JP2008094853A - インターロイキン２１受容体活性を調節する方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】 IL-21またはIL-21Rのアゴニストまたはアンタゴニストを用いてインターロイキン-21（IL-21）およびIL-21受容体の活性、および/またはそれらの間の相互作用を調節する方法および組成物を提供する。
【解決手段】 インターロイキン21受容体活性を調節するのに有用なＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストを含む組成物、融合蛋白質、融合蛋白質の製造方法、宿主細胞ならびにベクター。
【選択図】なし

Description

本発明はIL-21受容体アゴニストおよびアンタゴニストを用いてインターロイキン-21（IL-21）/IL-21受容体（MU-1）活性を調節する方法および組成物に関する。本明細書に開示された方法および組成物は免疫治療薬として有用である。
ヒトIL-21はIL-2、IL-4およびIL-15と配列相同性を示す約131個のアミノ酸長のサイトカインである（Parrish-Novak et al.（2000）Nature 408 : 57-63）（非特許文献１）。インターロイキンサイトカイン間の低い配列相同性にもかかわらず、サイトカインは「4つのへリックス束」構造への共通の折り畳みを共有しており、これがこのファミリーを表す。ほとんどのサイトカインはクラスIまたはクラスIIサイトカイン受容体のいずれかと結合する。クラスIIサイトカイン受容体としては、IL-10およびインターフェロンの受容体が挙げられ、クラスIサイトカイン受容体としては、IL-2〜IL-7、IL-9、IL-11〜13およびIL-15ならびに造血成長因子、レプチンおよび成長ホルモンの受容体が挙げられる（Cosman, D.（1993）Cytokine 5: 95-106）（非特許文献２）。
ヒトIL-21Rは、リンパ組織で、特にNK、BおよびT細胞で発現されるクラスIサイトカイン受容体である（上記のParrish-Novak et al.（2000））。ヒトインターロイキン-21（IL-21）およびその受容体（IL-21R）をコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列はWO00/53761（特許文献１）、WO01/85792（特許文献２）、上記のParrish-Novak et al.（2000）、Ozaki et al.（2000）Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97: 11439-114444（非特許文献３）に記載されている。IL-21Rは、IL-2受容体β鎖およびIL-4受容体α鎖と最高の配列相同性を有している（上記のOzaki et al.（2000））。リガンド結合の際には、IL-21Rは、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13およびIL-15の受容体によって共有されている共通のγサイトカイン受容体鎖（γc）と会合する（上記のOzaki et al.（2000）; Asao et al.（2001）J.Immunol. 167: 1-5）。IL-21Rの広範なリンパ系分布は、IL-21が免疫調節において役割を果たす可能性があるということを示唆する。実際、in vitro研究では、IL-21はB細胞、CD4+およびCD8+T細胞ならびにNK細胞の機能を大きく調節するということが示されている（上記のParrish-Novak et al.（2000）; Kasaian, M. T. et al.（2002）Immunity. 16: 559-569）。それにもかかわらず、IL-21のin vivoでの調節作用を裏付ける証拠はわずかである。
国際公開 WO 00/53761 国際公開 WO 01/85792 Parrish-Novak et al.（2000）Nature 408 : 57-63 Cosman, D.（1993）Cytokine 5: 95-106 Ozaki et al.（2000）Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97: 11439-114444
したがって、本発明の解決すべき課題は、IL-21またはIL-21Rのアゴニストまたはアンタゴニスト（本明細書では、それぞれ「IL-21/IL-21Rアゴニスト」または「アゴニスト」、および「IL-21/IL-21Rアンタゴニスト」または「アンタゴニスト」とも呼ばれる）を用いてインターロイキン-21（IL-21）およびIL-21受容体（本明細書では、「IL-21R」または「MU-1」とも呼ばれる）の活性、および/またはそれらの間の相互作用を調節する方法および組成物を開示することである。
一実施形態では、本出願人らは、IL-21アンタゴニスト、例えば、Fc免疫グロブリン領域と融合しているIL-21Rの細胞外ドメインを含む融合タンパク質を用いることによってIL-21R活性を低下させることによって、コラーゲン誘導関節炎（CIA）動物モデルにおいて炎症性症状が寛解されることを示した（実施例7）。CIAマウスの足ではIL-21R mRNAの発現がアップレギュレートされている（実施例8）。したがって、例えば、免疫細胞関連病態（例えば、成熟Ｔ細胞（成熟ＣＤ８＋、成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞）、成熟ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび巨核球のうちの１種以上の異常な活性を伴う病態）、例えば、移植片拒絶反応および自己免疫疾患、例えば、関節炎（関節リウマチをはじめとする）を治療または予防するために、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫抑制を誘導するために、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ活性のアンタゴニストを用いることができる。
したがって、一態様では、本発明は被験者において免疫細胞関連疾病、例えば、関節リウマチを治療（例えば、治癒、抑制、寛解、遅延または予防する、または反復もしくは再発を予防する）または予防する方法を特徴とし、この方法は、被験者に免疫細胞活性および/または細胞数を阻害または低下させるのに十分な量のIL-21/IL-21Rアンタゴニストを投与し、それによって免疫細胞関連疾病、例えば、関節リウマチを治療または予防すること含む。
IL-21/IL-21Rアンタゴニストは、被験者に単独で投与してもよいし、本明細書に記載されたような他の治療モダリティーと組み合わせて投与してもよい。被験者は、免疫細胞関連病態（例えば、成熟Ｔ細胞（成熟ＣＤ８＋、成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞）、成熟ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび巨核球のうちの１種以上の異常な活性を伴う病態、移植片拒絶反応および自己免疫疾患）を患う哺乳類、例えば、ヒトであることが好ましい。例えば、本方法は被験者において免疫細胞関連疾患、例えば、移植片拒絶反応または自己免疫疾患（例えば、糖尿病（I型）、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎および硬直性脊椎炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、血管炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹皮膚炎を含む）、乾癬、強皮病、喘息、アレルギー、IBDまたはクローン病などをはじめとする）のうちの1種以上から選択される疾患を治療または予防するために用いることができる。本発明のIL-21-またはIL-21Rアンタゴニストを用いる関節炎疾患、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎または硬直性脊椎炎のうちの1種以上から選択される疾患（好ましくは、関節リウマチ）の治療が好ましい。
一実施形態では、IL-21/IL-21Rアンタゴニストは、IL-21またはIL-21R、好ましくは、哺乳類、例えばヒトIL-21またはIL-21R（本明細書では、それぞれ「IL-21アンタゴニスト」および「IL-21Rアンタゴニスト」と呼ばれる）である哺乳類と例えば結合のような相互作用をし、1以上のIL-21および/またはIL-21R活性を低下させるか阻害する。好ましいアンタゴニストは、IL-21またはIL-21Rと親和性が高く、例えば、少なくとも約107M-1、好ましくは約108M-1、より好ましくは約109M-1〜1010M-1以上という親和性定数で、またはより強力に結合する。
例えば、IL-21/IL-21Rアンタゴニストは、IL-21を中和することによってIL-21R活性を低下させ、かつ/または阻害することができる。一実施形態では、アンタゴニストは、非IL21R断片、例えば、免疫グロブリンFc領域と融合しているIL-21Rの断片を含む融合タンパク質であり得る。他の実施形態では、このアンタゴニストは抗IL21Rまたは抗IL21抗体またはそれらの抗原結合断片、IL-21受容体の可溶性型、ペプチドまたは小分子阻害剤である。
一実施形態では、IL-21/IL-21Rアンタゴニストは抗IL21Rまたは抗IL21抗体、またはこれらの抗原結合断片である。例えば、抗体は、IL-21、例えばヒトIL-21、またはIL-21受容体、例えば、ヒトIL-21受容体ポリペプチドプチドと結合するモノクローナル抗体または単一特異性抗体またはそれらの抗原結合断片（例えば、Fab、F（ab'）2、Fvまたは一本鎖Fv断片）である。抗体はヒト、ヒト化、キメラまたはヒトIL-21またはヒトIL-21受容体ポリペプチドプチドに対してin vitroで作製した抗体であることが好ましい。抗体は中和抗体であることが好ましい。
他の実施形態では、IL-21/IL-21Rアンタゴニストは、IL-21ポリペプチドの全長または断片、例えば、IL-21ポリペプチド、例えば、ヒトIL-21ポリペプチド（例えば、配列番号19として示されるアミノ酸配列を有する、本明細書に記載されたようなヒトIL-21ポリペプチド）の、IL-21受容体結合ドメインまたはそれと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列、あるいは配列番号18として示される相当するヌクレオチド配列によってコードされるものの、またはそれと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列を含む。あるいは、アンタゴニストは、全長（例えば、配列番号2のアミノ酸1付近〜538付近もしくは20付近〜538付近のもの、または配列番号10のアミノ酸1〜529もしくは20〜529付近のもの）またはIL-21受容体ポリペプチドの断片、例えば、IL-21受容体ポリペプチドのIL-21結合ドメイン、例えば、IL-21Rの可溶性断片（例えば、ネズミまたはヒトIL-21Rの細胞外ドメインを含んでなるIL-21Rの断片、例えば、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近、1付近〜236付近、20付近〜235付近、20付近〜236付近のもの（ヒト）、または配列番号10のアミノ酸1付近〜236付近、20付近〜236付近のもの（ネズミ）、または配列番号1または9の相当するヌクレオチドによってコードされるものまたはそれと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列）を含む。
一実施形態では、アンタゴニストは、前記のIL-21またはIL-21受容体ポリペプチドまたはその断片を含み、かつ、例えば、第2の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、GST、Lex-AまたはMBPポリペプチド配列）と融合している融合タンパク質である。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも、IL-21と結合できるIL-21Rポリペプチドの断片、例えば、IL-21Rの可溶性断片（例えば、ネズミまたはヒトIL-21Rの細胞外ドメインを含んでなるIL-21Rの断片、例えば、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近、1付近〜236付近、20付近〜235付近、20付近〜236付近のもの（ヒト）、または配列番号10のアミノ酸1付近〜236付近、20付近〜236付近のもの（ネズミ）、または配列番号1または9の相当するヌクレオチドによってコードされるものまたはそれと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列）を含み、かつ、例えば、第2の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、Fc断片、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEをはじめとする種々のアイソタイプの重鎖定常領域）と融合している。例えば、融合タンパク質は、ヒトIL-21Rの細胞外ドメイン、例えば、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近、1付近〜236付近、20付近〜235付近、20付近〜236付近のものを含み、かつ、例えば、ヒト免疫グロブリンFc鎖（例えば、ヒトIgG、例えば、ヒトIgG1またはヒトIgG1の変異型）と融合していてもよい。一実施形態では、ヒトFc配列は1以上のアミノ酸で変異していた、例えば、配列番号28の残基254および257で野生型配列から変異してFc受容体結合が低下していた。他の実施形態では、融合タンパク質はネズミIL-21Rの細胞外ドメイン、例えば、配列番号10のアミノ酸1付近〜236付近、20付近〜236付近のもの（ネズミ）を含み、かつ、例えば、ネズミ免疫グロブリンFc鎖（例えば、ネズミIgG、例えば、ネズミIgG2aまたはネズミIgG2aの変異型）と融合していてもよい。
融合タンパク質は、第1の部分、例えば、IL-21R断片を、第2の部分、例えば、免疫グロブリン断片と連結するリンカー配列をさらに含むことができる。他の実施形態では、発現、立体的可動性、検出および/または単離または精製を容易にするために、融合タンパク質のNまたはC末端にさらなるアミノ酸配列を加えることができる。
本発明の方法に使用できるアンタゴニスト性融合タンパク質の例は図7〜15に示されている。一実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37または配列番号39、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号25または配列番号29として示されるアミノ酸配列（それぞれ、図8A〜8Cおよび10A〜10C）、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列を有する。他の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号24または配列番号28から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（それぞれ、図8A〜8Cおよび10A〜10C）、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列を含む。融合タンパク質が、配列番号29として示されるアミノ酸配列を有すること、または配列番号28として示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有することが最も好ましい（図10A〜10C）。
本明細書に記載されたIL-21/IL-21Rアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載された融合タンパク質は、誘導体化してもよいし、または別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、Fab'断片）と結合させてもよい。例えば、融合タンパク質または抗体、または抗原結合部分を、1種以上の他の分子実体、中でも例えば、抗体（例えば、二重特異性または多重特異性抗体）、毒素、放射性同位元素、細胞傷害性もしくは細胞分裂停止性薬剤と機能的に結合させてもよい（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合による会合または別の方法により）。
一実施形態では、本明細書に記載されたIL-21/IL-21Rアンタゴニスト、例えば、これらの医薬組成物を、併用療法において、すなわち、他の薬剤、例えば、免疫細胞関連病理学的疾患、例えば、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎または硬直性脊椎炎を含む）、または強皮病、全身性エリトマトーデスまたは血管炎のうちの1種以上から選択される疾患、好ましくは関節リウマチを治療するのに有用な治療薬と組み合わせて投与する。例えば、併用療法には、1種以上のさらなる治療薬、例えば、本明細書に詳細に記載されたような1種以上のサイトカインおよび成長因子阻害剤、免疫抑制薬、抗炎症薬、代謝阻害剤、酵素阻害剤、および/または細胞傷害性もしくは細胞分裂停止性薬剤と同時に製剤され、かつ/または同時に投与される、1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニスト、例えば、抗IL-21または抗IL-21R抗体またはその抗原結合断片、IL-21R融合タンパク質、可溶性IL-21R受容体、ペプチド阻害剤または小分子阻害剤を含み得る。
1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニストと同時投与かつ/または同時製剤できる好ましいさらなる治療薬の例としては、それだけには限定されないが、TNFアンタゴニスト（例えば、TNFと結合する、キメラ、ヒト化、ヒトまたはin vitroで作製された抗体、またはその抗原結合断片；TNF受容体の可溶性断片、例えば、p55またはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgG（75kDのTNF受容体IgG融合タンパク質、Enbrel（商標））、p55kDのTNF受容体IgG融合タンパク質；TNF酵素アンタゴニスト、例えば、TNFα変換酵素（TACE）阻害剤）；IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22のアンタゴニスト；T細胞およびB細胞枯渇剤（例えば、抗CD4または抗CD22抗体）；小分子阻害剤、例えば、メトトレキセートおよびレフルノミド；シロリムス（ラパマイシン）およびその類似体、例えば、CCI-779、Cox-2およびcPLA2阻害剤、NSAID；p38阻害剤、TPL-2、Mk-2およびNFkb阻害剤；RAGEまたは可溶性RAGE；P-セレクチンまたはPSGL-1阻害剤（例えば、小分子阻害剤、その抗体、例えば、P-セレクチンに対する抗体）；エストロゲン受容体β（ERB）アゴニストまたはERB-NFkbアンタゴニストのうちの1種以上が挙げられる。1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニストと同時投与かつ/または同時製剤できる、最も好ましいさらなる治療薬としては、TNF受容体の可溶性断片、例えば、p55またはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgG（75kDのTNF受容体IgG融合タンパク質、Enbrel（商標））、メトトレキセート、レフルノミド、またはシロリムス（ラパマイシン）またはその類似体、例えば、CCI-779のうちの1種以上が挙げられる。
本出願人らはさらに、IL-21/IL-21Rアゴニスト、例えば、IL-21ポリペプチドは、in vivoで免疫原性および非免疫原性腫瘍細胞に対する免疫を刺激するということを示した（実施例9）。この免疫の増加は、一部は成熟CD+8T細胞エフェクター機能のIL-21媒介性増強によるものである。ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答をアップレギュレートするために、例えば、被験者において癌または感染性疾患の治療に用いるために、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストは単独で用いてもよいし、抗原、例えば、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）と組み合わせて用いてもよい。
したがって、本発明は試験者において癌または感染性疾患を治療（例えば、治癒、抑制、寛解、遅延または予防する、または反復もしくは再発を予防する）または予防する方法を提供し、本方法は、被験者にIL-21/IL-21Rアゴニスト、例えば、免疫細胞（例えば、CD+8細胞）活性（例えば、エフェクター細胞活性）および/または細胞数を高めるのに十分な量の、IL-21/IL-21R活性を高めるかまたは増強する薬剤を投与することと、それによって前記疾患を治療または予防することを含む。癌疾患の例としては、それだけには限定されないが、充実性腫瘍、軟部組織腫瘍（例えば、リンパ腫または白血病）、および転移性病変が挙げられる。治療または予防できる感染性疾患の例としては、細菌性、ウイルス性および寄生性感染が挙げられる。
一実施形態では、被験者に、ワクチン組成物と同時または逐次のいずれかで、有効アジュバント作用量のIL-21/IL-21Rアゴニスト（例えば、IL-21ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、またはそれをコードする核酸）を投与することによる、抗原、例えば、病原、例えば、細菌性、ウイルス性および寄生性病原または腫瘍細胞由来の抗原を含有するワクチン組成物の、被験者においてその抗原に対する保護的免疫応答を惹起する能力を高める方法。一実施形態では、ワクチンが対象とする病原は、細胞内病原、例えば、ウイルス、細菌または原虫である。病原はまた、細胞外寄生体、例えば、蠕虫または細菌であることもある。抗原は全細胞、タンパク質、タンパク質サブユニットまたは断片であることもある。
好ましいIL-21/IL-21Rアゴニストは、IL-21またはIL-21Rと親和性が高く、例えば、少なくとも約107M-1、好ましくは約108M-1、より好ましくは約109M-1〜1010M-1以上という親和定数で結合する。
一実施形態では、IL-21/IL-21Rアゴニストは、IL-21ポリペプチド、例えば、ヒトIL-21ポリペプチド、またはその活性断片（例えば、配列番号19として示されるアミノ酸配列を含んでなるか、または配列番号18として示されるヌクレオチド配列によってコードされるヒトIL-21ポリペプチド、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列）である。他の実施形態では、IL-21/IL-21Rアゴニストは、IL-21ポリペプチド、例えば、ヒトIL-21ポリペプチド、またはその断片を含んでなり、かつ、第2の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、Fc断片、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEをはじめとする種々のアイソタイプの重鎖定常領域）、アゴニスト抗体またはその抗原結合断片、IL-21受容体、または小分子またはペプチドアゴニストと融合している融合タンパク質である。他の実施形態では、IL-21/IL-21Rアゴニストは、例えば、機能的IL-21の発現、をプロセッシング、および/または分泌を増加することによってIL-21の活性またはレベルを高める薬剤である。前記のIL-21/IL-21Rアゴニストおよび/または抗原をコードする核酸もまた、被験者に投与することができる。
本明細書に記載されたＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストは、単独で用いてもよいし、他の治療モダリティーと併用してもよい。必要に応じて、IL-21/IL-21Rアゴニストを、1種以上の、免疫応答を高めるさらなる薬剤、例えば、被験者において癌または感染性疾病に対する免疫応答を増強する薬剤（例えば、単独または抗原提示細胞、例えば、樹状細胞と組み合わせた抗原、抗原性ペプチド）と同時に投与することもできる。例えば、IL-21/IL-21Rアゴニストは、単独で投与してもよいし、例えば、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）として、抗原と組み合わせて投与してもよいし、かつ/または他のサイトカイン（例えば、IL-2、GM-CSFおよび/またはIL-15）と組み合わせて投与してもよい。どんな順序で併用療法を実施してもよく、例えば、IL-15および抗原を、被験者に同時投与し、その後、IL-21および抗原を投与することによって免疫応答をブーストしてもよい。
被験者は、癌または感染性疾患を患う、例えばヒトのような哺乳類であることが好ましい。IL-21/IL-21Rアゴニストは、癌または感染性疾病に対する免疫応答を高めるよう設計するのが好ましい。感染性疾病は、例えば、細菌性、寄生性またはウイルス性病原体によって引き起こされ得る。
もう1つの態様では、本発明は免疫細胞活性および/または数（例えば、成熟T細胞（成熟CD8+、CD4+T細胞）、成熟NK細胞、B細胞、マクロファージまたは巨核球であって、好ましくは、成熟CD8+T細胞またはマクロファージであるうちの1種以上の活性および/または数）または免疫細胞集団、例えば、混合しているかまたは実質的に精製されている免疫細胞集団を調節する、例えば、増加させるか減少させる方法を特徴とする。本方法は免疫細胞、例えば、本明細書に記載されたような免疫細胞を、免疫細胞活性および/または数を調節する、例えば、増加させるかまたは減少させるのに十分な量の、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載されたようなアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることを含む。
本方法は、例えば、in vitroまたはex vivoでの培養細胞に使用できる。例えば、免疫細胞、例えば、本明細書に記載されたようなT細胞を培養培地でin vitro培養することができ、1種以上のIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載されたようなアゴニストまたはアンタゴニストを、培養培地に添加することによって接触ステップを達成することができる。あるいは、本方法は被験者中に存在する細胞（例えば、本明細書に記載されたような免疫細胞）で、例えば、in vivo（治療的または予防的）プロトコールの一環として実施してもよい。
免疫細胞は、例えば、成熟T細胞（成熟、CD8+、CD4+、リンパ節T細胞、記憶T細胞）、成熟NK細胞、B細胞、抗原提示細胞（APC）、例えば、樹状細胞、マクロファージまたは巨核球のうちの1種以上、または細胞集団、例えば、混合しているかまたは実質的に精製されている免疫細胞集団から選択することができる。免疫細胞は成熟CD8+T細胞またはマクロファージであるのが好ましい。
免疫細胞活性の変化としては、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストと接触した免疫細胞の、参照、例えば、未処理免疫細胞と比較した何らかの変動、中でも例えば、増殖、サイトカイン分泌および/または産生、生存、分化、細胞応答性（例えば、脱感作）、細胞溶解活性、エフェクター細胞活性、遺伝子発現のうちの1以上の増加/減少が挙げられる。例えば、免疫細胞をIL-21/IL-21Rアゴニスト、例えば、IL-21ポリペプチドと接触させることによって、抗原または抗CD3抗体刺激された胸腺細胞、リンパ節T細胞、成熟CD4+T細胞、成熟CD8+T細胞、またはマクロファージのうちの1種以上の増殖、細胞溶解活性、エフェクター細胞機能またはサイトカイン分泌のうちの1つ以上を誘導することができる。
免疫細胞、例えば、T細胞の刺激性シグナルに対する応答性も、本明細書に記載されたようなアゴニストまたはアンタゴニストを用いて調節することができる。例えば、同種抗原に対するT細胞の増殖は、IL-21ポリペプチドの存在下で増加し得る。IL-21はまた、成熟CD8+T細胞の増殖および/または分化を増強することもできる。例えば、IL-21の存在下でCD8+T細胞を初回抗原刺激することによって、溶解（CTL）活性が増強され、かつ/またはサイトカイン、例えば、IFNγを分泌する能力が高められたエフェクター細胞を作製することができる。その他の実施形態では、IL-21/IL-21Rアゴニストを用いてマクロファージの増殖および/またはサイトカイン分泌を誘導することができる。
一実施形態では、免疫細胞活性（例えば、成熟T細胞（成熟、CD8+、CD4+、リンパ節T細胞、記憶T細胞）、成熟NK細胞、B細胞、抗原提示細胞（APC）、例えば、樹上細胞、マクロファージまたは巨核球のうちの1種以上、または細胞集団、例えば、混合しているかまたは実質的に精製されている免疫細胞集団の活性）を低下させる方法を示す。この方法は免疫細胞を、免疫細胞活性を低下させるのに十分な量のIL-21/IL-21Rアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載されたようなアンタゴニストと接触させることを含む。
他の実施形態では、免疫細胞活性および/数（例えば、成熟T細胞（成熟、CD8+、CD4+、リンパ節T細胞、記憶T細胞）、成熟NK細胞、B細胞、抗原提示細胞（APC）、例えば、樹上細胞、マクロファージまたは巨核球のうちの1種以上、または細胞集団、例えば、混合しているかまたは実質的に精製されている免疫細胞集団の活性および/または数）を増加させる方法を示す。この方法は、免疫細胞を、免疫細胞活性を高めるのに十分な量のIL-21/IL-21Rアゴニスト、例えば、本明細書に記載されたようなアゴニストと接触させることを含む。
もう1つの態様では、本発明は少なくとも、IL-21ポリペプチドと結合できるIL-21Rポリペプチドの断片、例えば、IL-21Rの可溶性断片（例えば、ネズミまたはヒトIL-21Rの細胞外ドメインを含んでなるIL-21Rの断片、例えば、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近、1付近〜236付近、20付近〜235付近、20付近〜236付近のもの（ヒト）、または配列番号10のアミノ酸1付近〜236付近、20付近〜236付近付近のもの（ネズミ）、または配列番号1または9の相当するヌクレオチドによってコードされるもの、またはそれと85%、90%、95%、98%以上同一の配列）を含み、かつ、例えば、第2の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、Fc断片、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEをはじめとする種々のアイソタイプの重鎖定常領域）と融合している融合タンパク質を特徴とする。例えば、融合タンパク質は、ヒトIL-21Rの細胞外ドメイン、例えば、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近、1付近〜236付近、20付近〜235付近、20付近〜236付近付近のものを含み、かつ、例えば、ヒト免疫グロブリンFc鎖（例えば、ヒトIgG、例えば、ヒトIgG1またはヒトIgG1の変異型）と融合することができる。一実施形態では、ヒトFc配列は1個以上のアミノ酸で変異しており、例えば、配列番号28の残基254および257で野生型配列から変異しており、FC受容体結合が低下していた。他の実施形態では、融合タンパク質は、ネズミIL-21Rの細胞外ドメイン、例えば、配列番号10のアミノ酸1付近〜236付近、20付近〜236付近付近のもの（ネズミ）を含み、かつ、例えば、ネズミ免疫グロブリンFc鎖（例えば、ネズミIgG、例えば、ネズミIgG2aまたはネズミIgG2aの変異型）と融合することができる。融合タンパク質はさらに、IL-21R断片を第2の部分と連結するリンカー配列を含むことができる。他の実施形態では、発現、検出および/または単離または精製を容易にするために、さらなるアミノ酸配列を融合タンパク質のNまたはC末端に加えることができる。
本明細書に記載された融合タンパク質は誘導体化してもよいし、または別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、Fab'断片）と結合させてもよい。例えば、融合タンパク質は（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合による会合または別の方法によって）、1種以上のその他の分子実体、中でも例えば、抗体（例えば、二重特異性または多重特異性抗体）、毒素、放射性同位元素、細胞傷害性または細胞分裂停止性薬剤と機能的に結合させてもよい。
