CN112739320A - 肉毒杆菌神经毒素血清型e的治疗和美容用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗障碍的肉毒杆菌神经毒素血清型E(BoNT/E)，其中所述BoNT/E被施用于人类受试者，并且在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供了最大抑制作用；施用后第14天，对靶细胞或组织分泌神经递质的抑制作用降低到＞25％。

Description

肉毒杆菌神经毒素血清型E的治疗和美容用途

本发明涉及梭菌神经毒素及其治疗和美容用途。

梭状芽胞杆菌属的细菌产生高效和特异的蛋白毒素，可毒害其递送到的神经元和其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(C.tetani，TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum，BoNT)血清型A-G和X产生的神经毒素(参见WO 2018/009903 A2)，以及由巴拉迪梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。

梭菌神经毒素中有一些是已知的最有效的毒素。举例来说，肉毒杆菌神经毒素对小鼠的半数致死剂量(LD₅₀)为0.5-5ng/kg，具体取决于血清型。破伤风和肉毒毒素都是通过抑制受累神经元的功能，特别是神经递质的释放发挥作用的。肉毒杆菌毒素作用于神经肌肉接合处，并抑制胆碱能在周围神经系统的传递，而破伤风毒素作用于中枢神经系统。

在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，通过蛋白质水解裂解事件在翻译后修饰，形成两条通过二硫键连接在一起的多肽链。裂解发生在特定的裂解位点，通常被称为活化位点，位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H链)，分子质量约为100kDa；和轻链(L链)，分子质量约为50kDa。H链包含N-末端易位成分(H_N结构域)和C-末端靶向成分(H_C结构域)。裂解位点位于L链和易位结构域成分之间。在H_C结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化到细胞中之后，H_N结构域将L-链穿过内体膜转移到细胞质中，L-链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白质水解裂解为SNARE蛋白质(如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)的细胞内转运蛋白发挥作用——见Gerald K(2002)“Cell and MolecularBiology”(第4版)John Wiley&Sons，Inc.。缩写词SNARE源自术语可溶性NSF附着受体，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感因子。SNARE蛋白是细胞内囊泡融合的一个组成部分，因此通过囊泡从细胞中转运分泌分子。蛋白酶功能是一种锌依赖性内肽酶，对SNARE蛋白具有很高的底物特异性。因此，一旦递送到所需靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L-链蛋白酶是一种非细胞毒性蛋白酶，能切割SNARE蛋白。

众所周知，肉毒杆菌神经毒素能够导致肌肉麻痹松弛。正是所述肌肉松弛剂特性使得内毒杆菌神经毒素(例如BoNT/A)被用于各种医疗和美容手术中，包括治疗眉间纹或多动面纹、头痛、半面痉挛、膀胱多动、多汗、鼻唇纹、颈肌张力障碍、眼睑痉挛以及痉挛。

然而，BoNT/A涉及作用时间长(例如＞6个月)，这在某些治疗或美容情况下是不利的。因此，仍然需要一种与BoNT/A具有不同药效学特性的替代疗法。

本发明克服了上述一个或多个问题。

本发明人首个测定BoNT/E(例如，BoNT/E缺乏在任何在天然存在的BoNT/E中所存在的复合蛋白质)在施用于人类受试者时的药效学性质。令人惊讶的是，发明人发现BoNT/E与BoNT/A具有不同的药效学特性，包括短时间内对靶细胞或组织的神经递质释放达到最大限度地抑制作用，以及作用持续时间较短(例如，施用后＜150天)。

尽管已经在体外系统和非人体的动物模型(如小鼠)中对BoNT/E进行了测试，但是先前使用天然存在的复合BoNT/E进行的研究不适合预测非复合(如重组)BoNT/E的药效学特性，因为已知这些不同形式的BoNT在体内表现不同。例如，在人类体神经细胞中，复合和非复合形式的BoNT表现出显著不同的宿主细胞反应。

基于本发明人的发现，可以确定适宜的BoNT/E临床实用性在人类受试者中实现治疗效果。

因此，一方面，本发明提供用于治疗障碍的肉毒杆菌神经毒素血清型E(BoNT/E)。相关方面包括用于治疗障碍的方法，以及BoNT/E在制造用于治疗障碍的药物中的用途，其中BoNT/E被施用给人类受试者。

一方面，提供一种用于治疗障碍的肉毒杆菌神经毒素血清型E(BoNT/E)，其中所述BoNT/E被施用给人类受试者，并且在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用；并且(其中所述对神经递质分泌的抑制作用)在施用后第14天，靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用降低到＞25％。

另一方面提供一种用于治疗障碍的方法，所述方法包括向人类受试者施用BoNT/E，并且其中BoNT/E是在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用；以及(其中对神经递质分泌的抑制)在施用后第14天对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用降低到＞25％。

另一方面提供了一种美容方法，其包括向人类受试者施用BoNT/E，其中BoNT/E是在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用；以及(其中对神经递质分泌的抑制作用)在施用后第14天对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用降低到＞25％。

又一方面提供了BoNT/E在制造用于治疗障碍的药物中的用途，其中将BoNT/E施用人类受试者，并且在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用；以及(其中对神经递质分泌的抑制作用)在施用后第14天对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用降低到＞25％。

BoNT/E优选为非复合形式(即不含在天然BoNT/E中存在的复合蛋白质)。此类复合蛋白质的实例包括神经毒素相关蛋白(NAP)和非毒性非血凝素组分(NTNH)。

非复合形式的BoNT/E的一个优点是，蛋白质含量的总重量由神经毒素(BoNT/E)本身提供。因此，以非复合形式施用例如5ng BoNT/e通常对应于施用5ng BoNT/E神经毒素。相反，以复合形式施用例如5ng BoNT/E(优选地，其中蛋白质含量的总重量通过A280处的吸光度、或例如Bradford分析法测定)将包括复合蛋白质，将导致BoNT/e的施用量减少(即小于5ng)。

非复合形式的BoNT/E(如上所述)通常每100纳克(ng)BoNT/E蛋白质含有少于50皮克(pg)的复合蛋白质；例如，每100ng BoNT/E蛋白质含有少于20pg的复合蛋白质。在一个实施方案中，非复合形式的BoNT/E每100ng BoNT/E蛋白质含有少于10pg的复合蛋白质，例如每100ng BoNT/E蛋白质含有少于5pg的复合蛋白质。

本发明的BoNT/E优选为重组BoNT/E(因此不含复合蛋白)。

本文中使用的术语“治疗”(treat)或“治疗”(treating)包括预防性治疗(例如，防止疾病的发生)以及矫正性治疗(对已经患有疾病的受试者的治疗)。优选地，如本文所使用的“治疗”或“治疗”意指矫正性治疗。术语“治疗”或“治疗”包括治疗疾病及其症状。在一些实施方案中，“治疗”或“治疗”是指疾病的症状。

因此，BoNT/E可以治疗有效量或预防有效量施用给人类受试者。

“治疗有效量”是BoNT/E的足以实现对疾病或其症状这种治疗的任何量，即当单独或联合施用于人类受试者以治疗疾病(或其症状)。

“预防有效量”是当单独或联合施用于人类受试者时抑制或延迟疾病(或其症状)的发生或复发的BoNT/E的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全防止疾病的发生或复发。“抑制”发病意味着要么减少发病的可能性(或症状)，要么完全防止发病。

术语“从组织释放神经递质的抑制作用”可意指抑制从所述组织内的神经释放神经递质。

本发明还提供一种美容方法，包括向人类受试者施用BoNT/E。

BoNT/E可以任何适合于实现所需治疗效果的方式施用于人类受试者。在一个实施方案中，BoNT/E经肠外施用。这种施用可以通过局部注射。在一个实施方案中，BoNT/E通过皮下注射、皮内注射和/或肌肉内注射施用。优选地，BoNT/E通过肌肉内注射(例如通过肌肉内注射)施用。

给人类受试者施用的BoNT/E的总剂量通常不小于0.03ng且通常不大于50ng。例如，在一些实施方案中，施用的BoNT/E的总剂量约为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50ng。

术语“总剂量”是指每个治疗方案给患者施用的BoNT/E的绝对量(以克或纳克表示)。例如，参考总剂量为5ng的BoNT/E意味着向人体患者施用5ng的BoNT/E并完成该患者的治疗方案。

总剂量可通过形成相同治疗方案一部分的一个或多个施用步骤施用。例如，可通过第一次施用2ng BoNT/E和第二次施用3ng BoNT/E来施用总剂量5ng。

优选地，总剂量是在单个施用步骤中施用的。

施用的BoNT/E总剂量通常小于50ng，例如小于40、30、20或10ng。

本发明的一个优点是它提供了一种快速起效的作用(例如抑制神经递质释放)。这对于许多临床和美容适应症是非常理想的。本发明的另一个优点是基本上避免了BoNT/E向邻近肌肉的局部扩散(即没有观察到明显的影响)。

