog detrusora-sfinktera, stisnutu vilicu, iskrivljenje kičme, grčenje, kao što je spasticitet na osnovu jedne ili više grupa koje se sastoje od moždanog udara, povrede kičmene moždine, traume od udarca u glavu, moždana kap, multipl skleroze, Parkinsonove bolesti i distonije (na primer, spazmodični tortikolis (cervikalna distonija), spazmodična distonija, limbična distonija, laringenalna distonija, oromandibularna (Meige's) distonija). Formulacija se takođe može primeniti na perineum (perinealni mišići) pacijenta koji je u procesu rađanja deteta da bi prouzrokovao relaksaciju tih mišića. Primeri kozmetičkih indikacija za formulacije obuhvataju primenu na mišiće koji proizvode bore ili brazdaste bore. Ostale indikacije za formulaciju obuhvataju miofacijalni bol, glavobolju povezanu sa migrenom, vakularne disturbance, neuralgiju, neuropatiju, bol od artritisa, povratni bol, hiperhidrozu, rinoreu, astmu, eksesivno lučenje pljuvačke i eksesivno izlučivanje stomačne kiseline. Naročito specifični tokovi primene formulacija prema pronalasku uključuju intramuskularnu, subkutanoznu ili jontoforetičnu primenu. Na primer, u studijama koje su izvršene da bi se podupreo dati pronalazak, pronađeno je da je botulinski otrov tipa B efikasan u kontrolisanju cervikalne distonije kada se daje intramuskularno u podeljenoj ili pojedinačnoj dnevnoj dozi između 5000-10000 jedinica.

Na osnovu narednog odnosnog aspekta pronalazak obuhvata postupke za lečenje pacijenata koji imaju razvijeni imunitet ili otpornost na specifični botulinski serotip sa stabilnom tečnom formulacijom koja obuhvata sledeći serotip. Na primer, pacijent koji je teško izlečiv prema botulinskom otrovu tipa A može se lečiti stabilnom tečnom formulacijom koja sadrži bilo koji od botulinskih serotipova B, Cl, C2, D, E, F ili G ili pacijent koji je teško izlečiv prema botulinskom otrovu tipa B može se lečiti stabilnom tečnom formulacijom koja sadrži bilo koji od botulinskih serotipova A, B, Cl, C2, D, E, F i G da bi se omogućila obnovljena efikasnost.

Ovaj i ostali predmeti i oblici pronalaska će postati vidljiviji kada se sledeći detaljni opis pronalaska protumači u konjukciji sa pridruženim crtežima.

Detaljan opis pronalaska

Dati pronalazak se bavi stabilnim tečnim farmaceutskim formulacijama botulinskog otrova i njihovim primenama. Pošto su preparati sa botulinskim otrovom obično komercijalno izneti na tržište za Široki spektar terapeutskih i kozmetičkih primena, prema labilnosti aktivnog toksičnog sastojka u rastvoru formulacije se ponovo mogu obnoviti iz liofilizovanih sastojaka koji imaju skučene (oskudne) zahteve za čuvanje. Na primer, "BOTOX®" je dobijen kao liofilizovani prah, koji se mora utovariti i čuvati u zamrzivaču na oko -50°C i ponovo se može obnoviti dodatkom merenih količina sonog rastvora neposredno pre upotrebe. Prateći rekonstrukciju preporučuje se da se formula primenjuje na pacijenta u toku 4 sata i da se bilo koji ponovo obnovljeni proizvod drži u zamrzivaču tokom tog vremena (PDR, 1997); zamrzavanje i odmrzavanje ponovo obnovljenog proizvoda nije preporučivo. (Hoffman, 1993).

Dati pronalazak daje stabilnu tečnu formulaciju koja sadrži botulinski otrov i koji je stabilan kao tečnost najmanje godinu dana na standardnim temperaturama za frižider i najmanje šest meseci na sobnoj temperaturi. Ova formulacija je korisna zbog toga što ne zahteva neuobičajene uslove čuvanja ili uslove transporta i zbog toga što smanjuje mogućnost grešaka u rastvaranju otrova koje mogu dovesti do prekomerene doze.

I Definicije

Kao što je i ovde korišćeno, pojam "stabilan" se odnosi na biološku aktivnost ili jačinu biološki aktivne supstance, naročito botulinskog otrova tokom đefinisanog ili nedefinisanog vremenskog perioda.

Pojam "botulinski otrov" se odnosi na biološki aktivni protein ili proteinski kompleks i obično je izveden iz bakterije Clostridium botulinum. Pojam se odnosi na bilo koji od najmanje osam poznatih seroloških osetljivih toksina (A, B, Cl, D, E, F i G), kao i na bilo koje dodatne botulinske otrove sa istom opštom sposobnošću da inhibiraju holinergičnu neurotransmisiju, a koji grade aktivni molekul. Po slobodnom izboru, pojam obuhvata noseći protein koji je takođe izveden iz bakterije C. borulinum i koji gradi kompleks sa aktivnim molekulom, kao što je opisano u daljem tekstu u odeljku II A. Serotipovi botulinskog otrova se odnose farmakološki, kao što je kasnije raspravljeno u daljem tekstu, ali su imunološki razdvojeni. Generalno, aktivni toksični molekul ima molekulsku veličinu između 145 i 170 kilodaltona (kD). U kontekstu datog pronalaska jasno je da toksični protein obuhvata otrove i noseće proteine koji su izolovani iz prirodnih izvora, kao i odgovarajuće otrove i noseće proteine koji su proizvedeni rekombinantno na osnovu postupaka koji su poznati u stanju tehnike. Povrh toga, "botulinski otrov" uključuje proteine sa aminokiselinskim sekvencama koje obuhvataju konzervativne aminokiselinske supstitucije, uključujući deleciju u pogledu poznatih sekvenci botulinskih otrova kao što je niže opisano.

"Biološka aktivnost" za botulinski otrov se odnosi na sposobnost blokiranja neurotransmisije na sinapsama sa acetilholinskim receptorima blokiranjem oslobađanja acetilholina iz nervnih završetaka. Pojam se ovde koristi izmenjeno sa pojmovima "inhibicija holinergične transmisije, inhibicija holinergičnog izlaska" i njihovim deklinacijama. Kao što je ovde opisano,in vitroogledi za postizanje biološke aktivnosti za toksin obuhvataju LD50ogled sa misom. "Jedinica" za aktivnost u ovom ogledu definiše se kao količina toksičnog proteina potrebnog da ubije 50% miševa koji su testirani ovom dozom. Funkcionalna definicija za ovaj pojam je data u primer u 2.

Obične aminokiseline se tumače pomoću njihovih skraćenica od jednog ili tri slova: alanin (A, Ala), cistein (C, Cys), asparaginska kiselina (D, Asp), glutaminska kiselina (E, Glu), fenilalanin (F, Phe), glicin (G, Gly), hisidin (H, His), izoleucin (I, Ile), lizin (K, Lys), leucin (L, Leu), metionin (M, Met), asparagin (N, Asn), prolin (P, Pro), glutamin (Q, Gln), arginin (R, Arg), serin (S, Ser), treonin (T, Thr), valin (V, Val), triptofan (W, Trp), tirozin (Y, Tyr).

Pojam "tečna farmaceutska formulacija" se odnosi na farmaceutski ili biološki aktivni preparat ili lek koji je sposoban da se čuva u tečnom farmaceutskom ekscipijentu, kao što je puferisani rastvor soli ili fiziološki pufer za produženi vremenski period. Formulacija može da bude koncentrovana formulacija koja se pre upotrebe rastvara u sličnoj ili različitoj tečnosti.

Pojam "pufer" se odnosi na jedinjenje, obično soli, koja rastvorena u vodenom mediumu služi da se održava koncentracija slobodnog vodoničnog jona iz rastvora unutar određenog pH opsega kada se vodonični joni dodaju ili uklanjaju iz rastvora. Rečeno je da so ili rastvor kada obezbeđuju tu funkciju imaju "puferski kapacitet" ili da "puferišu" rastvor preko tog opsega. Generalno, pufer će imati adekvatni puferski kapacitet van opsega koji je unutar ±1 pH jedinice za njegovu pH. "Fiziološki pufer" je pufer koji nije toksičan za sisare, naročito ne za ljude, kada se primenjuje kao deo faramceutskog preparata. Dati su primeri relevantnih fizioloških pufera u kontekstu datog pronalaska.

"Farmaceutski prihvatljiva tečnost" je tečnost koja se smatra bezbednom za potrošnju ili za ubrizgavanje kod sisara, a naročito kod ljudi.

Kao što je ovde korišćeno, pojam "ekscipijentni protein" se odnosi na protein koji se dodaje farmaceutski aktivnom preparatu, ali koji ne dozvoljava dodatnu značajnu biološku aktivnost za preparat. Primeri za ekscipijentni protein uključuju, ali nisu ograničeni na serumske albumine, naročito na humani serumski albumin, rekombinantni humani serumski albumin i želatin.