本発明の方法に使用できるアンタゴニスト性融合タンパク質の例を図7〜15に示す。一実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37または配列番号39、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号25または配列番号29として示されるアミノ酸配列（それぞれ、図8A〜8Cおよび10A〜10C）、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列を有する。他の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号24または配列番号28から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列によってコードされるアミノ酸配列（それぞれ、図8A〜8Cおよび10A〜10C）を含む。融合タンパク質が、配列番号29として示されるアミノ酸配列を有すること、または配列番号28として示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有することが最も好ましい（図10A〜10C）。
本発明はまた、本明細書に記載された融合タンパク質をコードする核酸配列を特徴とする。
もう1つの態様では、本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞およびベクターを特徴とする。宿主細胞は真核細胞、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞または原核細胞、例えば、大腸菌（E. coli）であることが好ましい。例えば、哺乳類細胞は培養細胞または細胞株であってもよい。例示的哺乳類細胞としては、リンパ性細胞株（例えば、NSO）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、COS細胞、卵母細胞、およびトランスジェニック動物由来の細胞、例えば、哺乳類上皮細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載された融合タンパク質をコードする核酸をトランスジェニック動物において発現させてもよい。一実施形態では、核酸を組織特異的プロモーター（例えば、哺乳類特異的プロモーター）の制御下におき、かつ、トランスジェニック動物で抗体を産生させる。例えば、融合タンパク質はトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたは齧歯類の乳に分泌される。
もう1つの態様では、本発明は融合タンパク質、例えば、本明細書に記載された融合タンパク質の生産方法を提供する。この方法は（a）本発明の宿主細胞の培養物を、好適な培養培地で増殖させること、および（b）培養物から融合タンパク質を精製することを含んでなる。これらの方法に従って生産されるタンパク質も提供する。
もう1つの態様では、本発明は、製薬上許容される担体と、本明細書に記載されたIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストのうちの少なくとも一方（例えば、本明細書に記載された融合タンパク質）とを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。一実施形態では、組成物、例えば、医薬組成物は、前記のIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストのうちの１つによる2種以上の組み合わせを含んでなる。IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストと薬剤、例えば、治療薬（例えば、本明細書に詳細に記載されたような、1種以上のサイトカインおよび成長因子阻害剤、免疫抑制薬、抗炎症薬、代謝阻害剤、酵素阻害剤および/または細胞傷害性もしくは細胞分裂停止性薬剤）、または抗原、例えば、抗原性ペプチドおよび/または抗原提示細胞との組み合わせも本発明の範囲内にある。
一実施形態では、医薬組成物はIL-21/IL-21Rアンタゴニストまたはアゴニストと、少なくとも1種のさらなる治療薬とを、製薬上許容される担体中に含む。組成物、例えば、医薬組成物に、1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニストと同時製剤できる好ましいさらなる治療薬の例としては、それだけに限定されないが、TNFアンタゴニスト（例えば、TNFと結合する、キメラ、ヒト化、ヒトまたはin vitroで作製した抗体、またはその抗原結合断片、TNF受容体の可溶性断片、例えば、p55またはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgG（75kDのTNF受容体IgG融合タンパク質、Enbrel（商標）、p55kDのTNF受容体IgG融合タンパク質、TNF酵素アンタゴニスト、例えば、TNFα変換酵素（TACE）阻害剤）、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22のアンタゴニスト、T細胞およびB細胞枯渇剤（例えば、抗CD4または抗CD22抗体）、小分子阻害剤、例えば、メトトレキセートおよびレフルノミド、シロリムス（ラパマイシン）およびその類似体、例えば、CCI-779、Cox-2およびcPLA2阻害剤、NSAID、p38阻害剤、TPL-2、Mk-2およびNFkb阻害剤、RAGEまたは可溶性RAGE、P-セレクチンまたはPSGL-1阻害剤（例えば、小分子阻害剤、その抗体、例えば、P-セレクチンに対する抗体）、エストロゲン受容体β（ERB）アゴニストまたはERB-NFkbアンタゴニストのうちの1種以上が挙げられる。1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニストと同時投与かつ/または同時製剤できる、最も好ましいさらなる治療薬はとしては、TNF受容体の可溶性断片、例えば、p55またはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75kdTNFR-IgG（75kDのTNF受容体IgG融合タンパク質、Enbrel（商標））、メトトレキセート、レフルノミド、またはシロリムス（ラパマイシン）またはその類似体、例えば、CCI-779のうちの1種以上が挙げられる。
もう1つの実施形態では、病原微生物、例えば、ウイルス性、細菌性または寄生微生物由来の抗原と、有効アジュバント作用量のIL-21/IL-21Rアゴニストとを、製薬上許容される担体中に含んでなる、ワクチンとして有用な医薬組成物を提供する。一実施形態では、得られた組成物は、ワクチン接種した被験者の、病原に対する保護的応答についての免疫を惹起できる。組成物中に用いるIL-21/IL-21Rアゴニストおよび抗原は、ポリペプチドであってもよいし、その生物学的に活性な断片であってもよいし、あるいは組成物中にそれをコードする核酸を含んでもよい。これらの核酸は、適当なプロモーター配列とともに、IL-21/IL-21Rアゴニストアジュバントとともに、または時間的に密接して投与される抗原として直接用いることができる。あるいは、これらの核酸配列を、病原微生物の代替ワクチン株に形質導入してもよく、in vivoで発現するとワクチンの抗原を提供できる。
その他の実施形態では、本発明は、癌の治療または寛解のための組成物、例えば、医薬組成物、および製薬上許容される担体において、癌「ワクチン」を補助する方法を提供する。癌ワクチンには、癌または腫瘍細胞表面で発現される抗原を含めることができる。この抗原は癌細胞に天然に存在するものであってもよい。あるいは、癌細胞をex vivoで操作して、選択した抗原でトランスフェクトしてもよく、患者に導入すると癌細胞がこれを発現する。本明細書に記載された例示的医薬組成物は、癌または腫瘍細胞抗原（タンパク質、その生物学的に活性な断片、またはそれをコードする核酸のいずれか単独として）、または細胞、例えば、癌または腫瘍細胞抗原でトランスフェクトされた癌細胞を、IL-21/IL-21Rアゴニスト（例えば、本明細書に記載されたようなアゴニスト、その断片、またはそれをコードする核酸）と組み合わせて含むことができる。一実施形態では、IL-21/IL-21Rアゴニストの、腫瘍細胞抗原との同時投与によって、腫瘍細胞抗原のCD8+T細胞エフェクター細胞活性が増強される。
例えばワクチン組成物のような前記組成物の製造方法も本発明に包含される。
以下の用語は本明細書では同じ意味で用いる:「MU-1」と「IL-21R」およびペプチド、ポリペプチドとタンパク質。
特に記載のない限り、本明細書で用いたすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用できるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で触れた、すべての出版物、特許出願、特許およびその他の参照文献はその全体が参考文献として組み込まれる。矛盾する場合には、定義をはじめ本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであって、制限しようとするものではない。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
IL-21またはIL-21受容体（「IL-21R」または「MU-1」）のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、インターロイキン-21（IL-21）/IL-21受容体（MU-1）活性を調節するための方法および組成物を開示する。例えば、免疫細胞関連病態（例えば、成熟Ｔ細胞（成熟ＣＤ８＋、成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞）、成熟ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび巨核球のうちの１種以上の異常な活性を伴う病態、例えば、移植片拒絶反応および自己免疫疾患）を治療または予防するために、IL-21/IL-21Rアンタゴニストを用いてｉｎ ｖｉｖｏで免疫抑制を誘導することができる。ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答をアップレギュレートするために、例えば、癌および感染性疾患の治療に用いるために、IL-21/IL-21Rアゴニストを単独で用いてもよいし、例えば、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）として抗原と併用してもよい。
一実施形態では、本出願人らは、Fc免疫グロブリン領域と融合している、IL-21Rの細胞外ドメインを含む中和融合タンパク質を用いることによってIL-21R活性が低下し、マウスコラーゲン誘導関節炎（CIA）動物モデルにおいて炎症症状が寛解されるということを示した（実施例7）。CIAマウスの足ではIL-21R mRNAの発現がアップレギュレートされている（実施例8）。したがって、例えば、免疫細胞関連病態（例えば、移植片拒絶反応および自己免疫疾患を含む、T細胞（CD8+、CD4+T細胞）、NK細胞、B細胞、マクロファージおよび巨核球のうちの１種以上の異常な活性を伴う病態）を治療または予防するために、IL-21/IL-21R活性をアンタゴナイズするIL-21R結合剤を用いてｉｎ ｖｉｖｏで免疫抑制を誘導することができる。
他の実施形態では、本出願人らは、アゴニスト性IL-21R結合剤は、主にCD8+T細胞の刺激に介して、免疫原性および非免疫原性腫瘍細胞に対する自然および適応免疫をinvivoで刺激するということを示した（実施例9）。したがって、例えば、免疫応答をin vivoでアップレギュレートするために、例えば、癌および感染性疾患の治療に用いるために、IL-21/IL-21R経路を刺激する結合剤を単独で用いてもよいし、または、例えば、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）として抗原と併用してもよい。
本発明がより容易に理解されるよう、まず、いくつかの用語を定義する。さらなる定義は詳細な説明の中で示す。
本明細書において、用語「MU-1」、「MU-1タンパク質」、「インターロイキン-21受容体」または「IL-21R」は、NILRとしても知られる、クラスIサイトカインファミリー受容体を指す（WO01/85792;Parrish-Novak et al.（2000）Nature 408: 57-63; Ozaki et al.（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11439-114444）。MU-1はIL-2とIL-15受容体、およびIL-4αの共有β鎖と相同である（上記のOzaki et al.（2000））。リガンドが結合すると、IL-21R/MU-1は、共通γサイトカイン受容体鎖（γc）と相互作用し（Asao et al.（2001）J Immunol. 167: 1-5）、STAT1およびSTAT3（Asao et al.（2001））またはSTAT5（Ozaki et al.（2000））のリン酸化を誘導することができる。MU-1は広範なリンパ組織分布を示す。用語「MU-1」は、例えば、IL-21（好ましくは、哺乳類の、例えば、ネズミまたはヒトIL-21）と相互作用、例えば、結合することができ、以下の特徴のうちの1つを有する受容体（好ましくは、哺乳類の、例えば、ネズミまたはヒト起源の）を指す。（i）天然の哺乳類MU-1ポリペプチドIL-21/MU-1のアミノ酸配列またはその断片、例えば、配列番号2（ヒト）もしくは配列番号10（ネズミ）として示されるアミノ酸配列またはその断片、（ii）配列番号2（ヒト）または配列番号10（ネズミ）として示されるアミノ酸配列またはその断片と実質的に相同な、例えば、少なくとも85％、90％、95％、98％、99％相同なアミノ酸配列、（iii）天然の哺乳類IL-2/MU-1ヌクレオチド配列またはその断片（例えば、配列番号1（ヒト）または配列番号9（ネズミ）またはその断片）によってコードされるアミノ酸配列、（iv）配列番号1（ヒト）または配列番号9（ネズミ）として示されるヌクレオチド配列またはその断片と実質的に相同な、例えば、少なくとも85％、90％、95％、98％、99％相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、（v）天然IL-21/MU-1ヌクレオチド配列またはその断片、例えば、配列番号1（ヒト）または配列番号9（ネズミ）またはその断片に対するヌクレオチド配列縮重によってコードされるアミノ酸配列、あるいは（vi）ストリンジェントな条件、例えば、高度にストリンジェントな条件下で前記のヌクレオチド配列配列のうちの1つとハイブリダイズするヌクレオチド配列。
IL-21R/MU-1は哺乳類、ヒト起源のものであるのが好ましい。ヒトIL-21/MU-1のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号1および配列番号2に示されている。ヒトIL-21R/MU-1アミノ酸配列の解析（配列番号2;図2B）により以下の構造的特徴が示された：配列番号2のアミノ酸1付近〜19付近（図2B）のリーダー配列、WSXWSモチーフ（配列番号2のアミノ酸213付近〜217付近）、膜貫通ドメイン（配列番号2のアミノ酸236〜252付近（図2B））、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近の細胞外ドメイン、および配列番号2の253付近〜538付近の細胞内ドメイン。成熟ヒトIL-21R/MU-1は配列番号2のアミノ酸20〜538の配列を有すると考えられている。
IL-21R/MU-1 cDNAは1988年3月10日に受託番号ATCC98687でAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。
IL-21ポリペプチドと結合する能力を保持している限りは、全長未満のいずれの型のIL-21R/MU-1タンパク質も、本発明の方法および組成物に使用できる。全長未満のIL-21R/MU-1タンパク質、例えば、可溶性IL-21Rは、宿主細胞において、全長MU-1タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相当する断片を発現させることによって生産することができる。これらの相当するポリヌクレオチド断片もまた本発明の一部である。前記の改変ポリヌクレオチドは、適当な所望の欠失変異体の構築、部位特異的変異導入法または適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含む、標準的な分子生物学技術によって作製することができる。
本明細書において「可溶性IL-21R/MU-1ポリペプチド」とは、膜に自身を固定することのできないIL-21R/MU-1ポリペプチドである。このような可溶性ポリペプチドとしては、例えば、ポリペプチドを固定するための膜貫通ドメインの十分な部分を欠く、または膜貫通ドメインが非機能的であるよう修飾されているMU-1またはIL-21Rポリペプチドが挙げられる。例えば、IL-21Rの可溶性断片（例えば、ネズミまたはヒトIL-21Rの細胞外ドメインを含んでなるIL-21Rの断片）は、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近、1付近〜236付近、20付近〜235付近、20付近〜236付近付近の（ヒト）、または配列番号10のアミノ酸1付近〜236付近、20付近〜236付近付近（ネズミ）のアミノ酸配列を含む。可溶性IL-21R/MU-1ポリペプチドは、例えば、融合されている第2の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、GST、Lex-AまたはMBPポリペプチド配列）さらに含むことができる。例えば、融合タンパク質は少なくとも、IL-21と結合することができるIL-21Rポリペプチドの断片、例えば、IL-21Rの可溶性断片（例えば、第2の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖、Fc断片、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEをはじめとする種々のアイソタイプの重鎖定常領域）と融合している、ネズミまたはヒトIL-21Rの細胞外ドメインを含んでなるIL-21Rの断片、例えば、配列番号2のアミノ酸1付近〜235付近、1付近〜236付近、20〜235、20付近〜236付近付近のもの（ヒト）、または配列番号10のアミノ酸1付近〜236付近、20付近〜236付近付近のもの（ネズミ））を含むことができる。
用語「インターロイキン-21」または「IL-21」とは、Il-2、IL-4およびIL-15と配列相同性を示すサイトカインを指す（Parrish-Novak et al.（2000）Nature 408: 57-63）。インターロイキンサイトカイン間の低い配列相同性にもかかわらず、サイトカインは「4つのへリックス束」構造への共通の折り畳みを共有しており、これがこのファミリーを表す。主に、活性化されたCD4+T細胞で発現され、NK、BおよびT細胞に対して作用を有すると報告されている（上記のParrish-Novak et al.（2000）; 上記のKasaian, M. T. et al.（2002））。IL-21はIL-21R（本明細書ではMU-1およびNILRとも呼ばれる）と結合する。IL-21が結合すると、IL-21Rの活性化により、stat5またはstat3シグナル伝達が導かれる（上記のOzaki et al.（2000））。用語「IL-21」または「IL-21ポリペプチド」とは、IL-21R（好ましくは、哺乳類の、例えば、ネズミまたはヒトIL-21）と相互作用、例えば、結合でき、以下の特徴のうちの1つを有するタンパク質（好ましくは、哺乳類の、例えば、ネズミまたはヒト起源の）を指す：（i）天然の哺乳類IL-21のアミノ酸配列またはその断片、例えば、配列番号19として示されるアミノ酸配列（ヒト）またはその断片、（ii）配列番号19として示されるアミノ酸配列（ヒト）またはその断片と実質的に相同な、例えば、少なくとも85％、90％、95％、98％、99％相同なアミノ酸配列、（iii）天然の哺乳類IL-2ヌクレオチド配列またはその断片（例えば、配列番号18（ヒト）またはその断片）によってコードされるアミノ酸配列、（iv）配列番号18（ヒト）として示されるヌクレオチド配列またはその断片と実質的に相同な、例えば、少なくとも85％、90％、95％、98％、99％相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、（v）天然IL-21ヌクレオチド配列またはその断片、例えば、配列番号19（ヒト）またはその断片に対するヌクレオチド配列縮重によってコードされるアミノ酸配列、あるいは（vi）ストリンジェントな条件、例えば、高度にストリンジェントな条件下で前記のヌクレオチド配列配列のうちの1つとハイブリダイズするヌクレオチド配列。
MU-1またはIL-21Rポリペプチド「の生物活性」という語句は、それだけには限定されないが、（1）IL-21ポリペプチドとの相互作用、例えば、結合、（2）シグナル伝達分子、例えば、γc、jak1との会合、（3）statタンパク質、例えば、stat5および/またはstat3の刺激性リン酸化および/または活性化、および/または（4）増殖、分化、エフェクター細胞機能、細胞溶解活性、サイトカイン分泌、および/または免疫細胞、例えば、T細胞（CD+8、CD4+T細胞）、NK細胞、B細胞、マクロファージおよび巨核球の生存の調節、例えば、刺激または低下をはじめとする、相当する成熟MU-1タンパク質の1つ以上の生物活性を指す。
本明細書において、本発明の方法において有用である「IL-21/IL-21Rアゴニスト」は、IL-21R/MU-1ポリペプチドの1つ以上の生物活性を増強、誘導あるいは強化する薬剤を指す。好ましくは、アゴニストは、IL-21R/MU-1ポリペプチドと例えば結合のような相互作用をする。
本明細書において、本発明の方法において有用である「IL-21/IL-21Rアンタゴニスト」は、IL-21R/MU-1ポリペプチドの1以上の生物活性を低下、阻害あるいは減少させる薬剤を指す。好ましくは、アンタゴニストはIL-21R/MU-1ポリペプチドと相互作用、例えば、結合する。IL-21/IL-21Rアンタゴニストを用いるアンタゴニズムは、必ずしもIL-21R/MU-1ポリペプチド生物活性の完全な排除を示すわけではない。
本明細書において、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストの「治療上有効量」は、被験者、例えば、ヒト患者に、単回または複数回用量投与した際に、疾患の1以上の症状の治癒、重篤度の低下、寛解において、またはかかる処置がない場合に予想されるものを越える被験者の生存の延長において有効である薬剤の量を指す。
本明細書において、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストの「予防上有効量」は、被験者、例えば、ヒト患者に、単回または複数回用量投与投与した際に、疾患、例えば、本明細書に記載されたような疾患の発症または再発の出現の予防または遅延において有効である、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストの量を指す。
2つの状態間の量的相違を示す、例えば、用語「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇させる」、「増加させる」、「減少させる」などは、2つの状態間の少なくとも統計的有意な差を指す。
本明細書中の用語「組み合わせて」はこれに関しては、薬剤が実質的に同時に、同時にまたは逐次のいずれかで与えられることを意味する。逐次与えられる場合には、第2の化合物の投与の開始時に、2種の化合物のうちの第1の方が治療部位で有効濃度でまだ検出可能であることが好ましい。
本明細書において「融合タンパク質」は、2以上の機能しうる形で結合している、例えば、連結している部分、例えば、タンパク質部分を含むタンパク質を指す。この部分が共有結合によって結合していることが好ましい。この部分は直接結合していてよく、またはスペーサーもしくはリンカーを介して結合していてもよい。
本明細書において用語「抗体」は、少なくとも1つ、好ましくは2つの重（H）鎖可変領域（本明細書ではVHと略される）と、少なくとも1つ、好ましくは２つの軽（L）鎖可変領域（本明細書ではVLと略される）とを含んでなるタンパク質を指す。VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」（FR）と呼ばれる、より保存されている領域とともに散在する、「相補性決定領域」（「CDR」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細かく分けることができる。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、はっきりと規定されている（Kabat, E. A., et al.（1991）Sequehces of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242およびChothia, C. et al.（1987）J. Mol. Biol.196: 901-917参照、なお、これらは参考文献として本明細書に組み込まれる）。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で並んだ、3つのCDRおよび4つのFRからなる:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体はさらに、重鎖および軽鎖定常領域を含み、それによってそれぞれ免疫グロブリン重鎖および軽鎖を形成することができる。一実施形態では、抗体は2つの免疫グロブリン重鎖と2つの免疫グロブリン軽鎖からなる四量体であり、これで免疫グロブリン重鎖と軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続されている。重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3からなる。軽鎖定常領域は1つのドメイン、CLからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、通常、抗体の、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第1の構成要素（Clq）をはじめとする宿主組織または因子との結合を媒介する。
本明細書において、用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1種以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認められているヒト免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α（IgA1およびIgA2）、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約25Kdすなわち214個のアミノ酸）は、NH2末端の可変領域遺伝子（約110個のアミノ酸）およびCOOH末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖」（約50kdすなわち446個のアミノ酸）は同様に、可変領域遺伝子（約116個のアミノ酸）およびその他の前記定常領域遺伝子のうちの1つ、例えば、γ（約330個のアミノ酸をコードする）によってコードされている。
本明細書において「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる、抗体クラス（例えば、IgMまたはIgG1）を指す。
本明細書において、抗体の「抗原結合断片」（または単に「抗体部分」または「断片」）という用語は、抗原（例えば、CD3）と特異的に結合する能力を保持する全長抗体の1以上の断片を指す。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例としては、（i）Fab断片、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片、（ii）F（ab'）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって結合されている2つのFab断片を含んでなる二価の断片、（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、（iv）抗体の1つの腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片、（v）VHドメインからなるdAb断片（Ward et al.,（1989）Nature 341: 544-546）、（vi）単離した相補性決定領域（CDR）が挙げられる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLとVHは別個の遺伝子によってコードされるが、組み換え法を用いて、VLとVH領域対が一価の分子を形成する、単一のタンパク質鎖として作製されるようにする合成リンカーによってそれらを連結してもよい（一本鎖Fv（scFv）として既知である;例えば、Bird et al.（1988）Science 242: 423-426;およびHuston et al.（1988）Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85:5879-5883参照）。かかる一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得、断片を完全抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングする。
本明細書に開示された配列と同様または相同な（例えば、少なくとも約85％の配列同一性）配列も本出願の一部である。実施形態によっては配列同一性が約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上もあり得る。あるいは、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、鎖の補体とハイブリダイズする場合には、かなりの配列同一性が存在する。核酸は、全細胞、細胞溶解物または部分精製された形態、もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
2つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語は本明細書では同じ意味で用いる）の計算は、以下のとおりに実施した。配列を最適比較目的でアラインし（例えば、最適アラインメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配列の一方または双方にギャップを導入してもよいし、また比較目的で非相同配列を無視してもよい）。好ましい実施形態では、比較目的でアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも60％、さらにより好ましくは少なくとも70％、80％、90％、100％である。次いで、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列中のある位置が、第2の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合に、分子はその位置で同一である（本明細書では、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適アラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、両配列によって共有される同一位置数の関数とする。
2つの配列間の、配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、GCGソフトウェアパッケージ（http ://www. gcg. comで入手可能）中のギャッププログラムに組み込まれている、NeedlemanおよびWunsch（（1970）J. Mol.Biol. 48 : 444-453）アルゴリズムを用いて、Blossum62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および16、14、12、10、8、6または4というギャップ加重および1、2、3、4、5または6という長さ加重を用いて求める。さらに別の好ましい実施形態では、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、GCGソフトウェアパッケージ（http ://www. gcg. comで入手可能）中のギャッププログラムを用いて、NWSgapdna CMPマトリックスおよび40、50、60、70または80というギャップ加重および1、2、3、4、5または6という長さ加重を用いて求める。特に好ましいパラメーターセット（および実施者が、分子が本発明の配列同一性または相同性限制限内にあるかどうかを調べるために、どのパラメーターを適用するべきであるかについて不確かである場合に用いるべきもの）は、Blossum62スコアリングマトリックスであり、これは12というギャップ・ペナルティー（gap penalty）、4というギャップ・エクステンド・ペナルティー（gap extend penalty）および5というフレームシフト・ギャップ・ペナルティーを用いる。2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントはまた、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている、E. MeyersおよびW.Millerのアルゴリズム（（1989）CABIOS, 4:11-17）を用いて、PAM120加重残基表、12というギャップ・レングス・ペナルティーおよび4というギャップ・ペナルティー用いて求めることもできる。
