JP2017535557A - 組み換え融合タンパク質製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、安定化剤および界面活性剤含む、組み換え融合タンパク質を安定して保存できるようにする液体製剤を提供する。
Description
本発明は生物技術の薬物製剤の分野に関し、具体的に、安定した組み換え融合タンパク質製剤およびその製造方法と使用に関する。
加齢黄斑変性（AMD）は黄斑変性症とも呼ばれ、網膜の黄斑領域の構造の老衰性の変化で、主に網膜色素上皮細胞および網膜の退行性病変による不可逆的視力低下または喪失である。当該病気は臨床でドライ型（萎縮型）AMDとウェット型（滲出型）AMDの2種類に分かれ、中では、ウェット型AMDはAMDの合計症例数の約20％を占めるが、欧米諸国では、ウェット型AMDは高齢者失明の最大の原因である。眼内における異常血管増殖はウェット型AMDの発生と進行の主な原因の一つで、異常血管増殖に対する阻害はウェット型AMDの治療の基本で、疾患の進行を遅延させ、ひいては阻止することが可能である。血管内皮増殖因子（VEGF）は分泌性タンパク質で、血管新生を誘導し、血管の透過性を増加し、炎症を引き起こすが、これらの要素はウェット型AMDの進行とも密接に関連する。そのため、ウェット型AMD治療薬の開発時、いつもVEGFは潜在の治療標的とされる。
組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質（以下IBI302と略す）は以上の機序に基づいて設計・開発されたAMD疾患に対する大分子薬物である。それは出願者らが自主的に設計した全世界で知的権利を所有するI類の新薬で、その投与様態は硝子体内注射と設計され、投与量は0.5〜2mg/眼と予測される。
1982年の最初の組み換え薬物である人工インスリンの市販以来、タンパク質工学の技術によって製造される組み換え融合タンパク質は多く開発されてきて、一部はすでに通常の薬品として受け入れられた。しかし、このような薬物はいずれも分子量が大きいポリペプチドまたはタンパク質で、その機能は不安定で、変性しやすく、そしてタンパク質は高濃度の時に自己集合が生じやすい。これらの不利な要素は、このような薬物を安定した安全で有効な製剤にすることに対する大きなチャレンジである。
組み換え融合タンパク質は生物大分子で、その構造は非常に複雑である。生産と保存の過程において、発現されたタンパク質は様々な物理・化学的変化が生じる。物理的変化は、吸着、アンフォールディング変性、集合や沈殿などがある。化学的変化は、脱アミド、異性化、酸化などがある。これらの変化は、最終製品の安全性と有効性に影響を与えることがある。そのため、製品の安定性と安全性を保証するために、適切な製剤処方を確立することが重要である。
IBI302は二重標的特異性融合タンパク質で、国家I類新薬である。その構造の複雑性のため、その化学的性質が不安定で、タンパク質が集合しやすく、かつ電荷異性体はアルカリ性成分から酸性成分に転化しやすい。
そのため、本分野では、製品の安定性を保証するために、組み換えタンパク質製剤の研究・開発はまだ必要である。
IBI302は二重標的特異性融合タンパク質で、国家I類新薬である。その構造の複雑性のため、その化学的性質が不安定で、タンパク質が集合しやすく、かつ電荷異性体はアルカリ性成分から酸性成分に転化しやすい。
そのため、本分野では、製品の安定性を保証するために、組み換えタンパク質製剤の研究・開発はまだ必要である。
本発明の目的は、融合タンパク質が高濃度でも安定して保存でき、また製剤は高温加速、長期間冷蔵や冷凍と解凍の繰り返しなどの条件のいずれでも安定性を保ち、臨床使用の安全性を向上させる組み換えタンパク質製剤を提供することにある。
本発明の第一では、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、安定化剤、界面活性剤および無菌注射用水を含む組み換え融合タンパク質の液体製剤であって、
前記組み換え融合タンパク質の濃度は5〜45mg/mLで、
前記緩衝塩はクエン酸塩、酢酸塩のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩の濃度は5〜25mmol/L、好ましくは8〜22mmol/Lで、
前記安定化剤は塩化ナトリウム、アミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、前記アミノ酸はアルギニン、グリシン、ヒスチジンのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、前記多価アルコールはショ糖、ソルビトール、マンニトールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩化ナトリウムの濃度は100〜200mmol/Lで、前記アミノ酸の濃度は50〜350mmol/Lで、前記多価アルコールの濃度は前記液体製剤の合計重量に対して1重量％〜15重量％で、
前記組み換え融合タンパク質の濃度は5〜45mg/mLで、