Takvi proteini po mogućstvu će biti relativno neimunogeni na vrste sisara kojima farmaceutska formulacija treba da se daje.

Pojam "obuhvata" se koristi u kontekstu za dati pronalazak i naročito u kontekstu prema zahtevima, a ima značenje pojma "obuhvata" ili "karakteriše se time". Kompozicija ili postupak koji "obuhvata" elemente A, B i C može da uključe, osim A, B i C ostale neizreagovane elemente, kao što su X i Y.

Pojam "oko" kao što se koristi u kontekstu za dati pronalazak i naročito u kontekstu prema zahtevima, označava "približno" ili "skoro". U kontekstu numeričkih vrednosti bez obavezivanja na striktnu numeričku definiciju može se upotrebiti pojam za procenu vrednosti koja je ±10% od vrednosti ili navedenog opsega.

Svi ostali pojmovi koji su ovde korišćeni treba da se obrazuju da bi se došlo do uobičajenih definicija koje su poznate osobama upućenim u stanje tehnike ili su navedene u standardnim medicinskim ili naučnim rečnicima.

II Botulinski otrov

Kao što je ranije spomenuto, botulinski otrov je polipeptidni proizvod proizveden od strane različitih sojeva (bakterija) Clostridum botulinum. Ovi sojevi proizvode najmanje osam serološki određenih otrova (A, B, Cl, C2, D, E, F i G). I C. barati i C. butvricum proizvode pojedinačni serotip koji je sličan serotipovima E i F, a svaki za sebe je u vezi sa drugim (Simpson, 1993). Generalno, toksični molekul ima veličinu molekula od oko 145 do 170 kilodaltona (kD). U nekim slučajevima, aktivni toksični molekul se sastoji od dva lanca povezana disulfidnom vezom dobijenom od progenitora polipeptida. Na primer, botulinski otrov tipa B se proizvodi iz jediničnog polipeptidnog prekusora od 150 kD, koji se smota da bi se stvorio težak lanac (H-lanac) od dva fragmenta povezana disulfidnom (vezom) od 100 kD i laki lanac (L-lanac) od 50 kD za maksimalnu aktivnost. Otrovi koji se javlljaju u prirodi se vezuju nekovalentno za netoksične proteinske nosače, koji su takođe dobijeni od strane C. botulinum. Ovi noseći proteini se vezuju za toksične lance kako bi formirali komplekse od 900 kD (tip A) i po mogućstvu oko 700 kD za tip B. Noseći proteini se ponovo prečišćavaju otrovom i optimalno čine deo ovde opisanih formulacija. Različiti serotipovi botulinskog otrova pokazuju različite specifičnosti u vezivanju ćelija. Na primer, izgleda da se otrovi tipa A i tipa B i tipa E vezuju za isto sinaptosomalno vezujuće mesto, dok se toksin tipa B vezuje za određeno mesto i nije spreman za vezivanje na mestu vezivanja tipa A/E (Melling, 1988). Ne želeći da se vezuju pomoću naročite teorije ili mehanizma dejstva, veruje se da H-lanac toksina obezeđuje vezivanje za neuronske ćelije i aktivnosti prodiranja ćelije, dok L-lanac deluje na inhibiranje oslobađanja acetilholina na sinapsi. Dalje se veruje da botulinski otrovi tipa A i B koriste neznatno različite mehanizme da bi se prouzrokovala inhibicija oslobađanja acetilholina: tip A čepa protein udružen sa sinapsom-25 (SNAP-25) i tip B čepa membranski protein vezan sa vezikulom (VAMP ili sinaptobrevin), oba ova proteina su komponente sinaptičkog oslobađanja vezikula iz sinapsi.

Svi serotipovi otrova C. botulinum proizvode opšti fiziološki rezultat kod sisara. Svi oni inhibiraju ili blokiraju aktivnost holinergične sinapse što rezultuje u delimičnoj ili ukupnoj paralizi mišića ili inhibiciji organa ili žlezdane funkcije zavisno od mesta primene. Na osnovu toga formulacije prema datom pronalasku se mogu koristiti sa bilo kojim od serotipova botulinskog otrova izvedenog iz C. botulinum koji se karakteriše pomoću gore opisanih bioiloških aktivnosti. Aminokiselinske sekvence najvećeg broja prisutnih serotipova su takođe poznate ili se mogu odrediti postupcima poznatim u stanju tehnike. Jasno je da u kontekstu datog pronalaska formulacija botulinskog otrova treba biti upotrebi) ena tako da uključi rekombinantno dobijeni botulinski otrov koji ima supstituciju konzervativne aminokiseline u pogledu tako poznatih sekvenci. Generalno se takve supstitucije dobijaju iz standardnih supstitucionih vrsta aminokiselina koje se nalaze u prirodi. Na primer, standardne supstitucione vrste mogu da budu šest vrsta zasnovanih na opštim svojstvima bočnih lanaca u visokoj frekvenciji supstitucije homologih proteina u prirodi, kao što je, na primer, određeno pomoću standardne izmene frekvencije matriksa poznatog u stanju tehnike, kao što je izmenjena Dajhofova frekvencija matriksa (Davhoff). U ovom matriksu (Davhoff) na primer, vrste su klasa I: Cys, klasa II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala i Gly predstavljaju male alifatične bočne lance i bočne lance sa Oh-grupom; klasa III: Asn, Asp, Glu i Gln predstavljaju neutralne i negativno naelektrisane bočne lance sposobne za formiranje vodoničnih veza; klasa IV: His, Arg i Lys predstavljaju bazne polarne bočne lance; klasa V: Ile, Val i Leu predstavljaju aromatične bočne lance. Osim toga, svaka grupa može da uključi odnosne aminokiselinske analoge, kao što su ornitin, homoarginin, N-metil lizin, dimetil lizin ili trimetil lizin u klasi IV i halogenizovani tirozin u klasi VI. Klase dalje mogu da obuhvate i L i D stereoizomere, mada su za supstituciju poželjne L-amino kiseline. Na osnovu primera supstitucija Asp za sledeći ostatak iz klase III, kao što su Asn, Gln ili Glu, je konzervativna supstitucija.

Dok se aktivnost botulinskog otrova može meriti korišćenjem elektrofizioloških ogleda, poput onih koji su već poznati u stanju tehnike, aktivnost je generalno merena ubrizgavanjem otrova u manje životinje, kao što je miš, i određivanje doze otrova koja je potrebna da ubije u prošeku 50% testiranih životinja. Ova doza pripisuje se kao "letalna doza-50" il LD50i definisana je kao biološki aktivna jedinica. Doze za terapeutske primene su konvencijom standardizovane za takve jedinice. Kao što je diskutovano niže u odeljku III B, različiti serotipovi mogu da imaju različite humane terapeutske potencijale merene po LD50jedinici. Jačina terapeutske doze se može odrediti na osnovu ove informacije sledeći postupke poznate u stanju tehnike.

III Pobijanje botulinskog otrova

Ovaj odeljak opisuje postupke za dobijanje botulinskog otrova koji se koristi u formulacijama prema datom pronalasku.

A. Prečišćavanje botulinskog otrova iz C. botulinum

Ovaj odeljak obezbeđuje opšte postupke za dobijanje botulinskog otrova iz zasejanog C. botulinum kao što je dato primerom sa B tipom botulinskog otrova. Osim postupka koji su specifično ovde navedeni, alternativni postupci za dobijanje botulinskog otrova tipa A i B, kao i drugih poznatih serotipova, poznati su u stanju tehnike.

Kao što je ovde pomenuto, aktivan sastojak u formulacijama prema datom pronalasku je proteinska komponenta od ekstrakta C. botulinum poznata kao botulinski otrov, aktivna komponenta koja ima molekulsku težinu od 145-170 kD i koji je obično prisutan u nativnom proteinskom kompleksu koji ima mnogo veću molekulsku težinu. Ovaj odeljak obezbeđuje primere postupaka za prečišćavanje različitih botulinskih otrova, fokusirajuće se na serotipove A i B botulinskog otrova. Jasno je da generalna naučna literatura obezbeđuje vodič za alternativne postupke za prečišćavanje otrova i da će osoba koja je upućena u stanje tehnike biti sposobna da identifikuje takve postupke i da ih primenjuje na posebne otrove koji su potrebni za upotrebu u formulacijama dobijenim u saglasnosti sa datim pronalaskom.

Generalno, botulinski otrov tipa B izolovan je kao kompleks iz visoko titracione fermentacije kultura C. botulinum prema dobro poznatim postupcima u stanju tehnike. Osnovne polazne kulture mogu se dobiti u Sjedinjenim Američkim Državama od strane institucije koja nosi licencu Centra za kontrolu bolesti (CDC) i na drugom mestu prema nacionalnim regulacijama na raspodelu na organizme. Za prečišćavanje botulinskog otrova B tipa, C. botulinum Okra ili Bean B su odgovarajući polazni materijali. Smrznute osnovne polazne kulture ubrizgavaju se u epruvete sa kulturnim medijumom kao što je tioglikolatni medijum ili triptikaza peptonski medijum i kulture rastu i proizvode se prema postupcima koji su niže opisani i podrobno opisani u U.S. patentu 5,696,077 koji su ovde inkorporirani pomoću reference i kao što su niže opisani.