因此，根据本发明，在给药后1天或更短时间内，优选在不到15小时内，施用BoNT/E并且(例如以这样的剂量)对靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少15％的抑制作用。例如，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在施用后1天或更短时间内(优选在不到15小时内)对靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少20％的抑制作用。

在一个实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在施用后第14天对靶细胞或组织的神经递质分泌提供＞20％、＞30％、＞40％、＞50％、＞60％、＞70％或＞80％的抑制作用。例如，优选地施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)以在施用后第14天对靶细胞或组织的神经递质分泌提供＞25％的抑制作用。BoNT/E可在施用后第14-49天施用，并且(例如，以如下剂量)对靶细胞或组织的神经递质分泌提供＞25％的抑制作用。

在另一实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在施用后≤13、≤12、≤11、≤10、≤9、≤8或≤7天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供40-95％抑制作用。例如，施用后≤13天、≤12天、≤11天、≤10天、≤9天、≤8天或≤7天内，BoNT/E对靶细胞或组织的神经递质分泌提供40-60％的抑制作用。

在一个实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在施用后≤6天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供40-95％的抑制作用。例如，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在施用后≤6天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供40-60％的抑制作用。

在另一实施方案中，将BoNT/E施用人类受试者并且(例如，以如下剂量)在施用后≤13天内(优选≤6天)对靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少40％抑制作用。例如，向人类受试者施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在施用后≤13天内(优选≤6天)对靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少50％的抑制作用。

在一个实施方案中，施用BoNT/E(例如，以如下剂量)，即在施用后15天或更短时间内、优选10天或更短时间内、更优选7天或更短时间内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用。

本发明的另一个优点是，它还提供了相对于BoNT/A作用的快速抵消(off-set)(即，在对靶细胞或组织的神经递质分泌的最大抑制作用之后)。这对于许多临床适应症是非常理想的。

根据本发明，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)提供：

在施用后≤13天(优选≤12或≤10天)内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供了至少40％的抑制作用；并且

施用后＞21天到＜100天，靶细胞或组织的神经递质分泌抑制作用降低到15％或更少。

例如，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)提供：

在施用后≤13天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少40％的抑制作用；以及

在施用后＞21天到＜80天，对靶细胞或组织的神经递质分泌抑制作用降低到15％或更少。

在一个实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)提供：在施用后≤13天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少40％的抑制作用；以及

在施用后40天到100天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌抑制降低到15％或更少。

例如，对人类受试者施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)提供：在施用后≤13天(优选≤12或≤10)内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少40％的抑制作用；并且

在施用后40天到80天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌抑制作用降低到15％或更少。

可通过本领域技术人员已知的常规技术来评估对来自靶细胞或组织(优选来自靶组织)的神经递质分泌的抑制作用。在一个实施方案中，如本文所用的“％神经递质分泌抑制作用”对应于肌肉动作电位(例如复合肌肉动作电位，CMAP)的％抑制作用。肌肉动作电位的抑制作用可使用标准技术进行评估。例如，受刺激肌肉的动作电位可在BoNT/E施用前后通过电极测量以确定抑制作用％。例如，电极可用于电生理学研究，用于测量组织内的动作电位(由神经递质分泌引起)，并测量动作电位的抑制作用％(对应于神经递质释放的抑制作用％)。

因此，在一个实施方案中，通过电生理学测量来自靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用％。例如，可以测量动作电位抑制作用％(通过电生理学测量)，提供神经递质分泌抑制作用％的读数。

使用电生理学测量神经递质分泌抑制作用的一个关键优势是，可以采用标准化方法，并提供客观结果。这与测量神经递质分泌抑制作用％的主观方法形成了对比，例如通过人工/人类(如医生)对治疗反应的评估推断出抑制作用％，例如在治疗后手动评估肌肉痉挛或面部皱纹的程度。这种主观方法的结果往往具有高度变异性，因而缺乏客观方法的精密度和可靠性。

“神经递质分泌抑制作用”可对应于在电生理学研究特别容易获得的浅表组织(例如，指短伸肌(EDB))处测量到的％抑制作用。通过测量这种浅表组织的神经递质分泌抑制作用％，可以提供更准确/可靠的读数(与浅表组织的测量相比)，这可以有利地推断为在替代组织(针对治疗或美容目的)对神经递质分泌的％抑制作用。

对所述“神经递质分泌抑制作用”的评估通过参考所附实施例、材料和方法来证明，并且可以使用其中所述的方法(例如其中所述的药效学模型)来评估。

在一个实施方案中，神经递质是乙酰胆碱。

本发明人已经发现，可以施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)提供对神经递质分泌抑制作用的快速起效和(在最大抑制作用之后)神经递质分泌的逐渐(基本上线性)的恢复。本发明人在0.04ng到约4.0ng剂量范围内证明，这种逐渐恢复可能与剂量无关，这一点是有利的。

因此，本发明有利地提供BoNT/E的总剂量，其在人类受试者中提供可预测的、基本上线性的对神经递质分泌的抑制作用(在最大抑制作用之后)的降低，可预测受试者在施用后100天内对治疗的反应(见图12)。例如，在BoNT/E抑制障碍的症状的情况下，可以预测症状开始复发的时间点，以及预测给定时间点的复发症状的严重性。

因此，在一个实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在最大抑制作用之后提供“神经递质分泌抑制作用％”实质性的线性降低。

术语“基本线性”意指“神经递质分泌的抑制作用％”的值的曲线(图)可用R平方值＞0.8的线性曲线拟合(Microsoft Excel 2010，MicrosoftCorporation)。在一个实施方案中，所述R平方值＞0.85、＞0.9或＞0.95。优选地，所述R平方值可以大于0.9。更优选地，所述R平方值可以大于0.95。

在一个实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在最大抑制作用之后提供对“神经递质分泌的抑制作用”的实质性线性降低，其中所述实质性线性降低发生在施用后的第10-56天、10-42天和/或第10-21天。

优选地，在施用后第10-56天、10-42天和/或第10-21天的所述曲线表示在神经递质分泌最大程度抑制作用之后BoNT/E效应(神经递质分泌抑制作用)的“抵消”。

在一个实施方案中，在施用后≤13天、≤12天、≤11天、≤10天、≤9天、≤8天、≤7天或≤6天(优选≤6天)，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用，随后，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用每天降低1-10％。

所述最大抑制作用(神经递质分泌抑制作用％)可≥40％、≥60％、≥75％或≥80％(例如≥85％)。优选地，所述最大抑制作用大于80％。

在一个实施方案中，所述最大抑制作用(对神经递质分泌的抑制作用％)为≥95％。

对靶细胞或组织分泌的神经递质的抑制作用％通常在达到最大抑制作用后每天降低约2-10％。

例如，在最大抑制作用之后的每一天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用％降低约1-4％、约4-6％、约6-8％或约8-10％。优选地，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用％在最大抑制作用之后每天降低约1-4％。

从施用后第10-21天、第6-42天、第10-42天、第10-49天和/或第10-56天开始，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用％通常每天降低约1-4％。

为方便起见，对神经递质分泌的抑制作用％的降低可计算为所述时间段内的平均降低，例如从施用后第10-24天、第6-42天、第10-42天、第10-49天和/或第10-56天。

对靶细胞或组织分泌的神经递质的抑制作用％在达到最大抑制作用后每周可降低约1-30％。例如，在最大抑制作用之后的每一周，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用％降低约1-28％、2-28％、约2-22％、约4-16％、约9-18％、约14-16％或约9-12％。

在一个实施方案中，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用％从施用后第1-3周、第1-6周和/或第2-6周，每周降低约9-17％。

为方便起见，对神经递质分泌的抑制作用％的降低可计算为所述时间范围内的平均降低，例如从施用后第1-6周、第2-6周和/或第1-3周。

所述最大抑制作用(神经递质分泌的抑制作用％)可≥40％、≥60％、≥75％或≥80％(例如≥85％)。优选地，所述最大抑制作用大于80％。

在一个实施方案中，所述最大抑制作用(对神经递质分泌的抑制作用％)为≥95％。

对神经递质分泌抑制作用％在所述“神经递质分泌抑制作用”的实质性线性降低后可能稳定。

在一个实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)以在施用后＞49天至＜100天或＞49天至＜90天期间对靶细胞或组织的神经递质分泌提供约10％-40％(优选约15％-40％)的抑制作用。在一个实施方案中，施用BoNT/E并且(例如，以如下剂量)在施用后＞42天到＜100天或＞42天到＜90天之间提供约10％-40％(优选约15％-40％)的靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用。