前記緩衝塩はクエン酸塩、酢酸塩のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩の濃度は5〜25mmol/L、好ましくは8〜22mmol/Lで、
前記安定化剤は塩化ナトリウム、アミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、前記アミノ酸はアルギニン、グリシン、ヒスチジンのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、前記多価アルコールはショ糖、ソルビトール、マンニトールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩化ナトリウムの濃度は100〜200mmol/Lで、前記アミノ酸の濃度は50〜350mmol/Lで、前記多価アルコールの濃度は前記液体製剤の合計重量に対して1重量％〜15重量％で、
前記界面活性剤はポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記界面活性剤の濃度は前記液体製剤の合計重量に対して0.01重量％〜0.08重量％で、
かつ前記液体製剤のpHは4.5〜7.5である、
液体製剤を提供する。
もう一つの好適な例において、前記組み換え融合タンパク質は組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質で、アミノ酸配列は配列番号1または配列番号3で示される。
もう一つの好適な例において、前記安定化剤はアミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
かつ前記液体製剤のpHは4.5〜7.5である、
液体製剤を提供する。
もう一つの好適な例において、前記組み換え融合タンパク質は組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質で、アミノ酸配列は配列番号1または配列番号3で示される。
もう一つの好適な例において、前記安定化剤はアミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
もう一つの好適な例において、前記塩化ナトリウムの濃度は120〜180mmol/Lである。
もう一つの好適な例において、前記アミノ酸の濃度は70〜260mmol/Lである。
もう一つの好適な例において、前記多価アルコールの濃度は3重量％〜10重量％である。
もう一つの好適な例において、前記多価アルコールの濃度は200〜300mmol/L、好ましくは220〜270mmol/Lである。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤のpHは5.0〜7.2、好ましくは5.5〜7.0である。
もう一つの好適な例において、前記アミノ酸の濃度は70〜260mmol/Lである。
もう一つの好適な例において、前記多価アルコールの濃度は3重量％〜10重量％である。
もう一つの好適な例において、前記多価アルコールの濃度は200〜300mmol/L、好ましくは220〜270mmol/Lである。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤のpHは5.0〜7.2、好ましくは5.5〜7.0である。
もう一つの好適な例において、前記緩衝塩はクエン酸塩で、
前記アミノ酸はアルギニンで、
前記多価アルコールはショ糖で、
前記界面活性剤はポリソルベート20である。
本発明において、前記緩衝塩はクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
本発明の第二では、本発明の第一に記載の液体製剤と、前記液体製剤が入る容器とを含むキットを提供する。
さらに、前記キットはさらに説明書を含む。
前記アミノ酸はアルギニンで、
前記多価アルコールはショ糖で、
前記界面活性剤はポリソルベート20である。
本発明において、前記緩衝塩はクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
本発明の第二では、本発明の第一に記載の液体製剤と、前記液体製剤が入る容器とを含むキットを提供する。
さらに、前記キットはさらに説明書を含む。
本発明の第三では、加齢黄斑変性を予防および/治療する薬物の製造における第一に記載の液体製剤の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記加齢黄斑変性はウェット型加齢黄斑変性である。
本発明の液体製剤は、組み換え融合タンパク質を安定化させ、当該組み換えタンパク質を安定して処方に存在させ、製品の品質を向上させ、製品の貯蔵期間を伸ばし、臨床使用の安全性を上げることができる。液体製剤は良い熱安定性を持ち、高温加速、長期間冷蔵や冷凍と解凍の繰り返しなどの条件のいずれでも安定を保つ。
もう一つの好適な例において、前記加齢黄斑変性はウェット型加齢黄斑変性である。