Ukratko, kulture se šire na osnovu postupaka poznatih u stanju tehnike da bi se proizvela dovoljna količina bakterijskog polaznog materijala kako bi se dobio željeni prinos otrova. Generalno, biće potrebno oko 20 litara bakterijske kulture za dobijanje 0.5 grama otrova. Kultura se uzima na sobnoj temperaturi i pH kulture se podešava do pH 3.5 sa sumpornom kiselinom ili drugom pogodnom kiselinom. Rezultujući precipitat ostavlja se da se staloži i preišćeni supernatant se dekantuje. Kalcijum hlorid se onda dodaje u precipitat sa mešanjem i zapremina se povećava sa dejonizovanom vodom, tako daje krajnja koncentracija za CaCl2oko 150 mm.

PH raste skoro do neutralne vrednosti (pH 6.5) i toksični rastvor se centrifugiranjem izbistri. Toksin se ponovo precipitira podešavanjem pH do 3.7. Rezultujući precipitat se ostavlja da se staloži i toksični precipitat se sakuplja centrifugiranjem, a potom se ponovo rastvara u puferu (pH 5.5) i iscrpno dializuje tokom noći nasuprot istom puferu. Dializovani toksin se centrifugira i rezultujući supernatant hromatografiše se kroz anjonsko-izmenjivačku kolonu (DEAE). Nevezana frakcija se sakuplja i testira na proteinski sadržaj. Toksinski kompleksi precipitiraju se iz ove frakcije dodatkom amonijum sulfata do oko 60% zasićenja. Tabeta se rastvara u fosfatnom puferu i dijalizuje nasuprot istom puferu (pH 7.9). Ovaj prečišćen toksinski preparat može se koristiti za dobijanje formulacije. Postupci za dobijanje botulinskog otrova tipa A takođe su dobro poznati u stanju tehnike. Na primer, Hambleton i dr. (1981) i Meling i dr. (1988), od kojih su oba inkorporirana pomoću reference, opisuje proizvodnju i prečišćavanje botulinskog otrova tipa A iz Clostridium botulinum tipa A NCTC 2916. Kulture bakterija narastaju iz proverene osnovne polazne kulture i ubrizgavanjem u 30 litara fermentatora koji radi u anaerobnim uslovima, na osnovu standardnh uslova poznatih u stanju tehnike. Prinos toksina neprekidno se posmatra (na primer, određivanjem sa LD5o), i kada se postigne maksimalni prinos (2x106 miša LDso/ml), kultura se zakišeljava (podešava se sa 3N H2SO4do pH 3.5) i otrov se sakuplja centrifugiranjem. Precipitirani sirovi toksin se ponovo rastvara i ekstrahuje sa 0.2M fosfatnim puferom (pH 6.0), uz tretman sa ribonukleazom (100 mg/ml na 340) i precipitaciju korišćenjem NH4SO4(60% zasićenje na 250). Precipitat se onda resuspenduje i podvrgava DEAE-Sefacel jonoizmenjivačkoj hromatografiji napH 5.5 (uz «bač» predabsorpciju). Kontroliše se aktivnosst frakcija i aktivne frakcije se ponovo precipitiraju korišćenjem NH4SO4(60% zasićenje na 250). Kao što je kasnije opisano, precipitat se može čuvati i ponovo rastvoriti da bi se dobila formulacija prema pronalasku. Formulacije prema datom pronalasku po mogućstvu obuhvataju vezujući toksinski kompleks, kao što su one dobijene ranije prema postupcima opisanim u pogledu na botulinski otrov tipa A i B, ili korišćenjem ekvivalentnih oblika za botulinske tipove otrova Cl, C2, D, E, F ili G, koji su dobijeni na osnovu postupaka poznatih u stanju tehnike. Jačina rastvora određena titracijom sa standardnom supstancom za toksin određuje se razblaživanjem ponovo obnovljenog vezujućeg kompleksa toksina u ekscipijentnom proteinu, tako da humani serumski albumin izbegava mehuriće i snažno mućkanje kao što se postiže mešanjem na vorteksu. Na osnovu pronalaska jačina rastvora određena titracijom sa standardnom supstancom određuje se u ogledu sa smrću miša kao što je LD50ogled sa mišom oisan u primeru 2. Radna osnovna polazna kultura se rastvara, alikvotira (tačno određeni deo nečega bez ostatka) i liofizira za čuvanje. Ovaj rastvor sa osnovnom polaznom strukturom testira se u ogledima na osnovu postupaka dobro poznatih u stanju tehnike i dat je u primeru 2.

IV Stabilne formulacije botulinskog otrova

Otkriće prema datom pronalasku je da se botulinski otrov može napraviti i čuvati u stabilnoj tečnoj formulaciji koja zadržava jačinu za produženi period vremena, na primer, bar 1-2 godine na temperaturama (rada) «frižidera» (tj. oko 5±3°C, ili još određenije oko 4±2°C, ili još opštije 0-10°C) ili bar 6 meseci na "sobnoj temperaturi"

(tj. oko 25°C ili još opštije 10-30°C). Takva formulalcija može se pogodno davati ljudima ili ostalim vrstama sisara kao farmaceutski preparat bez daljeg povraćaj a u tečno stanje od strane lekara. Formulacija se karakteriše sa pH između pH 5 i 6 po mogućstvu oko pH 5.5 - 5.6, održavanjem odgovarajućih uslova za pufere. Formulacija takođe može da obuhvati jedan ili više ekscipijentnih proteina. Primer 1 obezbeđuje detalje za dobijanje formulacije botulinskog otrova (tip B) na koncentracijama od 5000 U/ml. jasno je da se uslovi za takvu formaciju mogu primeniti na ostale serotipove botulinskog otrova kao što je botulinski otrov tipa A na

primeniti na ostale serotipove botulinskog otrova kao što je botulinski otrov tipa A na traženim koncentracijama za takve serotipove da bi se obezbedile stabilne formulacije u pogodno doziranim pakovanjima. Koncentrovani preparat botulinskog otrova, kao što su prečišćeni preparati toksina opisani ovde u pogledu tipova A i B, kratko se izmeša sa rastvaračem kao što je sukcinatni pufer sa pH između pH 5 i pH 6, po mogućstvu oko pH 5.6. U slučaju botulinskog otrova tipa B poželjna je koncentracija od oko 5000 U/ml, kao što je postignuto u LD50ogledu sa misom; međutim, bilo gde u opsegu od 100-20000 U/ml ili čak i više, može biti potrebno ili poželjeno, zavisno od doze koja treba da se oslobodi (daje). U slučaju botulinskog otrova tipa A mogu biti povoljne koncentracije u opsegu od 20-2000 i po mogućstvu oko 100-1000 U/ml. U svrhe farmaceutske proizvodnje uzima se uzorak formulacije i testira se u prisustvu mogućih kontaminanata patogenih bakterija (bioburden) i filtrira se u čašu ili polipropilensku bočicu za davanje pacijentu. Krajnji proizvod se može čuvati u tečnom stanju najmanje jednu godinu i po mogćstvu više od dve godine na 0-10°C bez značajnijeg gubitka biološke moći kao što je evidentirano sa <20% gubitka moći u LD50testu sa mišem (primer 2).

Diluent koji se odnosi na gore pomenuto može biti bilo koja farmaceutski prihvatljiva tečnost koja neće nepovoljno delovati na stabilnost kompleksa i koji održava stabilan opseg za pH između pH 5 i pH 6. Primeri naročito pogodnih pufera obuhvataju sukcinatne i fosfatne pufere; međutim, oni koji su upućeni u stanje tehnike prepoznaće da formulacija prema pronalasku neće biti ograničena na poseban pufer toliko dugo da bi pufer obezbedio prihvatljiv stepen stabilosti pH. "puferski kapacitet" u opsegu koji je označen. Generalno, pufer ima adekvatni puferski kapacitet od oko 1 pH jedinica za njegovu pK (Lachman, i dr. 1986). U kontekstu za dati pronalazak ovo obuhvata pufere sa pK u opsegu od oko 4.5 - 6.5. Stabilnost pufera može se proceniti na osnovu objavljenog tabelarnog prikazivanja za pK ili može biti određen empirijskim putem na osnovu postupaka poznatim u stanju tehnike. Osim ovde pomenutih sukcinatnih i fosfatnih pufera, ostali farmaceutski korisni puferi uključuju acetatni, citratni, akolinatni, malatni i karbonatni (pufer) (Lachman). PH rastvora se može podesiti đo željene krajnje tačke unutar opsega korišćenjem farmaceutski prihvatljive kiseline, na primer hlorovodonične ili sumporne kiseline ili baze, na primer, natrijum hidroksida.