在使用中，施用的BoNT/E的总剂量通常小于10ng，例如在0.04ng到5ng的范围内。在一个实施方案中，以0.5-5ng(例如0.9ng或3.6ng)的剂量施用BoNT/E。在另一实施方案中，以0.1-0.5ng(例如0.2ng)的剂量施用BoNT/E。在一个实施方案中，以1-5ng(例如3.6ng)的剂量施用BoNT/E。在另一实施方案中，以0.5-2ng(例如0.9ng)的剂量施用BoNT/E。

在一个实施方案中，以0.5-5ng(例如0.9ng或3.6ng)的剂量施用BoNT/E，其提供：

在施用后7天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少85％抑制作用；和/或

在施用后14天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少80％的抑制作用；和/或

在施用后21天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少70％的抑制作用；和/或

在施用后28天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少50％的抑制作用；和/或

在施用后35天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少40％的抑制作用；和/或

在施用后42天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少30％的抑制作用；和/或

在施用后49天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少25％抑制作用。

例如，以0.5-5ng(例如0.9ng或3.6ng)的剂量施用BoNT/E，其提供：

在施用后56天，对靶细胞或组织的神经递质分泌至少15％的抑制作用；和/或

在施用后63天，对靶细胞或组织的神经递质分泌≤15％的抑制作用。

在另一实施方案中，以0.1-0.5ng(例如0.2ng)的剂量施用BoNT/E，其提供：

在施用后7天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少65％；和/或

在施用后14天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少65％；和/或

在施用后21天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少50％；和/或

在施用后28天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少30％；和/或

在施用后35天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少30％；和/或

在施用后42天，对靶细胞或组织神经递质分泌的抑制作用≤15％。

在一个实施方案中，以1-5ng(例如3.6ng)的剂量施用BoNT/E，其提供：

在施用后约＞3天到≤13天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少85％；和/或

在施用后＞17天到＜19天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约80％-90％(优选约84％-86％)；和/或

在施用后＞20到＜22天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约70％-80％(优选约74％-76％)；和/或

在施用后＞23天到＜26天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约55％-65％(优选约60％-64％)；和/或

在施用后＞27天到＜29天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约50％-60％(优选约54％-56％)；和/或

在施用后＞34天到＜36天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约35％-45％(优选约43％-44％)；和/或

在施用后＞41天到＜43天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约30％-40％(优选约34％-36％)；和/或

在施用后＞48天到＜50天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约25％-35％(优选约29％-31％)；和/或

在施用后＞55天到＜57天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约10％-20％(优选约15％-17％)；和/或

在施用后＞62天到＜64天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约7％-17％(优选约13％-15％)；和/或

在施用后＞75天内，对靶细胞或组织神经递质分泌的抑制作用≤15％。

在另一实施方案中，以0.5-2ng(例如0.9ng)的剂量施用BoNT/E，其提供：

在施用后＞3天到≤13天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少85％；和/或

在施用后＞17天到＜19天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约70％-80％(优选约77％-79％)；和/或

在施用后＞20到＜22天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约65％-75％(优选约71％-73％)；和/或

在施用后＞23天到＜26天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约60％-70％(优选约65％-67％)；和/或

在施用后＞27天到＜29天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约55％-65％(优选约58％-60％)；和/或

在施用后＞34天到＜36天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约45％-55％(优选约50％-52％)；和/或

在施用后＞41天到＜43天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约30％-40％(优选约34％-37％)；和/或

在施用后＞48到＜50天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约30％-40％(优选约33％-35％)；和/或

在施用后＞55天到＜57天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约30％-40％(优选约35％-37％)；和/或

在施用后＞62到＜64天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约20％-30％(优选约22％-27％)；和/或

在施用后＞75天(如＞85天)内，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用≤15％。

在一个实施方案中，以0.1-0.5ng(例如0.2ng)的剂量施用BoNT/E，其提供：

在施用后＞3天到≤13天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少70％；和/或

在施用后＞17天到＜19天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约47％-57％(优选约52-54％)；和/或

在施用后＞20到＜22天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约45％-55％(优选约50％-52％)；和/或

在施用后＞23天到＜26天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约25％-35％(优选约29％-31％)；和/或

在施用后＞27天到≤29天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约25％-35％(优选约31％-33％)；和/或

在施用后＞34天到＜36天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约25％-35％(优选约30％-33％)；和/或

在施用后＞41天到＜43天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约1％-10％(优选约4％-6％)；和/或

在施用后＞48天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用≤15％。

在一些实施方案中，优选施用的BoNT/E的总剂量＜0.2ng，例如0.04-0.15ng(或0.01-0.04ng)。有利地，本发明人已发现施用较低剂量的BoNT/E(＜0.2ng)可实现对靶细胞或组织的神经递质分泌至少40％的抑制作用。这种较低剂量与神经递质分泌的良好最大抑制作用(例如，抑制作用至少40％或50％)相关，作用持续时间短得多和/或与达到最大作用的相似时间相关。后一点令人惊讶，并与包含复合蛋白质的BoNT(例如，包含复合蛋白质的BoNT/A)形成直接对比，其中当施用更高剂量(例如，剂量≥0.2ng)时，达到最大抑制的时间要短得多。例如，本发明人已经发现低至0.04ng(40pg)的BoNT-E(例如重组BoNT-E)提供与20U BoNT-A(

)相同的效应幅度(在施用后1-7天内)-参见实施例4。值得注意的是，20U Dysport＝108pg神经毒素(5.35-5.38pg神经毒素/U，通常为5.35pg神经毒素/U)。这些结果令发明人特别惊讶。

在一个实施方案中，以0.04-0.15ng(例如0.04ng)的剂量施用BoNT/E，其提供：

在施用后＞3天到≤13天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用至少40％；和/或

在施用后＞17天到＜19天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约30％-40％(优选约33-35％)；和/或

在施用后＞20到＜22天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约7％-17％(优选约12％-14％)；和/或

在施用后＞23天到＜26天之间，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用约15％-25％(优选约21％-23％)；和/或

在施用后＞48天，对靶细胞或组织神经递质分泌抑制作用≤15％。

在一个实施方案中，所述靶组织是肌肉。这类肌肉的实例包括枕额肌、鼻肌、口轮匝肌、口角减压肌、颈阔肌、胸骨舌骨肌、前锯肌、腹直肌、外斜肌、阔筋膜张肌、肱桡肌、髂棘肌、腰大肌、果胶肌、长收肌、缝匠肌、股薄肌、股外侧肌、股直肌、股内侧肌、股四头肌腱、髌骨、腓肠肌、比目鱼肌、胫骨、腓骨长肌、胫前肌、髌韧带、髂胫束、小鱼际肌、鱼际肌、尺侧腕屈肌、指浅屈肌、掌长肌、桡侧腕屈肌、肱桡肌、旋前圆肌、肱二头肌、肱二头肌、肱三头肌、胸大肌、三角肌、斜方肌、胸锁乳突肌、咬肌、眼轮匝肌、颞肌、颅表腱膜、大圆肌、指伸肌、腕伸肌、肘、长外展肌、跖肌、跟腱、比目鱼肌、大收肌、臀大肌、臀中肌、背阔肌、冈内肌。

在一个实施方案中，所述靶组织是选自波纹肌、肱三头肌、肱二头肌、肱肌和/或肱桡肌、指伸肌的一个或多个或其组合。

在一个实施方案中，靶组织是选自桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、指深屈肌、指浅屈肌、拇长屈肌、拇内收肌、肱肌、肱桡肌、肱二头肌、旋前圆肌、肱三头肌、胸大肌、肩胛下肌、背阔肌的一个或多个或其组合(优选其中所述BoNT/E用于治疗上肢痉挛)。

在一个实施方案中，靶组织是选自桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌的一个或多个或其组合。在一个实施方案中，靶组织是选自深屈肌、指浅屈肌、拇长屈肌、拇内收肌的一个或多个或其组合。在一个实施方案中，靶组织是选自肱肌、肱桡肌、肱二头肌、旋前圆肌的一个或多个或其组合。在一个实施方案中，靶组织是选自肱三头肌、胸大肌、肩胛下肌、背阔肌的一个或多个或其组合。

在一个实施方案中，所述靶组织是选自比目鱼肌、腓肠肌(例如内侧头或外侧头)、胫后肌、趾长屈肌、趾短屈肌、拇长屈肌、拇短屈肌的一个或多个或其组合(优选其中BoNT/E用于治疗下肢痉挛)。

