CN105380911A

CN105380911A - 一种猪干扰素冻干剂的制备方法

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Publication number: CN105380911A
Application number: CN201510883770.XA
Authority: CN
Inventors: 宋宏婷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2016-03-09

Abstract

本发明公开了一种猪干扰素冻干剂的制备方法，属于动物疫苗领域。本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，包括无菌采集健康猪鲜血，于4℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH₄Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％猪血清的Eagle`s？MEM混合培养液悬浮，将猪白细胞数稀释在10×10⁷个/ml～25×10⁷个/ml之间，制得猪白细胞悬浮液等六个步骤。本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法具有制备长效的猪病毒干扰素制剂，10天注射一次，对猪病毒性疾病具有良好效果的特点。

Description

一种猪干扰素冻干剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种冻干剂的制备方法，特别是一种猪干扰素冻干剂的制备方法。

背景技术

猪干扰素是研究最早的动物干扰素之一，20世纪80年代就有猪干扰素的相关报道。已发现的猪干扰素包括INF-α、β、ω、δ和INF-γ，现在已完成基因克隆、测序和定位。近年来，对猪干扰素的诱导条件和理化活性有了进一步的研究，同时对猪白细胞干扰素进行了大量的临床试验。研究表明，它对猪的许多病毒性传染病如流行性腹泻、猪瘟、传染性胃肠炎等，以及对牛病毒性腹泻、小鹅瘟、羔羊腹泻等都具有显著疗效，试验证实猪干扰素与牛羊等动物之间存在交叉活性。目前尚未有一种高效的用于治疗猪病毒病的干扰素制剂。现有的猪干扰素必须每天重复用药，价格昂贵，治疗效果欠佳。今后的发展趋势是寻找一种高效价格低廉的长效干扰素制剂，能够用于临床，对人而言，主要用作免疫增强剂和无毒副作用，动物主要用于病毒病的治疗。目前尚未有猪的长效干扰素投放市场。我们拟通过基因修饰建立猪长效干扰素，研制一种有效的制剂，3-5年投放市场。

干扰素（IFN）是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分，猪干扰素是治疗猪病毒性疾病的首选药物。猪是现代农业发展的主要项目，发展养猪生产是关系国计民生的大问题。困扰养猪业发展的主要问题是疾病问题，而猪的传染性疾病是对猪的最大危害，我国每年因猪的传染性疾病造成的经济损失达数十亿元，严重阻碍养猪业的发展。在猪的传染病中病毒性疾病占主导地位，约占85％。对于猪的病毒性传染病（如猪瘟、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征等）目前主要靠疫苗进行预防。猪病毒性疾病绝大多数都有可用的疫苗进行预防。

近年来，随着猪病毒新毒株、变异株的不断出现，我国猪病毒病的防治面临严峻的挑战，目前的预防和治疗措施已经不能有效地控制疫病的发展，其危害日益严重，因此迫切需要一种有效的防治措施和高效的药物。对动物的病毒性传染病的治疗只有依靠高免血清或病毒干扰制剂。由于受价格和动物适应性的影响，目前尚无可供的高免血清用于猪病毒性疾病的治疗。虽然已经研究出可以用于治疗病毒性疾病的干扰素制剂，如聚肌胞、猪干扰素等，但这些产品存在严重缺陷，这类药品半衰期短、疗效差、价格高。对患病动物每天必须重复用药，增加了用药的成本，往往达不到预期效果，使这类药物的应用受到严重的制约。到目前为止，还没有一种有效而实用的药物用于猪病毒性疾病的治疗，所以研制高效的抗病毒药物是治疗猪病毒性疾病的重要手段，是防治猪病毒性传染病发展养猪生产所必须。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种制备长效的猪病毒干扰素制剂，10天注射一次，对猪病毒性疾病具有良好效果的猪干扰素冻干剂的制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，包括以下步骤，

步骤一：无菌采集健康猪鲜血，于4℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH₄Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％猪血清的Eagle`sMEM混合培养液悬浮，将猪白细胞数稀释在10×10⁷个/ml～25×10⁷个/ml之间，制得猪白细胞悬浮液；