Ekscipijentni protein koji se dodaje formulaciji može biti bilo koji od brojnih farmaceutski prihvatljivih proteina ili peptida. Po mogućstvu, ekscipijentni protein odabran je zbog njegove sposobnosti da se primenjuje na sisare bez izazivanja imunog odgovora. Na primer, humani serumski albumin je pogodan za upotrebu u farmaceutskim formulacijama koje se primenjuju na ljude; obrnuto, serumski albumin govečeta se može odabrati za upotrebu kod stoke. Ostali poznati farmaceutski proteinski ekscipijenti, kao što je na primer želatin, se može koristi za ovu svrhu. Ekscipijent je uključen u formulaciju na dovoljnim koncentracijama da bi se sprečila absorpcija proteinskog kompleksa toksina u posudi ili bočici u kojoj se čuva. Koncentracija ekscipijenta će da varira prema prirodi ekscipijenta i koncentraciji toksinskog kompleksa u formulaciji. Na način dat primerom u studijama koje se izvršavaju kao podrška datom pronalasku, određeno je da koncentracija od 0.5 mg/ml humanog serumskog albumina je dovoljna u svrhe formulacija sa 5000 U/ml botulinskog otrova tipa B dok ne izazove značajnu imunološku ili alergijsku reakciju kod najvećeg broja ljudi; koncentracije od oko 0.05mg i lmg po 1000U botulina B treba da obezbedi dovoljnu zaštitu.

Takođe, bile su opisane odgovarajuće koncentracije ekscipijenata za stabilizovanje botulinskog otrova tipa A. Na primer, "BOTOX" (reg. žig) stabilizuje se dodatkom 0.5 mg albumina na 100 jedinica toksične aktivnosti (PDR).

V Korisnost

A. Terapeutske i kozmetičke upotrebe za formulacije botulinskog otrova

Farmaceutske kompozicije prema datom pronalasku mogu se koristiti za brojne indikacije u kojima je poželjna inhibicija ili blokada holinergične neurotransmisije naročito, ali time nije ograničena holinergična transmisija udružena sa kontrolom glatkih ili skeletnih mišića. Ovaj deo obezbeđuje primere poremećaja u kojima se formulacije prema pronalasku mogu koristiti terapeutski; međutim, ovde dati primeri ne treba da budu upotrebljavani da bi ograničili pronalazak. Reprezentativne doze i putevi primene za neke od ovih indikacija su opisane kasnije u delu B.

Botulinski otrov, naročito botulinski otrov tipa A, pokazao se da je efikasan za lečenje poremećaja grčenja mišića. Pojedinačni režim lečenja (koji može da obuhvati višestruko intramuskularno ubrizgavanje) može da obezbedi koristi iz nekontrolisanog mišićnog spazma za period duži od nekoliko meseci. Na primer, "BOTOX®" (botulinski otrov tipa A) ustanovljen je od strane U.S. Food and Drug Administration za lokalizovano ubrizgavanje u očnu duplju za lečenje blefarospazma. Ostale indikacije obuhvataju ostale fokalne distonije, kao što je laringalna distija, Meige's sindrom (oromandibularna distonija; orofacijalna diskinezija), spazmodični tortikolitis (Hardman i dr., 1996), limbična distonija, animus i disinergija svinktera urinarnog detrusa, blefarospazam, strabismus, hemifacijalni spazam, kao i rinorea, zapaljenje srednjeg uha, ekscesivna salivacija, astma, spazmični kolitis, ekcesivna sekrecija stomačne kiseline (videti, na primer, U.S. Patent 5,766,005), glavobolja udružena sa migrenom, vaskularne disturbance, neuralgija ili neuropatija (U.S. Patent 5,714,468; WO 953041), bol od artritisa (WO 9517904), poremećaji gastrointestinalnog trakta koji obuhvataju poprečno prugaste ili glatke mišiće (U.S.patent 5,674,205), relaksaciju perineuma tokom porođaja (U.S.patent 5,562,899) ili olakšanje grčenja vilice (U.S. Patent 5,298,019). Botulinski otrov tipa A takođe se lokalno ubrizgava da bi se postiglo kozmetičko olakšanje mišićnog tonusa koji uzrokuje "brazde" na licu i da bi se postigao "browlift" (Frankel, 1998) i nađeno je da je korisno kada se ubrizgava intramuskularno za lečenje fokalne hiperhidroze (prekomerno znojenje; WO 9528171; U.S. patent 5,766,605) kao i za lečenje juvenilne iskrivljenosti kičme kod odraslih osoba (U.S. Patent 5,053,005) i juvenilne moždane kapi (U.S. patent 5,298,019; AMO 9305800) i spazma i nehotične kontrakcije izazvane moždanom kapi, multiplskleroza ili Parkinsonova bolest (U.S. patent 5,183,462). Sve ovde naznačene reference ovim su inkorporirane referencom u svojoj celini.

U eksperimentima sprovedenim radi podrške datom pronalasku, testirane su stabilne tečne formulacije sa botulinskim otrovom tipa B i nađeno je da su efikasne kod cervikalne distonije, poznatije i kao torkolitis, stanja u kojima individualno iskustvo sa nehotičnim spazmima i mišićnim kontrakcijama u glavi, jeziku i kičmi koji jedan za drugim redom rezultuju pomerenim ili iskrenutim pokretima glave. Ova stanja su takođe često praćena drhtanjem i bolom u skeletnim mišićima. Generalno, uzroci poremećaja su nepoznati; međutim, razmišljalo se da je to rezultat disfunkcije centralnog nervnog sistema što rezultuje hiperaktivnošću muskulature. Režimi lečenja obuhvataju antiholinergične, dopaminergične, mišićne releksante, anti-spazmazmatični i antikonvulzantne lekove, ne obezbeđuju neprekidno olakšanje. Botulinski otrov tipa B efikasan je u lečenju ovog stanja izazivanjem lokalne paralize ili pareze, koji ima tipično vreme napada od oko 1 nedelju posle ubrizgavanja i trajanje odgovora od oko 1 do 4 meseca.

Forumulacije za ostale serotipove botulinskog otrova su korisne kod primarnog lečenja bilo kojeg od stanja prethodno opisanih u pogledu tipa A. Osim toga, kao što je ranije pomenut, botulinski otrovi tipa B-G su takođe korisni u lečenju pacijenata koji postaju teško izlečivi tretmanom sa botulinskim otrovom tipa A zbog prisustva imunog odgovora na toksin. Suprotno, serotip A može se koristiti kod pacijenata koji postaju teško izlečivi tretmanom sa botulinskim otrovom tipa B ili bilo kojim od ostalih serotipova otrova. Formulacije za jedan ili više serotipova botulinskog otrova se mogu napraviti i koristiti u saglasnosti sa datim pronalaskom.

Generalno, ocenjeno je da u pogledu sličnih bioloških efekata, različiti tipovi botulinskog otrova mogu biti zamenjivi u lečenju različitih poremećaja, naročito onih koji se odnose na mišićni spasticitet. Međutim, kao što je opisano kasnije u pogledu tipova A i B, efikasne doze (izražene u pogledu LD50ili bioloških jedinica) mogu značajno da variraju između različitih serotipova. Procene za ekvivalentne doze mogu se zasnovati na poznatim opisanim dozama u pogledu kojeg testiranog otrova.

B. Doziranje i načini primene

Botulinski toksin je poznat kao moćan i ponekad smrtonosan otrov za životinje. Međutim, kao što je kasnije opisano kada je preduzeta dovoljna opreznost prilikom podešavanja načina primene i doziranja, ovaj lek se može bezbedno koristiti kod ljudi. Doziranje za različite oblike botulinskog otrova variraće prema serotipu korišćenog otrova. Na primer, u eksperimentima koji se sprovode radi pomoći datom pronalasku, nađeno je da poređenjem LD50jedinica kod miša botulinski otrov tipa A ("BOTOX®" ) je oko 4-6 puta moćniji nego botulinski otrov tipa B u izazivanju paralize kod majmuna kao što je procenjeno elektrofiziološkim merenjima za izabrane skeletne mišiće. Ovo posmatranje je saglasno sa eksperimentalnim rezultatima kod pacova koji pokazuju velike razlike u količinama za dva otrova koja su potrebna da proizvedu paralizu udova pacova (Sellin; Jackson). U pogledu ovih posmatranja, odgovarajuće ekvivalentne doze se mogu empirijski proceniti ili odrediti od strane upućenog lekara.