在一个实施方案中，所述靶组织是比目鱼肌。在一个实施方案中，靶组织是腓肠肌(例如内侧头或外侧头)。在一个实施方案中，靶组织为胫骨后肌、指长屈肌、指短屈肌、拇长屈肌、拇短屈肌或其组合。

在一个实施方案中，所述靶组织是选自皱眉肌、直肌、眼轮匝肌、额肌的一个或多个或其组合(优选其中所述BoNT/E用于治疗面部上线)。

在一个实施方案中，所述靶组织是皱眉肌，和选自直肠肌、眼轮匝肌、额肌的一个或多个或其组合。在一个实施方案中，所述靶组织是直肠肌，以及选自皱眉肌、眼轮匝肌、额肌的一个或多个或其组合。在一个实施方案中，所述靶组织是眼轮匝肌，和选自皱眉肌、前肌、额肌的一个或多个或其组合。在一个实施方案中，所述靶组织是额肌，和选自皱眉肌、直肠肌、眼轮匝肌的一个或多个或其组合。

在一个实施方案中，所述靶细胞是运动神经元或感觉神经元。优选地，所述靶细胞是运动神经元。

所述靶细胞(在本文中与术语“神经”同义)可以是腋神经、膈神经、脊神经节、脊髓神经、交感神经节链、阴部神经、掌指总神经、尺神经、尺神经深支、坐骨神经、腓神经、胫神经、隐神经，骨间神经、腓浅神经、腓中背皮神经、跖内侧神经、腓内侧背皮神经、腓深神经、胫神经肌支、隐神经髌内支、腓总神经、股神经肌支、胫前皮支股神经、坐骨神经肌支、股神经、髂腹股沟神经、终丝神经、髂腹下神经、闭孔神经、桡神经、肋下神经、肋间神经、肋间神经背支、肋间神经内侧皮支、肌神经，三角肌神经、迷走神经、臂丛神经、锁骨上神经、面神经、耳颞神经或其组合。在优选实施方案中，所述靶细胞是腓神经。

用于本发明的BoNT/E可由与SEQ ID NO：1具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，用于本发明的BoNT/E可由与SEQ ID NO：1具有至少80％或90％序列同一性的核苷酸序列编码。优选地，用于本发明的BoNT/E可由具有(或包含)SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码。优选地，用于本发明的BoNT/E可由核苷酸序列编码，该核苷酸序列具有(或由其组成)经优化以在异源表达系统(例如SEQ ID NO：1)例如大肠杆菌宿主细胞中表达的密码子的序列。

用于本发明的BoNT/E可包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，用于本发明的BoNT/E可包含与SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3具有至少80％或90％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的BoNT/E包含(或由其组成)如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的多肽序列。

优选地，用于本发明的BoNT/E可包含与SEQ ID NO：2具有至少70％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的BoNT/E可包含与SEQ ID NO：2具有至少80％或90％序列同一性的多肽序列。更优选地，用于本发明的BoNT/E包含(或由其组成)如SEQ ID NO：2所示的多肽序列。

用于本发明的BoNT/E可包含与SEQ ID NO：2具有至少70％序列同一性的多肽序列，但前提是包括以下氨基酸的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个或八个；优选全部八个)多肽序列(其中所述氨基酸位置编号以所述BoNT/E蛋白质的N端甲硫氨酸氨基酸残基开始，以所述C端氨基酸残基结束)：

177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，用于本发明的BoNT/E可包含与SEQ ID NO：2具有至少80％或90％序列同一性的多肽序列，但前提是包括以下氨基酸的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个或八个，优选所有八个)多肽序列(其中所述氨基酸位置编号以所述BoNT/E蛋白质的N-末端甲硫氨酸氨基酸残基开始并以所述C-末端氨基酸残基结束)：

177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

所述氨基酸可以是相对于野生型BoNT/E多肽序列(例如SEQ ID NO.：3)的取代(例如突变)。例如：

177位的甘氨酸可以是精氨酸对甘氨酸的取代(R177G)；

198位的丝氨酸可以是C198S取代；

340位的丙氨酸可以是R340A取代；

773位的亮氨酸可以是I173L取代；

963位的亮氨酸可以是F963L取代；

964位的谷氨酰胺可以是E964Q取代；

967位的丙氨酸可以是R967A取代；和/或

1195位的天冬酰胺可以是插入物(例如野生型BoNT/e序列的G1194和N1195之间的插入物，例如SEQ ID NO.3的多肽序列)。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸和1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)177位的甘氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸、963位的亮氨酸、964位的谷氨酰胺、967位的丙氨酸和1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)177位的甘氨酸，以及以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)：198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)198位的丝氨酸，以及以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)：177位的甘氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)340位的丙氨酸，以及以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)：177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)773位的亮氨酸，以及以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)：177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)963位的亮氨酸，以及以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)：177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)964位的谷氨酰胺，以及以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)：177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)967位的丙氨酸，以及以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)：177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；1195位的天冬酰胺。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸包含(或由其组成)1195位的天冬酰胺，以及一个或多个(例如，一个或多个、两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个或七个)177位的甘氨酸、198位的丝氨酸、340位的丙氨酸、773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸。

在一个实施方案中，如上文所述，所述一个或多个氨基酸的存在提供了与缺乏所述氨基酸的BoNT/E蛋白质相比具有改进溶解度的BoNT/E蛋白质。所述改进的溶解度增加了异源表达系统(例如大肠杆菌表达系统)中蛋白质的收率。

在一个实施方案中，如上文所述，所述一个或多个氨基酸的存在提供与缺乏所述氨基酸的BoNT/E蛋白质相比具有改进效力的BoNT/E蛋白质。所述改进效力可优选地为体内效力改进(更优选地在人类受试者中改进的体内效力)。

在一个实施方案中，BoNT/E是WO 2014/068317 A1中描述的(或由WO 2014/068317A1中描述的核苷酸序列编码的)，其通过引用并入本文作为参考。

BoNT/E由两条多肽链组成，重链(H链)的分子量约为100kDa，轻链(L链)的分子量约为50kDa。H链包括C末端靶向成分(受体结合结构域或H_C结构域)和N末端易位成分(H_N域)。包含H链(H_C结构域和H_N结构域)和L链的BoNT/E称为全毒素。

在一个实施方案中，用于本发明的BoNT/E是全毒素。

示例性L链参考序列包括BoNT/E的氨基酸残基1-422。但是该参考序列应被视为指导，因为根据亚血清型可能发生轻微变化。作为示例，US2007/0166332(在此通过引用整体并入)引用了氨基酸残基M1-R422的稍微不同的BoNT/E L-链序列。

BoNT/E H_C结构域参考序列的实例包括氨基酸残基R846-K1252。

用于本发明的BoNT/E的L-链可以如下(序列号：4)：

用于本发明的BoNT/E的H链可以如下(序列号：5)：

BoNT/E的H_C结构域包含两个不同的结构特征，即H_CC和H_CN结构域。据信参与受体结合的氨基酸残基主要位于H_CC结构域。BoNT/E H_CN结构域参考序列的实例包括氨基酸残基846-1085。

上述序列位置可根据子类型略有改变，并且合适的(参考)BoNT/E H_CN结构域的进一步实例包括氨基酸残基848-1085。

BoNT/E可由肉毒梭菌或丁酸梭菌、优选肉毒梭菌产生。在一个实施方案中，BoNT/E在非梭状芽孢杆菌细胞中产生。或者(优选地)可以重组形式(例如在大肠杆菌中)产生BoNT/E。因此，在一个实施方案中，用于本发明的BoNT/E在异源表达系统(例如大肠杆菌)中产生。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞是大肠杆菌BLR(DE3)。

通过引用并入本文的WO 2014/068317 A1中描述了在异源表达系统(例如大肠杆菌)中产生的BoNT/E的进一步详情。

有利地，本发明的BoNT/E组合物基本上不含胰蛋白酶(用于激活单链多肽)，从而防止BoNT/E蛋白质的不想要的非特异性裂解。

本发明的BoNT/E组合物是由实际神经毒素(BoNT/E)提供该组合物的蛋白质含量。因此，施用所述4ng BoNT/E组合物相当于施用4ng BoNT/E神经毒素。

在一个实施方案中，其中BoNT/E组合物(如上所述)基本上不含胰蛋白酶，该组合物每100纳克(ng)BoNT/E蛋白质含有少于100皮克(pg)胰蛋白酶；例如，每100ng BoNT/E蛋白质含有少于50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶。在一个实施方案中，组合物(如上所述)每100ng BoNT/E蛋白质含有少于10pg的胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E蛋白质含有少于7pg的胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E蛋白质含有少于5pg的胰蛋白酶。在优选实施方案中，所述组合物(如上所述)每100ng BoNT/E蛋白质含有少于10pg的胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E蛋白质含有少于7pg的胰蛋白酶。