本明細書において、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を説明する。ストリンジェントな条件は当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y.（1989）, 6.3. 1-6.3.6に見ることができる。その参照文献には水性法および非水性法が記載されているが、いずれを用いてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例には、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、50℃での0.2×SSC、0.1% SDS中での1回以上の洗浄がある。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例としては、約45℃での6×SSC中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、55℃での0.2×SSC、0.1% SDS中での1回以上の洗浄がある。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、約45℃で6×SSC中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、60℃で0.2×SSC、0.1% SDS中での1回以上の洗浄がある。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約45℃で6×SSC中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、65℃での0.2×SSC、0.1% SDS中での1回以上の洗浄であることが好ましい。特に好ましい高度にストリンジェントな条件（および実施者が、分子が本発明のハイブリダイゼーション制限内にあるどうかを調べるために、どの条件を適用するべきであるかについて不確かである場合に用いるべき条件）は、65℃で0.5M リン酸ナトリウム、7% SDSと、それに続く、65℃で0.2×SSC、1% SDSでの1回以上の洗浄である。
本発明のIL-21/IL-21Rアゴニストおよびアンタゴニストは、その機能に実質的な影響を及ぼさない、さらなる保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸置換を含み得るということは理解されよう。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換わっているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野では規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
本明細書において、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組み換え発現ベクターが組み込まれている細胞を指すものとする。かかる用語は特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すものとするということは理解されよう。変異または環境的影響のいずれかのために、後代ではいくらかの修飾が起こり得るので、かかる子孫は実際には親細胞と同一でない場合もあるが、依然として本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
IL-21/IL-21Rアゴニストおよびアンタゴニスト
一実施形態では、IL-21R/MU-1ポリペプチドまたはその活性断片は、第2の部分、例えば、免疫グロブリンまたはその断片（例えば、そのFc結合断片）と融合していてもよい。例えば、IL-21R/MU-1の可溶性型は、「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのFc部分と融合していてもよい。他の融合タンパク質、例えば、GST、Lex-AまたはMBPとのものも使用できる。
融合タンパク質は、IL-21またはIL-21R断片を第2の部分と結合するリンカー配列をさらに含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質は、ペプチドリンカー、例えば、約4〜20個、より好ましくは、5〜10個のアミノ酸長のペプチドリンカーを含むことができ、本ペプチドリンカーは8アミノ酸長である。ペプチドリンカー中の各アミノ酸は、Gly、Ser、Asn、ThrおよびAlaからなる群から選択され、本ペプチドリンカーはGly-Serエレメントを含む。他の実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、ペプチドリンカーは次式（Ser-Gly-Gly-Gly-Gly）y（ここで、yは1、2、3、4、5、6、7または8である）を有する配列を含む。
他の実施形態では、発現、検出および/または単離または精製を容易にするために、融合タンパク質のNまたはC末端にさらなるアミノ酸配列を加えることもできる。例えば、IL-21/IL-21R融合タンパク質は、1以上のさらなる部分、例えば、GST、His6タグ、FLAGタグと連結していてもよい。例えば、融合タンパク質はさらに、融合タンパク質配列がGST（すなわち、グルタチオンS-トランスフェラーゼ）配列のC末端と融合しているGST融合タンパク質と連結していてもよい。このような融合タンパク質によって、MU-1融合タンパク質の精製が容易になり得る。
もう1つの実施形態では、融合タンパク質は異種シグナル配列（すなわち、Mu-1核酸によってコードされるポリペプチドには存在しないポリペプチド配列）をN末端に含む。例えば、天然のMu-1シグナル配列を除去し、別のタンパク質由来のシグナル配列で置き換えることができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）では、異種シグナル配列の使用によって、Mu-1の発現および/または分泌を高めることができる。
本発明のキメラまたは融合タンパク質は標準的な組み換えDNA技術によって生産することができる。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするDNA断片を、従来技術にしたがって、例えば、ライゲーションのための平滑末端の末端または互い違い末端の末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて突出末端を埋めること、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および酵素によるライゲーションを用いることによって、インフレームで連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化DNAシンセサイザーを含む従来技術によって合成することもできる。あるいは、アンカープライマーを用いる遺伝子断片のPCR増幅を実施することもでき、これによって2つの連続する遺伝子断片間に相補的なオーバーハングが生じ、次いで、これをアニーリングし、再増幅してキメラ遺伝子配列を得ることができる（例えば、Ausubel et al.（eds）CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992参照）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のFc領域）をコードする多数の発現ベクターが市販されている。Mu-1をコードする核酸を、融合部分が免疫グロブリンタンパク質とインフレームで連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングすることもできる。
MU-1融合ポリペプチドがオリゴマー、例えば、二量体または三量体として存在する実施形態もある。
第1のポリペプチド、および/または第1のポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法を用いて構築することができる。
Mu-1ポリペプチド部分が、天然Mu-1配列（野生型）内に、Mu-1ポリペプチドのIL-21とのより親和性の高い（非変異配列と比べて）結合をもたらす変異を有する変異形Mu-1ポリペプチドとして提供される実施形態もある。
Mu-1ポリペプチド部分が、天然Mu-1配列（野生型）内に、タンパク質分解に対してより耐性のある（非変異配列と比べて）Mu-1配列をもたらす変異を有する変異形Mu-1ポリペプチドとして提供される実施形態もある。
第1のポリペプチドが全長Mu-1ポリペプチドを含む実施形態もある。あるいは第1のポリペプチドは全長未満のMu-1ポリペプチドを含んでなる。
融合タンパク質に含まれ得るシグナルペプチドには、MPLLLLLLLLPSPLHP（配列番号21）がある。必要に応じて、Mu-1部分を含んでなる第1のポリペプチド部分と第2のポリペプチド部分の間に1以上のアミノ酸をさらに挿入することもできる。
第2のポリペプチドは可溶性であることが好ましい。第2のポリペプチドが、結合しているポリペプチドの半減期（例えば、血清半減期）を延長する実施形態もある。第2のポリペプチドが、融合ポリペプチドと第2のMu-1ポリペプチドとの結合を促進する配列を含む実施形態もある。好ましい実施形態では、第2のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチドの一領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当技術分野では公知であり、例えば、米国特許第5,516,964号、同5,225,538号、同5,428,130号、同5,514,582号、同5,714,147号および同5,455,165号に記載されている。
第2のポリペプチドが全長免疫グロブリンポリペプチドを含んでなる実施形態もある。あるいは、第2のポリペプチドは全長未満の免疫グロブリンポリペプチド、例えば、重鎖、軽鎖、Fab、Fab2、FvまたはFcを含んでなる。第2のポリペプチドが、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含むことが好ましい。第2のポリペプチドが、免疫グロブリンポリペプチドのFc領域を含むことがより好ましい。
本発明のもう1つの態様では、第2のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のFc領域のエフェクター機能よりも少ないエフェクター機能を有する。Fcエフェクター機能としては、例えば、Fc受容体結合、補体固定およびT細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第6,136,310号参照）。T細胞枯渇活性、Fcエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は当技術分野では公知である。一実施形態では、第2のポリペプチドはFc受容体と低い親和性しかないかまたは全く親和性がない。別の実施形態では、第2のポリペプチドは補体タンパク質C1qと低い親和性しかないかまたは全く親和性がない。
好ましい第2のポリペプチド配列は、配列番号17のアミノ酸配列を含む。この配列はFc領域を含む。下線を引いたアミノ酸は、野生型免疫グロブリン配列の対応する位置に見られるアミノ酸と異なるものである:
HTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
K
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
P
SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
Q
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号17）。
本発明の方法に使用できるアンタゴニスト性融合タンパク質の例は図7〜15に示されている。一実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37または配列番号39、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号25または配列番号29として示されるアミノ酸配列（それぞれ、図8A〜8Cおよび10A〜10C）、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列を有する。他の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、配列番号24または配列番号28から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも85％、90％、95％、98％以上同一の配列によってコードされるアミノ酸配列（それぞれ、図8A〜8Cおよび10A〜10C）を含む。融合タンパク質が、配列番号29として示されるアミノ酸配列を有すること、または配列番号28として示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有することが最も好ましい（図10A〜10C）。
その他の実施形態では、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストは、IL-21またはIL-21R、好ましくは、哺乳類（例えば、ヒトまたはネズミ）IL-21またはIL-21Rと結合する抗体、またはその抗原結合断片である。
本発明のMU-1タンパク質はまた、動物を免疫化して、MU-1タンパク質と特異的に反応し、リガンドの受容体との結合を阻害することができるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を得るために用いることもできる。かかる抗体は免疫原として全MU-1を用いて得てもよいし、MU-1の断片を用いることによって得てもよい。動物を免疫化するために、MU-1のより小さい断片を用いることもできる。ペプチド免疫原には、カルボキシル末端にシステイン残基をさらに含めることができ、これがスカシガイ・ヘモシアニン（KLH）などのハプテンに抱合される。チロシン残基を硫酸化チロシン残基で置換することによってさらなるペプチド免疫原を作製してもよい。かかるペプチドを合成する方法は、例えば、R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85,2149-2154（1963）; J. L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211,10（1987）におけるように、当技術分野では公知である。
MU-1タンパク質との結合する中和または非中和抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）もまた、前記の症状の治療において有用であり得る。これらの中和モノクローナル抗体は、リガンドのMU-1受容体鎖との結合をブロックすることができる場合がある。
本発明は、IL-21またはIL-21Rと特異的に反応する抗体を含んでなる組成物をさらに提供する。
IL-21またはIL-21Rに対して向けられるヒトモノクローナル抗体（mAb）は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。当該の抗原で免疫化した、こういったトランスジェニックマウス由来の脾細胞を用いて、ヒトタンパク質由来のエピトープに特異的親和性を有するヒトmAbを分泌するハイブリドーマを作製する（例えば、Wood et al.国際出願WO91/00906、Kucherlapati et al. PCT公開WO91/10741、Lonberg et al.国際出願WO92/03918、Kay et al.国際出願92/03917、Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368: 856-859、Green, L. L. et al. 1994 Nature Genet. 7: 13-21、Morrison, S. L. et al.1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855、Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7: 33-40、Tuaillon et al. 1993 PNAS 90: 3720-3724、Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21 :1323-1326参照）。
モノクローナル抗体はまた、組み換えDNA技術の当業者に公知の他の方法によって作製してもよい。特定の抗原特異性を有する抗体断片を同定し、単離するための、「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法と呼ばれる代替方法が開発されており、モノクローナル抗体を作製するために利用することができる（コンビナトリアル抗体ディスプレイについての概要については、例えば、Sastry et al. 1989 PNAS 86 :5728、Huse et al. 1989 Science 246:1275およびOrlandi et al. 1989 PNAS 86 :3833参照）。前記のように、動物を免疫原で免疫化した後、得られたB細胞プールの抗体レパートリーをクローニングする。オリゴマープライマーの混合物およびPCRを用いることによって、免疫グロブリン分子の多様な集団の可変領域のDNA配列を得る方法は一般に知られている。例えば、5'リーダー（シグナルペプチド）配列および/またはフレームワーク1（FR1）配列に相当する混合オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに保存されている3'定常領域プライマーに対するプライマーを、いくつかのネズミ抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域のPCR増幅に用いることができる（Larrick et al.,l991, Biotechniques 11: 152-156）。同様の戦略はまた、ヒト抗体由来のヒト重鎖および軽鎖可変領域を増幅するために用いることもできる（Larrick et al., 1991, Methods : Companion to Methods in Enzymology 2:106-110）。
当技術分野で公知の組み換えDNA技術によって、キメラ免疫グロブリン鎖を含むキメラ抗体を作製することもできる。例えば、ネズミ（またはその他の種）モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化してネズミFcをコードする領域を除去し、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の同等部分と置き換える（Robinson et al.,国際特許公開PCT/US86/02269、Akira, et al.,欧州特許出願184, 187、Taniguchi, M.,欧州特許出願171,496、Morrison et al.,欧州特許出願173,494、Neuberger et al.,国際出願WO86/01533、Cabilly et al.米国特許第4,816,567号、Cabilly et al.,欧州特許出願125,023、Better et al.（1988 Science 240: 1041-1043）、Liu et al.（1987）PNAS 84: 3439-3443、Liu et al., 1987, J. Immunol.139: 3521-3526、Sun et al.（1987）PNAS 84 :214-218、Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005、Wood et al.（1985）Nature 314: 446-449およびShaw et al., 1988, J : Natl Cancer Inst. 80:1553-1559参照）。
抗体または免疫グロブリン鎖は、当技術分野で公知の方法によってヒト化することができる。ヒト化免疫グロブリン鎖をはじめとするヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しないFv可変領域の配列を、ヒトFv可変領域由来の同等配列と置き換えることによって作製することができる。ヒト化抗体を作製する一般的な方法は、Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202-1207によって、Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214によって、およびQueen et al. US5,585,089、US5,693,761およびUS5,693,762によって示されており、そのすべての内容は参照により本明細書に組み入れられる。それらの方法は、少なくとも1つの重鎖または軽鎖由来の、免疫グロブリンFv可変領域のすべてまたは一部をコードする核酸配列の単離、操作および発現を含む。かかる核酸の供給源は当業者には十分に公知であり、例えば、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。次いで、ヒト化抗体またはその断片をコードする組み換えDNAを適当な発現ベクターにクローニングすればよい。
ヒト化またはCDR移植した抗体分子または免疫グロブリンは、CDR移植またはCDR置換によって作製することもでき、これでは免疫グロブリン鎖の1つ、2つまたはすべてのCDRを置換してもよい。例えば、米国特許第5,225,539号、Jones et al. 1986 Nature 321:552-525、Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534、Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060、Winter US5,225,539参照、なお、これらのすべての内容は参照により本明細書に特に組み入れる。Winterは、本発明のヒト化抗体を調整するために使用できるCDR移植法を記載しており（1987年3月26日に出願された、英国特許出願GB2188638A、Winter US5,225,539）、その内容は参照により特に組み入れられる。特定のヒト抗体のCDRのすべてを非ヒトCDRの少なくとも一部と置き換えてもよいし、またはいくつかのCDRのみを非ヒトCDRと置き換えてもよい。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要なCDR数を置き換えることが必要であるだけである。
例えば、抗体のその他の部分、例えば、定常領域の欠失、付加または置換によって修飾されている、モノクローナル、キメラおよびヒト化抗体も本発明の範囲内にある。例えば、抗体は以下のように:（i）定常領域を欠失することによって、（ii）定常領域を別の定常領域、例えば、抗体の半減期、安定性、または親和性を高めるよう意図された定常領域、または他の種または抗体クラス由来の定常領域で置換することによって、あるいは（iii）定常領域中の1個以上のアミノ酸を修飾して、中でも例えば、グリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Fc受容体（FcR）結合、補体固定を変更することによって修飾されていてもよい。
抗体定常領域を変更する方法は当技術分野では公知である。機能が変更された、例えば、エフェクターリガンド、例えば、細胞上のFcRまたは補体のC1成分に対する親和性が変更された抗体は、抗体の定常部分の少なくとも1個のアミノ酸残基を異なる残基と置き換えることによって作製することができる（例えば、EP388,151Al、US5,624,821およびUS5,648,260参照、なお、そのすべての内容を参照により本明細書に組み入れる）。同様の種類の変更は、ネズミまたはその他の種の免疫グロブリンに適用した場合には、これらの機能を低下させるか除去すると記載される。
例えば、特定の残基を、その側鎖に適当な官能基を有する残基と置き換えることによって、または荷電官能基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸、ことによると芳香族非極性残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはアラニンを導入することによって、抗体（例えば、ヒトIgGなどのIgG）のFc領域のFcR（例えば、FcγR1）に対する、またはC1q結合に対する親和性を変更することが可能である（例えば、US5,624,821参照）。
IL-21ポリペプチドのアミノ酸配列は公に知られている。例えば、ヒトIL-21のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Genbank受託番号X_011082で入手できる。開示されているヒトIL-21ヌクレオチド配列を以下に示す。
1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc
61 tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttggga cactggtcca
121 caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat
181 tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga
241 agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa
301 gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag
361 gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg
421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca
481 aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc
541 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg
601 tattccaagt ggaggag（配列番号18）
開示されているヒトIL-21ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPE
FLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKH
RLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS（配列番号19）
本発明はまた、高度にストリンジェントな条件（例えば、65℃で0.1×SSC）下で、配列番号1、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸も包含する。MU-1タンパク質または融合タンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重によって配列番号1、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38に示されるヌクレオチド配列とは異なる、単離されたポリヌクレオチドも本発明に包含される。点変異によって、または導入された修飾によって引き起こされる、配列番号1、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36または配列番号38に示されるようなヌクレオチド配列における変化も本発明に含まれる。
MU-1タンパク質を組み換え生産するために、単離された本発明のポリヌクレオチドを、Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19,4485-4490（1991）に開示されたpMT2またはpED発現ベクターなどの発現制御配列と機能しうる形で連結することもできる。多くの好適な発現制御配列が当技術分野では知られている。組み換えタンパク質を発現させる一般法もまた公知であり、R. Kaufman, Methods in Enzymology 185,537-566（1990）に例示されている。本明細書において定義される「機能しうる形で連結された」は、MU-1タンパク質が、連結されたポリヌクレオチド/発現制御配列で形質転換されている（トランスフェクトされている）宿主細胞によって発現されるような方法で、単離された本発明のポリヌクレオチドと発現制御配列の間が酵素的または化学的に連結されて、共有結合を形成すること意味する。
本明細書において用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターの一種として「プラスミド」があり、これは、その中にさらなるDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループを指す。別の種のベクターとしてウイルスベクターがあり、これでは、さらなるDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製できる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることによって宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、ある種のベクターは、それらが機能しうる形で連結されている遺伝子の発現を導くことができる。かかるベクターは本明細書では「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組み換えDNA技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は同じ意味で用いることがある。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、発現ベクターのかかる他の形態、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製に欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）も含むものとする。
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。かかる調節配列は、例えば、Goeddel；Gene Expression Technology:Methods in Enzyfnology 185, Academic Press, San Diego, CA（1990）に記載されている。当業者ならば、調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、トランスフォームされる宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどといった因子に応じて変わることがあるということは理解されよう。哺乳類宿主細胞発現にとって好ましい調節配列としては、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、FF-1aプロモーターおよびBGHポリA、サイトメガロウイルス（CMV）（CMVプロモーター/エンハンサーなど）、シミアン・ウイルス40（SV40）（SV40プロモーター/エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節エレメント、およびその配列についてのさらなる説明については、例えば、Stinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号およびSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号参照。
本発明の組み換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子を保持することもできる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、すべてAxelらによる、米国特許第4,399,216号、同4,634,665号および同5,179,017号参照）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、薬剤、例えば、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子（dhfr-宿主細胞においてメトトレキセート選抜/増幅とともに用いるための）およびneo遺伝子（G418選抜のための）が挙げられる。