Varijacije u preporučenom doziranju može takođe da varira u saglasnosti sa istorijom (bolesti) pacijenta. Pacijenti koji su primili ponovljene doze botulinskog otrova tipa A, na primer, pokazano je da postaju "otporni" na dalje lečenje, tražeći veće doze da bi se proizveo ekvivalentan efekat tokom vremena. Bez vezivanja za bilo koji mehanizam dejstva, veruje se da se ovaj fenomen odnosi na razvijanje kod pacijenata specifičnog imunog odgovora za serotip. Izveštaji na upadanje antitela kod pacijenata vodi ka ponovljenoj terapiji za botulinski otrov tipa A u opsegu od 3% do 57%. Shodno tome, preporučuje se da u slučaju da klinički lekari odluče da zamene serotipove tokom režima lečenja, inicijalna doza za novi serotip treba da bude izračunata na osnovu prirode pacijenta, pre nego na osnovu istorije doziranja pacijenta.

Odgovarajući postupci za primenu obuhvataju bilo koji od njih koji će rezultovati u oslobađanju aktivnog sastojka toksina u tkivo od značaja, bez uzrokovanja posebnih sporednih efekata kod pacijenata. Takav postupak obuhvata bez ograničavanja intramuskularno (i.m.) ubrizgavanje, opštu primenu, subdermalno, perineuralnu primenu, jontoforetičnu tekuću primenu i slično. Specifični postupci za primenu botulinskih otrova koji uključuju manevre za ograničavanje sistemske raspodele aktivnih komponenata, dobro su poznati u stanju tehnike. Elektromiografija se može koristiti da identifikuje i da preciznije locira specifičnu grupu mišića, naročito za lečenja koja obuhvataju mišiće koji su komplikovani za identifikovanje, kao što su oni u očnoj duplji oka, larinksa i pterigoidnoj oblasti kao i mišića kod ugojenih subjekata.

Lečenje distonija obično se izvršava davanjem otrova u blizini zona inervacije za pobuđene mišiće, obično inramuskularnim ubrizgavanjem korišćenjem hipodermične igle. Tipično, rezultujuća lokalizovana paraliza može da obezbedi olakšanje kod pacijenta u periodu do 3 ili 4 meseca. Pacijenti se mogu testirati sa nižim dozama i pojedinačno titered do optimalne doze da bi se postigla dovoljna neuromuskularna blokada za ispravljanje bilo kakve disfunkcije bez proizvodnje paralize. Promene u doziranju mogu biti posmatrane ukoliko pacijent postane otporan na otrov. Prednost datog pronalaska je u tome da savladava opšti problem doziranja koji se odnosi na nestabilnost toksičnog materijala u rastvoru što može dovesti do daljih nejasnoća u pogledu odgovarajuće doze.

Preporučene doze botulinskog otrova tipa A određene su za brojne indikacije i poznate su u stanju tehnike. Na primer, za lečenje strabizma doza od 1.25 - 2.5 U botulinskog otrova tipa A je preporučljiva za primenu na poprečne mišiće i za horizontalni strabizam manje od 20 dioptera; 2.5 - 5 U je preporučljiva doza za horizontalni strabizam veća je od 20 prism dioptera (Phvsician's Desk Reference, 51<st>Edition).

Botulinski otrov tipa A takođe se koristi za lečenje blefarospazma sa ubrizganim dozama od 1.25 - 2.5 U, korišćenjem 27-40 izbaždarene igle, u medijalni i lateralni pre-tarsal orbicularis oculi gornjeg kapka i u lateralni pre-tarsal orbicularis oculi donjeg kapka. Očekuje se da lečenje traje oko 3 meseca; sa ponavljanjem lečenja doziranje može da se poveća do dvostruke vrednosti u zavisnosti od odgovora pacijenta. Preporučivo je da kumulativna doza od ne više od 200 U botulinskog otrova tipa A treba da bude data tokom tridesetodnevnog perioda (Phvsician's Desk Reference, 5T1 Edition).

Primer 3 obezbeđuje primere studije o doziranju koje su rangirane za upotrebu botulinskog otrova tipa B u lečenju cervikalne distonije (tortikolis) korišćenjem formulacija u saglasnosti sa datim pronalaskom. U ovim studijama koje su kasnije podvučene, tečna formulacija botulinskog otrova tipa B u saglasnosti sa pronalaskom obezbeđena je da bi se primenila od strane kliničkih lekara sa instrukcijama da opskrbe formulaciju u kliničkom frižideru sa kontrolom temperatura između 2-8°C. Generalno, formulacija je opskrbljena od raspodeljenih porcija i čuva se na preporučivoj temperaturi u vremenu od 6-12 meseci. Klinički pacijenti primaju približno šestomesečnu opskrbu formulacije.

Ukratko, pacijentima su date varijabilne doze otrova intramuskularnim (i.m.) ubrizgavanjem u 2-4 površinska dela jezika i/ili grupu mišića ramena određenih u saglasnosti sa procenom kliničkih lekara o udelu mišića u poremećaju. U jednoj studiji su davane pojedinačno podeljene doze uopsegu od 100-1200 U sa kumulativnim dozama između 270-2280 U tokom perioda koji doseže 398 dana. Tokom studije je uočeno da su svi pacijenti iskusili poboljšanje i nije bilo smanjenja u jačini formulacije.

Dalje studije sprovedene radi podrške datom pronalasku otkrivaju da se pacijenti koji postaju otporni na botulinski otrov tipa A mogu lečiti botulinskim otrovom tipa B. Pacijenti koji učestvuju u studiji pokazju smanjeno svojstvo odgovaranja na botulinski otrov tipa A i smatraju se uspešno lečenim ukoliko posle lečenja pokazuju najmanje 25% smanjenje ukupnog rezultata (smanjenje = poboljšanje), kao što je procenjeno sa Toronto Western Spasmodic Tortikolis Rating Scale (TWSTRS; Conskv, 1994), poređenjem sa osnovnim rezultatom. Primenjuju se pojedinačne doze između 150-1430 U za botulinski otrov tipa B, sa kumulativnim dozama u opsegu od 300-12000 jedinica do 117 dana kao što je opisano u primeru 3. Pacijenti su iskusili poboljšanje ovom studijom, a naročito sa višim dozama i nema dokaza za razvoj blokiranih antitela na botulinski tip B, niti ima dokaza o smanjenju jačine formulacije. U daljoj studiji su periodično primenjene individualne doze od 0, 400, 1200 i 2400 U za formulaciju botulinskog otrova tipa B za period do 203 dana sa uspehom u lečenju tortikolisa, kao što je opisano ovde.

Sledeći primeri ilustruju, ali ni na koji način ne ograničavaju predmetni pronalazak.

PRIMERI

Materijali

Ukoliko drugačije nije označeno, svi ovde opisani reagensi mogu se dobiti od bilo kojeg cenjenog komercijalnog prodavca koji prodaje reagense za upotrebu u hemijskoj, biohemijskoj, biotehnološkoj ili farmaceutskoj industriji kao što je podesno.

Primer1: Dobijanje stabilne formulacije botulinskog otrova

A. Pobijanje sukcinatnog pufera

Sukcinatni pufer se dobija u porciji od 31 sa 2.7 mg/ml đisodijum sukcinata i 5.8 mg/ml natrijum hlorida, koja je dopunjena sa 0.5 mg/ml humanog serumskog albumina (Michigan Biological Prodducts Institute). Koncentrovana hlorovodonična kiselina se koristi da se podesi pH pufera do pH 5.6. Pufer se filtrira kroz 0.2 mm filter u zapečaćenoj posudi. Pre upotrebe se uzima uzorak pufera i testira se za pH, bakterijski endotoksin i kontaminiranih mikroorganizama "bioburden".

B. Pobijanje formulacije botulinskog otrova

Alikovt koncentrovanog botulinskog otrova tipa B razblažuje se približno 1000 puta korišćenjem sukcinatnog pufera (pH 5.6) da bi se dobila jačina od 5000 + 1000 U/ml. Razblaženi otrov se čuva u zapečaćenoj staklenoj posudi od 2 1 i vodi se kao "rastvor velike zapremine". Zatim se taj rastvor čuva na 5±3°C, dok se materijal ne spremi za podnošenje.

Pre podnošenja, uzima se uzorak ovog rastvora i testira na prisustvo kontaminiranih mikroorganizama (Bioburden) na osnovu standardnih postupaka poznatih u stanju tehnike. Zatim se prenosi na peristaltičku pumpu preko medical grade tubing i filtrira (0.2 u.m) u sterilni prihvatnih koji je smešten unutar prostorije za podnošenje. Staklene bočice od 3.5 cc pune se rezultujućim sterilisanim filtriranim "rastvorom velike zapremine" u alikvotima od 0.5 ml (2500 U), 1 ml (5000 U) ili 2 ml (10000 U).

Kompozicija krajnjeg proizvoda iz posude pokazana je u tabeli 1.