因此，在一个实施方案中，短语“基本上不含胰蛋白酶”意指每100ng BoNT/E蛋白质少于100pg胰蛋白酶；例如，每100ng BoNT/E蛋白质少于50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶，优选每100ng BoNT/E蛋白质少于10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E蛋白质少于7pg胰蛋白酶。

用于测定组合物中胰蛋白酶浓度的方法是本领域已知的(例如，在WO 2014/068317中描述)。举例来说，可使用夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)测定本发明组合物中胰蛋白酶的浓度。

已知BoNT/E能切割25kDa突触体相关蛋白(SNAP-25)。

在一些实施方案中，BoNT/E可为经修饰的BoNT/E或其衍生物，包括但不限于下文所述者。修饰的BoNT/E或衍生物可包含一个或多个与BoNT/E的天然(未修饰)形式相比修饰的氨基酸，或可包含不以BoNT/E的天然(未修饰)形式存在的一个或多个插入氨基酸。举例来说，修饰的BoNT/E可具有修饰的氨基酸序列，其在与天然(未修改的)BoNT/E序列相关的一个或多个结构域中。这种修饰可以修饰BoNT/E的功能方面，例如生物活性或持久性。因此，在一个实施方案中，BoNT/E是经修饰的BoNT/E或BoNT/E衍生物。

修饰的BoNT/E可在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(例如修饰的H_C结构域)，其中，所述修饰的重链以比天然(未修饰的)BoNT/E更高或更低的亲和力结合到靶神经细胞。H_C结构域中的此类修饰可包括修饰H_C结构域的神经节苷脂结合位点的或改变与神经节苷脂受体结合的蛋白质(SV2或突触结合蛋白)结合位点的残基和/或靶神经细胞的蛋白质受体。WO 2006/027207和WO 2006/114308中描述了此类修饰的梭状芽胞杆菌神经毒素的实例，其全部通过引用并入本文作为参考。

修饰的BoNT/E可在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如在底物结合或催化结构域中的修饰，其可改变或修饰修饰的L-链的SNARE蛋白特异性。WO 2010/120766和US 2011/0318385中描述了此类修饰的梭菌神经毒素的实例，其全部通过引用并入本文作为参考。

修饰的BoNT/E可包含增加或减少修饰的BoNT/E的生物学活性和/或生物学持久性的一个或多个修饰。例如，修饰的BoNT/E可包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中所述基序增加或减少修饰的BoNT/E的生物学活性和/或生物学持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中x是任何氨基酸)。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy是疏水性氨基酸)。WO 2002/08268中描述了包含基于亮氨酸和酪氨酸基序的修饰梭状芽胞杆菌神经毒素的实例，其在此通过引用整体并入作为参考。

术语“BoNT/E”在一个实施方案中旨在包含杂交和嵌合BoNT/E。杂交BoNT/E包括来自一种梭状芽孢杆菌神经毒素或其亚型的轻链的至少一部分，以及来自另一种梭状芽孢杆菌神经毒素或梭状芽孢杆菌神经毒素亚型的重链的至少一部分，其中，所述亚型中的至少一个是BoNT/E亚型。在一个实施方案中，杂交BoNT/E可包含来自一种梭状芽胞杆菌神经毒素亚型的轻链的整个轻链和来自另一种梭状芽胞杆菌神经毒素亚型的重链，其中至少一种亚型是BoNT/E亚型。在另一实施方案中，嵌合梭状芽胞杆菌神经毒素可包含一种梭状芽胞杆菌神经毒素亚型的重链的一部分(例如结合结构域)，重链的另一部分来自另一种梭状芽胞杆菌神经毒素亚型，其中至少一种亚型为BoNT/E亚型。类似地或可选地，治疗元素可包含来自不同BoNT/E亚型的轻链部分。这种杂交或嵌合的BoNT/E多肽是有用的，例如，作为向以下情况的患者提供治疗益处的手段：对给定梭菌神经毒素亚型具有免疫抗性的患者，对给定梭菌神经毒素重链结合结构域受体浓度低于平均浓度的患者，或对膜或囊泡毒素底物具有蛋白酶抗性变体(例如SNAP-25、鞋面和突触融合蛋白)的患者。杂交和嵌合梭状芽胞杆菌神经毒素在US 8071110中有描述，在此通过引用将其全文并入。因此，在一个实施方案中，本发明的BoNT/E是杂交BoNT/E或嵌合BoNT/E。

本发明还包含具有非天然蛋白酶切割位点的BoNT/E。在这种BoNT/E多肽中，天然蛋白酶裂解位点(如上所述，也称为激活位点)被修饰或替换为非BoNT/E天然的蛋白酶切割位点(即外源性切割位点)。这样一个位点需要一种外源性蛋白酶来进行酶切，从而可以更好地控制酶切事件的时间和位置。可用于BoNT/E中的非天然蛋白酶酶切位点包括：

其他蛋白酶切割位点包括被非细胞毒性蛋白酶切割的识别序列，例如被梭菌神经毒素的轻链切割的识别序列。这些包括被非细胞毒性蛋白酶(例如梭菌神经毒素的轻链)切割的SNARE(例如SNAP-25、syntaxin、VAMP)蛋白质识别序列。包含非天然蛋白酶切割位点的梭菌神经毒素在US7132259、EP 1206554-B2和US 2007/0166332中描述，所有这些通过引用全部并入本文。术语蛋白酶切割位点还包含一个内含子，它是一个自切割序列。自剪接反应是可控的，例如通过改变存在的还原剂的浓度。

本发明还包含包含“破坏性切割位点”的BoNT/E。在所述BoNT/E多肽中，将非天然蛋白酶切割位点并入BoNT/E中，所选位置使得在所述位点处的切割将降低BoNT/E的活性或使其失活。如果在施用后BoNT/E被破坏，则破坏性蛋白酶切割位点可易受局部蛋白酶的切割，迁移到非目标位置。合适的非天然蛋白酶切割位点包括上述那些。包含破坏性裂解位点的梭菌神经毒素在WO 2010/094905和WO 2002/044199中描述，两者在此通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，BoNT/E包含天然切割位点。

在一个实施方案中，BoNT/E不包含E3连接酶识别基序。

BoNT/E，尤其是其轻链组分，可被聚乙二醇化-这可有助于增加稳定性，例如轻链组分的作用持续时间。聚乙二醇化优选地包括将聚乙二醇添加到轻链组分的N-末端。举例来说，轻链的N-末端可藉由一个或一个以上氨基酸(例如，半胱氨酸)残基延伸，其可相同或不同。一个或多个所述氨基酸残基可具有其自身的PEG分子附着(例如共价附着)于其上。WO2007/104567中描述了该技术的实例，其通过引用整体并入本文。

本发明中使用的BoNT/E可使用重组核酸技术生产。

用于本发明的BoNT/E可通过以下方法制备：在适当的宿主细胞中表达编码BoNT/E的核酸，溶解宿主细胞以提供含有单链BoNT/E的宿主细胞匀浆，并分离单链BoNT/E。在本发明使用之前，通过将单链BoNT/E与水解BoNT/E激活环中的肽键的蛋白酶接触，优选地将单链BoNT/E蛋白质水解处理成相应的活性双链BoNT/E(例如，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起)。

优选地，所述宿主细胞提供异源(例如非梭菌)表达系统。优选地，宿主细胞是大肠杆菌。

用于本发明的BoNT/E优选为双链形式。

BoNT/E可在本发明中用作药物组合物的一部分。药物组合物可包含BoNT/E和药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或盐。因此，在一个实施方案中，BoNT/E可与药学上可接受的载体、赋形剂、辅剂和/或盐组合施用。

BoNT/E可用于肠外、持续输注或局部应用。在一个实施方案中，BoNT/E被调配用于肠外施用，例如通过皮下注射、皮内注射和/或肌肉内注射。优选地，BoNT/E被配制用于肠外施用，例如通过更优选地肌肉内施用(例如通过注射)。

适合于注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳液或干粉的形式，在使用前溶解或悬浮在合适的载体中。

在局部递送BoNT/E的情况下，BoNT/E可配制成乳膏(例如用于局部施用)或皮下注射。

局部输送装置可包括气雾剂或其他喷雾剂(例如喷雾器)。

液体剂型通常使用BoNT/E和无热原无菌载体制备。BoNT/E可溶解或悬浮在基质中，具体取决于载体和所用浓度。在制备溶液时，BoNT/E可溶解在载体中，如有必要，可通过添加氯化钠使溶液等渗，并在注入适当的无菌小瓶或安瓿并密封之前，使用无菌技术通过无菌过滤器过滤灭菌。或者，如果具有足够的溶液稳定性，可通过高压灭菌器对密封容器中的溶液进行灭菌。有利地，诸如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂等添加剂可溶解于该载体中。