本発明の液体製剤は、組み換え融合タンパク質を安定化させ、当該組み換えタンパク質を安定して処方に存在させ、製品の品質を向上させ、製品の貯蔵期間を伸ばし、臨床使用の安全性を上げることができる。液体製剤は良い熱安定性を持ち、高温加速、長期間冷蔵や冷凍と解凍の繰り返しなどの条件のいずれでも安定を保つ。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
具体的な実施形態
本出願の発明者らは幅広く深く研究したところ、初めて、加速、長期間や冷凍・解凍などの条件で製品の安定性を保証できる、組み換え融合タンパク質製剤を意外に研究・開発した。本発明が適用できる組み換え融合タンパク質（VEGF阻害剤）はさらにほかの遺伝子工学技術によって得られる組み換え融合タンパク質（VEGF阻害剤）を含む。これに基づき、本発明を完成させた。
本出願の発明者らは幅広く深く研究したところ、初めて、加速、長期間や冷凍・解凍などの条件で製品の安定性を保証できる、組み換え融合タンパク質製剤を意外に研究・開発した。本発明が適用できる組み換え融合タンパク質（VEGF阻害剤）はさらにほかの遺伝子工学技術によって得られる組み換え融合タンパク質（VEGF阻害剤）を含む。これに基づき、本発明を完成させた。
組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質
本発明における好適な組み換え融合タンパク質はアミノ酸配列が配列番号1で示される組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質（US61/629,932(PCT/US2012/067489)；特許名称：Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereofを参照する）である。
本発明のもう一つの好適な組み換え融合タンパク質はアミノ酸配列が配列番号3で示される組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質である。
本発明における好適な組み換え融合タンパク質はアミノ酸配列が配列番号1で示される組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質（US61/629,932(PCT/US2012/067489)；特許名称：Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereofを参照する）である。
本発明のもう一つの好適な組み換え融合タンパク質はアミノ酸配列が配列番号3で示される組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質である。
液体製剤
本発明の組み換え融合タンパク質の液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、安定化剤、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、塩化ナトリウム、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、多価アルコール、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、アミノ酸、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、多価アルコール、アミノ酸、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
本発明の組み換え融合タンパク質の液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、安定化剤、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、塩化ナトリウム、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、多価アルコール、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、アミノ酸、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
もう一つの好適な例において、前記液体製剤は、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、多価アルコール、アミノ酸、界面活性剤および無菌注射用水を含む。
前記組み換え融合タンパク質の濃度は5〜45mg/mLである。
前記緩衝塩はクエン酸塩、酢酸塩のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩の濃度は5〜25mmol/L、好ましくは8〜22mmol/Lである。
前記安定化剤は塩化ナトリウム、アミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
前記アミノ酸はアルギニン、グリシン、ヒスチジンのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。前記アミノ酸の濃度が50〜350mmol/L、より好ましくは70〜260mmol/Lである。