いくつかの細胞種が、MU-1タンパク質またはその融合タンパク質の発現にとって好適な宿主細胞として働くことができる。機能的MU-1タンパク質を発現することができる細胞種であれば、いずれを用いてもよい。好適な哺乳類宿主細胞としては、例えば、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト腎臓293細胞、ヒト上皮A431細胞、ヒトColo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、その他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のin vitro培養物由来の細胞株、一次外植片、HeLa細胞、マウスL細胞、BHK、HL-60、U937、HaK、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1xまたはC2C12細胞が挙げられる。
MU-1タンパク質またはその融合タンパク質はまた、単離された本発明のポリヌクレオチドを1種以上の昆虫発現ベクター中の好適な制御配列に機能しうる形で連結すること、および昆虫発現系を用いることによって生産することもできる。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キットの形で、例えば、Invitrogen, San Diego,Calif. U. S. A.（the MaxBac（登録商標）キット）から市販されており、また、参考文献として本明細書に組み込まれる、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555（1987）に記載されているような方法は当技術分野では十分に公知である。MU-1タンパク質の可溶性型もまた、前記のように、適当な単離ポリヌクレオチドを用いて昆虫細胞で生産することができる。
あるいは、MU-1タンパク質またはその融合タンパク質は、酵母などの下等真核生物で、または細菌などの原核生物で生産することもできる。好適な酵母株としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス（Kluyveromyces）株、カンジダまたは異種タンパク質を発現できるいずれかの酵母株が挙げられる。好適な細菌株としては、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、, バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィウリウム（Salmonella typhimurium）または異種タンパク質を発現できるいずれかの細菌株が挙げられる。
細菌における発現は、組み換えタンパク質を組み込んでいる封入体の形成をもたらすこともある。したがって、活性なまたはより活性な物質を生産するには、組み換えタンパク質の再折り畳みが必要であることがある。細菌封入体から正しく折り畳まれた異種タンパク質を得るためのいくつかの方法が当技術分野では知られている。これらの方法は一般に、封入体からタンパク質を可溶化すること、次いで、カオトロピック剤を用いてタンパク質を完全に変性すること含む。タンパク質の一次アミノ酸配列にシステイン残基が存在する場合には、ジスルフィド結合を正しく形成させる環境（レドックス系）で再折り畳みを達成する必要があることが多い。再折り畳みの一般法は、Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195（1990）に開示されている。EP0433225および同時係属出願米国出願番号第08/163,877号にはその他の適当な方法が記載されている。
MU-1タンパク質またはその融合タンパク質はまた、トランスジェニック動物の産物として、例えば、MU-1タンパク質またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞を特徴とする、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳の成分として発現させることもできる。
MU-1タンパク質またはその融合タンパク質は、培養形質転換宿主細胞を、所望のタンパク質を発現するのに必要な培養条件下で増殖させることによって調製することもできる。次いで、得られた発現されたタンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製すればよい。可溶性型のMU-1タンパク質またはその融合タンパク質は培養上清から精製することもできる。膜結合型の本発明のMU-1タンパク質は、発現細胞から全膜画分を調製すること、および膜をTritonX-100などの非イオン性界面活性剤で抽出することによって精製することができる。
MU-1タンパク質または融合タンパク質は、当業者に公知の方法を用いて精製することができる。例えば、本発明のMU-1タンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮することができる。濃縮ステップ後、濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（DEAE）またはポリエチレンイミン（PEI）基を有するマトリックスまたは基質を使用できる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般に用いられる他の種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換ステップを用いてもよい。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んでなる種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が好ましい（例えば、S-セファロース（登録商標）カラム）。培養上清からのMU-1タンパク質または融合タンパク質の精製はまた、コンカナバリンA-アガロース、ヘパリン-トヨパール（toyopearl）（登録商標）またはシバクロンブルー（Cibacrom Blue）3GAセファロース（登録商標）などの親和性樹脂にわたる、またはフェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルなどの樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、またはイムノアフィニティークロマトグラフィーによる1以上のカラムステップを含むこともある。最後に、MU-1タンパク質をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC媒体、例えば、ペンダントメチルまたはその他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる、1以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）ステップを用いることもできる。MU-1タンパク質に対する抗体を含むアフィニティーカラムを、公知の方法にしたがって精製に用いることもできる。実質的に精製され、単離された組み換えタンパク質を提供するために、前記精製ステップのうちのいくつかまたはすべては、種々の組み合わせで、またはその他の既知の方法とともに用いることができる。単離されたMU-1タンパク質は、他の哺乳類タンパク質を実質的に含まないよう精製されていることが好ましい。
本発明のMU-1タンパク質または融合タンパク質はまた、MU-1と結合できる薬剤についてスクリーニングするために用いることもできる。固定化されているかされていない、所望の結合タンパク質を用いる結合アッセイは当技術分野では十分に公知であり、この目的で、本発明のMU-1タンパク質用いて用いることができる。精製された細胞をベースとする、またはタンパク質をベースとする（細胞を含まない）スクリーニングアッセイを用いて、かかる薬剤を同定することができる。例えば、精製型のMU-1タンパク質を担体に固定化し、精製されたMU-1タンパク質に対する結合またはリガンドの可能性があるものを調べることができる。
医薬組成物
IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストは、製薬上許容される担体と組み合わせた場合には、医薬組成物として用いることができる。かかる組成物は、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストおよび担体の他、種々の賦形剤、増量剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤および当技術分野で十分に公知のその他の物質を含むことができる。用語「製薬上許容される」は、有効成分の生物活性の有効性を干渉しない非毒性物質を意味する。担体の特徴は、投与経路に応じて変わる。
本発明の医薬組成物には、サイトカイン、リンホカインまたはM-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、G-CSFなどの他の造血因子、幹細胞因子およびエリスロポエチンを含めることができる。また、本医薬組成物には、以下に詳細に述べるような抗サイトカイン抗体を含めることもできる。本医薬組成物には、プラスミノゲンアクチベーターおよび因子VIIIなどの血栓溶解因子または抗血栓因子を含めることもできる。本医薬組成物にはさらに、以下に詳細に述べるようなその他の抗炎症薬を含めることもできる。かかるさらなる因子および/または薬剤は、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストと相乗効果を生じさせるために、またはIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストによって引き起こされる副作用を最小にするために本医薬組成物に含めることができる。逆に、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストを、サイトカイン、リンホカイン、その他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症薬の副作用を最小にするために、特定のサイトカイン、リンホカイン、その他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症薬の製剤に含めることもできる。
本発明の医薬組成物は、その中で、他の製薬上許容される担体に加え、IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストが、ミセル、不溶性単分子膜、液晶または水溶液中ではラメラ層として凝集型で存在する脂質などの両親媒性薬剤と混合されているリポソームの形態であってもよい。リポソーム製剤に好適な脂質としては、それだけには限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。かかるリポソーム製剤の調製は、例えば、その全体を参考文献として本明細書に組み込まれる、米国特許第4,235,871号、同4,501,728号、同4,837,028号および同4,737,323号に開示されるように当業者のレベル内にある。
本明細書において、用語「治療上有効量」は、意味ある患者の利益、例えば、かかる状態の症状の寛解、治癒または治癒速度の増加を示すのに十分である医薬組成物の各有効成分の総量または方法を意味する。単独で投与される、個々の有効成分に適用する場合には、この用語はその成分のみを指す。組み合わせに適用する場合には、この用語は、組み合わせて逐次投与されるか同時投与されるかにかかわらず、治療作用をもたらす有効成分の混合量を指す。
本発明の処置方法または使用方法を実施する際には、被験者、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）に治療上有効量のIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストを投与する。IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストは本発明の方法にしたがって、単独で投与してもよいし、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子、または抗炎症薬を用いる処置などの他の治療と組み合わせて投与してもよい。1種以上の薬剤と同時投与する場合には、IL-21および/またはIL-21R結合性薬剤を、第2の薬剤と同時に投与してもよいし、逐次投与してもよい。逐次投与する場合には、主治医が、他の薬剤と組み合わせたIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニスト投与の適当な順序を決定する。
医薬組成物中に用いたか、または本発明の方法を実施するためのIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストの投与は、種々の従来法、例えば、経口摂取、吸入、または皮膚、皮下もしくは静脈内注射で実施することができる。患者への静脈内投与が好ましい。
治療上有効量のIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストを経口投与する場合には、結合剤は錠剤、カプセル剤、散剤、溶液またはエリキシル剤の形態である。錠剤形で投与する場合には、本発明の医薬組成物に、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体をさらに含めてもよい。錠剤、カプセル剤および散剤は、約5〜95%の結合剤、好ましくは約25%〜90％の結合剤を含む。液体形で投与する場合には、水、石油、ピーナッツ油、鉱油、ダイズ油またはゴマ油などの動物または植物起源の油または合成油などの液体担体を加えてもよい。液体形態の医薬組成物には、生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールをさらに含めてもよい。液体形で投与する場合には、医薬組成物は約0.5〜90重量％の結合剤、好ましくは約1〜50％の結合剤を含む。
治療上有効量のIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストを静脈内、皮膚、または皮下注射によって投与する場合には、結合剤は発熱物質を含まない、非経口上許容される水溶液の形である。pH、等張性、安定性などを十分考慮した上での、かかる非経口上許容されるタンパク質溶液の調製は、当技術分野における技術の範囲内にある。静脈内、皮膚または皮下注射に好ましい医薬組成物は、結合剤の他に、塩化ナトリウム注射液（Sodium Choloride Injection）、リンゲル液（Ringer's Injection）、ブドウ糖注射液（Dextrose Injection）、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液（Dextrose and Sodium Chloride Injection）、乳酸リンゲル液（Lactated Ringer's Injection）などの等張性溶剤または当技術分野で公知のその他の溶剤を含むべきである。本発明の医薬組成物にはまた、安定剤、防腐剤、バッファー、抗酸化剤、または当業者に公知のその他の添加剤を含めることができる。
本発明の医薬組成物中のIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストの量は、治療されている症状の性質および重篤度、ならびにその患者が受けた従前の治療の性質に応じて変わる。最終的に、主治医が、個々の患者各々を処置するための結合剤の量を決定する。主治医は、最初に、低容量の結合剤を投与し、患者の応答を観察する。患者にとって最適の治療作用が得られるまで、より多い用量の結合剤を投与すればよく、一般にはその時点の投与量をさらに増加させることはない。本発明の方法を実施するために用いられる種々の医薬組成物は、体重1kg当たり約0.1μg〜約100mgのIL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストを含むべきであるということを考慮する。
本発明の医薬組成物を用いる静脈内療法の期間は、治療されている疾病の重篤度ならびに各特定の患者の症状および特異体質応答の可能性に応じて変わる。IL-21/IL-21Rアゴニストまたはアンタゴニストの各適用期間は12〜24時間の連続静脈内投与の範囲内にあることを考慮する。最終的に、主治医が、本発明の医薬組成物を用いる静脈内療法の適当な期間を決定する。
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、以下に同定される、1種以上の用途または生物活性（本明細書に記載されたアッセイと関連するものを含む）を示すと予想される。本発明のタンパク質について記載された用途または活性は、かかるタンパク質の投与または使用によって、またはかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与または使用によって（例えば、遺伝子治療またはDNAの導入に好適なベクターにおいてなど）提供され得る。
免疫応答を強化するためのIL-21/IL-21Rアゴニストの使用
一態様では、本発明は、免疫細胞または免疫細胞集団を、IL-21ポリペプチドの活性を増強または強化するIL-21またはIL-21R結合剤と接触させることによって、免疫細胞、例えば、T細胞（例えば、CD8+T細胞）の増殖を高める方法を提供する。これらの方法は、少なくともある程度は、アゴニストIL-21R結合剤が、主にCD8+T細胞の刺激によって、in vivoで免疫原性および非免疫原性腫瘍細胞に対する自然免疫および適応免疫を刺激したという発見に基づいている（実施例9）。本方法はまた、ある程度は、IL-21が抗原刺激されたまたは抗CD3抗体刺激された胸腺細胞、リンパ節T細胞、CD4+T細胞またはCD8+T細胞の増殖を誘導するという発見に基づいている。本出願人らはまた、アロ抗原に対するT細胞の増殖はIL-21の存在下で高めることができるということも示している。さらに、IL-21はまた、CD8+T細胞の増殖および/または分化を強化することもできる（実施例10）。例えば、IL-21の存在下でのCD8+T細胞の初回抗原刺激により、溶解（CTL）活性が強化され、かつ/またはサイトカイン、例えば、IFNγを分泌する能力が高められたエフェクター細胞を得ることができる。IL-21/IL-21R活性を刺激するIL-21またはIL-21R結合剤は、マクロファージの増殖および/またはサイトカイン分泌を誘導するために用いることもできる。IL-21はまた、記憶T細胞および抗原提示細胞（APC）に対しても作用を有する。IL-21はまた、活性化CD4+細胞によって産生されることが分かっている。したがって、IL-21/IL-21R経路を刺激する結合剤は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答をアップレギュレートするために、例えば、癌および感染性疾患の治療に用いるために、単独で、または例えば、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）として抗原と組み合わせて用いることができる。
一実施形態では、アゴニスト性IL-21/IL-21Rアゴニストは、種々の免疫不全および疾患（重症複合免疫不全（SCID）を含む）の治療において、例えば、Tおよび/またはBリンパ球の成長および増殖の調節（アップまたはダウン）、ならびにNK細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性の発揮において有用であり得る。これらの免疫不全は遺伝的なものであることもあり、ウイルス（例えば、HIV）ならびに細菌または真菌感染によって引き起こされたものであることもあり、あるいは自己免疫疾患に起因するものであることもある。より詳しくは、HIV、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、放線菌、レーシュマニア、マラリアおよびカンジダ症などの種々の真菌感染による感染症をはじめとするウイルス、細菌、真菌または他の感染によって引き起こされる感染性疾患を本発明のタンパク質を用いて治療することができる。もちろん、これに関連して、本発明のタンパク質はまた、一般に免疫系へのブーストが望まれる場合に、すなわち、癌の治療において有用であり得る。
免疫応答をアップレギュレートする手段として、抗原機能（好ましくは、Bリンパ球抗原機能）のアップレギュレーションも、治療において有用であり得る。免疫応答のアップレギュレーションは、既存の免疫応答の強化であってもよいし、または最初の免疫応答の誘発の形であってもよい。例えば、Bリンパ球抗原機能を刺激することによる免疫応答の強化が、ウイルス感染の場合には有用であり得る。さらに、刺激型のBリンパ球抗原を全身投与することによって、インフルエンザ、一般的な風邪および脳炎などの全身性ウイルス疾病を軽くすることができる。
あるいは、感染患者からT細胞を除去すること、T細胞をin vitroで、本発明のペプチドか本発明の可溶性ペプチドの刺激型のいずれかまたはともに発現するウイルス抗原パルスしたAPCで同時刺激すること、およびこのin vitro活性化T細胞を患者に再導入することによって、感染患者において抗ウイルス免疫応答を強化することもできる。抗ウイルス免疫応答を強化する別の方法は、幹線細胞を患者から単離すること、それらを本明細書に記載されたような本発明のタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトし、その結果、細胞がその表面に本タンパク質のすべてまたは一部を発現すること、およびトランスフェクトされた細胞を患者に再導入することであろう。感染細胞はここでin vivoでT細胞に同時刺激シグナルを送達し、それによって活性化することができる。
もう1つの適用では、抗原機能のアップレギュレーションまたは強化が、腫瘍免疫の誘導において有用であることがある。被験者における腫瘍特異的耐性を克服するために、少なくとも1つの本発明のペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫）を、被験者に投与することができる。必要に応じて、腫瘍細胞をトランスフェクトしてペプチドの組み合わせを発現させればよい。例えば、患者から採取した腫瘍細胞をex vivoで、IL-21/IL-21Rアゴニストの発現を単独に、またはB7-2様活性を有するペプチド単独、またはB7-1様活性および/またはB7-3様活性を有するペプチドとともに組み合わせてその発現を導く発現ベクターでトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞を患者に戻すとトランスフェクトされた細胞の表面でペプチドが発現される。あるいは、腫瘍細胞をin vivoトランスフェクションの標的とするために遺伝子治療技術を用いることができる。
腫瘍細胞の表面でBリンパ球抗原の活性を有するペプチドと組み合わせたIL-21/IL-21Rアゴニストの存在により、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するT細胞媒介性免疫応答を誘導するために必要なT細胞に対する同時刺激シグナルが提供される。さらに、MHCクラスIまたはMHCクラスII分子を欠く腫瘍細胞、または十分量のMHCクラスIまたはMHCクラスII分子を再発現できない腫瘍細胞を、MHCクラスα鎖タンパク質およびβ２ミクログロブリンタンパク質またはMHCクラスIIα鎖タンパク質およびMHCクラスIIβ鎖タンパク質のすべてまたは一部（例えば、細胞質ドメイン末端切断部分）をコードする核酸でトランスフェクトすることで、MHCクラスIまたはMHCクラスIIタンパク質を細胞表面に発現させることができる。適当なクラスIまたはクラスIIMHCがIL-21/Il-21Rアゴニスト、および/またはBリンパ球抗原（例えば、B7-1、B7-2、B7-3）の活性を有するペプチドとともに発現されることで、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するT細胞媒介性免疫応答が誘導される。場合によって、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫を誘導するために、MHCクラスII会合型タンパク質、例えば、インバリアント鎖の発現をブロックする、アンチセンス構築物をコードする遺伝子を、IL-21/IL21-Rアゴニストおよび/またはBリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするDNAで同時トランスフェクトしてもよい。したがって、ヒト被験者におけるT細胞媒介性免疫応答の誘導は、被験者における腫瘍特異的寛容を克服するのに十分であり得る。
他の実施形態では、IL-21/IL-21Rアゴニストはワクチンアジュバントとして使用できる。アジュバントとは、単独ではわずかな免疫原性しかない種々の抗原に対する免疫応答の発達およびプロファイルを強化し、かつ/または導く能力を有する免疫調節化合物である。サイトカインおよび/またはリンホカインをアジュバントとして用いることができる。アジュバントを適切に選択することによって、アジュバントがなくては発達しないであろう十分な体液性および細胞性免疫応答を誘導することができる。特に、アジュバントは、ワクチン中のサブユニットおよびペプチド抗原に対する免疫応答の強化において大きな作用を有する。その刺激活性はまた、タンパク質抗原に対して向けられる抗原特異的免疫応答の発達にも有益である。強力な粘膜応答、高血清力価、CTLの誘導および活発な細胞応答を必要とする種々の抗原については、アジュバントとサイトカイン/リンホカイン組み合わせによって、ほとんどの抗原製剤では提供されない刺激が提供される。
本明細書において、語句「ワクチンアジュバント」または「ワクチン療法」は、抗原に対する免疫応答を強化する、抑制するあるいは調節するための、抗原（例えば、ウイルス性、寄生体性および細菌性ポリペプチド、タンパク質またはペプチド）、または他の抗原（例えば、腫瘍または癌細胞ポリペプチド、タンパク質またはペプチド）または抗原をコードするポリヌクレオチドと組み合わせた、IL-21/IL-21Rアゴニスト、例えば、IL-21ポリペプチドまたはそれをコードするるポリヌクレオチドの使用を意味するものとする。この定義の目的では、「組み合わせ」は、抗原とともの使用、同時（混合されたかまたは混合されていない）または逐次使用を意味する。
用語「ワクチンアジュバント組成物」とは、注射用液体溶液または懸濁液を従来法で調製するための、免疫学上許容される賦形剤または担体をさらに含むワクチンアジュバントを指す。ワクチンアジュバント組成物は、IL-21によって誘発された免疫応答をさらに強化する薬剤をさらに含むことができる。例えば、ワクチンアジュバント組成物は、3-O-脱アシル化モノホスホリル脂質A（MPL（商標））またはモノホスホリル脂質Aおよびその誘導体および類似体をさらに含むことができる。MPL（商標）は１〜100μg/用量の範囲で用いることができる。
ワクチン療法に用いられる抗原としては、免疫原性または非免疫原性タンパク質由来のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド、ならびに以下の、糖類、タンパク質、ポリもしくはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分またはその断片のうちのいずれかが挙げられる、この節では、「ペプチド」は一連の少なくとも6個のアミノ酸を含み、かつ、少なくとも1つの抗原決定基を含み、「ポリペプチド」はペプチドより長い分子であるが、全長タンパク質を構成するものではない。本明細書において、「断片」は、糖類、タンパク質、ポリもしくはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分の一部ではあるがすべてよりは小さいものを含む。
本明細書において、用語「有効アジュバント作用量」は、脊椎動物宿主において免疫応答の増加を誘発するのに好適な、本明細書に記載されたアジュバントの組み合わせの用量を意味する。特定の投与量は、幾分かは、宿主の年齢、体重および病状、ならびに投与方法および抗原に応じて変わる。
本発明のワクチンアジュバント組成物は、それだけには限定されないが、鼻腔内、経口、膣内、直腸、非経口、皮内、経皮（例えば、参照により本明細書に組み入れる国際出願WO98/20734（44）参照）、筋内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内を含めて様々な経路で、ヒトまたは非ヒト脊椎動物に投与することができる。抗原成分または抗原性組成物の成分の量は、幾分かは抗原の主体性、ならびに宿主の年齢、体重および病状、ならびに投与方法に応じて大きく変わる。この場合も、好適な用量は当業者によって容易に決定される。必要ではないが、抗原およびアジュバントの組み合わせは同時に投与されることが好ましい。抗原性組成物の用量の数および投与計画も、当業者によって容易に決定される。アジュバントの組み合わせのアジュバント特性によって、必要とされる用量の数または投与計画の時間的経過が減少される例もある。
本発明のアジュバントの組み合わせは、それだけには限定されないが、ヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染する、ウイルス、細菌、真菌または寄生微生物由来のものを含めて広範な病原性微生物由来の、または癌細胞もしくは腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞種、癌腫）由来の、広範な抗原と組み合わせて用いるのに適している。抗原は、タンパク質由来のペプチドまたはポリペプチド、ならびに以下の、糖類、タンパク質、ポリもしくはオリゴヌクレオチド、癌もしくは腫瘍細胞、アレルゲン、アミロイドペプチドタンパク質または他の高分子成分のうちのいずれかの断片を含むことができる。抗原組成物中に2種以上の抗原が含まれる例もある。
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、望ましいウイルスワクチンとしては、それだけには限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス1〜3型、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリウイルス、ロタウイルス、カリチウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタ呼吸器・生殖器症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスによって引き起こされる疾病の予防および/または治療を対象とするものが挙げられる。一実施形態では、C型肝炎ウイルス感染を治療するために、IL-21/IL-21RアゴニストをTNFアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載されたTNFアンタゴニストと組み合わせて投与する。
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、望ましい細菌ワクチンとしては、それだけには限定されないが、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）（型に分けられるものと型に分けられないものの双方）、ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオジェネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）ストレプトコッカス・ファエカリス（Streptococcus faecalis）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）、クラミジア・ニューモニア（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア・シッタキ（Chlamydia psittaci）、ボルテデラ・パータシス（Bordetella pertussis）、サルモネラ・テフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・テフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・コレラスイス（Salmonella choleraesuis）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、シゲラ（Shigella）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、コリネバクレリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosi）s、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）−マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）複合体、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、クロスロリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、レポトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）およびマイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）によって引き起こされる疾病の予防および/または治療を対象とするものが挙げられる。
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、真菌病原菌に対する望ましいワクチンとしては、それだけに限定されないが、アスペルギリス（Aspergillis）、ブラストミセス（Blastomyces）、カンジダ（Candida）、コクシジオデス（coccidiodes）、クリプトコッカス（Cryptococcus）およびヒストプラズマ（Histoplasma）によって引き起こされる疾病の予防および/または治療を対象とするものが挙げられる。