使用前溶解或悬浮在适当载体中的干粉，可通过在无菌区域使用无菌技术将预先灭菌的成分填充到无菌容器中来制备。或者，可以在无菌区使用无菌技术将成分溶解到合适的容器中。然后冷冻干燥产品，无菌密封容器。

适用于肌肉内、皮下或皮内注射的肠外悬浮液的制备方式基本相同，只是无菌成分悬浮在无菌载体中，而不是溶解，并且不能通过过滤完成灭菌。可在无菌状态下分离所述组分，或者可在分离后(例如通过γ射线辐照)对其进行灭菌。

有利地，例如聚乙烯吡咯烷酮的助悬剂包含在组合物中以促进组分的均匀分布。

根据本发明的施用可利用多种递送技术，包括微粒胶囊化、病毒递送系统或高压气雾剂撞击。BoNT/E可通过鞘内或硬膜外注射在脊柱中与受累器官的神经支配有关的脊髓节段水平上施用于患者。

施用BoNT/E的剂量范围是那些产生期望的治疗效果的剂量范围(例如，上述那些)。剂量也可基于实施例中所描述的CBA单位。

在一个实施方案中，本发明的障碍是一个或多个：与斜视、眼睑痉挛、斜视、肌张力障碍(例如痉挛性肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、局灶性肌张力障碍、迟发性肌张力障碍、喉肌张力障碍、肢体肌张力障碍、颈肌张力障碍)、斜颈(例如痉挛性斜颈)相关的病症，美容治疗(美容)应用受益于细胞/肌肉失能(通过SNARE下调或失活)、神经肌肉障碍或眼球运动病症(例如，伴随性斜视、垂直斜视、侧直肌麻痹、眼球震颤、甲状腺功能不全肌病)、书写痉挛、眼睑痉挛、磨牙症、威尔逊病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛、慢性多发性硬化所致的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、animus、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、提上睑肌-骨盆综合征、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森氏病、口吃、面肌痉挛、眼睑障碍、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、肛门痉挛、肢体痉挛(如下肢痉挛或上肢痉挛)、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗、流涎过多、胃肠道分泌物过多、肌肉疼痛(如肌肉痉挛引起的疼痛)、头痛(如紧张性头痛)、眉毛皱纹、皮肤皱纹(例如面部上缘，如眉间纹、外眦线和/或额肌线)、癌症、子宫障碍、泌尿生殖系统障碍、泌尿生殖-神经系统障碍、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。

在一个实施方案中，所述障碍是下肢痉挛。优选地，下肢痉挛是在18岁以上的受试者中。

在一个实施方案中，所述障碍是上肢痉挛。优选地，上肢痉挛是在18岁以上的受试者中。

本发明还包括使用BoNT/E的美容方法。例如，美容方法可用于治疗面部上缘线(例如眉间纹、外眦线和额线)。

在一个实施方案中，美容方法用于治疗眉间纹，并且选自外眦线和额线中的一个或多个。在一个实施方案中，美容方法用于治疗外眦线，和选自眉间纹和额线中的一个或多个。在一个实施方案中，美容方法用于治疗额骨线，以及选自眉骨线和外眦线中的一个或多个。

本发明的美容方法可包括施用(有效量)BoNT/E以治疗眉骨线、外眦线和/或额肌线，其中在同时或顺序施用BoNT/E以治疗所述眉骨线、外眦线和/或额肌线的部位，使得所述眉骨线、外眦线和/或额肌线中的每处得以治疗(优选同时治疗)。

优选地，所述美容方法用于治疗眉间纹。眉间纹可以是中度或重度(例如由医生确定)。

与BoNT/E的使用有关的实施方案旨在平等地应用于本文所述的治疗方法和美容方法，反之亦然。

在一个实施方案中，人类受试者是男性。

序列同源性

可以使用各种序列比对方法中的任何一种来确定％同一性，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如分段方法。确定％同一性的方案是本领域技术人员领域内的常规方法。全局方法从分子的开始到结束排列序列，并通过累加单个残基对的分数和施加空位罚值来确定最佳排列。非限制性方法包括，例如，CLUSTAL W，参见例如，JulieD.Thompson等人，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penaltiesand Weight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research4673-4680(1994)；以及迭代细化，参见，例如，Osamu Gotoh，Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structura) Alignments，264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过识别所有输入序列共享的一个或多个保守基序来排列序列。非限制性方法包括，例如，Match box，参见，例如，Eric Depiereux和Ernest Feytmans，Match box：A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences，8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs采样，参见，例如，C.e.Lawrence等人，Detecting SubtleSequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment，262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见，例如，Ivo Van Waie等人，Align-M-A NewAlgorithm for MultipIe AIignment of Highly Divergent Sequences，20(9)Bioinformatics：1428-1435(2004)。

因此，序列同一性％由常规方法确定。例如，见Altschul等人，Bull.Math.Bio.48：603-161986和Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.美国89：10915-11992。简单地说，两个氨基酸序列通过使用10的空位罚值、1的空位罚值和如下所示的Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)进行比对以优化比对分数(氨基酸由标准的一个字母代码表示)。

两个或多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性％”是序列共享的相同位置的数目的函数。因此，同一性％可计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100％。序列同一性的计算还可以考虑差异的数目，以及需要引入的每个差异的长度，以优化两个或多个序列的比对。序列比较和两个或多个序列之间的同一性％的确定可以使用特定的数学算法，例如BLAST来执行，这些算法是技术人员所熟悉的。

确定序列同一性的比对分数

如下计算同一性％：

基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸替换、缺失或添加。优选性质上属次要的变化，即保守的氨基酸替换(见下文)和其他不会显著影响多肽折叠或活性的替换；小的缺失，通常是一个到大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基、高达约20-25个残基的小连接肽或亲和标签。

保守的氨基酸替换

除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可包含非天然存在的氨基酸残基。

非天然氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲氨基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、异苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、去甲缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然存在的氨基酸残基结合到蛋白质中的方法。例如，可以采用体外系统，其中使用化学氨基酰化抑制子tRNAs抑制无义突变。本领域已知合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法。含有无义突变的质粒的转录和翻译在无细胞系统中进行，该无细胞系统包括大肠杆菌S30提取物和市售酶及其他试剂。蛋白质是用色谱法纯化的。例如，见Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.113：2722，1991；Ellman等人，Methods Enzymol.202：301，1991年；Chung等人，Science259：806-9，1993年；以及Chung等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：10145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化抑制子tRNAs在爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271：19991-8，1996)。在第三种方法中，大肠杆菌细胞在不存在待替换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)和存在所需的非天然氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养。非天然存在的氨基酸被掺入多肽中以代替其天然对应物。见Koide等人，Biochem.33：7470-6，1994。天然氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然氨基酸。化学修饰可以与定点突变相结合，以进一步扩大取代的范围(Wynn和Richards，Protein Sci.2：395-403，1993)。

有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可取代本发明多肽的氨基酸残基。

本发明多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的程序进行鉴定，例如定点突变或丙氨酸扫描突变(Cunningham and Wells，Science244：1081-51989)。生物相互作用的位点也可以通过结构的物理分析来确定，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定的接触位点氨基酸的突变来确定。例如，见de Vos等人，Science255：306-12，1992；Smith等人，J.Mol.Biol。224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett。309：59-64，1992。还可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析来推断必需氨基酸的同一性。

利用已知的诱变和筛选方法，如Reidhar-Olson和Sauer(Science241：53-7，1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-6，1989)，可以制备和测试多个氨基酸取代。简而言之，这些作者公开了同时随机化多肽中的两个或多个位置、选择功能性多肽、然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置允许取代的光谱的方法。可使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人，Biochem，30：10832-7，1991；Ladner等人，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和区域定向突变(Derbyshire等人，Gene 46：145，1986；Ner等人，DNA 7：127，1988)。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第20版，John Wiley and Sons，纽约(1994年)，以及Hale&Marham，HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，纽约(1991年)，为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。

本发明不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料可用于本发明实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，任何核酸序列均以5′至3′方向从左向右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左向右书写。

本文提供的标题不是本公开的各个方面或实施方案的限制。

本文使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所使用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在此互换使用。在本发明说明书和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的三字母代码，其定义符合IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)。另据了解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个核苷酸序列编码。