步骤二：取一份猪白细胞悬浮液，加入含100个活性单位的猪白细胞干扰素，置于37℃水浴摇床搅拌培养36h；

步骤三：按照每毫升猪白细胞悬液50HANDVⅡ的加入量，在细胞悬液中加入一定量新城疫病毒NDVⅡ，调节pH为7.2，在水浴恒温振荡器37℃旋转培养24h，培养完成后，用6MHCl把培养液的pH调至3.5，在4℃下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的NaOH溶液把pH调至7.4，离心去除沉淀，取上清液，制得猪白细胞干扰素粗制液；

步骤四：取一份猪白细胞干扰素粗制液，用NaOH溶液调节pH值到8.5，在冰浴条件下，按照干扰素粗制液：聚乙二醇酯摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇酯，聚乙二醇酯加入量为五份，升温至4℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至12℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至25℃，搅拌反应2h，向溶液加入五份聚乙二醇酯，升温至36℃，搅拌反应2h，完全反应后，加入0.75Μ的甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇酯修饰的干扰素；

由于采用了上述技术方案，采用聚乙二醇酯对干扰素进行修饰，能够扩大干扰素分子的分子大小，使得干扰素不易经过肾脏代谢而排出体外，从而延长了干扰素在猪体内的存在时间；同时能够提高干扰素的稳定性，延长半衰期，降低免疫原性，提高干扰素的水溶性。

步骤五：取一份聚乙二醇酯修饰的干扰素，取适量去离子水作为溶剂，按照聚乙二醇酯修饰的干扰素：烷基丁二酸酯磺酸钠摩尔比1:1向溶液中加入烷基丁二酸酯磺酸钠，用盐酸调节pH为2.6，按照烷基丁二酸酯磺酸钠：α-氰基丙烯酸丁酯摩尔比1:2.5向溶液中加入α-氰基丙烯酸丁酯，搅拌10min，再用NaOH调节溶液的pH为5.8，继续搅拌反应，用0.8μm微孔滤膜除去大的纳米球，得纳米球乳状胶体溶液；

由于采用了上述技术方案，将干扰素以α-氰基丙烯酸丁酯为载体，制备成为纳米球粒径，能够成团靶向给药；同时有具有良好的分散性，在到达靶点后能够分散作用，提高干扰素的药效作用力。

步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件下加入渗透性保护液，继续在次声波条件下振荡30~45s，将溶液置于真空度0.98的环境下，设置温度为-12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为-20℃，按照80Pa/min的速度恢复气压至常压，得到猪干扰素冻干剂。

由于采用了上述技术方案，温度在3.9℃的条件下DMSO对细胞毒性最小，但是温度过低，冻存液中可能形成小冰晶，从而对细胞造成机械损伤，因此将温度控制在3.2~3.9℃。

在次声波振荡条件下，可以将冷冻保护剂迅速扩散开，渗透入乳状胶体的内部，将干扰素分子完全置于在冷冻保护剂中。

在真空状态下，经过预冻存后投入液氮中，阻隔空气热交换，提高冷冻效率，能够迅速降温，提高冻存脱水的效率，从而避免在冷冻过程中出现小冰晶，使得干扰素直接形成玻璃体，提高了冻存的存活率，实现活性无损冻干。

本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，所述渗透性保护液由3%~3.8%的DMSO，4.8%~5.6%的明胶，0.6%~1.0%的单糖，2.8%~3.2%的甘氨酸，1.8%~2.4%的人血清白蛋白，1.4%~2.0%的吐温-800，0.5%~0.7%的NaCl，4.9%~5.1%的甘露，20%~34%的乙酸乙酯和44.2%~58.2%的去离子水组成。

由于采用了上述技术方案，人血清白蛋白是一种良好的冻干剂保护液，但是采用人血清蛋白作为保护液成本过高，因此配制渗透性保护液用其他组分来代替大部分人血清蛋白能够大大降低成本。

采用3%~3.8%的DMSO配制成为渗透性保护液，在渗透保护细胞活性的同时，将保护剂的细胞毒性降低到最小，减小了在冷冻过程中保护剂对冻存干扰素造成的细胞毒性损伤。