前記多価アルコールはショ糖、ソルビトール、マンニトールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。前記多価アルコールの濃度は1重量％〜15重量％、好ましくは3重量％〜10重量％である。
前記緩衝塩はクエン酸塩、酢酸塩のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩の濃度は5〜25mmol/L、好ましくは8〜22mmol/Lである。
前記安定化剤は塩化ナトリウム、アミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
前記アミノ酸はアルギニン、グリシン、ヒスチジンのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。前記アミノ酸の濃度が50〜350mmol/L、より好ましくは70〜260mmol/Lである。
前記多価アルコールはショ糖、ソルビトール、マンニトールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。前記多価アルコールの濃度は1重量％〜15重量％、好ましくは3重量％〜10重量％である。
前記塩化ナトリウムの濃度は100〜200mmol/Lである。
前記界面活性剤はポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188のうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
前記界面活性剤の濃度は前記液体製剤の合計重量に対して0.01重量％〜0.08重量％、好ましくは0.02重量％〜0.06重量％である。
前記液体製剤のpHは4.5〜7.5、好ましくは5.0〜7.0である。
前記界面活性剤はポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188のうちの1種類または2種類以上の組み合わせである。
前記界面活性剤の濃度は前記液体製剤の合計重量に対して0.01重量％〜0.08重量％、好ましくは0.02重量％〜0.06重量％である。
前記液体製剤のpHは4.5〜7.5、好ましくは5.0〜7.0である。
本発明の液体製剤または液体製剤を含むキットは、加齢黄斑変性を予防および/治療する薬物の製造に使用することができる。組み換え融合タンパク質は、安定性を保ち、製品の品質が高く、貯蔵期間が長く、臨床使用の安全性を向上させることができる。
本発明で説明された上述特徴、或いは実施例で説明された特徴は任意に組み合わせることができる。本願説明書で開示されたすべての特徴はいずれの組成物の様態とも併用することができ、説明書で開示された各特徴は、いずれの相同、同等或いは類似の目的の代替性特徴にも任意に替えることができる。そのため、特に説明しない限り、開示された特徴は同等或いは類似の特徴の一般的な例にすぎない。
本発明で説明された上述特徴、或いは実施例で説明された特徴は任意に組み合わせることができる。本願説明書で開示されたすべての特徴はいずれの組成物の様態とも併用することができ、説明書で開示された各特徴は、いずれの相同、同等或いは類似の目的の代替性特徴にも任意に替えることができる。そのため、特に説明しない限り、開示された特徴は同等或いは類似の特徴の一般的な例にすぎない。
本発明の利点は、以下の通りである。
（1）本発明は長い貯蔵期間を有する新型製剤を提供し、組み換え融合タンパク質、たとえば組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質を安定化させ、製剤は高温加速、長期間冷蔵や冷凍と解凍の繰り返しなどの条件のいずれでも安定性を保つ。
（2）本発明の液体製剤は、組み換え融合タンパク質製剤の物理・化学的安定性を向上させ、当該組み換えタンパク質を安定して処方に存在させ、製品の品質を向上させ、製品の貯蔵期間を伸ばし、臨床使用の安全性を上げることができる。
（1）本発明は長い貯蔵期間を有する新型製剤を提供し、組み換え融合タンパク質、たとえば組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質を安定化させ、製剤は高温加速、長期間冷蔵や冷凍と解凍の繰り返しなどの条件のいずれでも安定性を保つ。
（2）本発明の液体製剤は、組み換え融合タンパク質製剤の物理・化学的安定性を向上させ、当該組み換えタンパク質を安定して処方に存在させ、製品の品質を向上させ、製品の貯蔵期間を伸ばし、臨床使用の安全性を上げることができる。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989）に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。
別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明の方法に用いることができる。ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。