其他术语的定义可能出现在整个说明书中。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本说明书不限于所描述的特定实施方案，并且因此可以改变。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不想是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，应理解在该范围的上限和下限之间的每个中间值还应具体公开至下限单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值与该所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在该范围中，并且其中任一、任一或两个限制均包括在较小范围中的每个范围也包含在本发明中，受制于所述范围中的任何具体排除的限值。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，剔除其中一个或两个限值的范围也包括在本发明中。

必须注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。因此，例如，对“肉毒杆菌神经毒素”的引用包括多个这样的候选成分，对“肉毒杆菌神经毒素”的引用包括对本领域技术人员已知的一种或多种肉毒杆菌神经毒素及其等效物的引用，以此类推。

仅在本申请的提交日期之前提供本文所讨论的出版物用于其公开。本文中的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。

附图简述

现在将参考以下附图和实施例，仅以示例的方式描述本发明的实施方案。

图1显示了(A)指短伸肌的位置，(B)记录的动作电位。

图2显示了BoNT/E剂量递增程序和结果。

图3显示了与安慰剂相比，施用不同剂量的rBoNT/E后12周内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图4显示了与安慰剂相比，施用不同剂量的

后26周内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图5显示了与安慰剂相比，施用不同剂量的rBoNT/E后26周内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图6显示了与安慰剂相比，施用不同剂量的rBoNT/E后7天内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图7显示了与安慰剂相比，施周不同剂量的

后7天内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图8显示了在施用0.04ng rBoNT/E或20U

后26周内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图9显示了在施用0.04ng rBoNT/E或20U

后7天内受刺激的指短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图10显示了在施用0.2ng rBoNT/E或40U

后26周内受刺激的指短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图11显示了在施用0.2ng rBoNT/E或40U

后7天内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。

图12显示了施用0.04ng rBoNT/E后第10-21天受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。已对CMAP值进行了线性曲线拟合(MicrosoftExcel)，其R平方值为0.9642，斜率为y＝3.5531x+9.9523。CMAP值对应于图3所示的该剂量值。

图13显示了施用0.9ng rBoNT/E后10-42天内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。已对CMAP值进行了线性曲线拟合(MicrosoftExcel)，其R平方值为0.9926，斜率为y＝1.6167x-4.8227。CMAP值对应于图3所示的该剂量值。

图14显示了在施用3.6ng rBoNT/E后10-56天内受刺激的趾短伸肌的基线复合肌肉动作电位(CMAP)的％(平均值+/-s.e.m.)。已对CMAP值进行了线性曲线拟合(MicrosoftExcel)，其R平方值为0.9736，斜率为y＝1.7325x-9.3108。CMAP值对应于图3所示的该剂量值。

序列表

如果在以下任何SEQ ID NOs中指示初始Met氨基酸残基或相应的初始密码子，则所述残基/密码子是任选的。

SEQ ID NO：1(BoNT/E的核苷酸序列)

SEO ID NO：2(BoNT/E的多肽序列)

SEQ ID NO：3(BoNT/E-UniProt Q00496)

SEQ ID NO：4(BoNT/E L-链的多肽序列)

SEO ID NO：5(BoNT/E H-链的多肽序列)

实施例

材料与方法

药效学模型

药效学模型使用了指短伸肌(EDB)肌肉(图1A)。EDB是足部的浅表肌肉，可用于电生理研究。它涉及到脚的第二到第四个脚趾的延长，并且它的虚弱不影响行走。

EDB肌肉先前用于测定BoNT/A的作用，发表在Hamjian和Walker(1994)，MuscleNerve，17(12)：1385-92。此后，该模型被广泛用于：

·对BoNT注射后人体肌肉松弛的开始和程度以及作用持续时间进行量化(Sloop等人(1996年)，Neurology，46(5)，1382-6)；

·比较BoNT的不同亚型(例如BoNT/B与BoNT/A)(Sloop等人(1997年)，Neurology，49(1)，189-94)；

·检查BoNT/A制剂的效力(Park和Ahn(2013)，J Clin.Neurol.，9(3)，157-164)。

该方法包括注射EDB的刺激作用和其动作电位的记录(图1B)。BoNT/E或BoNT/A是以超声引导的方式施用的，使用表面电极刺激和记录动作电位。

图2总结了剂量递增程序，该程序是基于对先前队列的安全性(盲法)和药效学(匿名)数据的回顾。

研究设计与治疗

进行了I期、随机、双盲、安慰剂对照研究(人体临床试验)。

每位受试者在右侧EDB肌肉内注射单剂量的rBoNT-E或安慰剂(随机比3∶1)。

使用受试者队列，每个队列注射比前一个更高剂量的rBoNT-E。每个队列中的所有受试者接受相同剂量的rBoNT-E或安慰剂。

最多有8个队列：

·初始队列：每个队列4名受试者(3名rBoNT-E，1名安慰剂)。

·之后的队列：一旦在至少三名注射rBoNT-E的受试者中、在三个连续时间点、CMAP抑制作用与基线相比抑制作用～50％时，将队列的受试者增加一倍至八名。

队列按剂量递增顺序接受注射：

·在两个连续队列中，剂量递增直至每个队列中六名注射rBoNT-E的受试者中至少有四名在三个连续时间点达到最大CMAP抑制作用(比基线值减少≥85％)。

·使用的剂量为：0.1个基于细胞的分析单位(CBA U；0.04ng)、0.5CBAU(0.2ng)、2.25CBA U(0.9ng)和9.0CBA U(3.6ng)。

录入标准包括：

·健康男性成人(18-55岁)，体重指数为18-30kg/m²。

·通过刺激腓神经进行电生理检查(筛查时和注射前)，EDB CMAP总幅度≥5mV。

·愿意遵守研究方案并在要求的时间内留在诊所。

排除标准包括：

·录入前≤6个月接受过BoNT治疗。

·对rBoNT-E制剂成分过敏史。

·使受试者处于BoNT暴露风险的医学病症。

·使用神经肌肉传递剂。

基于细胞的分析

rBoNT/E的生物学活性通过基于细胞的分析(CBA)进行测定，并以相对于定义的参考标准的相对效力％表示。这种CBA模拟了BoNT/E的体内作用机制，即与受体结合，导致毒素内化并通过轻链内肽酶结构域切割突触体相关蛋白25(SNAP25)。CBA使用Neuro-2A，一种小鼠神经母细胞瘤细胞系通过基因工程表达一个报告子，该报告子利用全长SNAP-25，其两侧有荧光团、青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白(YFP)。当工程细胞与BoNT/E孵育时，毒素结合，并通过受体介导的内吞作用内化，导致BoNT/E轻链释放到胞浆中。内肽酶轻链在报告子中裂解SNAP-25，导致C末端报告子片段释放到含有SNAP-25和YFP残基的胞浆中。该片段被迅速降解，导致YFP荧光丧失。仅在毒素通过BoNT/E H链受体结合、内化和易位活动进入细胞时检测重组BoNT/E生物活性；因此，体外CBA模拟BoNT/E的自然细胞生物学。与BoNT/E量相对应的CBA单位在以下实施例中提供。

1 CBA单位可定义为在1分钟内切割1nM底物(SNAP-25)所需的BoNT/E量。

实施例1

BoNT/E的的施用

图3显示安慰剂在100％CMAP基线附近变化，并显示出对BoNT/E的明显剂量效应。两个较高剂量显示出相同的药效学(PD)曲线，达到最大抑制作用(90％以上)，作用持续时间约50天(15％抑制作用截止时长)或30天(50％抑制作用截止时长)。

D

的施用

图4再次显示了安慰剂在100％基线附近变化，40和70U的

(BoNT/a)剂量达到60-70％的抑制作用。在26周的随访期结束时，抑制作用稳定了数周，但没有恢复(回到15％的抑制作用)。

实施例2

持续到施用后26周的分析

图4和图5的比较表明，对于所研究的剂量范围，rBoNT-E起效更快，峰值效应更大且作用持续时间更短。

实施例3

作用起效

BoNT/E的作用起效时间(定义为记录到15％CMAP抑制作用的第一个时间点)在研究的所有受试者和所有rBoNT-E剂量水平中都是快速且一致的。还发现起效时间在第1天(施用BoNT/E的当天)和第2天之间，施用

则在第1天到第7天之间。结果如图6和图7所示，数值汇总如下表所示。

表1显示了rBoNT/E的数据。

rBoNT/E与第1天(施用当天)和第2天之间的快速起效有关。在第2天到第14天(最晚)之间记录了达最大效果的时间。rBoNT/E也与两个最高试验剂量持续50天左右的较短作用持续时间有关。