单糖不仅可以为细胞代谢提供一定的营养，同时可以作为非渗透性保护剂，保证降低了渗透性保护剂含量，对冻存效果不会造成影响。

生理盐水降低了保护剂的渗透压，减小了在冻存过程中引起保护剂的渗透性损伤。

本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，所述渗透性保护液由3.4%的DMSO，5.2%的明胶，0.8%的单糖，3%的甘氨酸，2.1%的人血清白蛋白，1.7%的吐温-800，0.6%的NaCl，5%的甘露，27%的乙酸乙酯和51.2%的去离子水组成。

由于采用了上述技术方案，该比例为最佳值。

本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，所述单糖包括0.3%~0.5%的葡萄糖和0.5%~0.7%的果糖。

本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，所述次声波的频率为8~13Hz。

由于采用了上述技术方案，该频率与内脏器官震动频率相接近，从而使得干扰素更好的适应冻存液环境，提高保护剂渗透效果。

本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，所述聚乙二醇酯的分子量为50KDa。

由于采用了上述技术方案，该分子量为最佳值。

本发明的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，所述DMSO的浓度为0.34~0.37g/mL。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、制备出长效的猪病毒干扰素制剂，10天注射一次，对猪病毒性疾病具有良好效果，提高干扰素的稳定性，延长半衰期，降低免疫原性，提高干扰素的水溶性。

2、将干扰素以α-氰基丙烯酸丁酯为载体，制备成为纳米球粒径，能够成团靶向给药，同时有具有良好的分散性，在到达靶点后能够分散作用，提高干扰素的药效作用力。

3、配制渗透性保护液用其他组分来代替大部分人血清蛋白能够大大降低成本，提高冻存脱水的效率，从而避免在冷冻过程中出现小冰晶，使得干扰素直接形成玻璃体，提高了冻存的存活率，实现活性无损冻干。

具体实施方式

下面对本发明作详细的说明。

为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种猪干扰素冻干剂的制备方法，包括以下步骤，

步骤一：无菌采集健康猪鲜血，于4℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH₄Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％猪血清的Eagle`sMEM混合培养液悬浮，将猪白细胞数稀释在10×10⁷个/ml，制得猪白细胞悬浮液；

步骤四：取一份猪白细胞干扰素粗制液，用NaOH溶液调节pH值到8.5，在冰浴条件下，按照干扰素粗制液：聚乙二醇酯摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇酯，聚乙二醇酯的分子量为为50KDa，聚乙二醇酯加入量为五份，升温至4℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至12℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至25℃，搅拌反应2h，向溶液加入五份聚乙二醇酯，升温至36℃，搅拌反应2h，完全反应后，加入0.75Μ的甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇酯修饰的干扰素；

步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.85%的盐水中，维持温度在3.2℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件下加入渗透性保护液，次声波的频率为8Hz，渗透性保护液包括3%的DMSO，DMSO的浓度为0.34g/mL，5.6%的明胶，0.6%的单糖，3.2%的甘氨酸，1.8%的人血清白蛋白，2.0%的吐温-800，0.5%的NaCl，5.1%的甘露，20%的乙酸乙酯和58.2%的去离子水，其中单糖包括0.3%的葡萄糖和0.7%的果糖；继续在次声波条件下振荡30s，将溶液置于真空度0.98的环境下，设置温度为-12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为-20℃，按照80Pa/min的速度恢复气压至常压，得到猪干扰素冻干剂。

实施例2

一种猪干扰素冻干剂的制备方法，包括以下步骤，

步骤一：无菌采集健康猪鲜血，于4℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH₄Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％猪血清的Eagle`sMEM混合培养液悬浮，将猪白细胞数稀释在25×10⁷个/ml，制得猪白细胞悬浮液；