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、寄生体に対する望ましいワクチンとしては、それだけに限定されないが、レーシュマニア・メジャー（Leishmaraia major）、アスカリス（Ascaris）、トリシュリス（Trichuris）、ジアルジア（Giardia）、シストソーマ（Schistosoma）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、トリコモナス（Trichomona）、トキソプラズマ・ゴンジー（Toxoplasma gondii）およびニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）によって引き起こされる疾病の予防および/または治療を対象とするものが挙げられる。
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎動物の宿主において治療的または予防的抗癌作用を誘発するのに望ましいワクチンとしては、それだけに限定されないが、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、癌胎児性抗原（CEA）、MUC-1、Her2、CA-125、MAGE-3、EGFR、HELP、GCC、CD66-c、プロスタシン（prostasin）、TMPRSS3、TADG12およびTADG15をはじめとする、癌抗原または腫瘍関連抗原を利用するものが挙げられる。
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎動物の宿主においてアレルゲンに対する応答を調節するための望ましいワクチンとしては、アレルゲンまたはその断片を含むものが挙げられる。かかるアレルゲンの例は、参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,830,877号（45）および公開された国際特許出願WO99/51259（46）に記載されており、花粉、昆虫の毒液、動物の鱗屑、真菌の胞子および薬物（ペニシリンなど）を含む。ワクチンは、アレルギー反応の既知の原因であるIgE抗体の産生を干渉する。
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎動物の宿主においてアミロイド沈着を特徴とする疾病を予防または治療するための望ましいワクチンとしては、アミロイドペプチドタンパク質（APP）の一部を含むものが挙げられる。この疾病は、アルツハイマー病、アミロイド病またはアミロイド形成的疾病と様々に呼ばれている。したがって、本発明のワクチンは、本発明のアジュバントの組み合わせおよびAβペプチド、ならびにAβペプチドの断片およびAβペプチドまたはその断片に対する抗体を含む。
HIVおよびSIVの場合には、抗原性組成物は、少なくとも1種のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは前記タンパク質由来の断片を含む。抗原性組成物中に複数のHIVまたはSIVタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび/または断片が含まれる例もある。
本発明のアジュバントの組み合わせ製剤はまた、ポリヌクレオチドワクチン（DNAワクチンとしても知られる）中にアジュバントとして含めるのにも適している。かかるワクチンは、ブピビカイン（bupivicaine）などの促進剤をさらに含むこともできる（参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,593,972号（49）参照）。
免疫細胞活性を低下させるためのIL-21/IL-21Rアンタゴニストの使用
さらにもう1つの態様では、本発明は、T細胞集団を、免疫細胞または集団の活性を阻害するのに十分な量のIL-21/IL-21Rアンタゴニストと接触させることによって、免疫細胞、例えば、成熟T細胞（成熟CD8+T細胞、成熟CD4+T細胞）、成熟NK細胞、B細胞、マクロファージおよび巨核球、またはその集団の活性を阻害する方法を特徴とする。また、IL-21および/またはIL-21Rのアンタゴニスト（例えば、本明細書に記載されたような融合タンパク質または中和抗体）を免疫応答の阻害が望まれる被験者に投与することもできる。こういった状態としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、関節炎疾患）、または臓器移植が挙げられる。
本出願者らは、Fc免疫グロブリン領域と融合しているIL-21Rの細胞外ドメインを含む中和融合タンパク質を用いて、IL-21R活性を低下させることによってマウスコラーゲン誘導関節炎（CIA）動物モデルにおいて炎症症状が寛解されることを示した（実施例7）。CIAマウスの足ではIL-21R mRNA発現がアップレギュレートされている（実施例8）。従って、例えば、移植片拒絶反応および自己免疫疾患をはじめとする免疫細胞関連疾患の治療または予防のために、in vivoにおいて免疫抑制を誘導するためにIL-21/IL-21R活性をアンタゴナイズするIL-21R結合剤を用いることができる。
また、IL-21R DNAはクローン病に関する染色体座にも位置する。結果として、本発明の結合剤をクローン病およびその他の炎症性腸疾患を治療するのに用いることができる。
また、対象方法は、免疫細胞または造血性細胞（例えば、骨髄性、リンパ系、赤血球系の細胞またはその前駆細胞）の活性、例えば、増殖、分化、生存）を調節する（例えば、阻害する）ために用いることができ、それゆえに、種々の免疫疾患を治療または予防するために用いることができる。それだけに限定されないが治療または予防できる疾患の限定するものではない例としては、移植片拒絶反応、自己免疫疾患（例えば、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリトマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、脊椎関節症、硬直性脊椎炎、内因性喘息、アレルギー喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮病、膣炎、直腸炎、薬剤発疹、癩病境界反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、皮膚粘膜眼症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変症、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症を含む）、移植片対宿主病、およびアトピー性アレルギーなどのアレルギーが挙げられる。本発明の結合剤を用いて治療できる好ましい疾患としては、関節炎疾患（例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、および硬直性脊椎炎（好ましくは、関節リウマチ））、多発性硬化症、I型糖尿病、狼瘡（SLE）、IBD、クローン病、喘息、血管炎、アレルギー、強皮病および乾癬が挙げられる。
もう1つの実施形態では、多発性骨髄腫および関連Bリンパ球性悪性腫瘍を治療するためにIL-21/IL-21Rアンタゴニストを単独でまたは本明細書に記載されたようなその他の治療薬（例えば、TNFアンタゴニスト）と組み合わせて用いることができる（Brenne, A. et al.（2002）Blood 第99巻（10）: 3756-3762頁）。
IL-21/IL-21Rアンタゴニストを用いて、数多くの方法により免疫応答を調節することができる。ダウンレギュレーションはすでに進行している免疫応答を阻害または遮断する形であってもよいし、または免疫応答の誘導を抑制することを含むこともできる。T細胞応答の抑制、またはT細胞における特定の寛容の誘導、もしくはその両方によって、活性化されたT細胞の機能を阻害することもできる。T細胞応答の免疫抑制は、一般に、T細胞の抑制剤への連続暴露を必要とする積極的、非抗原特異的プロセスである。T細胞における無反応性またはアネルギーの誘導を伴う寛容は、それが通常抗原特異的であり、寛容化剤への暴露停止後にも持続することにおいて免疫抑制と区別できる。操作上、寛容は寛容化剤の不在下での特異的な抗原への再暴露におけるT細胞応答の欠如によって立証することができる。
1以上の抗原機能（それだけに限定されないが、Bリンパ球抗原機能を含む）をダウンレギュレートまたは阻害すること、例えば、活性化されたT細胞によって高レベルリンホカイン合成を阻害することが、組織、皮膚および臓器移植の状況において、および移植片対宿主病（GVHD）において有用であろう。例えば、T細胞機能の遮断によって組織移植における組織破壊の軽減が起こるはずである。一般に、組織移植では移植片の拒絶反応がT細胞によってそれが異質なものとして認識されることによって開始され、その後、移植片を破壊する免疫反応が起こる。IL-21/IL-21Rアンタゴニストを、B7リンパ球抗原と免疫細胞上のその天然リガンドとの相互作用を阻害または遮断する分子と組み合わせて投与すること（B7-2活性を有する可溶性の単量体型ペプチド単独、または別のBリンパ球抗原（例えば、B7-1、B7-3）の活性を有する単量体型ペプチドもしくは遮断抗体との組み合わせなど）によって、移植に先立ち、対応する同時刺激シグナルを伝達することなく、分子と免疫細胞上の天然リガンドとの結合を導くことができる。この状況においてBリンパ球抗原機能を遮断することにより、T細胞などの免疫細胞によるサイトカイン合成を阻止することによって、免疫抑制薬として作用する。さらに、同時刺激の欠如もまたT細胞をアネルギー化するのに十分であり、それによって被験者において寛容を誘導し得る。Bリンパ球抗原遮断試薬によって長期寛容を誘導することにより、これらの遮断試薬を反復投与する必要性を回避し得る。被験者において十分な免疫抑制または寛容を得るためには、Bリンパ球抗原の組み合わせの機能を遮断することも必要であり得る。
特定の遮断試薬の臓器移植による拒絶反応またはGVHDの予防への効果は、動物モデルを用いて評価でき、それらのモデルからヒトでの効果が予測される。使用できる適した系の例としては、ラットの同種心臓移植片およびマウスの異種膵島細胞移植片が挙げられ、これらはいずれも、Lenschow et al., Science 257: 789-792頁（1992）およびTurka et al., Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A., 89: 11102-11105頁（1992）に記載されたように、CTLA4Ig融合タンパク質のin vivoにおける免疫抑制効果を調べるために用いられてきた。さらに、GVHDのネズミモデル（Paul編, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, 846-847頁を参照）を用いてin vivoにおけるBリンパ球抗原機能の遮断によって疾患の進行に及ぼす効果を測定することができる。
また、抗原機能の遮断は自己免疫疾患を治療するためにも治療上有効であり得る。多くの自己免疫疾患は自己組織に対して反応し、疾病の病態に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するT細胞の不適切な活性化によって起こる。自己反応性T細胞の活性化を阻止することによって病徴を軽減またはなくすことができる。IL-21/IL-21Rアンタゴニストを、Bリンパ球抗原の受容体:リガンド相互作用を破壊することによってT細胞の同時刺激を遮断する試薬と組み合わせて投与することによって、T細胞の活性化を阻害するまたは病的過程に関与する可能性のある自己抗体またはT細胞由来のサイトカインの産生を阻止することができる。さらに、遮断試薬と組み合わせたIL-21/IL-21Rアンタゴニストは、自己反応性T細胞の抗原特異的な寛容を誘導することができ、それによって疾病の長期軽減がもたらされ得る。これらの薬剤の自己免疫疾患の予防または軽減への効果は、ヒト自己免疫疾患の十分に解明されている数多くの動物モデルを用いて調べることができる。例としては、ネズミ実験的自己免疫性脳炎、MRL/lpr/lprマウスまたはNZBハイブリッドマウスの全身性紅斑性狼瘡、ネズミ自己免疫性コラーゲン関節炎、NODマウスおよびBBラットの真性糖尿病、ならびにネズミ実験的重症筋無力症が挙げられる（Paul編, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856頁を参照）。
一実施形態では、IL-21/IL-21Rアンタゴニスト、例えば、その医薬組成物、が併用療法で投与される、すなわち、その他の薬剤、例えば、免疫および炎症性疾患などの病理学的状態または疾患を治療するのに有効である治療薬と組み合わせられる。本開示内容において「組み合わせて」とは、薬剤が実質的に同時に、同時にまたは逐次施与されることを意味する。逐次施与する場合、第2の化合物の投与開始時に、2種類の化合物のうちの最初の化合物が治療部位において有効な濃度でまだ検出可能であることが好ましい。
例えば、併用療法には、以下でさらに詳細に述べる1種以上の補助治療薬、例えば、1種以上のサイトカインおよび成長因子阻害剤、免疫抑制薬、抗炎症薬、代謝阻害剤、酵素阻害剤、ならびに/または細胞傷害性薬剤もしくは細胞分裂停止薬と同時製剤および/または同時投与される1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニスト、例えば、IL-21もしくはIL-21受容体に対する抗体またはその抗原結合断片（例えば、キメラ、ヒト化、ヒト、もしくはin vitroで作製した抗体またはその抗原結合断片）、IL-21融合タンパク質、可溶性IL-21受容体、ペプチド阻害剤または小分子阻害剤）を含めることができる。さらに、本明細書に記載された1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニストは、本明細書に記載された2種以上の治療薬と併用してもよい。かかる併用療法は、投与する治療薬をより低用量で用いることで、種々の単剤療法に関連した推定される毒性または合併症を回避することが有利である。さらに、本明細書において開示された治療薬は、IL-21/IL-21R受容体経路とは異なる経路に作用することで、IL-21/IL-21Rアンタゴニストの作用を強化するおよび/またはその佐薬として作用すると思われる。
IL-21/IL-21Rアンタゴニストと併用する好ましい治療薬は、自己免疫反応およびその後の炎症反応を異なる段階で妨害する薬剤である。一実施形態では、本明細書に記載された1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニストは、1種以上の補助薬剤、例えば、その他のサイトカインもしくは成長因子アンタゴニスト（例えば、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合物）; またはその他の標的と結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、その他のサイトカインもしくは成長因子、それらの受容体、またはその他の細胞表面分子と結合する抗体）; および抗炎症性サイトカインまたはそのアゴニストと同時製剤および/または同時投与できる。本明細書に記載されたIL-21/IL-21Rアンタゴニストと併用することができる薬剤の限定するものではない例としては、それだけに限定されないが、インターロイキン（IL）またはそれらの受容体のアンタゴニスト、例えば、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、およびIL-22のアンタゴニスト;サイトカインまたは成長因子もしくはそれらの受容体、例えば、腫瘍壊死因子（TNF）、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGFおよびPDGFのアンタゴニストのうちの1種以上が挙げられる。また、IL-21/IL-21Rアンタゴニストは、例えば、CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80（B7.1）、CD86（B7.2）、CD90、またはCD154（gp39もしくはCD40L）をはじめとするそれらのリガンドなどの細胞表面分子に対する抗体、またはLFA-1/ICAM-1およびVLA-4/VCAM-1の阻害剤と組み合わせることもできる（Yusuf-Makagiansar H. et al.（2002）Med Res Rev 22（2）: 146-67）。本明細書に記載されたIL-21/IL-21Rアンタゴニストと併用することができる好ましいアンタゴニストとしては、IL-1、IL-12、TNFa、IL-15、IL-17、IL-18、およびIL-22のアンタゴニストが挙げられる。
これらの薬剤の例としては、IL-12（好ましくは、ヒトIL-12）と結合するキメラ、ヒト化、ヒトもしくはin vitroで作製した抗体（またはその抗原結合断片）などのIL-12アンタゴニスト、例えば、WO 00/56772に開示された抗体,（Genetics Institute/BASF）; IL-12受容体阻害剤、例えば、ヒトIL-12受容体に対する抗体; およびIL-12受容体、例えば、ヒトIL-12受容体の可溶性断片が挙げられる。IL-15アンタゴニストの例としては、IL-15もしくはその受容体に対する抗体（またはその抗原結合断片）、例えば、ヒトIL-15またはその受容体に対するキメラ、ヒト化、ヒトまたはin vitroで作製した抗体、IL-15受容体の可溶性断片、およびIL-15結合タンパク質が挙げられる。IL-18アンタゴニストの例としては、ヒトIL-18に対する抗体、例えば、キメラ、ヒト化、ヒトもしくはin vitroで作製した抗体（またはその抗原結合断片）、IL-18受容体の可溶性断片、およびIL-18結合タンパク質が挙げられる（IL-18BP, Mallet et al.（2001）Circ. Res. 28頁）。IL-1アンタゴニストの例としては、Vx740などのインターロイキン-1-変換酵素（ICE）阻害剤、IL-1アンタゴニスト、例えば、IL-1RA（ANIKINRA, AMGEN）、sILIRII（Immunex）、および抗IL-1受容体抗体（またはその抗原結合断片）が挙げられる。
TNFアンタゴニストの例としては、TNF（例えば、ヒトTNFa）に対するキメラ、ヒト化、ヒトもしくはin vitroで作製した抗体（またはその抗原結合断片）、例えば、D2E7（ヒトTNFa抗体、米国特許第6,258,562号; BASF）、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356（ヒト化抗TNFa抗体; Celltech/Pharmacia）、cA2（キメラ抗TNFa抗体; Remicade（商標）, Centocor）; 抗TNF抗体断片（例えば、CPD870）; TNF受容体、例えば、p55もしくはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75 kdTNFR-IgG（75kD TNF受容体-IgG融合タンパク質, Enbrel（商標）; Immunex; 例えば、Arthritis & Rheumatism（1994）Vol.37, S295; J. Invest. Med.（1996）Vol.44, 235Aを参照）、p55 kdTNFR-IgG（55kD TNF受容体-IgG融合タンパク質（Lenercept））の可溶性断片; 酵素アンタゴニスト、例えば、TNFa変換酵素（TACE）阻害剤（例えば、α-スルホニルヒドロキサム酸誘導体, WO01/55112、およびN-ヒドロキシホルムアミドTACE阻害剤 GW 3333、-005、または-022）; およびTNF-bp/s-TNFR（可溶性TNF結合タンパク質; 例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S284; Amer. J. Physiol.-Heart and Circulatory Physiology（1995）Vol.268, pp. 37-42を参照）が挙げられる。好ましいTNFアンタゴニストはTNF受容体、例えば、p55もしくはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75 kdTNFR-IgGの可溶性断片、およびTNFa変換酵素（TACE）阻害剤である。
その他の実施形態では、本明細書に記載されたIL-21-/IL21R結合剤は、以下のもの: IL-13アンタゴニスト、例えば、可溶性IL-13受容体（sIL-13）および/もしくはIL-13に対する抗体; IL-2アンタゴニスト、例えば、DAB 486-IL-2および/もしくはDAB 389-IL-2（IL-2融合タンパク質; Seragen; 例えば、Arthritis & Rheumatism（1993）Vol.36, 1223頁を参照）、ならびに/またはIL-2Rに対する抗体、例えば、抗Tac（ヒト化抗IL-2R; Protein Design Labs, Cancer Res. 1990 Mar 1; 50（5）: 1495-502）のうちの1種以上と組み合わせて投与することができる。さらにもう1つの組み合わせとしては、IL-21アンタゴニストと非枯渇性抗CD4阻害剤（IDEC-CE9.1/SB 210396（非枯渇性霊長類化抗CD4抗体; IDEC/SmithKline）との組み合わせが挙げられる。さらに他の好ましい組み合わせとしては、抗体、可溶性受容体またはアンタゴニスト性リガンドをはじめとする同時刺激経路CD80（B7.1）またはCD86（B7.2）のアンタゴニスト; さらにp-セレクチン糖タンパク質リガンド（PSGL）、抗炎症性サイトカイン、例えば、IL-4（DNAX/Schering）; IL-10（SCH 52000; 組み換えIL-10 DNAX/Schering）; IL-13およびTGF、ならびにそのアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）が挙げられる。
その他の実施形態では、1種以上のIL-21-/IL21R結合剤は、1種以上の抗炎症薬、免疫抑制薬、または代謝もしくは酵素阻害剤と同時製剤および/または同時投与することができる。本明細書に記載されたIL-21アンタゴニストと併用することができる薬剤または阻害剤の限定するものではない例としては、それだけに限定されないが、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、例えば、イブプロフェン、テニダップ（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S280）を参照）、ナプロキセン（例えば、Neuro Report（1996）Vol.7, 1209-1213を参照）、メロキシカム、ピロキシカム、ジクロフェナク、およびインドメタシン; サルファサラジン（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）第39巻, No. 9（supplement）, S281を参照）; プレドニゾロンなどのコルチコステロイド; サイトカイン抑制抗炎症薬（CSAID）; ヌクレオチド生合成阻害剤、例えば、プリン生合成阻害剤、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキセート（N-［4-［［（2,4-ジアミノ-6-プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］-L-グルタミン酸）; およびピリミジン生合成阻害剤、例えば、ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ（DHODH）阻害剤（例えば、レフルノミド（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S131; Inflammation Research（1996）Vol.45, 103-107を参照）のうちの1種以上が挙げられる。IL-21/IL-21Rアンタゴニストと併用する好ましい治療薬としては、NSAID、CSAID、（DHODH）阻害剤（例えば、レフルノミド）、および葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキセート）が挙げられる。
さらなる阻害剤の例としては、コルチコステロイド（経口、吸引および局所注入）; 免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）; およびmTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779（Elit. L.（2002）Current Opinion Investig. Drugs 3（8）: 1249-53; Huang, S. et al..（2002）Current Opinion Investing. Drugs 3（2）: 295-304）; TNFaまたはIL-1などの炎症性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する薬剤（例えば、IRAK、NIK、IKK、p38またはMAPキナーゼ阻害剤）; COX2阻害剤、例えば、セレコキシブおよびその変種、MK-966、例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol39, No. 9（supplement）, S81を参照）; ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えば、R973401（IV型ホスホジエステラーゼ阻害剤; 例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S282を参照））; ホスホリパーゼ阻害剤、例えば、細胞質ホスホリパーゼ2（cPLA2）阻害剤（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体（米国特許第6,350,892号））; 血管内皮細胞成長因子または成長因子受容体の阻害剤、例えば、VEGF阻害剤および/またはVEGF-R阻害剤; ならびに血管形成阻害剤のうちの1種以上が挙げられる。IL-21/IL-21Rアンタゴニストと併用する好ましい治療薬免疫抑制薬、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）; およびmTOR阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、CCI-779; COX2阻害剤、例えば、セレコキシブおよびその変異体; ならびにホスホリパーゼ阻害剤、例えば、細胞質ホスホリパーゼ2（cPLA2）阻害剤（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体）。
IL- 21/IL-21Rアンタゴニストと組み合わせることができる治療薬のさらなる例としては、6-メルカプトプリン（6-MP）; アザチオプリン サルファサラジン; メサラジン; オルサラジンクロロキニーネ/ヒドロキシクロロキン; ペンシラミン; 金チオマレート（筋肉内および経口）; アザチオプリン; コヒチン（cochicine）; β-2 アドレナリン作用性受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラル（salmeteral）; キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）; クロモグリケート; ネドクロミル; ケトチフェン; イプラトロピウムおよびオキシトロピウム; ミコフェノレート・モフェチル; アデノシンアゴニスト; 抗血栓薬; 補体阻害剤; ならびにアドレナリン作用薬のうちの1種以上が挙げられる。
本明細書において開示されたIL-21-/IL21R結合剤の特定の免疫疾患を治療または予防するためのその他の治療薬との併用については、以下でさらに詳細に記述する。
IL-21-/IL21R結合剤と組み合わせることができる、関節炎疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎および乾癬性関節炎）を治療または予防するための薬剤の限定するものではない例としては、以下のもの: 本明細書に記載されたIL-12アンタゴニスト、NSAID; CSAID;本明細書に記載されたTNF、例えば、TNFaのアンタゴニスト; 本明細書に記載された非枯渇性抗CD4抗体; 本明細書に記載されたIL-2アンタゴニスト; 抗炎症性サイトカイン、例えば、IL-4、IL-10、IL-13およびTGFa、またはそのアゴニスト; 本明細書に記載されたIL-1またはIL-1受容体アンタゴニスト; 本明細書に記載されたホスホジエステラーゼ阻害剤; 本明細書に記載されたCOX-2阻害剤; Iloprost（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S82を参照）; メトトレキセート; サリドマイド（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S282を参照）およびサリドマイド系薬剤（例えば、Celgen）; レフルノミド; プラスミノーゲン活性化の阻害剤、例えば、トラネキサム酸; 例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S284参照）; サイトカイン阻害剤、例えば、T-614; 例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S282を参照）; プロスタグランジンE1（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S282を参照）; アザチオプリン（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S281を参照）; インターロイキン-1変換酵素（ICE）阻害剤; zap-70および/または1ck阻害剤（チロシンキナーゼzap-70または1ck阻害剤）; 本明細書に記載された血管内皮細胞成長因子または血管内皮細胞成長因子受容体の阻害剤; 本明細書に記載された血管形成阻害剤; コルチコステロイド抗炎症薬（例えば、SB203580）; TNF変換酵素阻害剤; インターロイキン-11（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S296を参照）; インターロイキン-13（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S308を参照）; インターロイキン-17阻害剤（例えば、Arthritis & Rheumatism（1996）Vol.39, No. 9（supplement）, S120を参照）; 金; ペニシラミン; クロロキン; ヒドロキシクロロキン; クロラムブシル; シクロホスファミド; シクロスポリン; 全身リンパ節照射; 抗胸腺細胞グロブリン ; CD5-毒素; 経口ペプチドおよびコラーゲン;ロベンザリット二ナトリウム; サイトカイン制御薬（Cytokine Regulating Agents）（CRA）HP228およびHP466（Houghten Pharmaceuticals, Inc.）; ICAM-1アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.）; 可溶性補体受容体1（TP10; T Cell Sciences, Inc.）; プレドニゾン; オルゴテイン; グリコサミノグリカンポリサルフェート; ミノサイクリン; 抗IL2R抗体; 海洋性および植物性脂質（魚および植物種子の脂肪酸; 例えば、DeLuca et al.（1995）Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777を参照）; オーラノフィン; フェニルブタゾン; メクロフェナム酸; フルフェナム酸; 静脈内免疫グロブリン投与; ジロートン; ミコフェノール酸（RS-61443）; タクロリムス（FK-506）; シロリムス（ラパマイシン）; アミプリロース（セラフェクチン（therafectin））; クラドリビン（クロロデオキシアデノシン）; ならびにアザリビンのうちの1種以上が挙げられる。好ましい組み合わせとしては、1種以上のIL-21アンタゴニストとメトトレキセートまたはレフルノミド、中程度または重度の関節リウマチの場合では、シクロスポリンとの組み合わせが挙げられる。