共通の方法
SEC-HPLC法：「中華人民共和国薬典」（2010年版、3部）付録IIIBに従って測定し、親水シリカゲルサイズ排除クロマトグラフィーカラムによって検出し、面積正規化法でサンプルの純度を計算する。
電荷異性(cIEF)：コーティング毛細管Neutral Capillary(50μm i.d×45cm)を使用し、Beckmanキャピラリー電気泳動装置(型番：PA800plus)によって毛細管の両末端に電圧を加えてサンプルを電離させ、電離完成後32Karatソフトでスペクトルを分析して積分し、面積正規化法で計算する。
DSC：MIcroCal VP-DSCを使用し、開始温度は10℃で、終了温度は110℃で、走査速度は60℃/hである。異なるサンプルからそれぞれ相応の緩衝液を除いたら最終の各サンプルのTm値を得る。
SEC-HPLC法：「中華人民共和国薬典」（2010年版、3部）付録IIIBに従って測定し、親水シリカゲルサイズ排除クロマトグラフィーカラムによって検出し、面積正規化法でサンプルの純度を計算する。
電荷異性(cIEF)：コーティング毛細管Neutral Capillary(50μm i.d×45cm)を使用し、Beckmanキャピラリー電気泳動装置(型番：PA800plus)によって毛細管の両末端に電圧を加えてサンプルを電離させ、電離完成後32Karatソフトでスペクトルを分析して積分し、面積正規化法で計算する。
DSC：MIcroCal VP-DSCを使用し、開始温度は10℃で、終了温度は110℃で、走査速度は60℃/hである。異なるサンプルからそれぞれ相応の緩衝液を除いたら最終の各サンプルのTm値を得る。
実施例1
アミノ酸、多価アルコール、塩化ナトリウムなどの融合タンパク質の安定性に対する影響
表1に示すように無菌注射用水で各溶液を調製し、調製された各溶液をそれぞれ融合タンパク質（アミノ酸配列は配列番号3で示される）に対して限外ろ過置換を行った。
融合タンパク質の濃度が10mg/mlの限外ろか置換液を相応の溶液で1.5mg/mlに希釈した。その後、1.5mlの希釈液を取り、それに最終濃度が0.03重量％になるように適量のポリソルベート20を入れた。0.2μmのろ膜でろ過した後、サンプルとして検出した。
一方、それぞれ5mlの表1に記載の溶液を取り、最終濃度が0.03％になるように適量のポリソルベート20を入れた後、0.2μmろ膜でろ過した後緩衝液のブランクコントロールとした。DSC法を使用し、異なるタンパク質安定化剤における融解温度Tm値を検出したが、実験結果を表2に示す。
アミノ酸、多価アルコール、塩化ナトリウムなどの融合タンパク質の安定性に対する影響
表1に示すように無菌注射用水で各溶液を調製し、調製された各溶液をそれぞれ融合タンパク質（アミノ酸配列は配列番号3で示される）に対して限外ろ過置換を行った。
融合タンパク質の濃度が10mg/mlの限外ろか置換液を相応の溶液で1.5mg/mlに希釈した。その後、1.5mlの希釈液を取り、それに最終濃度が0.03重量％になるように適量のポリソルベート20を入れた。0.2μmのろ膜でろ過した後、サンプルとして検出した。
一方、それぞれ5mlの表1に記載の溶液を取り、最終濃度が0.03％になるように適量のポリソルベート20を入れた後、0.2μmろ膜でろ過した後緩衝液のブランクコントロールとした。DSC法を使用し、異なるタンパク質安定化剤における融解温度Tm値を検出したが、実験結果を表2に示す。
14群の異なるサンプルからそれぞれ相応の溶液ブランクを除いたら最終の各サンプルのTm値を得る。研究結果から、14群のサンプルはいずれも高い熱安定性を有することが示された。中でも、サンプル群1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、2-3、2-4、2-6、2-7は熱安定性が最も良く、サンプル群2-1、2-2、2-5はそれらに次ぐ。結果から、表1における各成分と組み換え融合タンパク質からなる組み換え融合タンパク質製剤は良い熱安定性を有することがわかる。
実施例2
pH値の安定性
表3に示すように無菌注射用水で各pH値の溶液を調製し、調製された各溶液をそれぞれ融合タンパク質（アミノ酸配列は配列番号3で示される）に対して限外ろ過置換を行った。
融合タンパク質の濃度が10mg/mlの限外ろか置換液を相応の溶液で1.5mg/mlに希釈した。その後、1.5mlの希釈液を取り、それに最終濃度が0.03重量％になるように適量のポリソルベート20を入れた。0.2μmのろ膜でろ過した後、サンプルとして検出した。
一方、それぞれ5mlの各pH値の溶液を取り、最終濃度が0.03重量％になるように適量のポリソルベート20を入れた後、0.2μmろ膜でろ過した後緩衝液のブランクコントロールとした。DSC法を使用し、異なるpH値における融解温度Tm値を検出したが、実験結果を表4に示す。
pH値の安定性
表3に示すように無菌注射用水で各pH値の溶液を調製し、調製された各溶液をそれぞれ融合タンパク質（アミノ酸配列は配列番号3で示される）に対して限外ろ過置換を行った。