表2显示了

的数据。

a CMAP抑制作用在6个月随访期结束时仍未恢复15％基线。

在所研究的剂量范围内，

显示起效较晚，在第1天到第7天之间，且作用持续时间超过施用后26周。

实施例4

40pg rBoNT/E和20U

的比较

图8和图9显示，40pg rBoNT-E产生与20U

相同的作用幅度。值得注意的是，20U Dysport＝108pg神经毒素(5.38pg神经毒素/U)。

下表进行了PD性质对比。

表3显示了rBoNT/E和

的比较数据。

PD参数	rBoNT-E-40pg	Dysport 20U
			起效时间	D1-D2	D1-D7
最大作用	平均～50％抑制作用	平均～50％抑制作用
			达最大作用的时间	平均9天	平均57天
作用持续时间	平均20天	平均＞6个月＊

＊2/6受试者约40天，4/6受试者＞26周

实施例5

200pg rBoNT/E和40U

的比较

图10和图11显示，200pg rBoNT-E产生与40U

相同的作用幅度。下表进行了PD性质比较。

表4显示了rBoNT/E和

的比较数据。

PD参数	rBoNT-E-200pg	Dysport 40U
			起效时间	D1-D2	D1-D4
最大作用	平均～70％抑制作用	平均～70％抑制作用
			达最大作用的时间	平均9天	平均29天
作用持续时间	平均35天	平均＞6个月

总之，BoNT/E表现出：

·在健康志愿者(正常肌肉)单次肌肉注射剂量高达3.6ng的rBoNT-E具有良好的总体安全性特性；

·邻近肌肉无局部扩散(AH和ADQ)；

·快速起效，与研究剂量无关；

·剂量依赖的作用幅度，自0.9ng的剂量起达最大作用；

·在大约一周内达到最大作用；以及

·两个最高试验剂量的相似PD曲线与大约50天的作用持续时间相关。

相反，在26周(6个月)的

记录期结束时，仍观察到CMAP抑制作用。

关于最大作用幅度：

·20U Dysport与0.04ng rBoNT-E比较；以及

·40-70U Dysport与0.2ng rBoNT-E比较。

实施例6

上面部纹的治疗

一个有严重眉间纹的受试者(根据面部皱纹量表(FWS)为3级，其中0＝无，3＝严重)。在五个部位肌肉注射至少0.1ng(每个注射部位)的rBoNT/E(按顺序，使每块肌肉基本上同时注射)：前肌一个部位，每个皱眉肌两个部位。

受试者眉间纹的严重程度在施用后7天(施用后)使用FWS进行评估，并确定等级为0(因此，证明rBoNT/E对治疗面部上纹起效快)。

受试者眉间纹的严重程度在35天(施用后)使用FWS进行评估，并确定为2级(中度)。

在56天(施用后)使用FWS评估受试者眉间纹的严重程度，并确定等级为3级(严重)(因此，证明rBoNT/E对治疗上面部纹的作用持续时间较短)。

通过引用将以上说明书中提及的所有出版物并入本文作为参考。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所描述的本发明的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，如权利要求所述的本发明不应当不适当地局限于这种特定实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意欲在以下权利要求的范围内。

Claims (30)

1.用于治疗障碍的肉毒杆菌神经毒素血清型E(BoNT/E)，其中将所述BoNT/E施用于人类受试者，并且在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用；且

在施用后第14天，对靶细胞或组织的神经递质分泌抑制作用降低到＞25％。

2.用于治疗障碍的方法，所述方法包括向人类受试者施用BoNT/E，并且其中施用BoNT/E在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供最大抑制作用；且

在施用后第14天，对靶细胞或组织的神经递质分泌抑制作用降低到＞25％。

3.美容方法，包括向人类受试者施用BoNT/E，其中BoNT/E在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌作用提供最大抑制作用；且

在施用后第14天，对靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用降低到＞25％。

4.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中所述BoNT/E不含在天然存在的BoNT/E中所存在的复合蛋白质。

5.根据上述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中所述BoNT/E为重组BoNT/E。

6.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用的所述BoNT/E总剂量大于3.6ng。

7.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用的所述BoNT/E总剂量大于4ng。

8.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用所述BoNT/E并提供：

在施用后≤13天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌的至少40％的抑制作用；以及

在施用后＞21天到＜100天，对靶细胞或组织的神经递质分泌抑制作用降低到15％或更少。

9.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用所述BoNT/E并提供：

在施用后≤13天内，对靶细胞或组织的神经递质分泌的至少40％的抑制作用；以及

在施用后＞40天到＜80天，对靶细胞或组织的神经递质分泌提供的抑制作用降低到15％或更少。

10.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用所述BoNT/E并且在神经递质分泌的最大抑制作用之后提供神经递质分泌抑制作用％的实质性线性降低。

11.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在施用后≤10天内对所述靶细胞或组织的神经递质分泌提供至少40％的抑制作用。

12.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在施用后＜80天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供了15％或更少的抑制作用。

13.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在施用后＜60天内对所述靶细胞或组织的神经递质分泌提供了15％或更少的抑制作用。

14.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在施用后＜30天肉对靶细胞或组织的神经递质分泌提供了15％或更少的抑制作用。

15.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在5-100天内对神经递质分泌提供了大于15％的抑制作用。

16.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在5-60天内对神经递质分泌提供了大于15％的抑制作用。

17.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在5-40天内对神经递质分泌提供了大于15％的抑制作用。

18.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在5-30天内对神经递质分泌提供了大于15％的抑制作用。

19.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在施用后≤13天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供40-60％的抑制作用。

20.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E，并且在施用后≤11天内对靶细胞或组织的神经递质分泌提供了40-60％的抑制作用。

21.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E并提供了：

a.施用后≤13天内对靶细胞或组织神经递质分泌的最大抑制作用；以及

b.随后对神经递质分泌抑制作用每天降低1-10％。

22.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中施用了所述BoNT/E并提供了：

a.施用后≤10天内对靶细胞或组织神经递质分泌的最大抑制作用；以及

b.从施用后的第10-24天、第6-42天、第10-42天和/或第10-56天开始，对神经递质分泌的抑制作用％每天降低1-3％。

23.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中通过电生理学测量靶细胞或组织的神经递质分泌的抑制作用％。

24.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中所述BoNT/E：

a.由与SEQ ID NO：1具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码；或

b.包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少70％序列同一性的多肽序列。

25.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中所述BoNT/E包含与序列ID NO：2具有至少70％序列同一性的多肽序列，但前提条件是所述多肽序列包含一个或多个以下氨基酸(其中所述氨基酸位置编号从BoNT/E蛋白质的N端甲硫氨酸氨基酸残基开始，以C端氨基酸残基结束)：

177位的甘氨酸；198位的丝氨酸；340位的丙氨酸；773位的亮氨酸；963位的亮氨酸；964位的谷氨酰胺；967位的丙氨酸；1195位的天冬酰胺。

26.根据前述权利要求中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或美容方法，其中所述障碍是以下相关病症中的一种或多种：斜视、眼睑痉挛、斜视、肌张力障碍(例如痉挛性肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、局灶性肌张力障碍、迟发性肌张力障碍、喉肌张力障碍、肢体肌张力障碍、颈肌张力障碍)、斜颈(如痉挛性斜颈)，因细胞/肌肉失能(通过SANRE下调或失活)而受益的美容(美容)应用，神经肌肉疾病或眼运动状况(如伴发斜视、垂直斜视、侧直肌麻痹、眼球震颤、甲状腺功能不全肌病)、书写痉挛，眼睑痉挛、磨牙症、威尔逊氏病、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛、慢性多发性硬化所致的痉挛、导致膀胱控制异常的痉挛、animus、背部痉挛、抽筋、紧张性头痛、提上睑肌-骨盆综合征、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森氏病、口吃、面肌痉挛、眼睑疾病、脑瘫、局灶性痉挛、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、失弛缓症、吞咽困难、流泪、多汗、流涎过多、胃肠分泌物过多、肌肉痛(如肌肉痉挛引起的疼痛)、头痛(如紧张性头痛)、眉毛皱纹、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖系统障碍、泌尿生殖系统神经系统障碍、慢性神经源性炎症和平滑肌障碍。

27.根据权利要求1-2或4-26中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素或方法，其中所述障碍为上肢痉挛。

28.根据权利要求1-2或4-27中任一项使用的肉毒杆菌神经毒素、方法或用途，其中所述障碍是18岁以上受试者的上肢痉挛。

29.根据权利要求3-25中任一项的美容方法，其中所述美容方法用于治疗面部上线；任选地，其中所述面部上线是从眉间纹、外眦线、额肌线或其组合中选择的一个或多个。

30.根据权利要求3-25或29中任一项的美容方法，其中所述美容方法用于治疗眉间纹。

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