関節炎疾患を治療するためにUL-21/IL-21Rと併用する阻害剤の好ましい例としては、TNFと結合するTNFアンタゴニスト（例えば、キメラ、ヒト化、ヒトもしくはin vitroで作製した抗体、またはその抗原結合断片）; TNF受容体、例えば、p55もしくはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75 kdTNFR-IgG（75kd D TNF受容体-IgG融合タンパク質, Enbrel（商標））、p55 kD TNF受容体-IgG融合タンパク質; TNF酵素アンタゴニスト、例えば、TNFa変換酵素（TACE）阻害剤）の可溶性断片; IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22のアンタゴニスト;T細胞およびB細胞枯渇剤（例えば、抗CD4または抗CD22抗体）; 小分子阻害剤、例えば、メトトレキセートおよびレフルノミド; シロリムス（ラパマイシン）およびその類似体、例えば、CCI-779; Cox-2およびcPLA2阻害剤; NSAID; p38阻害剤、TPL-2、Mk-2およびNFkb阻害剤; RAGEまたは可溶性RAGE; p-セレクチンまたはPSGL-1阻害剤（例えば、小分子阻害剤、それに対する抗体、例えば、P-セレクチンに対する抗体）; エストロゲン受容体β（ERB）アゴニストまたはERB-NFkbアンタゴニストが挙げられる。1種以上のIL-21/IL-21Rアンタゴニストと同時投与および/または同時製剤することができる最も好ましい補助治療薬としては、TNF受容体、例えば、p55もしくはp75ヒトTNF受容体またはその誘導体、例えば、75 kdTNFR-IgG（75kD TNF受容体-IgG融合タンパク質, Enbrel（商標））の可溶性断片; メトトレキセート、レフルノミド、またはシロリムス（ラパマイシン）またはその類似体、例えば、CCI-779のうちの1種以上が挙げられる。
IL-21-/IL21R結合剤と組み合わせることができる、多発性硬化症を治療または予防するための薬剤の限定するものではない例としては、以下のもの: インターフェロン、例えば、インターフェロン-α（例えば、Avonex（商標）; Biogen）およびインターフェロン-1b（Betaseron（商標）; Chiron/Berlex）; コポリマー1（Cop-1; Copaxone（商標）; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.）; 高圧酸素; 静脈内免疫グロブリン投与; クラブリビン（clabribine）; 本明細書に記載されたTNFアンタゴニスト; コルチコステロイド; プレドニゾロン; メチルプレドニゾロン; アザチオプリン; シクロホスファミド; シクロスポリン; メトトレキセート; 4-アミノピリジン; ならびにチザニジンが挙げられる。IL-21と併用することができるさらなるアンタゴニストとしては、その他のヒトサイトカインまたは成長因子、例えば、TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF、およびPDGFに対する抗体またはそのアンタゴニストが挙げられる。本明細書に記載されたIL-21アンタゴニストは、細胞表面分子、例えば、CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90またはそれらのリガンドに対する抗体と組み合わせることができる。また、IL-21アンタゴニストをメトトレキセート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノレート・モフェチル、レフルノミド、NSAID、例えば、イブプロフェン、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害剤、アドレナリン作用薬、本明細書に記載された炎症性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する薬剤、IL-Ib変換酵素阻害剤（例えば、Vx740）、抗P7、PSGL、TACE阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、例えば、キナーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、サルファサラジン、アザチオプリン（azathoprine）、メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、本明細書に記載された可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体、ならびに抗炎症性サイトカイン（例えば、IL-4、IL-10、IL-13およびTGF）などの薬剤と組み合わせてもよい。
IL- 21アンタゴニストと組み合わせることができる、多発性硬化症の治療薬の好ましい例としては、インターフェロン-b、例えば、IFNb-1aおよびIFNb-1b; コパクソン、コルチコステロイド、IL-I阻害剤、TNF阻害剤、CD40リガンドおよびCD80に対する抗体、IL-12アンタゴニストが挙げられる。
IL-21/IL-21Rアンタゴニストと組み合わせることができる、炎症性腸疾患またはクローン病を治療または予防するための薬剤の限定するものではない例としては、以下のもの:ブデノシド（budenoside）;上皮細胞成長因子; コルチコステロイド;シクロスポリン、サルファサラジン;アミノサリチレート;6-メルカプトプリン;アザチオプリン;メトロニダゾール;リポキシゲナーゼ阻害剤; メサラミン;オルサラジン;バルサラジド; 酸化防止剤;トロンボキサン阻害剤;IL-1受容体アンタゴニスト;抗IL-1モノクローナル抗体;抗IL-6モノクローナル抗体;成長因子;エラスターゼ阻害剤;ピリジニル-イミダゾール化合物;本明細書に記載されたTNFアンタゴニスト;IL-4、IL-10、IL-13および/またはTGFbサイトカインまたはそのアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）; インターロイキン-11; プレドニゾロン、デキサメタゾンまたはブデソニドのグルクロニド-もしくはデキストラン-抱合プロドラッグ; ICAM-1アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.）;可溶性補体受容体1（TP10; T Cell Sciences,Inc.）;持続放出性メサラジン;メトトレキセート;血小板活性化因子（PAF）のアンタゴニスト;シプロフロキサシン;ならびにリグノカインが挙げられる。
一実施形態では、IL-21/IL21Rアンタゴニストを、免疫応答、例えば、移植片拒絶反応または移植片対宿主病の制御に関与するその他の標的に向けられた1種以上の抗体と併用することができる。本発明のIL-21/IL21Rアンタゴニストと組み合わせることができる、免疫応答を治療または予防するための薬剤の限定するものではない例としては、以下のもの:それだけに限定されないが、CD25（インターロイキン-2受容体-a）、CD11a（LFA-1）、CD54（ICAM-1）、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80（B7-1）および/またはCD86（B7-2）をはじめとする細胞表面分子に対する抗体が挙げられる。さらにもう1つの実施形態では、IL-21/IL21Rアンタゴニストを、シクロスポリンAまたはFK506などの1種以上の一般免疫抑制剤と併用する。
本発明のもう1つの態様は、従って、IL-21/IL21Rアンタゴニストのその他の治療用化合物との組み合わせ投与を実施するためのキットに関する。一実施形態では、キットは医薬担体中に製剤された1種以上の結合剤、および少なくとも1つの薬剤、例えば、必要に応じて、1種以上の別個の医薬調製物中に製剤された治療薬を含んでなる。
IL-21/IL21Rアゴニストの免疫賦活剤としての活性を測定するためのアッセイ
IL-21/IL21Rアゴニストの免疫系の賦活剤としての活性は、諸手段のうち、以下の方法によって測定できる:
胸腺細胞または脾細胞の細胞傷害性についての好適なアッセイとしては、それだけに限定されないが、Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience（Chapter3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter7, Immunologic studies in Humans）; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Hermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bowmanet al., J. Virology 61: 1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079-3092, 1994に記載されたものが挙げられる。
T細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプ変換についてのアッセイ（これによって、特に、T細胞依存性抗体応答を調節し、かつTh1/Th2プロファイルに影響を及ぼすタンパク質が同定される）としては、それだけに限定されないが、Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990; およびAssays for B cell function: In vitro antidody production, Mond, J. J. and Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coliganeds. Vol.1 pp.3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994に記載されたものが挙げられる。
混合リンパ球反応（MLR）アッセイ（これによって、特に、主としてTh1およびCTL反応を引き起こすタンパク質が同定される）としては、それだけに限定されないが、Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience（Chapter3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter7, Immunologic studies in Humans）; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992に記載されたものが挙げられる。
樹状細胞依存性アッセイ（これによって、特に、ナイーブなT細胞を活性化する樹状細胞によって発現されるタンパク質が同定される）としては、それだけに限定されないが、Guery et al., J. Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67: 4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264: 961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; およびInaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631-640, 1990に記載されたものが挙げられる。
リンパ球生存/アポトーシスについてのアッセイ（これによって、特に、超抗原誘導後のアポトーシスを阻止するタンパク質およびリンパ球のホメオスタシスを制御するタンパク質が同定される）としては、それだけに限定されないが、Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1: 639-648, 1992に記載されたものが挙げられる。
T細胞系への分化およびその発生の初期段階に影響を及ぼすタンパク質についてのアッセイとしては、それだけに限定されないが、Antica et al., Blood 84: 111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad Sci. U. S. A. 88: 7548-7551, 1991に記載されたものが挙げられる。
IL-21/IL21Rアゴニストまたはアンタゴニストのサイトカイン産生および細胞増殖/分化のモジュレーターとしての活性の測定についてのアッセイ
IL-21/IL21Rアゴニストまたはアンタゴニストのサイトカイン産生および細胞増殖/分化のモジュレーターとしての活性を、32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+（preB M+）、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7eおよびCMKを含むがそれらに限定されない細胞系の、数多くの通常の因子依存性細胞増殖アッセイのいずれか1つによって調べることができる。
T細胞または胸腺細胞増殖についてのアッセイとしては、それだけに限定されないが、Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience（Chapter3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter7, Immunologic studies in Humans）; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994に記載されたものが挙げられる。
脾細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および/または増殖についてのアッセイとしては、それだけに限定されないが、Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. and Shevach, E. M. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol.1 pp.3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; およびMeasurement of mouse and human Interferon. gamma., Schreiber, R. D. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol.1 pp.6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto. 1994に記載されたものが挙げられる。
造血性およびリンパ球産生細胞の増殖および分化についてのアッセイとしては、それだけに限定されないが、Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L. S. and Lipsky, P. E. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol.1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173: 1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336: 690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80 :2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol.1 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83: 1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin11-Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C. and Turner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coliganeds. Vol.1 pp. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9-Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C. and Turner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coliganeds. Vol.1 pp.6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991に記載されたものが挙げられる。
抗原に対するT細胞クローン応答についてのアッセイ（これによって、特に、T細胞の作用を指示するとともに、APC-T細胞相互作用に影響を与えるタンパク質が、増殖およびサイトカイン産生を測定することにより同定される）としては、それだけに限定されないが、Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience（Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Immunologic studies in Humans）; Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77: 6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988に記載されたものが挙げられる。
IL-21/IL21Rアゴニストまたはアンタゴニストの血液生成のレギュレーターとしての活性の測定についてのアッセイ
IL-21/IL21Rアゴニストまたはアンタゴニストは血液生成の制御に、それゆえに骨髄性またはリンパ系細胞の欠損の治療に有用であり得る。コロニー形成細胞または因子依存性の細胞系に加え、周辺生物活性までも血液生成の制御への関与を示し、例えば、単独または他のサイトカインと組み合わせて、赤血球前駆細胞の成長および増殖の支援に関与を示し、それによって、例えば、種々の貧血の治療において、または放射線/化学療法と併用して赤血球前駆体および/または赤血球系細胞の産生を刺激する用途で有用性が示され;例えば、化学療法と併用してその後に起こる骨髄抑制を予防または治療するのに有用である、顆粒球および単球/マクロファージなどの骨髄性細胞の成長および増殖の支援に関与を示し（すなわち、従来のCSF活性）;巨核球、ひいては血小板の増殖を支援し、それによって血小板減少症などの種々の血小板異常の、一般には血小板輸血の代替にまたは相互に用いる予防または治療が可能となり;および/またはありとあらゆる上記の造血性細胞へと成熟することができ、それゆえに種々の幹細胞の異常（それだけに限定されないが、再生不良性貧血および発作性夜間血色素尿症をはじめとする、一般に移植によって治療されるものなど）における治療的有用性が認められる造血幹細胞の増殖の支援に関与を示し、さらに、放射線/化学療法後の幹細胞コンパートメントの、in-vivoまたはex-vivoにおける（すなわち、骨髄移植または末梢前駆細胞移植（同種または異種）と併用して）正常細胞としてまたは遺伝子療法のために遺伝子操作されたものとしての再増殖に関与を示す。
IL-21-またはIL-21R結合剤の活性は、諸手段のうち、以下の方法によって測定し得る:
種々の造血系の増殖および分化についての好適なアッセイは、前述している。
胚幹細胞分化についてのアッセイ（これによって、特に、胚分化造血に影響を及ぼすタンパク質が同定される）としては、それだけに限定されないが、Johansson et al. Cellular Biology 15: 141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13: 473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81: 2903-2915, 1993に記載されたものが挙げられる。
幹細胞生存および分化についてのアッセイ（これによって、特に、リンパ系造血を制御するタンパク質が同定される）としては、それだけに限定されないが、Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M. G. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al.eds. Vol pp. 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, N. Y. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. and Briddell, R. A. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al.eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc., New York, N. Y. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22: 353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R. E. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al.eds Vol pp. 1-21, Wiley-Liss, Inc., New York, N. Y. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Allen, T. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al.eds. Vol pp. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, N. Y. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H. J. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al.eds. Vol pp.139-162, Wiley-Liss, Inc., New York, N. Y. 1994に記載されたものが挙げられる。
次の限定するものではない例により本発明をさらに例示する。
実施例1: ネズミMU-1 cDNAの単離および特性決定
Mu-1受容体のネズミホモログの部分断片を、ヒト配列由来のオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって単離した。17日齢ネズミ胸腺からおよびネズミ2D6 T細胞系より単離したRNAからcDNAを調製した。以下の、図1のヒトcDNA配列の領域584〜603および876〜896各々に相当するオリゴヌクレオチド:
AGCATCAAG CCGGCTCCCCC（5p）（配列番号11）
CTCCATTCAC TCCAGGTCCC（3p）（配列番号12）
を用いたPCRによって、cDNAから約300ヌクレオチドのDNA断片を増幅した（配列番号1に相当）。増幅は、Taqポリメラーゼを用いて、1.5mMの塩化マグネシウムを含有する1X Taqバッファー中、94℃ で1分間、50℃で 1分間、および72℃で 1分間にて30サイクル実施した。この断片のDNA配列を決定し、この断片内部分から以下の配列:
TTGAACGTGACTGRGGCCTT（5P）（配列番号13）
TGAATGAAGTGCCTGGCTGA（3P）（配列番号14）
を有する2種類のオリゴヌクレオチドを導いた。
オリゴヌクレオチドを用いて、最初のPCR産物の内部262ヌクレオチド断片（図1のネズミcDNA配列のヌクレオチド781〜1043、および配列番号9に相当）を増幅し、2D6 T細胞系から単離したcDNAライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。フィルターを標準5X SSC ハイブリダイゼーション条件を用いて65℃でハイブリダイズし、65℃でSSC内に洗い流した。20クローンが426,000クローンのスクリーンでプローブとハイブリダイズした。2つの独立したクローンからDNA配列を決定した。クローン #6の全長配列は、ヒトMU-1の全長ネズミホモログ（配列番号9）であると確認された。
ネズミMU-1の全長ヌクレオチド配列を図1に示す（配列番号9に相当）。このヌクレオチド配列は、ヌクレオチド407〜464に推定リーダー配列、407〜1993にコード配列、およびヌクレオチド1994〜1997に終止コドンを有している。ヌクレオチド1〜406は5'非翻訳領域に相当し、ヌクレオチド1998〜2868は3'非翻訳領域に相当する。
ネズミMU-1の推定タンパク質配列を図2に示す（配列番号10に相当）。このネズミMU-1タンパク質は、SPScan（スコア=10.1）によって決定された推定リーダー配列（配列番号10のアミノ酸1〜19に相当）、および推定膜貫通ドメイン（配列番号10のアミノ酸237〜253に相当）を含んでいる。推定シグナル伝達モチーフとしては、以下の領域: ボックス1: 配列番号10のアミノ酸265〜274、ボックス2: 配列番号10のアミノ酸310〜324、配列番号10の281、319、361、297、および510位の6個のチロシン残基が挙げられる。推定STATドッキング部位としては、STAT5、EDDGYPA（配列番号20）、STAT3、YLQRが挙げられる。
オリゴヌクレオチドを用いて、最初のPCR産物の内部262ヌクレオチド断片（図1のネズミcDNA配列のヌクレオチド781〜1043、および配列番号9に相当）を増幅し、2D6T T細胞系から単離したcDNAライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。フィルターを標準5X SSC ハイブリダイゼーション条件を用いて65℃でハイブリダイズし、65℃でSSC内に洗い流した。20クローンを426,000クローンのスクリーンでプローブとハイブリダイズさせ、単離した。2つの独立したクローンからDNA配列を決定した。クローン #6の全長配列は、ヒトMU-1の全長ネズミホモログ（配列番号9）であると確認された。
ネズミMU-1の全長ヌクレオチド配列を図1に示す（配列番号9に相当）。このヌクレオチド配列は、ヌクレオチド407〜464に推定リーダー配列、407〜1993にコード配列、ヌクレオチド1994〜1997に終止コドンを有している。ヌクレオチド1〜406は5'非翻訳領域に相当し、ヌクレオチド1998〜2628は3'非翻訳領域に相当する。
ネズミMU-1の推定タンパク質配列を図2に示す（配列番号10に相当）。このネズミMU-1タンパク質は、SPScan（スコア=10.1）によって決定された推定リーダー配列（配列番号10のアミノ酸1〜19に相当）、および推定膜貫通ドメイン（配列番号10のアミノ酸237〜253に相当）を含んでいる。推定シグナル伝達モチーフとしては、以下の領域: ボックス1: 配列番号10のアミノ酸265〜274、ボックス2: 配列番号10のアミノ酸310〜324、配列番号10の281、319、361、368、397、および510位の6個のチロシン残基が挙げられる。推定STATドッキング部位としては、STAT5: EDDGYPA（配列番号20）; STAT3: YLQRが挙げられる。
実施例2: ヒトおよびネズミのMU-1の比較
ギャップアルゴリズムを用いてヒトおよびネズミのMU-1アミノ酸を比較した。ネズミおよびヒト推定タンパク質配列の比較を図4に示す。アミノ酸は、ギャップアルゴリズムにより65.267%同一であった。BLOSUM62 アミノ酸置換マトリックスによりアラインメントを得た（Henikoff, S. and Henikoff, J. G.（1992））。タンパク質ブロックのアミノ酸置換マトリックス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）。ギャップパラメーター=ギャップ加重:8、平均マッチ=2.912、長さ加重=2、平均ミスマッチ=-2.003。類似性パーセント=69.466%。
ヒトおよびネズミcDNAヌクレオチド配列の比較を図3に示す。DNA配列は、ギャップアルゴリズムを用いてアラインメントした場合、66.116%同一である。ギャップパラメーター=ギャップ加重=50、平均マッチ10.000、長さ加重=3、平均ミスマッチ=0.000。類似性パーセント=66.198%。
ヒトおよびマウスのMU-1タンパク質はいずれも1型サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ネズミおよびヒトのMU-1双方の配列の評価により、推定ボックス-iおよびボックス-2シグナル伝達モチーフの存在が示される。6個のチロシン残基は細胞質ドメインに存在し、MU-1のシグナル伝達機能においても重要である可能性がある。MU-1の配列とそのファミリーのその他のメンバーとの比較により、STAT 5およびSTAT 3のドッキング部位が存在する可能性が示された。
実施例3: ヒトMU-1が利用するSTATシグナル伝達経路の決定
BAF-3細胞を、ヒトEPO受容体の細胞外ドメインおよびMU-1受容体の細胞内ドメインからなるキメラサイトカイン受容体を発現するよう操作した。huEPORJMU-l（cyto）キメラ受容体を発現したBAF-3細胞は、ヒト可溶性EPOに応答して増殖した。これらの細胞を解析してEPOシグナル伝達を受けてどちらのSTAT分子がリン酸化されるかを決定した。簡便に、対照未改変親BAF-3細胞およびEPOR/MUキメラBAF-3細胞をIL-3含有増殖培地から休ませ、IL-3またはEPOのいずれかによって0、15、30および60分間再刺激した。細胞をペレット化し、オルトバナデートを含有する氷冷溶解バッファーに再懸濁して、リン酸化チロシンを保護した。同量の細胞溶解物をSDS-PAGEにより電気泳動し、ウエスタン解析のためにニトロセルロース膜にブロットした。複製したブロットをリン酸化および非リン酸化型のSTAT 1、3、5、および6について、各形態のSTAT分子に特異的な抗体を用いることにより染色した。非活性化HELA細胞およびα-インターフェロンにより活性化されたHELA細胞を正の対照として用いた。
これらの特定条件下では、MU-1を介したシグナル伝達によって試験したすべての時点（T=0、T=15'、T=30'、1=60'）においてSTAT 5のリン酸化が引き起こされることをこれらの結果が示した。対照またはキメラBAF-3細胞のIL-3処理では、STAT 3のリン酸化は起こったが、STAT 1または5では起こらなかった。
実施例4: ネズミおよびヒトMU-1の組織発現
ノーザン解析
種々の組織由来のポリA+RNAのノーザンブロット（Clonetech, Palo Alto, CA）を製造業者の推奨される通りに実施した。ネズミのブロットでは、ハイブリダイゼーションに図1のヌクレオチド781〜1043および配列番号9に相当する262ヌクレオチド断片を用いた。
成体ネズミ脾臓、肺、および心臓組織でネズミMU-1の単一の転写物が検出された。ヒト組織で見られた多数の転写物はマウス組織では見られなかった。
成人ヒトリンパ系組織、PBL、胸腺、脾臓およびリンパ節、ならびに胎児肺でヒトMU-1の2つの転写物が検出された。
In Situ ハイブリダイゼーション
In situ ハイブリダイゼーション研究をPhylogency Inc. of Columbus, OH（Lyons et al., 1990, J. Cell. Biol: 111:2427-2436の方法に従う）によって実施した。簡単に説明すると、連続した5〜7ミクロンのパラフィン切片を脱パラフィンし、固定し、プロテイナーゼKで消化し、トリエタノールアミンで処理し、脱水させた。直線状cDNA鋳型からcRNAを調製し、アンチセンスおよびセンスプローブを作製した。製造業者の条件（Ambion）に従ってcRNA転写物を合成し、35S-UTPで標識した。切片を一晩ハイブリダイズし、ストリンジェントに洗浄し、RNAアーゼAで処理し、核軌道乳剤に浸け、2〜3週間露光した。この手法のバックグラウンドレベルを示すために、対照切片をセンスプローブとハイブリダイズした。ネズミプローブはヌクレオチド860〜1064（配列番号9）に相当する186bp断片からなるものであった。ヒトプローブはヒトMU-1 DNAから作製した23bpのPCR産物であった。
ネズミMU-1発現は成体小腸のリンパ節胚中心および外側の筋層で見られた。また、分化したリンパ節およびパイアー斑もネズミMU-1発現を示した。
ヒトMU-1発現は皮質のリンパ小節胚中心で検出された。マクロファージを含有する髄質はヒトMU-1に対して陰性であった。ヒト脾臓では、ヒトMU-1発現が赤脾髄ではなく白脾髄部分で検出された。
実施例5: 細胞および細胞系でのヒトMU-1の発現
RNアーゼプロテクション解析を、休止状態および活性化状態のヒトT細胞およびB細胞系、RajiおよびRPMI 8866、ならびにI細胞系Jurkatで実施した。ヒトT細胞は、抗CD3および抗CD28を用いて活性化した。細胞系は、ホルボールエステルおよびイオノマイシンを用いて活性化した。MU-1リボプローブ作製プラスミドは、23bp PCR産物（PCRは5'プライマー
CACAAAGCTTCAGTATGAGCTGCAGTACAGGAACCGGGGA（配列番号15）および3'プライマー
CACAGGATCCCTTTAACTCCTCTGACTGGGTCTGAAAGAT（配列番号16）
を用いて実施した）をpGEM3zf（-）（Promega, Madison, WI）ベクターのBamHIおよびHindIII部位に挿入することによって構築した。リボプローブを作製するため、リボプローブ作製プラスミドをHindIIIで直線状にした。得られたDNAをフェノール/クロロホルム抽出し、エタノールで沈殿させた。製造供給元によって推奨されているプロトコールに従って、T7 RNAポリメラーゼを用いてリボプローブを作製した（PharMingen, San Diego, CA）。RNアーゼプロテクションアッセイをPharMingen社のRiboQuant Multi-Probe Ribonuclease Protection Assay systemを用いて実施した。2.0ugの全RNAを各RPA反応に加え、RNアーゼ消化後、プロテクトされたリボプローブをQuickPoint 高速核酸分離システム（Novex, San Diego, CA）にかけた。ゲルを乾燥させ、製造供給元の推奨に従って露光した。