融合タンパク質の濃度が10mg/mlの限外ろか置換液を相応の溶液で1.5mg/mlに希釈した。その後、1.5mlの希釈液を取り、それに最終濃度が0.03重量％になるように適量のポリソルベート20を入れた。0.2μmのろ膜でろ過した後、サンプルとして検出した。
一方、それぞれ5mlの各pH値の溶液を取り、最終濃度が0.03重量％になるように適量のポリソルベート20を入れた後、0.2μmろ膜でろ過した後緩衝液のブランクコントロールとした。DSC法を使用し、異なるpH値における融解温度Tm値を検出したが、実験結果を表4に示す。
実施例3
組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質製剤
以下の配合で製剤を調製したが、融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号3で示される。
配合A
組み換え融合タンパク質 10 mg/ml
クエン酸ナトリウム 10 mmol/L
アルギニン 80 mmol/L
ショ糖 5重量％
ポリソルベート20 0.03重量％
pH 6.2
溶媒 無菌注射用水
半製品を無菌でバイアル瓶に取り分け、ゴム栓とアルミ蓋をし、完成品を得た。
組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質製剤
以下の配合で製剤を調製したが、融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号3で示される。
配合A
組み換え融合タンパク質 10 mg/ml
クエン酸ナトリウム 10 mmol/L
アルギニン 80 mmol/L
ショ糖 5重量％
ポリソルベート20 0.03重量％
pH 6.2
溶媒 無菌注射用水
半製品を無菌でバイアル瓶に取り分け、ゴム栓とアルミ蓋をし、完成品を得た。
配合B
組み換え融合タンパク質 40 mg/ml
クエン酸ナトリウム 10 mmol/L
アルギニン 80 mmol/L
ショ糖 5重量％
ポリソルベート20 0.03重量％
pH 6.2
溶媒 無菌注射用水
半製品を無菌でバイアル瓶に取り分け、ゴム栓とアルミ蓋をし、完成品を得た。
組み換え融合タンパク質 40 mg/ml
クエン酸ナトリウム 10 mmol/L
アルギニン 80 mmol/L
ショ糖 5重量％
ポリソルベート20 0.03重量％
pH 6.2
溶媒 無菌注射用水
半製品を無菌でバイアル瓶に取り分け、ゴム栓とアルミ蓋をし、完成品を得た。
実施例4
加速安定性実験
実施例3のサンプルをそれぞれ25℃の恒温槽で保存して加速安定性実験を行い、1か月後サンプルを取り出してサンプルの0日における検出結果と比較することによって、製剤の高温条件における加速安定性を判定したが、実験結果を表5および表6に示す。
加速安定性実験
実施例3のサンプルをそれぞれ25℃の恒温槽で保存して加速安定性実験を行い、1か月後サンプルを取り出してサンプルの0日における検出結果と比較することによって、製剤の高温条件における加速安定性を判定したが、実験結果を表5および表6に示す。
キャピラリー等電点電気泳動焦(cIEF)およびタンパク質の純度(SEC-HPLC)によって融合タンパク質の化学的安定性を特徴付けた。等電点PI＞8.0における百分率含有量の変化およびタンパク質の純度(SEC-HPLC)の主要ピーク含有量を判定の手段とし、結果から、製剤A、Bの電荷異性含有量は1か月の加速後顕著な変化がなかったことがわかる（表5を参照する）。同時に、製剤A、Bの主要ピーク含有量も顕著な変化がなかったが（表6を参照する）、ほかの指標、たとえば外観、タンパク質濃度、濁度などのいずれも当該加速条件で顕著な変化がなかった。結果から、25℃の加速条件において2種類の製剤の配合は当該組み換え融合タンパク質の安定性を少なくとも1か月保つことができることがわかる。
実施例5
長期間安定性実験
当該実施例で使用されたサンプルは実施例4と同様で、すなわち、実施例3で調製された製剤である。サンプルをそれぞれ2〜8℃の恒温槽で保存して長期間安定性実験を行い、3か月、6か月の時点でサンプルを取り出してサンプルの0日における検出結果と比較することによって、製剤の低温条件における長期間安定性を判定した。
実験結果は表7および8に示す。
長期間安定性実験
当該実施例で使用されたサンプルは実施例4と同様で、すなわち、実施例3で調製された製剤である。サンプルをそれぞれ2〜8℃の恒温槽で保存して長期間安定性実験を行い、3か月、6か月の時点でサンプルを取り出してサンプルの0日における検出結果と比較することによって、製剤の低温条件における長期間安定性を判定した。
実験結果は表7および8に示す。
実施例6
凍結・解凍安定性
当該実施例で使用されたサンプルは実施例3の製剤配合とほぼ同様で、異なる点は融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号1で示される。サンプルは、-80℃の条件で冷凍して室温条件で解凍するという操作を3回および6回繰り返した後、サンプルを検出したが、実験結果を表9および10に示す。
凍結・解凍安定性