TABELA1

Sastav za formulaciju botulina B

Aktivni sastojak Inaktivni sastojci Koncentracija

Botulinski otrov tipa B - 5000 T 1000 LDS0U/ml Sukcinat, USP lo mM

- Natrijum hlorid, USP 100 mM

Humani albumin, 0.5 mg/L

oslobođeni FDA

Hlorovodonična kiselina, Za podešavanje pH [ m I

Primer 2: Testiranje stabilnosti formulacije botulinskog otrova

A. Rezultati stabilnosti formulacije

Botulinski otrov tipa B se proizvodi i razblažuje kao što je ranije opisano do koncentracije od 2500 jedinice/ml i čuva se u alikvotima od 1 ml u staklenoj bočici od 5 ml na 5°C do i uključujući 30 meseci. Na 0, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 i 30 meseci uz početno čuvanje, alikvoti su izabrani nasumice i testirani su na jačinu u LD50ogledu sa mišom. Rastvori se takođe posmatraju na prisustvo i testiraju se za pH na osnovu standardnih posstupaka.

Tabela 2 pokazuje rezultate testiranja alikvota uklonjenih u različitim tačkama vremena.

Ovi rezultati pokazuju da su formulacije napravljene prema datom pronalasku stabilne, kao što je evidentirano na osnovu jačine koja je unutar opsega jačina datih od početnog vremena, najmanje 30 meseci od čuvanja na 5°C.

Tabela 3 pokazuje rezultate za testirane alikvote formulacija botulinskog otrova tipa B koji su đobijeni i alikvotirani kao što je ranije opisano, ali su čuvani na 25°C. Ovi rezultati pokazuju da su formulacije stabilne u periodu od najmanje 6 meseci na 25°C, kao što je evidentirano na osnovu srednje jačine koja zadržava barem oko 90%, i po mogućstvu barem 95%, posle 6 meseci čuvanja i najmanje oko 75% od početne jačine posle 9 meseci čuvanja na 25°C.

B. Test stabilnosti

1.Određivanje pH za formulaciju botulinskog otrova

pH formulacije botulinskog otrova tipa B se mere korišćenjem Fišerovog Scientific Accumet pH metra, Model 50 sa automatskom sondom sa temperaturnom kompenzacijom. Elektroda koja se koristi je Orion Ross Combination Electrode sa KCI referentnom elektrodom. pH se određuje na osnovu standardne standardizacije sa dve tačke( two~ point standardizatiori)(pH 4.0, pH 7.0) prema uputstvima proizvođača. Urađena su tri merenja za svaki uzorak. PH vrednosti se zabeleže za dve značajne vrednosti i uzima se srednja vrednost.

2.LDjn test jačine na mišu

Zdrav, nekorišćeni CFW ili CD-1 miš bilo kog pola, težine 18 do 22g koristi se da bi se odredila LD50. Za svaki punjeni proizvod, miševi su testirani za 5 doza formulacije botulinskog otrova tipa B. Svaki ogled se odvija petoostruko.

Dva koncentrovana rastvora koja se razblažuju pre upotrebe dobijaju se iz testiranog uzorka. Koncentrovani rastvor A se dobija razblaživanjem testiranog uzorka na procenjenoj jačini od 750 U/ml sa želatinskim fosfatnim puferom pH 6.2. Koncentrovani rastvor B se dobija 10-strukim razblaživanjem rastvora A na 75 U/ml. Sledeći testovi razblaživanja pripremaju se od koncentrovanog rastvora B: 1:7.5, 1:10, 1:13.5, 1:18 i 1:24.3. Mišu se daju injekcije od 0.2 ml interperitonealno za odgovarajuće razblaživanje jedinjenja. Miševi su čuvani 4 dana posle davanja injekcije i dnevno su posmatrani. Beleži se smrt za bilo kojeg od miševa. Zapažanja su završena posle četiri dana.

Kumulativne smrti (CD) na različitim nivoima razblaživanja izračunavaju se dodavanjem broja smrti od maksimalnog razblaživanja naviše. Kumulativni preživeli (opstali slučajevi) (CS) izračunati su dodavanjem broja preživelih miševa od minimalnog razblaživanja naniže. %CD se izračunava kao CD/(CD+CS) x 100% za svako razblaživanje. Razblaživanje koje je predstavljeno kao LD50određuje se postupkom čitanja proporcionalne distance (rastojanja) (PD) i Muench korišćenjem razblaživanja koje proizvodi %CD vrednosti koje su spojene velikom zagradom sa 50% kumulativne smrti:

PD vrednost je dobijena i umnožena pomoću razlike log između razblaženih nivoa koji se nalaze u zagradi sa 50% CD. Ova vrednost se dodaje log razblaživanja sa mortalitetom (CD) većem od 50 da bi se dobilo razblaživanje koje predstavlja LD50.

Antilog za ovo razblaživanje izračunava se da bi se dobio broj LD50jedinica otrova po injekcionoj zapremini (0.2 ml). Ovaj broj se onda pomnoži sa 5 da bi se dobile LD50 jedinice po ml otrova koncentrovanog rastvora B.

LD50jedinice po ml koncentrovanog rastvora B pomnožene su sa njegovim faktorom razblaživanja (tj. razblaženosti koja je potrebna za dobijanje procenjene jačine od 75 U/ml) da bi se dobila jačina uzorka. Aritmetička sredina i standardna devijacija po ml LD50 jedinice su izračunate za 5 prihvatljivih testova.

3.Javljanje formulacije

Pojavljivanje je procenjeno kroz vizuelni pregled naspram crne i bele pozadine pod sjajnim svetlom uz pažljivu (blagu) vrtlog. Boja, jasnoća i prisustvo vidljivih čestica je bilo procenjeno.

Primer 3: Tretman cervikalne distonije (CD)

A. Razblaživnje leka, proračun, primena i režim doziranja

1.Postupanje ( obrađivanje) leka

Bočice sa lekom napunjene su da bi se oslobodilo 2.0 ml (10000 U), 1.0 ml (5000 U) ili 0.5 ml (2500 U) nerazblaženog leka. Snažno mućkanje ili pojava mehurića se izbegavaju u svim fazama rukovanja, pošto se botulinski otrov denaturiše pri bilo kojem od ovih uslova. Formulacija se uklanja iz bočice korišćenjem 1 ml tuberkulinske brizgalice da bi se uklanjanjem obezbedila tačna zapremina.

2. Proračun za lek

Botulinski otrov tipa B se primenjuje na pacijente sa cervikalnom distonijom (CD) davanjem sadržaja iz odgovarajućih bočica da bi se obezbedila doziranje koje je označeno u tabeli dole. Jedinice za miša (U) za povećanje doze izračunata je kao što sledi, gde je 1 U količina otrova prisutna u dozi koja predstavlja LD5o, određena je u mišu kao što je opisano u primeru 2.

Za svakao doziranje botulinski otrov tipa B primenjen je na osnovu standardne procedure, kao što je kasnije opisano. Injekcije jedinjenja davane su od strane neurologa prethodno obučenih (upućenih) u terapeutsku korist botulinskog otrova pacijentima sa CD. Od pacijenata je traženo da se odmaraju što je više moguće da bi se olakšalo posmatranje glave i jezika u miru. Određeni su mišići jezika koji su uključeni u izazivanje CD i potvrđeno je palpatacijom obuhvaćenih mišiža. Sa obazrivošću istraživača izvršena je procena za EMG da bi se dalje pronašli izazvani mišići. Mišići koji se uzimaju u obzir za tretman u ovom protokolu su mišić podizač

(levator scapulae, scalenus medius) i prednji mišići (prema glavi), semispinalis capitism, splenius capitus, sternocleidomastoid i trapezius. Injekcije su davane u svaki od ovih mišića na 1 do 5 mesta. Ukupno injekciono vreme po mestu manje je ili jednako 1 ml da bi se izbeglo grčenje lokalnog tkiva, ali je najmanje 0.1 ml da bi se olakšalo tačno merenje zapremine sa standardnom brizgalicom od 1.0 ml. U početku, pacijenti primaju ukupnu dozu od 5000 U, sa sledećim dozama od oko 1500 jedinica prilikom nastavljenih poseta klinici.

B. Kliničke studije za cervikalnu distoniju (CD)

1. Studija 1

Osam pacijenata (3 mužjaka, 5 ženki) sa srednjim prošekom godina od 43.9 godina i individualnim kliničkim dijagnozama za idiopatski CD učestvuju u studiji u kojima se formulacija botulinskog otrova tipa B ubrizgana u 2-4 površinska dela jezika ili mišića ramena. Pacijenti se izlažu tretmanu svake 4 nedelje pod uslovom da nema ozbiljnijih štetnih efekata ili stalnog kliničkog poboljšanja prilikom tretmana. Pacijenti učestvuju u 1-5 sesija sa doziranjem. Kao što je ovde opisano, individualne sesije sa doziranjem u opsegu su od 100 U do 1200 U sa ukupnim kumulativnim dozama u opsegu od 270 U do 2280 U za formulaciju botulinskog otrova tipa B. Efikasnost se procenjujem korišćenjem tzv. "Tsui Torticolis Scale" (Tsui, J.K.C.