ヒトMU-1 RNAは非刺激集団に比べて、抗CD3+抗CD28を用いて刺激したヒト精製CD3+細胞ではアップレギュレートされる。また、MU-1はTh1およびTh2非対称T細胞集団における再刺激によってもアップレギュレートされる。B細胞系、RPMI8866およびRajiはMU-1を構成的に発現するが、Jurkat T細胞系は構成的に発現しない。
実施例6: ヒトMU-1と既知のサイトカインとの結合
MU-1のリガンドを同定するために、ヒトおよびネズミ両方のIg融合タンパク質を構築し、Biacore社のチップに固定した。種々の細胞培養コンディション培地、ならびに既知のサイトカインのパネルをMU-1との結合について評価した。また、数種類のサイトカインをそのファミリーのその他の受容体鎖と組み合わせて試験して、MU-1がリガンド結合に第2の受容体鎖を必要とする可能性を検討した。以下のサイトカイン: mIL-2、hIL-2、hIL-i5、mIL-7、TSLP、TSLP+IL7、TSLP+IL7R、TSLP+IL7g、TSLP+IL-2、TSLP+1L2+IL2Rβ、IL2Rβ、lL2Rγ、IL7R、lL2+2Rβ、lL2+2Rγ、ILl 5+IL2Rβ、lL15+2Rγ、lL7+2Rγ、IL2+IL7R、IL15+IL7R、IL7+IL7Rを試験し、これらがMU-1結合について陰性であることが判明した。既知の受容体を同様に固定し、MUFc結合について試験すると、結果は陰性であった。IL-ISはIL2Rbとは結合するが、IL2RgまたはMUFcとは結合しない。
実施例7: コラーゲン誘導関節炎（CIA）マウスの症状の重症度に及ぼすIL-21/IL-21R経路調節の効果
本実施例は、IL-21Rアンタゴニスト、例えば、IL-21R-Ig融合タンパク質（ネズミIL21RFcタンパク質または「muIL21RFc」）または抗IL21R抗体によってコラーゲン誘導関節炎（CIA）ネズミモデルの症状が寛解されることを示している。これに対して、IL-21の投与はCIAマウスの関節炎の症状を悪化させる。
全ての試験に、雄DBA/1（Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine）マウスを用いた。ウシII型コラーゲン（Chondrex, Redmond, WA）を用いて関節炎を誘発させた。ウシII型コラーゲン（Chondrex, Redmond, WA）を0.1M酢酸に溶解し、1mg/mlのマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（H37RA株）を含有する同量のCFA（Sigma）に乳化した。0日目に100μgのウシコラーゲンを尾下部に皮下注射した。21日目にマウスに同量のフロイント不完全アジュバント（Sigma）と混合した0.1M酢酸中100μgのウシコラーゲンを含有する溶液を尾下部に皮下注射した。未処置の動物にコラーゲンを含まない同一セットの注射を受けさせた。投与プロトコールは図16に図示する。MuIL21RFcを予防的にまたは治療的にDBAマウスに投与した。治療計画では、マウスにて2日間連続して疾患が観察された場合に治療を開始した。
疾患の進行については、週に少なくとも3回、マウスをモニターした。指標: 0= 正常、腫れなし; 1= 1〜2本の指の腫れを伴う肉眼で見える紅斑、または足関節の軽度の腫れ; 2= 軽度〜中程度の足の腫れおよび/または2本の指の腫れを特徴とする顕著な紅斑; 3= 足全体の、すなわち、足関節または手関節に及ぶ広範囲な腫れ; 4= 腫れの消散、足の硬直; 四肢使用困難または関節の硬直、を基にそれぞれの肢に臨床スコアを付けた。従って、所与のマウスの四肢全てのスコアの合計は、最大全身スコア16であった。
疾患の種々の段階で、動物を安楽死させ、組織を回収し、足を組織学用に10%ホルマリン、または4%パラホルムアルデヒド、pH 7.47で固定し、20%EDTA（pH8.0）で脱灰し、in situ ハイブリダイゼーション用にパラフィン包埋した。光学顕微鏡使用により足を5等級スコアリング法（0〜4）にて採点して、関節炎の強さおよび程度を特徴付けた。炎症性浸潤を、パンヌス形成、滑膜の繊維化、関節軟骨の侵食および/または軟骨下骨の破壊などの炎症に関連するその他の変化とともにスコアリングに使用した。それぞれの足に関する所見により、組織学的等級を判定した: NAD= 0または異常は発見されず; 1= 軽微〜中程度; 2: 軽度〜中程度; 3: 著しい; 4: 重度。
コラーゲンブースト1日前から1日おきに、muIL21RFc（100μgまたは200μg）を腹腔内（ip）投与して、CIAマウスを予防的処置した後、症状の重症度の低下を観察した（データ示さず）。
muIL21RFc（200μg/マウス 3x/週）の半治療的CIAマウスに及ぼす効果を、処置後の日数の関数として図17に示す。マウスIg（200μg/マウス 3x/週）を対照として用いた。重症度スコアの低下は、処置後7日から観察される。
IL-21の投与はCIAマウスの関節炎症状を悪化させる。図18は、平均CIAスコアをコラーゲンブースト後の日数の関数として示すグラフである。1mgのネズミIL-21を腹腔内（ip）投与したマウスはPBS処置した対照マウスより高いCIAスコアを示した。
これらの試験は、IL-21Rアンタゴニスト、例えば、IL-21R-Fc融合タンパク質のCIAマウスへの投与によって関節炎の症状が予防的または半治療的にかなり寛解したことを例示している。これに対して、IL-21の投与は症状を悪化させる。
実施例8: IL-21R転写物のin situ ハイブリダイゼーション
CIAを有するマウスの関節炎の足におけるIL-21R mRNAの発現を調べた。アンチセンスネズミIL-21Rリボプローブを用い（図19、パネルA）; センスプローブを負の対照として用いた（図19、パネルB）。
DIG RNA標識ミックス（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を製造業者によって記載された通りに用いてジゴキシゲニン標識したプローブを調製した。IL-21受容体mRNAの発現はマクロファージ、好中球、繊維芽細胞、リンパ球の亜集団、滑膜細胞および表皮で検出された（図19、パネルA）。対照の足では、またはセンスプローブを用いた場合には染色の減弱が見られた（図19、パネルB）。mIL-21R mRNA陽性細胞は: 好中球（N）、およびマクロファージ（M）であった。in situ ハイブリダイゼーションでは関節炎マウスの足においてIL-21Rの発現の増強が示されている。
実施例9: 強い抗腫瘍応答をもたらすIL-21受容体のin vivo活性化
本実施例は、IL-21を発現する腫瘍細胞の投与が免疫原性および非免疫原性腫瘍モデル両方のin vivoにおける抗腫瘍応答を強化することを示している。CD8+T細胞およびNK細胞は、腫瘍破壊およびその後の腫瘍抗原特異的T細胞の発達に必要である。腫瘍微小環境に存在するIL-21が、自然免疫および適応免疫いずれものin vivo 抗腫瘍応答を増強する。
試験手順
マウス C57BL/6バックグラウンドの雌C57BL/6、Balb/C、IFNγ-/-およびIL-10-/-マウスはJackson Laboratories（Bar Harbor, ME.）から購入した。C57BL/6 scidマウスおよびヌードマウスはTaconic（Germantown, NY）から購入した。IL-21R-/-マウスはWyeth Research, MA.にて作製し、Charles Rivers Laboratories（Andover, MA）（Kasaian, M. T. et al.（2002）Immunity. 16: 559-569）にて維持管理した。マウスは国立衛生研究所（National Institutes of Health）および米国実験動物協会（American Association of Laboratory Animal Care）の規制に従って維持管理し、処置した。
腫瘍細胞系および試薬 本明細書において記載する試験では、2種類の腫瘍細胞系、B16F1黒色腫およびMethA繊維肉腫を用いた。B16F1黒色腫およびMethA繊維肉腫細胞は、種々のサイトカインのin vivoにおける抗腫瘍作用を調べるために、腫瘍ワクチン接種モデルで広く用いられている。B16F1腫瘍細胞は免疫抗原性が低く、これまでの、照射を受けた野生型腫瘍細胞のワクチン接種ではその後の生存B16F1抗原投与に対し、ワクチン接種を受けたマウスの20%しか防御されない（Dranoff, G. et al.（1993）PNAS 90: 3539-3543）。これに対して、MethA、メチルコランテレン（methylcholantheren）誘発性繊維肉腫は免疫原性が高い（すなわち、照射を受けたMethA細胞のワクチン接種によってその後の生存MethA抗原投与に対し、およそ100%の防御がもたらされる）。
B16F1黒色腫細胞は10%熱失活ウシ胎児血清、2%グルタミン、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM培地での培養によって維持した。MethA繊維肉腫細胞はBalb/Cマウスでの腹腔内接種により維持した。B16F1黒色腫特異的TRP-2（SVYDFFVWL、配列番号）（van Elsas, A. et al.（2001）Journal of Experimental Medicine 194: 481-489; Sutmuller, R. P. et al.（2001）Journal of Experimental Medicine. 194: 823-832）および対照ペプチドOVA257-264（SIINFEKL、配列番号）はWyeth Research, MAにて合成した。本書で用いるモノクローナル抗体抗CD3、抗CD28およびラットIgG2a、ならびにIL-2サイトカインはすべてPharMingen（San Diego, CA）から購入した。
IL-21および緑色蛍光タンパク質（GFP）発現腫瘍細胞の作製 B16F1およびMethA腫瘍細胞を、IL-21およびGFP、またはGFPのみを発現するよう操作した。mIL21-IRES-GFPまたはIRES-GFPをコードするレトロウイルスベクターをGFP-RVベクターを用いて構築した（Ranganath, S. et al.（1998）Journal of Immunology 161: 3822-3826）。293-VSVgエコトロピックパッケージング細胞系をトランスフェクトすることにより、高力価のレトロウイルスを得た（Ory, D. S. et al.（1996）PNAS 93: 11400-11406）。スピン感染を1800rpmで、室温にて40分間実施した。細胞を3回感染させた。GFPを発現する腫瘍細胞をフローソーティングにより濃縮すると、GFP発現細胞の純度は90%より高かった。
in vivo 腫瘍研究 C57BL/6マウスの背部の毛を剃り、105個のB16F1-IL-21または対照B16F1-GFPをi. d.注入した。Balb/Cマウスに106個もしくは2x106個のMethA-IL-21細胞または対照MethA-GFP細胞のいずれかを注入した。腫瘍増殖はカリパスで垂直径を測定することによりモニターした。腫瘍が重度の潰瘍形成を示すかまたはその大きさが200mm2に達した時にマウスを犠牲にした。一般に、各試験では各群10個体のマウスを用い、2回以上繰り返して同様の結果を得た試験の代表的な結果を示す。
in vivo 枯渇研究 CD4+またはCD8+T細胞枯渇は、腫瘍細胞注入前3日間連続して各マウスに400gの抗CD4（GK1.5）、抗CD8（53-6.7）mAbまたはラットIgGアイソタイプ対照のいずれかをi. p.注入することによって行った。12日間腫瘍細胞を注入した後、Ab注入を1日おきに続けた。NK細胞枯渇では、腫瘍細胞注入1日前に50μlのウサギ抗マウス/ラットアシアロGM1ポリクローナル抗体（Cedarlane, Ontario, CA）をi. p.注入した。同様に正常ウサギ血清を注射したマウスを対照に用いた。腫瘍細胞接種後、抗体注入を2週間、週2回続けた。T細胞およびNK細胞枯渇は、腫瘍抗原投与1日前（T細胞の場合）または腫瘍細胞抗原投与当日（NK細胞の場合）に、関連した抗体を用いるフローサイトメトリーによりリンパ節および脾臓で確認された。FACS解析では、抗CD4、抗CD8、抗アシアロGM1で処置したマウスにおいてT細胞またはNK細胞関連集団が99%を超えて枯渇したことが分かった。これに対して、アイソタイプ対照で処置したマウスは、未処置マウスのプロファイルと類似のTリンパ球プロファイルを示した。
IL-21酵素免疫測定法（ELISA）106個のB16F1-IL-21、B16F1-GFP、MethA-IL-21およびMethA-GFP腫瘍細胞の一晩培養した上清を、Dunussi-Joannopoulos, K. et al.（1998）Blood 91: 222-230で詳述されたようにELISAによってIL-21レベルについてアッセイした。簡便に、mMul-mutm IgG2a（Wyeth Research,MA.）をコーティング抗体として用い、抗マウスIL-21（R & D systems, Minneapolis, MN.）を捕捉Abとして用いた。精製mIL-21（Wyeth Research, MA）（上記のKasaian, M. T. et al.（2002））を対照として用いた。
Taqmanによって検出されるIL-21R mRNA発現 製造業者の取扱説明書（Promega, Madison, WI）に従って種々の腫瘍細胞系からRNAを単離した。プレート結合型抗CD3（1μg/ml）および抗CD28（1μg/ml）mAb（BD PharMingen）により24時間活性化した脾細胞から抽出したmRNAを正の対照として用いた。精製したRNAをDNアーゼ（Ambion Inc, Austin, Tx）で処理し、定量的TaqManポリメラーゼ鎖反応（PCR）解析によるmRNA解析の前に濃度を50ng/μlに調整した。IL-21Rおよびシクロフィリン特異的プライマー対ならびにプローブはPrimerExpress ソフトウェアを用いて設計し、Wyeth Researchにて作製した（プライマー: 5'-GCCTTCTCAGGACGCTATGAT-3'（配列番号40）および5'-CCCTACAGCACGTAGTTGGA-3'（配列番号41）ならびにプローブ TCCTGGGACTCAGCTTATGACGAACC）（配列番号42）。既知のIL-21R発現細胞由来のRNAについて各遺伝子の標準曲線を作成した。対照および変換細胞系のmRNA発現を各細胞系のシクロフィリン発現に基づいて標準化し、これらの結果をmRNAの相対単位（R. U.）として示している。
増殖アッセイ C57BL/6マウスまたはBalb/Cマウスのいずれか由来の脾細胞（2x105個細胞/ウェル）を、96ウェルプレートで、GFPまたはIL-21のいずれかを発現した種々の濃度の照射を受けた同系腫瘍細胞を用いて刺激した。培養中最後の6時間、3Hチミジンを1Ci/ウェル（PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA）にて添加した。上清をガラス繊維フィルターマットに回収した後、 3H-チミジン取り込みを液体シンチレーション計数法によって測定した。
Elispot アッセイ IFN-γ Elispot キット（R & D systems）により製造業者の取扱説明書に従ってTRP-2特異的T細胞応答を調べた。簡単に説明すると、5μg/mlの特異的TRP-2ペプチド（van Elsas, A.（2001）J. Exp. Med. 194: 481-489）または非特異的OVAペプチドおよび20U/ml ネズミIL-2（PharMingen）を含有する200μl完全培地中の2x105〜4x105個の脾細胞（腫瘍を注入したマウス由来のもの）を各ウェルに入れた。プレートをCO2インキュベーター中、37℃で24時間インキュベートした。次いで、プレートを4℃にて一晩インキュベートし、Abの検出、次に、ストレプトアビジン-アルカリ性ホスファターゼ複合体とともに2時間のインキュベーションを行った。5-ブロモ-4クロロ-3'インドリルリン酸 p-トルイジン塩/塩化ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT）アルカリ性ホスファターゼ基質（R & D systems）を用いてスポットを可視化した。プレートを水道水で洗浄し、風乾し、立体顕微鏡を使用してスポットを計数し、バックグラウンドスポットを減じて106個細胞当たりに換算した。通常、OVAペプチドを抗原として用いた場合には、10スポット未満/ウェルが検出された。
腫瘍細胞を接種したマウス由来の脾細胞のin vitroにおける再刺激 腫瘍ペプチド特異的T細胞系を、Bloom, M. B. et al.（1997）J. Exp.Med. 185: 453-459に記載されたように作製した。簡単に説明すると、マウスにB16F1-GFP細胞またはB16F1-IL-21細胞のいずれかを接種した。8〜11日後、脾細胞を回収し、5μg/mlのTRP-2ペプチド（上記のvan Elsas, A et al.（2001））とともに培養した。培養第3日目に、20U/mlのIL-2（BD PharMingen）を各培養物に添加した。5日後、51Cr放出アッセイに細胞を用いた。
CTLアッセイ 4時間の51Cr放出アッセイにより標的に対する細胞傷害性を定量した。簡単に説明すると、RMA-S細胞をTRP-2ペプチド10μg/mlにてパルスし、Na2 51CrO4（PerkinElmer Life Sciences）を用いて37℃で1時間標識した。洗浄後、96-丸底プレートで51Cr標識した標的細胞をこれまでに記載した腫瘍細胞を注入したC57BL/6マウスから作製したT細胞系とともに、異なるE:T比でインキュベートした。37℃で4時間のインキュベーション後、上清を集め、シンチレーションカウンター（Wallac, Turku, Finland）で放射能を検出した。固有の溶解率を、100x［（CTLによる放出-自然な放出）/（最大放出-自然な放出）］として算出した。最大放出は1%TritonX-100の添加により測定した。CTLの不在下での自然な放出は、通常、最大放出の15%未満であった。
IL-21変換したB16F1細胞およびMethA細胞は生物学的機能を有するIL-21を分泌する
B16F1およびMethA腫瘍細胞を、GFPさらにIL-21（B16F1/MethA-IL21）またはGFP（B16F1/MethA-GFP）各々を発現するよう変換させた。106個のB16F1-IL-21、B16F1-GFP、MethA-IL-21またはMethA-GFP腫瘍細胞の一晩培養した上清を上記の試験プロトコールで記載したようにELISAによってアッセイした。図20Aで示すように、一晩の培養により、B16F1-GFPまたはMethA-GFP腫瘍細胞ではなく、B16F1-IL-21およびMethA-IL-21細胞が相当量のIL-21を分泌した。変換細胞によって分泌されたIL-21サイトカインが生物学的機能を有しているかどうかを調べるために、照射を受けたIL-21またはGFP発現腫瘍細胞を用いて、最適下限量の抗CD3（500ng/ml）および抗CD28（10μg/ml）の存在下で、C56BL/6マウスまたはBalb/Cマウス由来のナイーブな同系脾細胞を刺激した。図20Bおよび20Cで示すように、試験したすべての濃度において対照GFP発現細胞と比較して、B16F1-IL-21およびMethA-IL-21細胞は、ナイーブな脾細胞の増殖を促進した。これらの結果は、変換腫瘍細胞によって分泌されたIL-21が生物学的機能を有することを示唆している。
IL-21はin vitroにおいて腫瘍細胞増殖には作用しない
IL-21が、変換されたB16F1細胞およびMethA細胞のin vitroにおける増殖特性に及ぼす影響を調べた。B16F1-IL-21およびB16F1-GFPまたはMethA-IL-21およびMethA-GFP腫瘍細胞を12ウェルプレートにおいて105個/l.5ml培地の濃度にて培養した。トリパンブルー排除法により、毎日、細胞数をモニターした。これらの結果は2連の平均として示している。抗CD3および抗CD28mAbにより活性化したC57BL/6脾細胞由来のRNAを正の対照として用いた。同数の腫瘍細胞を12ウェルプレートで培養し、種々の時点にて生存細胞数を測定した。図21Aおよび21Bで示すように、IL-21産生腫瘍細胞の増殖動態は5日間のGFP発現対照腫瘍細胞のものと非常に類似していた。これは、IL-21には変換された腫瘍細胞のin vitroにおける増殖特性に及ぼす明確な作用がないことを示している。腫瘍細胞のIL-21に対する不応答は、定量的Taqman PCR解析において腫瘍細胞によるIL-21R発現がなかったことからもさらに確認された。図21Cは、Taqman PCRによって測定した腫瘍細胞から抽出されたシクロフィリンおよび変換されたIL-21R mRNAの量を示す棒グラフである。トランスフェクト細胞におけるIL-21R mRNAの発現をシクロフィリンの値に対して標準化し、相対単位（R. U.）として示した。抗CD3および抗CD28mAbを用いて活性化したC57BL/6脾細胞由来のRNAを正の対照として用いた。
IL-21はin vivoにおいて腫瘍増殖を抑制する
IL-21が腫瘍増殖に及ぼすin vivoにおける影響を評価するために、B16F1-IL-21またはMethA-IL-21腫瘍細胞を同系マウスの脇腹に皮内接種した。図22Aで示すように、腫瘍注入後27週間が経過しても、B16F1-IL-21腫瘍細胞を接種したいずれのC57BL/6マウスにおいても腫瘍形成は検出されなかった。これに対して、B16F1-GFP細胞を有するすべてのC57BL/6マウスでは、早くも9日で腫瘍が増殖し始めた。対照腫瘍は急速に大きくなり、腫瘍細胞接種後2〜3週間で全身腫瘍組織量が多いことからこれらのマウスを屠殺しなければならなかった。MethAモデルでは、Balb/Cマウスで、MethA-IL-21またはMethA-GFP細胞のいずれかの腫瘍接種後1週間で小さいが目に見える腫瘍塊が検出された（図22B）。しかしながら、MethA-IL-21腫瘍は2週目（11日）から次第に大きさが縮小し、最終的には100%のマウスで完全に退縮したが、対照MethA-GFP腫瘍の80%ではマウスを屠殺するまで大きくなり続けた。これらの結果は、腫瘍微小環境でのIL-21の存在が免疫原性腫瘍および非免疫原性腫瘍両方の拒絶反応を引き起こす強い免疫応答の誘因となっていることを示している。
IL-21はscidマウスおよびヌードマウスにおける腫瘍増殖を阻止し得ない
IL-21-変換された腫瘍細胞の拒絶反応における細胞性および体液性免疫応答の関連した役割を調べるために、同数（105個）のB16F1-IL-21細胞または対照B16F1-GFP細胞をT細胞およびB細胞欠損（scid）マウスに注入した。scidマウスではB16F1-IL-21細胞およびB16F1-GFP細胞はいずれも同様の増殖動態を示し（図23A）、リンパ球（B細胞および/またはT細胞）がIL-21媒介性腫瘍拒絶に必要とされることがわかった。また、C57BL/6ヌード/ヌードマウスについての試験ではT細胞の役割も確認された。図23Bで示すように、B16F1- IL-21細胞を接種したすべてのヌードマウスは、ゆっくりとした増殖動態ではあるが腫瘍を発現した。総合すれば、これらの結果から、IL-21媒介性抗腫瘍応答が適応免疫の関与を必要とすることがわかる。
IL-21媒介性腫瘍拒絶にはCD4+T細胞ではなく、CD8+T細胞が必要とされる
どのT細胞サブセットがIL-21によって誘導される作用に重要であるかをさらに細かく調べるために、抗CD4または抗CD8 mAbを投与することによってリンパ球亜集団のin vivo枯渇を行った。図25Aで示すように、B16F1-IL-21腫瘍はCD4+T細胞枯渇マウスおよび対照ラットIgG処理マウスでは増殖しなかった。しかしながら、10個体のCD8+T細胞枯渇マウスのうち7個体で目に見える腫瘍が生じ、IL-21誘導性抗腫瘍応答にはCD4+T細胞ではなくCD8+T細胞が必要とされることが示唆される。注目すべきことに、CD8+T細胞枯渇マウスでのB16F1-IL-21の増殖は大幅に遅延し、CD8+T細胞以外の細胞が初期腫瘍増殖の抑制に寄与する可能性があることが示唆される。
IL-21誘導性抗腫瘍応答にはNK細胞が必要とされる
蓄積された試験的証拠によって、抗腫瘍免疫を高める防御の第一線としてのNK細胞の役割が裏付けられる（Smyth, M. J. et al.（2001）International Immunology 13: 459-463; Smyth, M. J. et al.（2002）Curr. Opin. Immunol. 14: 165-171; Smyth, M. J. et al.（2002）Blood. 99: 1259-1266）。この可能性は同数のB16F1-IL-21腫瘍細胞をNK細胞枯渇マウスまたは対照C57BL/6マウスに注入することによって検討された。対照C57BL/6マウスでは検出可能な腫瘍形成は見られなかったが、一方、すべてのNK細胞枯渇マウスではB16F1-IL-21腫瘍細胞接種後2週間で腫瘍が生じた。この結果は、IL-21誘導性抗腫瘍応答にはCD8+T細胞とともにNK細胞も必要であることを示している。
IL-21はIFNγを分泌する腫瘍抗原特異的T細胞の産生を支援し、腫瘍抗原特異的CTL活性を高める
最近、正常メラニン細胞分化抗原チロシナーゼ関連タンパク質2（TPR2）の残基180〜188からなる九量体ペプチドがB16黒色腫反応性細胞傷害性Tリンパ球によって認識されるB16黒色腫の腫瘍拒絶抗原の1つであることが立証された（van Elsas, A. et al.（2001）上記; Sutmuller, R. P.（2001）J. Exp. Med. 194:823-832）。TPR-2ペプチドを用いて、IL-21がT細胞応答に及ぼすin vivo 作用を評価した。IFNγ ELISPOTアッセイにて、IL-21またはGFP発現B16F1細胞のいずれかを注入したマウス由来の脾細胞を、TPR-2ペプチドを用いてin vitro において刺激した。図26Aで示すように、B16F1-IL-21注入マウスのIFNγ産生細胞数はB16F1-GFP注入マウスの数より3倍多かった。IL-21媒介性抗腫瘍T細胞応答をさらに特徴付けるために、IL-21またはGFP発現腫瘍のいずれかを注入したマウス由来の脾細胞をまず、本明細書に記載されたようにTRP-2ペプチドを用いてin vitro において刺激した後、in vitro CTLアッセイに用いた。本明細書に記載された試験で用いたB16F1細胞系は、フローサイトメトリーで測定した場合、低レベルのMHCクラスI分子を発現する（van Elsas, A. et al.（2001）上記; Sutmuller, R. P.（2001）上記; Lim, Y. S. et al.（1998）Molecules & Cells 8: 629-636）。よって、本発明者らのCTLアッセイではRMA-S細胞を抗原提示細胞として用いた。図26Bで示すように、B16F1-IL-21注入マウス由来の脾細胞は、OVAペプチドに対して見られるいくつかの交差反応にもかかわらず、GFP発現腫瘍（図26C）に比べ、TRP-2ペプチドでパルスしたRMA-S細胞に対する細胞溶解活性があらゆるE:T比で高まった。これらの結果は、IL-21媒介性腫瘍拒絶が腫瘍抗原特異的細胞溶解性T細胞応答の発生を後押ししていることを示している。TRP-2はB16F1腫瘍細胞および正常メラニン細胞間で共有される抗原の1つであるため、ここで検出されたCTLは実質的に自己反応性T細胞である。実際には、10〜20%のC57BL/6マウスが対照細胞では起こらないB16F1-IL-21腫瘍細胞注入部位での局所毛髪および皮膚色素脱失を起こした（データ示さず）。
IL-21誘導性抗腫瘍応答はIFN-γおよびIL-10と無関係である
IFNγおよびIL-10は、これまでに腫瘍拒絶に重要であることが報告されている（Gerard, C. M. et al.（1996）Human Gene Therapy. 7:23-31; Lim, Y. S. et al.（1998）Molecules & Cells 8: 629-636）。ELISOPの結果は、IL-21が、腫瘍特異的細胞が産生するIL-10ではなくIFNγを高めたことを示している。IL-21媒介性抗腫瘍作用へのIFNγおよびIL-10の関与を調べるために、同数のB16F1-IL-21またはB16F1-GFP腫瘍細胞を、IFNγ-/-またはIL-10-/-マウスのいずれかに注入した。図27A〜27Bで示すように、上記のサイトカイン欠損マウスでは、B16F1-IL-21細胞注入後の腫瘍の形成はなかった。しかしながら、B16F1-GFP対照細胞ではIFNγ-/-およびIL-10-/-マウスのすべてに腫瘍が生じた。これらのデータから、IL-21媒介性抗腫瘍作用にはIFNγまたはIL-10の積極的な関与を必要としないことがわかる。
サイトカイン遺伝子療法を用いて、IL-21のin vivoにおける免疫制御能を研究した。本実施例は、IL-21が、遺伝子操作したB16F1黒色腫またはMethA繊維肉腫細胞によって腫瘍部位で分泌される場合に、同系のIL-21Rの存在を必要とする有効な抗腫瘍免疫応答を増幅することを示している（図23）。CD8+T細胞およびNK細胞は腫瘍破壊およびその後の腫瘍抗原特異的T細胞の発生に必要である（図24Aおよび24B）。主要なTh1およびTh2サイトカイン、IFNγおよびIL-10各々が、IL-21媒介性抗腫瘍応答にとって必要不可欠であるとは考えられない（図26Aおよび26B）。
本明細書に記載されたIL-21変換されたB16黒色腫腫瘍細胞の迅速かつ最も確実な根絶は、その他のサイトカイン遺伝子ワクチン接種モデルで得られたデータとは対照的である。IL-4-、IL-5-、IL-6-、IL-12-、IFNγ-、TNFα-またはGM-CSF変換されたB16ワクチンで免疫性を与えたマウスは、最終的にはすべてのマウスが致命的な腫瘍で死亡したものの、腫瘍形成において緩やかな遅延を示した（Dranoff, G. et al.（1993）PNAS 90: 3539-3543; Nagai, H. et al.（2000）J.Invest. Dermat. 115: 1059-1064）。さらに、GM-CSF、IL-5、IL-6、およびTNF-α発現細胞は、肝脾腫大症、萎縮および震えから死に至るまでの重大な副作用を引き起こした。今日までに、文献では、IL-2およびIL-10だけがin vivoにおいて変換B16腫瘍の完全退縮を誘導することが報告されている（Dranoff, G. et al.（1993）上記; Gerard, C. M.（1996）Human Gene Therapy 7: 231）。本明細書に記載された研究では、生存B16F1-IL-21またはMethA-IL-21変換された腫瘍細胞を注入した同系マウスは、腫瘍接種後27週間が経過しても臨床的に明らかな腫瘍を発達させなかった。さらに、免疫化したマウスから取り出した脾臓およびリンパ節由来のリンパ球様細胞のフローサイトメトリー解析では、細胞集団において重要な変化が示されず（データ示さず）、腫瘍微小環境でのIL-21のパラクリン分泌が、検出可能な全身性副作用をもたらすことなく、有効な抗腫瘍応答を調整していることを示唆している。
IL-21R-/-マウスではB16F1-IL-21腫瘍が生じたが、C57BL/6（対照）マウスでは生じなかった。これは、IL-21およびIL-21R相互作用は、その他のサイトカイン受容体が関連するIL-21Rシグナル伝達経路においては明らかに余分なものであるにもかかわらず、IL-21-媒介性作用には重要であることを強く示している（上記のParrish-Novak et al.（2000）; 上記のOzaki et al.（2000）; 上記のAsao et al.（2001））。しかしながら、IL-21R-/-マウスは、IL-21以外のサイトカインに応答する正常なNK細胞およびT細胞を有するため、IL-21R-/-マウスにおけるB16F1-IL-21腫瘍の増殖がT細胞およびNK細胞発生における本質的な欠陥に起因するとは考えるべきではない（上記のKasaian, M. T. et al.（2002））。
自然免疫系および適応免疫系は腫瘍に対する免疫応答に関与することがある。IL-21はin vitro においてNK細胞およびT細胞両方の活性化を促進することができる。本明細書に記載されたin vivo 枯渇試験では、完全IL21-B16F1腫瘍拒絶にNK細胞およびCD8+T細胞の両方が必要とされることが示された。NK細胞の腫瘍監視への関与は、明細書に記載されたNK枯渇試験によって確認される（図24B）。B16F1-IL-21細胞が極めて低レベルのMHCクラスI分子を発現することを考えると（データ示さず）、生存B16F1-IL-21細胞の接種によって最初の局所炎症反応を引き起こしている可能性がある。NK細胞は腫瘍細胞に対する防御の第一線として役割を果たすことができる（Trinchieri, G.（1994）J. Exp. Med. 180: 417-421; Levitsky, H. I. et al.（1994）J. Exp. Med. 179: 1215-1224; Wu, T. C.（1995）J. Exp. Med. 182: 1415-1421）。この初期の腫瘍殺傷によって多量の腫瘍由来抗原が生じるが、これらは順次、プロフェッショナルAPCに取り込まれ、MHC拘束性細胞傷害性T細胞に提示され得る。適応免疫応答が引き起こされる前のNK細胞のB16F1-IL-21細胞の初期監視への貢献は、CD8+T細胞枯渇マウスにおいて著しく遅延したB16F1-IL-21腫瘍増殖にさらに反映される（図24A）。