步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.9%的盐水中，维持温度在3.9℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件下加入渗透性保护液，次声波的频率为13Hz，渗透性保护液包括3.8%的DMSO，DMSO的浓度为0.37g/mL，4.8%的明胶，1.0%的单糖，2.8%的甘氨酸，2.4%的人血清白蛋白，1.4%的吐温-800，0.7%的NaCl，4.9%的甘露，34%的乙酸乙酯和44.2%的去离子水，其中单糖包括0.5%的葡萄糖和0.5%的果糖；继续在次声波条件下振荡45s，将溶液置于真空度0.98的环境下，设置温度为-12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为-20℃，按照80Pa/min的速度恢复气压至常压，得到猪干扰素冻干剂。

实施例3

一种猪干扰素冻干剂的制备方法，包括以下步骤，

步骤一：无菌采集健康猪鲜血，于4℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH₄Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％猪血清的Eagle`sMEM混合培养液悬浮，将猪白细胞数稀释在20×10⁷个/ml之间，制得猪白细胞悬浮液；

步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.87%的盐水中，维持温度在3.7℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件下加入渗透性保护液，次声波的频率为11Hz，渗透性保护液包括3.4%的DMSO，DMSO的浓度为0.35g/mL，5.2%的明胶，0.8%的单糖，3%的甘氨酸，2.1%的人血清白蛋白，1.7%的吐温-800，0.6%的NaCl，5%的甘露，27%的乙酸乙酯和51.2%的去离子水，其中单糖包括0.4%的葡萄糖和0.6%的果糖；继续在次声波条件下振荡40s，将溶液置于真空度0.98的环境下，设置温度为-12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为-20℃，按照80Pa/min的速度恢复气压至常压，得到猪干扰素冻干剂。

实施例4

本实施例对实施例1~3所得混合冻干粉进行性能检测，结果如表1所示。

常温效价检测试验方法：将实施例1~3所得混合冻干剂保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别在1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散法，测定每个时间点所取样品的干扰素效价变化。

表1实施例1~3所得冻干剂常温效价检测实验结果

实施例5

本实验例对实施例3的冻干剂防治猪瘟的效果进行临床实验。

实验方法：选取断奶仔猪90只，其中10只作为攻毒组隔离饲养，10只作为空白组隔离饲养，60只作为对照组分为6组，每组10只，隔离饲养，分别用对比例1～6的制剂治疗，另外10只作为试验组，用实施例1的制剂治疗。饲养方式为自由采食普通饲料，自由饮水，24h后，取试验组、对照组和攻毒组的猪肌注接种稀释后的猪瘟病毒液，接种量为2ml/只；感染后开始针对性治疗，肌肉注射，注射液给药量为0.2ml/kg体重；记录120h后的死亡情况，结果如表2所示。

表2实施例1所得冻干剂对猪瘟的防治效果实验结果

其中，对比例1~6的药剂配方如表4所示。

表4对比例1~6的药剂配方

从表4中可以看出，实施例1所得冻干剂可以有效防治猪瘟，且效果要明显优于抗猪瘟卵黄抗体、抗猪瘟转移因子、α-干扰素中任意一种单独使用或其中两种组合使用的情况。

实施例6

田间控制治疗试验和田间推广治疗试验，结果见表5、6

表5田间控制治疗试验统计

表6田间推广治疗试验统计

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

2.如权利要求1所述的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述渗透性保护液由3%~3.8%的DMSO，4.8%~5.6%的明胶，0.6%~1.0%的单糖，2.8%~3.2%的甘氨酸，1.8%~2.4%的人血清白蛋白，1.4%~2.0%的吐温-800，0.5%~0.7%的NaCl，4.9%~5.1%的甘露，20%~34%的乙酸乙酯和44.2%~58.2%的去离子水组成。

3.如权利要求1或2所述的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述渗透性保护液由3.4%的DMSO，5.2%的明胶，0.8%的单糖，3%的甘氨酸，2.1%的人血清白蛋白，1.7%的吐温-800，0.6%的NaCl，5%的甘露，27%的乙酸乙酯和51.2%的去离子水组成。

4.如权利要求3所述的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述单糖包括0.3%~0.5%的葡萄糖和0.5%~0.7%的果糖。

5.如权利要求1或4所述的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述次声波的频率为8~13Hz。

6.如权利要求5所述的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇酯的分子量为为50KDa。

7.如权利要求6所述的一种猪干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述DMSO的浓度为0.34~0.37g/mL。