(1986), Lancet 2: 245-247). Pacijenti učestvuju u studiji od 127 do 398 dana, sa prosečnim vremenom za studiju od 244.8 dana. Rezultati za tortikolis su veoma slični baznim vrednostima is vi pacijenti doživljavaju umeren pad u vrednostima rezultata (pad=poboljšanje) u zavisnosti od doziranja, kada se poredi ukupna količina leka koja se daje (pacijentima). Pacijenti doživljavaju poboljšanje kod tortikolis stanja. U ovoj studiji nema naznaka o razvijanju blokiranih antitela.

2.Studija 2

Pacijenti koji učestvuju u ovoj studiji imaju kliničku dijagnozu za idiopatsku CD (tortikolis) i imaju razvijenu otpornost na botulinski otrov tipa A. Pacijenti primaju intramuskularno injekcije sa formulacijom botulinskog otrova tipa B na osnovu datog pronalaska na 2-4 površinska mesta na jeziku i mišićima ramena.

Dvanaest pacijenata (srednjeg godišta 52.3 godine) čine sastavni deo ove studije i upotpunjuju studiju. Pacijenti učestvuju u studiji u periodu od 37 do 127 dana, sa srednjim vremenom od 65 dana. Pacijenti se tretiraju sa 1 do 3 doze leka iz studije. Kumulativne doze su počev od 940-2100 U, i individualne doze su počev od 150-1430 U za botulinski otrov tipa B. Prosečna dužina vremenskog intervala između ovih sesija (sa davanjem doza) je oko 22.3 dana za pacijente koji primaju niže doze (ukupno 100-899 U) i 48.4 dana za one sa višim opsegom (za primanje doza) (900-1500 U).

Klinička korist definiše se barem 25% smanjenjem u rezultatu na Toronto Western Spasmodic Torticollis Scale (TWSTRS)-Severity Scale (Consky, E.S., Lang, A.E.

(1994) in: Therapy with Botulinum Toxin. Jankovic, J. i Hallet M., eds. Marcel Dekker, Inc., New York) u odnosu na liniju baznih vrednosti. Srednja vrednost kod svih pacijenata je bila na liniji baznih vrednosti. 56% pacijenata iz grupe koja prima višu dozu pokazuje pad u TWSTRS-rezultat jačine mišićnog odgovora, poređenjem sa 7% pacijenata iz grupe koja prima niže doze. Umereno poboljšanje za TWSTRS-rezultate sa bolom takođe je posmatrano za obe grupe, naročito u ranijoj fazi studije. Nema dokaza o razvijanju blokiranih antitela za botulinski otrov tipa B kod ovih pacijenata.

3.Studija 3

Dvadeset osam pacijanta (prosečno godište 50.9 godina) sa potvrđenom dijagnozom cervikalne distonije primaju injekcije ormulacije botulinskog otrova tipa B na 2-4 površinska mesta na jeziku i mišićima ramena sa dozama koje se povećavaju (do 1.5 po uzastopnoj sesiji). Kao što je ranije opisano, klinička korist procenjena je korišćenjem TWSTRS-testa, sa 25% smanjenjem za rezultat kod kojeg se smatra daje došlo do poboljšanja.

Pacijenti učestvuju u studiji od 28-177 dana sa srednjim vremenom za studiju od 71.9 dana. Pacijenti se tretiraju sa 1 do 3 doze formulacije. Kumulativne doze su počev od 1430 U do 12000 U, sa individualnim dozama u opsegu od 300 U do 12000 U. Za potrebe kliničkog ispitivanja, definisane su 4 grupe doza: 100-800 U (grupa A), 900-2399 U (grupa B), 2400-5999 U (grupa C) i 6000-12000 U (grupa D). Dužina vremena između sesija sa davanjem doza rangirana je na sledeći način: Grupa A, 13-101 dan, avg. 35.7 dana; Grupa B, 14-113 dana, aavg. 48.8 dana: Grupa C, 29-177 dana, avg. 62.2 dana; Grupa D, 28-177 dana, avg. 55.1 dana.

Srednje bazalne vrednosti rezultata slične su za sve pacijente u svim grupama za tretman, i sve 4 grupe doživljavaju prosečno smanjene za rezultat (poboljšanje) tokom studije. Srednji procenat poboljšanja vrednosti na baznoj liniji i odnos srednje vrednostiodgovora za rezultat mišićne snage veća je kod grupa C i D tokom studije. Merenja maksimalnog prosečnog poboljšanja, prosečni maksimalni procenat poboljšanja i prosečni maksimalni odnos za odgovor veći su za dve grupe (koje su primile veće doze) nego za dve grupe (koje su primile manje doze) (8.1 i 6.8 naspram 2.1 i 3.6 za maksimalno poboljšanje; 43.9% i 35.5% naspram 10% i 16.1% za prosečno maksimalno poboljšanje; 0.32 i 0.23 naspram 0.05 i 0.09 za prosečan maksimalni odnos za odgovor). Procenat pacijenata koji reaguju na tretman veća je za dve grupe sa višim dozama (C, 80% i D, 78%) nego za dve grupe sa nižim dozama (A, 0% i B, 27%). Srednje vreme trajanja odgovora duže je dve grupe sa višim dozama (C, 47.6 dana; D, 38.1 dan) nego za dve grupe sa nižim dozama (A, 0 dana; B, 31 dan). Ovi rezultati pokazuju odgovor zavistan od doze za formulacije botulinskog otrova B u saglasnosti sa datim pronalaskom.

4.Studija 4

Tri doze za formulacije botulinskog otrova tipa B testirane su u odnosu na placebo tretman u studiji koja obuhvata 85 pacijenta od CD u koje ulazi slučajno izabrani pacijenti, dvostruko šlepa proba, jedinična doza, tzv. "4-arm", paralena grupa, multi centrična studija. Pacijenti su poredani u opsegu od 18 do 80 godina. Doze su 400, 1200 ili 2400 U botulinskog otrova tipa B ubrizgavane su u 2-4 površinska mesta na jeziku i/ili u mišiće ramena. Pacijenti su procenjeni korišćenjem TWSTRS rezultatske skale na baznoj liniji i 2 i 4 nedelje posle tretmana. Pacijenti koji ne pokazuju poboljšanje u 3 ili više taČaka (>20%) kod tačnih rezultata za TWSTRS posle 4 nedelje povučeni su iz studije kao pacijenti koji ne reaguju. Oni se vraćaju na procenjivanje svake 4 nedelje, sve dok njihovi nivoi odgovora ne padnu za više od 50%.

Svi rezultati za TWSTRS pokazuju poboljšanje sa povećanom dozom formulacije botulinskog otrova tipa B. Četvrte nedelje postoje statstički značajno poboljšanje kod pacijenata u grupi sa dozama od 2400 U kada se porede sa pacijentima sa placebo tretmanom is a TWSTRS-merenim bolom i TWSTRS-ukupnom procenom i procenat pacijenata koji pokazuju poboljšanje veći je u grupi sa 2400 U. Prosečna globalna procena za pacijente značajno je više u grupi od 2400 U, posle 2, 4 i 8 nedelje u poređenju sa bilo kojom tretiranom grupom; u analizama odstupanja rezultata posle 4 nedelje postoji značajna raazlika (p=0.0028). U analizama odstupanja rezultata posle 4 nedelje postoji statistički značajna razlika (p=0.0073) među tretiranim grupama i takođe postoje značajne razlike između placebo i grupe sa dozama od 2400 U (p=0.0015) i analize doznog odgovora (p=0.0008).

Pacijenti učestvuju u ovoj studiji od 25 do 203 dana, sa većim rednim brojem dana za grupu sa dozom od 2400 U (61 dan).

5. Studija 5

Ova studija takođe nasumična, dvostruka šlepa proba, kontrolisani placebo tretman, jedinična doza, tzv. "4-arm", paralena grupa, multi centrična studija za bolesnike na lečenju van bolnice, ispituje efekte jediničnog placebo tretmana (grupa A) ili jedne od tri doze (2500 U, Grupa B; 5000 U, Grupa C; 10000 U, Grupa D) za formulaciju botulinskog otrova tipa B ubrizganu u 2 do 4 površinska mesta na jeziku i/ili mišića ramena kod pcijenata sa potvrđenom dijagnozom CD. Vrednosti za pacijente određivani su prilikom vizite 2 i 4 nedelje posle tretmana. Oni sa poboljšanjem većim od 20% posle 4 nedelje poređenjem sa osnovnom linimom (TWSTRS-ukupni rezultat) smatraju se "pacijentima koji reaguju" i od njih je traženo da se vrate na ponovno procenjivanje u intervalima na četiri nedelje, maksiman četiri meseca ili dok njihov nivo odgovora ne padne za više od 50%.

Sto dvadeset i dva pacijenta poredanih po uzrastu od 19-81 godine, ulaze u obzir za studiju. Vreme koje pacijenti provode u studiji odražava se na vreme koje oni odgovaraju na studiju sa lekom. Grupe koje se tretiraju slične su u minimalnom i maksimalnom broju dana za deo pacijenta koji ostaju u studiji. Srednje vreme za studiju se povećava sa povećanjem doze, od 45 dana za placebo grupu A do 61 dan

(B), 67 dana (C) i 75 dana (D).