当該実施例で使用されたサンプルは実施例3の製剤配合とほぼ同様で、異なる点は融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号1で示される。サンプルは、-80℃の条件で冷凍して室温条件で解凍するという操作を3回および6回繰り返した後、サンプルを検出したが、実験結果を表9および10に示す。
以上の研究結果から、本発明の緩衝液および安定化剤と組み換え融合タンパク質で調製された液体製剤は、良い安定性を有し、融合タンパク質が高濃度でも安定して保存でき、製剤は高温加速、長期間冷蔵や冷凍と解凍の繰り返しなどの条件のいずれでも安定性を保ち、臨床使用の安全性を向上させることができる。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
Claims (14)
- 組み換え融合タンパク質の液体製剤であって、組み換え融合タンパク質、緩衝塩、安定化剤、界面活性剤および無菌注射用水を含み、
前記組み換え融合タンパク質の濃度は5〜45 mg/mLで、
前記緩衝塩はクエン酸塩、酢酸塩のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩の濃度は5〜25mmol/Lで、
前記安定化剤は塩化ナトリウム、アミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、前記アミノ酸はアルギニン、グリシン、ヒスチジンのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、前記多価アルコールはショ糖、ソルビトール、マンニトールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩化ナトリウムの濃度は100〜200mmol/Lで、前記アミノ酸の濃度は50〜350mmol/Lで、前記多価アルコールの濃度は前記液体製剤の合計重量に対して1重量％〜15重量％で、
前記界面活性剤はポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記界面活性剤の濃度は前記液体製剤の合計重量に対して0.01重量％〜0.08重量％で、
かつ前記液体製剤のpHは4.5〜7.5である、
ことを特徴とする液体製剤。 - 前記組み換え融合タンパク質は組み換えヒト血管内皮増殖因子受容体-抗体-ヒト補体受容体1の融合タンパク質で、アミノ酸配列は配列番号1または配列番号3で示されることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 前記安定化剤はアミノ酸、多価アルコールのうちの1種類または2種類以上の組み合わせであることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 前記塩化ナトリウムの濃度は120〜180mmol/Lであることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 前記アミノ酸の濃度は70〜260mmol/Lであることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 前記多価アルコールの濃度は220〜270mmol/Lであることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 前記液体製剤のpH値は5.0〜7.2であることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 前記液体製剤のpH値は5.5〜7で、
組み換え融合タンパク質 5〜45mg/ml、
クエン酸塩 5〜15 mmol/L、
アルギニン 50〜100 mmol/L、
ショ糖 2〜8重量％、
ポリソルベート20 0.02〜0.06重量％、
および無菌注射用水を含むことを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。 - 前記緩衝塩はクエン酸で、
前記アミノ酸はアルギニンで、
前記多価アルコールはショ糖で、
前記界面活性剤はポリソルベート20であることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。 - 前記液体製剤のpH値は5.5〜7.0であることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 前記緩衝塩はクエン酸塩、酢酸塩のうちの1種類または2種類以上の組み合わせで、かつ前記塩の濃度は8〜22mmol/Lであることを特徴とする請求項1に記載の液体製剤。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の液体製剤と、前記液体製剤が入る容器とを含むことを特徴とするキット。
- 加齢黄斑変性を予防および/または治療するための薬物の製造における、請求項1〜11のいずれかに記載の液体製剤または請求項12に記載のキットの使用。
- 前記加齢黄斑変性はウェット型加齢黄斑変性であることを特徴とする請求項13に記載の使用。
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