Za sve rezultate za TWSTRS, sve tretirane grupe pokazuju poboljšanje od osnovne

linije do 4 nedelje. Svi TWTRS rezultati idu ka poboljšanju ukoliko se povećava doza formulacije. U analizi odstupanja četvrte nedelje TWSTRS-ukupni rezultati, razlike među tretiranim grupama statistički je značajno (p=0.0001), i značajna su sva tri poređenja za placebo sa aktivnim grupama (p=0.0016 za placebo naspram 2500 U; p=0.0005 za placebo naspram 5000 U; p=0.0001 za placebo naspram 10000 U). Procenat pacijenata koji su reagovali na tretman tokom četvrte nedelje je veći u grupi D (10000 U) nego kod bilo koje grupe za TWSTRS-ukupno, -smatnja, i - rezultati za bol. Postoji značajni odgovor za svaki od četiri rezultata TWSTRS (ukupno, p=0.001; jačina, p=0.035; smetnja, p=0.0002; bol, p=0.001). Procena bola poboljšana je za sve tretirane grupe tokom četiri nedelje do 67.5, 70.2 i 75.1 u grupama B, C i D, svaka za sebe u vezi sa drugim. Razlike među tretiranim grupama statistički su značajne

(p=0.0049), analiziranje odgovora na davanje doze statistički je značajno (p=0.0017) i značajna su poređenja placebo za sve tri aktivne grupe (p=0.0149, 0.0084 i 0.0007 za grupe B, C, D poređenjem za placebo, respektivno).

Primer 4: Fiziološki odgovor na formulaciju botulinskog otrova tipa B kod ljudi

Osamnaest zdravih subjekata testirana su na odgovor M-talasne amplitud m.e extensor digitalis brevis (EDB) na botulinski otrov tipa B korišćenjem standardnih elektrofizioloških postupaka poznatih u stanju tehnike. Subjekti su rangirani po uzrastu od 18-22 godine.

Elektrofiziološke studije se izvode 2, 4, 6,9,11, 13 i 14 dana, doza nakon ubrizgavanja formulacije botulinskog otrova tipa B injekcijama rangirano je u opsegu od 1.25 U do 480 U (i.m). Rezultati analize pokazuju smanjenje zavisno od doze za M-talasnu amplitudu EDB i za regiju (mišića) sa povećanom dozom. Maksimalni efekti na 480 U rezultuju 75% redukcijom za M-talasne amplitude od osnovne linije.

U odvojenoj studiji, 10 subjekata su nasumice odabrani da bi im se ubrizgala doza formulacije botulinskog otrova tipa B "B" formulacija u jednom EDB i doza "BOTOX® " (botulinskog otrova tipa A "A") za ostale EDB korišćenjem jedne od pet različitih šema doziranja: 1.25 UA/20 U B; 2.5 U A/80 U B; 5 U B; 7.5 U A/320 U B; 10 U A/480 U B (2 subjekta po rasporedu za doziranje). Jednom kontrolnom subjektu data je injekcija sonog rastvora u svaki EDB mišić. Stopa opadanja kod M-talasne amplitude i regije slična je kod oba mišića sa maksimalnim efektom koji se javlja približno šestog dana posle injekcije. Oba serotipa pokazuju smanjenje za M-talasnu amplitudu. Olakšanje koje se javlja posle pokretanja tela najveće je 9 dana za oba tipa otrova.

Pošto je pronalazak opisan u pogledu specifičnih postupaka i izvođenja, ocenjeno je da različite modifikacije i promene mogu biti urađene bez promene pronalaska.

Claims (22)

1. Stabilna, spremna za upotrebu, tečna farmaceutska formulacija koja obuhvata serumski albumin, farmaceutski prihvatljiv puferisani slani rastvor koji obezbedjuje puferisani pH opsega izmedju pH 5 i pH 6, i izolovani botulinski otrov koji je stabilan u formulaciji najmanje jednu godinu na temperaturi izmedju 0° and 10° C, ili najmanje 6 meseci na temperaturi izmedju 10° i 30° C.

2. Formulacija prema zahtevu 1, naznačena time stoje pomenuti puferisani pH 5.6 ± 0.2.

3. Formulacija prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačena time što je puferisani slani rastvor puferisan sa fosfatnim puferom, fosfat-citratnim puferom ili sukcinantnim puferom.

4. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačena time što je botulinski otrov botulinski otrov serotipa A, B, Ci, D, E, F ili G.

5. Formulacija prema zahtevu 4, naznačena time što je botulinski otrov botulinski otrov tipa B prisutan u stabilnoj, spremnoj za upotrebu tečnoj farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji u opsegu od 100 - 20000 U/ml.

6. Formulacija prema zahtevu 5, naznačena time što je botulinski otrov tip B prisutan u stabilnoj, spremnoj za upotrebu tečnoj farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji izmedju 1000 i 5000 U/ml.

7. Formulacija iz zahteva 5 ili zahteva 6, naznačena time što je botulinksi otrov tipa B prisutan u kompleksu velike molekulske težine od 700 kilodaltona (kD) ± 10%.

8. Formulacija prema zahtevu 4, naznačena time što je botulinski otrov tipa A prisutan u stabilnoj, spremnoj za upotrebu tečnoj farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji u opsegu od 20 do 2000 U/ml.

9. Formulacija prema zahtevu 8, naznačena time što je botulinski otrov tipa A prisutan u stabilnoj, spremnoj za upotrebu tečnoj farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji od 100 do 1000 U/ml.

10. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, naznačena time što je serumski albumin rekombinat humanog serumskog albumina.

11. Formulacija prema zahtevu 1, naznačena time što stabilna, spremna za upotrebu tečna farmaceutska formulacija obuhvata 100 mM natrijum hlorida, 10 mM sukcinantnog pufera u puferisanom pH od 5.6, 0.5 mg/ml humanog serumskog albumina i botulin tipa B prisutnog u koncentraciji of 5000 ± 1000 U/ml.

12. Upotreba stabilne, spremne za upotrebu tečne farmaceutske formulacije prema bilo kom od prethodnih zahteva za proizvodnju leka za inhibiciju holinergične transmisije za odabrani mišić, grupu mišića, žlezde ili organa.

13. Upotreba prema zahtevu 12, naznačena time što se lek koristi za lečenje poremećaja izabranih iz grupe koja se sastoji od spasticiteta, bleferospazma, strabizma, hemifacijalnog spazma, distonije, upale srednjeg uha, spastičnog kolitisa, anizmusa, disinergije urinarnog detrusora-sfinktera, stisnute vilice i iskrivljene kičme.

14. Upotreba prema zahtevu 13, naznačena time što se lek koristi za lečenje spasticiteta prema jednoj ili više grupa koje sa sastoje od moždanog udara, povrede kičmene moždine, zatvorene traume glave, cerebralne paralize, multipla skleroze i Parkinsonove bolesti.

15. Upotreba prema zahtevu 13, naznačena time što se lek koristi za lečenje distonije izabrane iz grupe koja se sastoji od spazmotičnog tortikolisa (cervikalna distonija), spazmotična distonija, limbična distonija, laringenalna distonija i oromandibularna (Megie's) distonija.

16. Upotreba prema zahtevu 12, naznačena time što odabrani mišić ili mišićna grupa proizvodi bore ili brazdaste bore.

17. Upotreba prema zahtevu 12, naznačena time što je odabrani mišić perinealni mišić i gde se navedeni lek koristi u toku procesa radjanja deteta.

18. Upotreba prema zahtevu 12, naznačena time što je lek za lečenje stanja izabranih iz grupe koja se sastoji od miofacijalnog bola, glavobolje povezane sa migrenom, vaskularnih disturbanci, neuralgije, neuropatije, bola kod artritisa, bola u ledjima, hiperhidroze, rinoree, astme, prekomernog lučenja pljuvačke i prekomernog izlučivanja stomačne kiseline.

19. Upotreba prema bilo kom od zahteva 12 do 18, naznačena time što je lek za lečenje pacijenta koji otporan na botulinski otrov serotipa A i botulinski otrov u formulaciji je izabran iz grupe koja se sastoji od botulinskog otrova serotipova B, Ci, D, E, F i G.

20. Upotreba prema zahtevu 19, naznačena time što je botulinksi otrov u tečnoj formulaciji botulinski otrov tipa B.

21. Upotreba prema bilo kom od zahteva 12 do 18, naznačena time što je lek za lečenje pacijenta koji je otporan na botulinski otrov tipa B i botulinski otrov u formulaciji je izabran iz grupe koja se sastoji od botulinskog otrova serotipova A, Ci, D, E, F i G.

22. Upotreba prema zahtevu 21, naznačena time što je botulinski otrov u tečnoj formulaciji botulinski otrov tipa A.