T細胞のIL-21誘導性腫瘍退縮への関与の証拠は、ヌードマウスにおける腫瘍増殖の回復によって示される（図23B）。CD4+およびCD8+T細胞のいずれもが種々の腫瘍細胞に基づくワクチンストラテジーにおいて腫瘍退縮の誘導および感染防御免疫の発生に重要であることが記載されている（Colombo, M. P., and G. Forni（1994）Immunology Today 15: 48-51; Hock, H. et al.（1993）PNAS 90: 2774-2778; Hung, K. et al.（1998）J. Exp. Med. 188: 2357-2368; Segal, B. M. et al.（2002）J. Immunol. 168: 1-4）。研究ではCD4+Tヘルパー細胞がナイーブなCD8+T細胞の活性化に必要とされることが示された（Clarke, S. R.（2000）Journal of Leukocyte Biology. 67: 607-614）。これに対して、上記の研究結果は、IL-21の抗腫瘍応答にはCD4+ではなくCD8+T細胞が必要とされることを立証している。本明細書において開示された研究結果は、CD4+T細胞を排除することによって実際にin vivoにおけるサイトカイン遺伝子療法の抗腫瘍作用を高め得ることを立証した最近の研究と一致していると考えられる（Sutmuller, R. P. et al.（2001）Journal of Experiniental Medicine. 194: 823-832; Nagai, H. et al.（2000）Journal of Investigative Dermatology 115: 1059-1064）。また、IL-21は、T細胞活性化に必要な同時刺激の閾値を下げ、および/またはIL-21Rを有するAPCの抗原提示を増強することによりナイーブなCD8+T細胞の活性化を高め得る（Schoenberger, S. P. et al.（1998）Nature. 393: 480-483; Bennett, S. R. et al.（1998）Nature 393: 478-480）。
B16F1-IL-21腫瘍細胞を注入したマウスは注入部位周囲に毛髪および皮膚の色素脱失を起こした。正常マウスメラニン細胞に対する自己免疫は、腫瘍注入部位に近接したB16腫瘍細胞と共有する共通のエピトープを介して誘導されたと思われる。また、他の研究者らによっても、抗CD4枯渇またはCTLA-4遮断とともにサイトカイン遺伝子変換されたB16黒色腫細胞を用いて同様の観察結果が報告された。しかしながら、皮膚色素脱失は白斑様であり、メラニン細胞に対する推定自己免疫細胞のより全身的な関与が示唆される（Sutmuller, R. P. et al.（2001）Journal of Experimental Medicine. 194: 823-832; Nagai, H.（2000）Journal of Investigative Dermatology. 115: 1059-1064; van Elsas, A. et al.（1999）Journal of Experimental Medicine. 190:355-366）。TRP-2はB16F1腫瘍細胞および正常メラニン細胞間で共有されるかかるエピトープの1つである。自己抗原に対して高い親和性を有するT細胞が胸腺において排除されるため、胸腺での排除を免れるTRP-2特異的T細胞は結合力の低いものであるはずである。それにもかかわらず、B16F1-IL-21腫瘍注入マウスはB16F1-GFP（対照）腫瘍注入マウスに比べて3倍よりも多いTRP-2特異的T細胞を有しており、IL-21がB16F1-IL-21注入マウスにおいてナイーブなT細胞の活性化の閾値を下げることを示唆する。
また、IL-21の抗腫瘍活性はCD8+T細胞機能の増強とも相関関係があり、このことは抗原特異的なIFNγ産生の増加、および腫瘍特異的なCTL活性の強化のいずれによっても立証される。IFNγおよびIL-10はいずれも腫瘍拒絶に欠くことのできない役割を果たすことが報告されているが、IFNγおよびIL-10欠損マウスに関する本発明者らの試験では、IL-21媒介性腫瘍拒絶にそれらの存在が必要ではないことを示している。
要約すれば、本明細書に示した結果は少なくとも3つの非排他的な機構がIL-21媒介性抗腫瘍応答の基礎となることを示唆している:（1）腫瘍微小環境におけるIL-21のパラクリン分泌が、NK細胞が媒介する初期の生得的腫瘍監視を始動させ、後押しする;（2）IL-21がAPCを活性化し、 腫瘍残屑の取り込み、その後の腫瘍抗原のナイーブなT細胞への提示、それによってCD8+T細胞による適応免疫応答を促進する;（3）IL-21がナイーブなT細胞の活性化の閾値を下げ、それにより、主要な寛容を回避した低親和性自己反応性T細胞の回復補充および活性化を可能にする。
実施例10: IL-21は抗原特異的CD8+T細胞応答を増強する
本実施例は、IL-21およびIL-21R mRNA発現の解析、ならびにIL-21のネズミCD8+T細胞の応答に及ぼす影響を示している。ナイーブなCD8+T細胞はIL-21Rを発現し、発現は刺激によりアップレギュレートされる。外因性IL-21の存在下で刺激した場合、CD8+T細胞だけが検出可能なIL-21 mRNAを発現する。IL-21は、制限レベルの刺激ではIL-2ほど影響力が強くはないが、抗原または抗CD3 mAbによる刺激を受けたCD8+T細胞の増殖を特異的に増加させる。しかしながら、IL-2と比べ、IL-21がCD8+T細胞のin vitro 初回抗原刺激中に存在することにより、標的細胞を溶解し、IFNγを産生させる能力の高いエフェクター細胞が発生する。これらの研究結果は、CD8+T細胞応答の発生におけるIL-21の役割を裏付けるものである。
試験プロトコール
試薬 ネズミIL-21をCOS細胞のトランスフェクションおよび上清の濃縮によって作製した; 活性はバイオアッセイによりrmIL-21（R & D Systems, Minneapolis, MN）を基準とした。同量の濃縮したモックトランスフェクタント上清を対照として用いた。IL-21R. FcはヒトIL-21Rの推定細胞外ドメインを変異を有するネズミIgG2aをC末端側に連結して、Fc結合および補体結合を最小にするよう構築した。記載のとおり、rhIL-2（R & D Systems, Minneapolis, MN）、rmIL-12（Wyeth, Cambridge, MA）、rmIL-15（R & D Systems）、rmIL-21（R & D Systems）を用いた。
マウス 2C TCR Tgマウス（このマウスのTCRはLd アロ抗原に特異的である）を繁殖させ、Charles River Laboratories（Wilmington, MA）にて維持管理した。
RPAs
T細胞アッセイ T細胞は2C TCR Tg リンパ節からネガティブセレクションカラム（R & D Systems）を用いて精製するか、またはCD8およびCD62L発現に基づいて選別した。記載のとおり、精製したT細胞（2x105/ml）をプレート結合型抗CD3 mAb（2C11; Wyeth, Cambridge, MA）または照射を受けたBalb/c脾細胞（2000R; 1〜5x106/ml）およびサイトカインを用いて刺激した。増殖は3H-チミジン取り込み（1uCi/ウェル）によって調べた。初回抗原刺激では、培養を上記のように、指定のサイトカインとともに4〜6日間と定めた。細胞を回収し、洗浄し、計数し、5x103 51Cr-標識したP815（特異的）またはEL4（非特異的）標的を、記載したエフェクター:標的比にて用いる4時間のCTLアッセイに用い、または抗CD3 mAbコーティングしたプレート（1ug/ml）で40時間再刺激した。
CD8+T細胞によるIL-21RおよびIL-21発現 これまでの報告では、IL-21Rのリンパ系限局性発現と活性化されたヒトCD4+T細胞によるIL-21発現が示されている。本発明者らはRNアーゼプロテクションアッセイを利用して、ナイーブなネズミCD8+T細胞によるIL21RおよびIL-21mRNAの発現を解析した。CD8+CD62L+2C TCR+細胞を選別し、モックもしくはIL-21トランスフェクトCOS上清または抗CD28 mAbの存在下、抗CD3 mAbで刺激し、IL-21RまたはIL-21 RNアーゼプロテクションアッセイ用にRNAを調製した（図27A）。
新たに単離されたCD8+T細胞はIL-21R mRNAを発現し、このことはこれらの細胞がIL-21に応答することができることを意味した。内部標準に対するシグナル強度の定量によって、TCRが媒介する活性化によりIL-21R mRNAレベルが2倍まで高まることが示された（図27A）。CD28同時刺激によるTCR活性化ではIL-21R mRNAが4倍まで高まり、CD8+T細胞の生理的な2-シグナルの活性化によってIL-21R発現のアップレギュレーションおよびIL-21に対する感受性の増強が生じることが示唆される。興味深いことに、刺激中にIL-21が存在することによってもIL-21R発現の4倍の増強が起こり、このことによりIL-21がCD8+T細胞活性化中にIL-21反応性を増幅する機構の証拠が提供される。ナイーブなCD8+T細胞によるIL-21Rの発現によって、CD8+T細胞にも作用するその他のサイトカインの受容体、例えば発現に活性化を必要とするIL-2、IL-12またはIL-15に対するものと区別される。非トランスジェニックCD8+T細胞においてほぼ同じ結果が認められた（データ示さず）。
IL-21 mRNA発現は同じ精製ネズミCD8+T細胞で解析した。ナイーブな、抗CD3、または抗CD3/抗CD28 mAb活性化ネズミCD8+T細胞がIL-21 mRNAを発現するとはいえないことが判明した（図28B）。これはヒトCD8+T細胞を用いた結果に一致しており、活性化がIL-21 mRNA発現をアップレギュレートすることが示されたCD4+T細胞での観察結果とは対照的である。興味深いことに、抗CD3 mAbおよび外因性IL-21での刺激によってIL-21mRNA発現の強いアップレギュレーションがもたらされ（刺激36時間後に2倍、60時間後に8倍）、CD8+T細胞がこのサイトカインを産生し得ることが示された。
このように、CD8+T細胞はIL-21R mRNAを発現し、外因性IL21の存在下でさらにIL-21R発現を、さらにde novo IL-21発現をアップレギュレートする。活性化されたCD4+T細胞はこれらの事象を推進する最初のIL-21の起こり得る起源である。このように、IL-21は、主としてCD4+T細胞によって産生され、CD8+T細胞によって利用されるIL-2と類似している。本発明者らの結果は、ある機構がCD8+T細胞活性化中にIL-21反応性を維持するために、CD4+T細胞由来のIL-21とは無関係に存在していることを示唆している。
IL-21はCD8+T細胞の増殖を促進する
IL-21が、抗CD40で刺激したヒトB細胞ならびに固定化した抗CD3 mAbで刺激したヒトおよびネズミT細胞の増殖を増加させること示されていた［1,2］。ここで、本発明者らはIL-21が精製CD8+ネズミT細胞の抗原刺激に及ぼす影響を解析し、IL-21によって2C CD8+T細胞の増殖が用量依存的に促進されることが判明した（図29A）。IL-21はIL-15と同様の効力を示したが、IL-2またはIL-12ほど影響力が強くはなかった（図29B）。
IL-21がB細胞機能に影響を及ぼし得る［1］ことから、次の試験ではIL-21が直接、T細胞に作用することによって2C CD8+T細胞増殖を増加しているのか、またはこの系によるAPCへの作用を介して間接的に行っているのかを評価する。精製2C CD8+T細胞を漸増量のIL21の存在下、固定化した抗CD3 mAbで刺激した（図28C）。抗原反応の場合のように、IL-21は抗CD3刺激に対して用量依存的にCD8+T細胞増殖を促進した。このことはIL-21のAPCへの作用の可能性を除外するものではなく、このサイトカインがT細胞に直接作用して、それらの機能を調節し得ることを裏付けるものである。CD8+T細胞の抗CD3刺激によってサイトカインの影響を比較することで、IL-21およびIL-15が同様のレベルの増殖をもたらし、増殖の誘導においてはIL-2およびIL-12がIL-21よりも影響力が強い（図28D）ことが示された。
これらの研究の多くで用いたIL-21はCOSトランスフェクタントの上清を濃縮したものであったため、IL-21R.Fc融合タンパク質を用いてIL-21応答を特異的に中和した。ELISAを行って、mL-21R.FcがmIL-21と結合すること、それがIL-21とその受容体との結合を中和し得ることを示した（データ示さず）。2C CD8+T細胞をIL-21R.Fcの存在または不在下、固定化した抗CD3 mAbおよび漸増量のIL-21により刺激した（図28C）。IL-21によって誘導される反応性は可溶性IL-21R.Fcの添加によって抑制され、IL-21-トランスフェクタント上清の存在下で認められる増殖の促進が特異的にIL-21に起因することが示される。IL-21R.FcがIL-2またはIL-15-媒介性増殖に及ぼす影響はなかった（データ示さず）。
IL-21はネズミCD8+T細胞の抗原によって誘導される増殖を特異的に促進し、抗原または抗CD3刺激によって各々、平均して3倍および6倍の増殖の増加がもたらされた（n=5）。これは比較的低いレベルのIL-21R発現、IL-2およびIL-15の場合、ガンマについての競合、またはこのサイトカインの生物学的作用に起因したものかもしれない。本明細書で示したデータは、IL-21が分離されていないT細胞のアロ抗原刺激による増殖を促進したことを示す本発明者らのこれまでの結果を拡大し、CD8+T細胞が媒介する生理学的反応におけるIL-21の潜在的な重要性を強調するものである。CD8+T細胞増殖を増強させるその能力に対し、IL-21はネズミNK細胞の増殖を支援せず、IL-15媒介性NK細胞増殖を抑制する。これらの結果は、IL-21が種々の細胞種において異なるシグナル伝達プログラムを始動させる可能性があることを示唆している。分離されていないT細胞を用いた結果と一致して、最適な下限レベルの抗CD3または抗原刺激で精製CD8+T細胞の増殖を増加させるのにIL-21が最も有効であることが判明した（データ示さず）。このことはIL-21が限定された抗原と反応する細胞の感受性を増強する補助的なシグナルとしての役割を果たすことを示唆する。IL-2と同様に、IL-21は活性化されたCD4+T細胞によって産生され、CD8+T細胞に作用してその増殖を促進し、CD4+T細胞に起因するT-ヘルパー活性に寄与し得る。このように、IL-21はT細胞由来のIL-2またはマクロファージ由来のIL-12ほど影響力が強くはないが、CD8+T細胞増殖を促進するものであり、これらのサイトカインの余分ではない役割が示される。
IL-21はCD8+エフェクターT細胞の溶解活性を高める
IL-21がCD8+T細胞増殖を促進することを立証したため、次ぎに本発明者らはIL-21がCD8+T細胞分化に及ぼす影響を検討した。2C TCR Tg CD8+T細胞を指定のサイトカインの存在下でin vitroにおいて初回抗原刺激した後、回収し、同数の細胞をCTL活性についてアッセイした（図29A）。初回抗原刺激中にIL-21が存在することにより、IL-21の不在下で初回抗原刺激した細胞よりも高い単位細胞当たりの溶解活性を有するCD8+エフェクターT細胞が生じた。この溶解活性の増強はIL-2が初回抗原刺激中にも存在した場合に一層顕著であった（図29B）。非特異的標的細胞を殺傷する能力が生じるようなこれらの初回抗原刺激条件はなかった（データ示さず）。このように、IL-21は抗原特異的CD8+T細胞エフェクター機能の発達を強く促進する。また、IL-12およびIL-15などのその他のサイトカインもCTL分化を促進することがわかってきた。IL-21をこれらのサイトカインと比較すると、強力なCTLを誘導するその能力については同等であった（図29B）。
これまでに、本発明者らはIL-21がアロ抗原特異的CTLのIL-15誘導性発生およびIL-15誘導性NK溶解活性を増加させ得ることを示してきた。特定の抗原特異的な初回抗原刺激および標的細胞を用いて本明細書で示したデータは、IL-21単独またはIL-2との組み合わせで、ナイーブなCD8+T細胞のCTL発生を促進し得ることを示すことによってこの結果を拡大する。これについては抗原レベルに対する感受性の増強、接着分子の発現の増強または顆粒酵素の発現の増強をはじめとするいくつかの機構によって説明することができる。これらの可能性を検討する研究は進行中であり、予備データではIL-21が高いグランザイム A mRNA発現を誘導したことが示される。重要なことには、IL-2はCD8+T細胞増殖を刺激することにおいてはIL-21よりもずっと効力があったが、IL-21の存在下での初回抗原刺激では著しい溶解活性が生じた。それらがホモロジー、ある受容体鎖を共有し、いずれもがCD4+T細胞によって産生されるという事実にもかかわらず、ここで示した研究結果はIL-2およびIL21の独自の役割を強調し、CD8+T細胞応答の発生におけるIL-21の重要な役割を示唆している。
IL-21 CD8+T細胞のIFNγ（またはIFNg）産生
CTL活性のほかに、分化したCD8+エフェクターT細胞は抗原で再刺激された場合に高いレベルのIFNγを分泌する。そのため、本発明者らは初回抗原刺激中に存在するIL-21が、CD8+T細胞のIFNγ産生能力を調節するかどうかを解析し、これをCD8+T細胞応答に作用することが分かっているその他のサイトカインと比較した。2C TCR Tg T細胞を、抗原/APC、IL-2および指定のサイトカインとともに5日間初回抗原刺激した後、同数の細胞を抗CD3 mAbで再刺激した（図29C）。CD8+T細胞初回抗原刺激中のIL-21処理により、IL-21の不在下で初回抗原刺激した細胞よりも高力価のIFNgを産生する細胞が発生した（13倍の増強）。同等のCTL活性をもたらすサイトカイン量を用いて、IL-12またはIL-21の存在下で初回抗原刺激したCD8+T細胞は、同じような力価のIFNγを産生し、IL-15がIFNγを産生するCD8+T細胞の誘導において最も有効であった。IL-15およびIL-21はいずれもCD8+T細胞溶解活性の発生を同様に促進したため（図29B）、IFNγ産生を誘導するこの能力の相違によってこれらの関連サイトカインの必須の役割が示される。最近、IL-21がCD4+T細胞によるIL-12誘導性IFNγ産生をアンタゴナイズすることがわかってきたため、これらの結果は特に興味深い。このように、IL-21はCD4+およびCD8+T細胞のIFNγ産生細胞への分化においては異なる役割を担う。このことはCD8+T細胞のIL-12/Stat4非依存的なIFNg産生能力に一致する。結論として、IL-21への暴露によって、CD8+T細胞の分化因子としてのその役割に一致したIFNγ分泌能力の増強がもたらされる。
本明細書に記載された試験では、IL-21が、抗原に応じているCD8+T細胞の強力な増殖および分化因子であることを示している。IL-21R-欠損動物は機能的CD8+T細胞を有している。この見解は、本明細書で示したデータと相まって、CD8+T細胞の発生/維持にIL-21応答を必要としないことよりもIL-21がエフェクター機能の発生を増加することを意味している。IL-2と同様に、IL-21は活性化されたCD4+T細胞によって産生され、これら2つのサイトカインの作用を比較する本発明者らの結果からは、IL-2はCD8+T細胞の増殖を強く推進するが、IL-21はCD8+Tエフェクターの分化の促進にずっと効果的であることが示唆される。最近、IL-21が主としてTh2細胞によって産生されることが示され、Th2応答中のIFNgを産生するCTL発生の機構が示唆される。IL-15はナイーブな細胞の増殖およびCTL発生を誘導するその能力はIL-21と同様であるが、IFNγ産生の誘導ではずっと効果的である。また、IL-12は、IL-2と同様に、強いCD8+T細胞増殖を誘導し、IL-21と同様に、強力なCTL活性およびIFNγ産生を誘導する。このように、IL-2、IL-12、IL-15およびIL-21はナイーブなCD8+T細胞応答の種々の側面を強化するのに有効である。さらに、これらのサイトカインは種々の細胞種で産生される: IL-2およびIL21は活性化されたCD4+T細胞によって分泌されるが、IL-12は活性化されたマクロファージによって産生され、IL-15は間質細胞、内皮細胞、ならびにマクロファージによって産生される。総合すれば、これはIL-2、IL-12、IL-15およびIL-21が免疫応答の異なる段階および部位で作用し、余分なものではないことを示している。本発明者らはこれまで、IL-21が自然免疫および適応免疫応答間の移行のメディエーターである可能性があることを提示してきたが、CD8+T細胞応答の増強を示す本明細書で示したデータはこの仮説を裏付けるものである。CD8+T細胞へのその強力な作用を考えれば、腫瘍およびin vivoでのウイルス感染に対するCD8+応答におけるIL-21の役割の解析に関心が寄せられるであろう。
実施例11: 最初のマクロファージがIL-21Rを発現し、IL-21に対して増殖ならびにサイトカインおよびケモカインレベルの高い分泌によって反応する
本実施例では、IL-21がマクロファージおよび骨髄前駆細胞の増殖を特異的に促進する造血性細胞の成長因子として作用するという研究結果を記載する。
造血性細胞増殖の調節におけるIL-21単独およびその他の因子と組み合わせての作用を検討した。IL-21がリニージ・ネガティブ（lineage negative）のネズミ骨髄前駆体のメチルセルロース中でのマクロファージコロニーの増殖を特異的に促進する、マウスおよびヒト造血性細胞の成長因子として作用することが判明した。また、IL-21はヒトCD34+細胞の増殖を促進するよう作用し、マクロファージ特異的マーカーCD14の発現の増強も引き起こす。ヒト骨髄から選別したCD14+細胞を用いて、RNアーゼプロテクション解析（RPA）によって、IL-21Rがマクロファージで発現され、TNFおよびIL-1によってアップレギュレートされ、その後、GMCSF中での増殖が起こることが示されている。このように、その他の炎症性サイトカインのIL-21反応性の制御における役割が示唆される。マウスおよびヒトマクロファージでのIL-21Rタンパク質の発現がFACS解析により検出された。IL-21はこれらの細胞に直接作用し、その結果として、活性化, 増殖およびケモカインおよびサイトカインの分泌の増加をもたらす。総合すれば、これらの結果はIL-21/IL-21R複合体が、マクロファージの増殖および機能を制御する、ならびに炎症部位でのマクロファージ応答に作用するのに重要であることを示している。
本願を通じて引用されたすべての参考文献、係属中の特許出願および公開特許の開示内容は参照により本明細書に特に組み入れる。
等価物
当業者ならば、単なる通常の試験によって、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの等価物を理解するであろうし、または解明することもできよう。かかる等価物は以下の特許請求の範囲に包含されるものである。
マウスIL-21/MU-1の全長cDNA配列を示す図である。ヌクレオチド配列は配列番号9のヌクレオチド１〜262８に相当する。 図１−１の続きである。 マウスIL-21R/MU-1のアミノ酸配列（配列番号10のアミノ酸1〜529に相当する）を示す図である。アミノ酸1〜19に推定リーダー配列があり、これはSusanによって10.1というスコアで推定された（太字体）。配列番号10のアミノ酸237〜253に推定膜貫通ドメインがある（下線）。推定シグナル伝達モチーフは以下の領域:Box1:アミノ酸265〜274およびBox2:アミノ酸310〜324（太字で下線）を含み、6個のチロシンが配列番号10のアミノ酸位281、319、361、368、397および510に位置する。WSXWSモチーフ（配列番号8）がアミノ酸残基214からアミノ酸残基218に位置する（大きな太字）。推定STATドッキング部位は配列番号10のアミノ酸393〜398およびアミノ酸510〜513を含む。 ヒトMU-1のアミノ酸配列（配列番号2に相当する）を示す図である。推定シグナル配列の位置（配列番号2のアミノ酸1〜19付近）;WSXWSモチーフ（配列番号2のアミノ酸213〜217付近）および膜貫通ドメイン（配列番号2のアミノ酸236から252、236〜253、236〜254付近（下線））。推定JAK結合部位、シグナル伝達モチーフおよびSTATドッキング部位も示されている。これの部位のおおよその位置は四角で囲まれている。 ヒトおよびマウスMU-1cDNA配列（それぞれ、配列番号１の核酸1〜2665および配列番号9の核酸1〜2628に相当する）のギャップ比較を示す図である。HuMU-1=ヒトMU-1、murMU-1=マウスMU-1。ギャップパラメーター（Gap Parameters）：ギャップ加重（Gap Weight）=50、平均マッチ（Average Match）＝10,000、長さ加重（Length Weight）=3、平均ミスマッチ（Average Mismatch）=0.000、同一性パーセント（Percent Identity）=66.116。 図３−１の続きである。 図３−２の続きである。 図３−３の続きである。 ヒトMU-1タンパク質（配列番号2のアミノ酸538に相当する）とマウスMU-1タンパク質（配列番号10のアミノ酸1〜529に相当）のギャップ比較を示す図である。BLOSUM62アミノ酸置換マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G.（1992））。タンパク質ブロックからのアミノ酸置換マトリックス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 : 10915-10919）。ギャップ・パラメーター=ギャップ加重:8、平均マッチ=2.912、長さ加重＝２、平均ミスマッチ=-2.003．同一性パーセント=65.267。 ヒトMU-1のアミノ酸（配列番号2に相当する）、マウスMU-1（配列番号10に相当する）およびヒトIL2β鎖（GENbank受託番号M26062）のマルチプル配列アラインメントを示す図である。リーダーおよび膜貫通ドメインには下線が引いてある。保存されたサイトカイン受容体分子モチーフは太字体で示す。推定シグナル伝達領域は下線を引き、かつ、太字体で示す。 MU-1によるシグナル伝達を示す図である。クローンE7 EPO-MU-1キメラではMU-1はSTAT5をリン酸化する。実施例3において特定された条件下では、MU-1によるシグナル伝達は、調べたすべての時点でSTAT5のリン酸化をもたらす。対照またはキメラBAF-3細胞をIL-3で処理した結果、STAT3がリン酸化されたがSTAT1または5はされなかった。 アミノ末端でミツバチリーダー配列およびHis6タグ（配列番号23のアミノ酸1〜44）と融合している、ヒトIL-21R単量体（配列番号2のアミノ酸20〜235に相当する）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号22および配列番号23として示されている。 図７Ａの続きである。 C末端でリンカー（配列番号25のアミノ酸236〜243に相当する）を介してヒト免疫グロブリンG1（IgG1）Fc配列（配列番号25のアミノ酸244〜467に相当する）と融合している、ヒトIL-21R細胞外ドメイン（配列番号2のアミノ酸1〜235に相当する）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号24および配列番号25として示されている。 図８Ａの続きである。 図８Ｂの続きである。 C末端でリンカー（配列番号27のアミノ酸236〜243に相当する）を介してヒト免疫グロブリンG1（IgG1）Fc配列（配列番号27のアミノ酸244〜467に相当する）およびHis6配列タグ（配列番号27のアミノ酸468〜492に相当する）と融合している、ヒトIL-21R細胞外ドメイン（配列番号2のアミノ酸1〜235に相当する）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号26および配列番号27として示されている。 図９Ａの続きである。 図９Ｂの続きである。 C末端でリンカー（配列番号29のアミノ酸236〜243に相当する）を介してヒト免疫グロブリンG1（IgG1）Fc配列（配列番号29のアミノ酸244〜467に相当する）、ヒト免疫グロブリンG1（IgG1）Fc変異配列と融合している、ヒトIL-21R細胞外ドメイン（配列番号2のアミノ酸1〜235に相当する）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヒトFc配列は残基254および257で野生型配列から変異してFc受容体結合が低下していた。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号28および配列番号29として示されている。 図１０Ａの続きである。 図１０Ｂの続きである。 C末端でロドプシン配列タグと融合している、ヒトIL-21R細胞外ドメイン（配列番号2のアミノ酸1〜235に相当する）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号30および配列番号31として示されている。 図１１Ａの続きである。 C末端でEK切断部位および変異IgG1 Fc領域（配列番号33のアミノ酸236〜470に相当する）と融合している、ヒトIL-21R細胞外ドメイン（配列番号2のアミノ酸1〜235に相当する）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号32および配列番号33として示されている。 図１２Ａの続きである。 図１２Ｂの続きである。 C末端でマウス免疫グロブリンG2a（IgG2a）と融合している、マウスIL-21R細胞外ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヌクレオチド（ゲノムの）およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号34および配列番号35として示されている。 図１３Ａの続きである。 C末端でFlagおよびHis6配列タグと融合している、マウスIL-21R細胞外ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヌクレオチド（ゲノムの）およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号36および配列番号37として示されている。 図１４Ａの続きである。 C末端でFlagおよびHis6配列タグと融合している、（ミツバチリーダー）マウスIL-21R細胞外ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヌクレオチド（ゲノムの）およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号38および配列番号39として示されている。 図１５Ａの続きである。 コラーゲン誘導関節炎（CIA）マウスモデルを用いる実験のための、予防的、治療的および半治療的処置スケジュールをまとめたタイムテーブルである。 処理後日数の関数としての、半治療的CIAマウスに対するmuIL21RFc（200μg/マウス3×/週）の作用を示すグラフである。マウスIg（200μg/マウス3×/週）を対照として用いた。 コラーゲンブースト後日数の関数としての、平均CIAスコアに対するマウスIL-21の作用を示すグラフである。2〜4の全身スコアを示す場合にはマウスに1μgのマウスIL21を腹腔内注射した。 パネルA〜Bは、負の対照（パネルB）と比較した、CIAのマウスの関節炎の足における（パネルA）IL-21R mRNAの発現の増加を示す写真である。 IL-21変換されたB16F1およびMethA細胞によって分泌されたIL-21のレベルおよび生物活性を示す棒グラフである。図20Aは変換された腫瘍細胞によるIL-21分泌レベルを示す。図20（B、C）は変換された腫瘍細胞によって分泌されたIL-21の生物活性を示す棒グラフである。C57BL/6（B）またはBalb/C（C）マウスのいずれか由来のナイーブな脾細胞を、示された濃度の照射した同系腫瘍細胞で72時間刺激した。96ウェルプレート中の培養物に、最適以下の量の抗CD3および抗CD28mAbを添加した。培養の最後の6時間の間3Hチミジンを加えた。 変換された腫瘍細胞のin vitro増殖特性およびIL-21R発現の評価を示すグラフである。図21Aおよび21Bはそれぞれ、培養時間に対する、B16F1-IL-21およびB16F1-GFPまたはMethA-IL-21およびMethA-GFP腫瘍細胞の数を示す。図21Cはトランスフェクトされた細胞におけるIL-21mRNAの発現を示す棒グラフであり、これはサイクロフィリン値に対して標準化し、相対ユニット（R.U.）として表した。 変換された腫瘍細胞のin vivo増殖特性を示す線グラフである。IL-21またはGFP発現腫瘍細胞を示したように同系未処置マウスに注入した。腫瘍の大きさは垂直直径を乗じることによってスコアとし、各群のすべてのマウスの平均をとった。（A）105個のB16F1-Il21またはGFP細胞を注入されたC57BL/6マウスにおける腫瘍増殖。（B）1×106または2×106個のMethA-IL-21またはMethA-GFP細胞のいずれかを注入されたBalb/Cマウスにおける腫瘍増殖。 B16F1-IL-21細胞の注入後の日数に対する、重症複合免疫不全およびヌードマウスにおけるB16F1-IL-21腫瘍増殖の変化を示す線グラフである。B16F1-IL-21およびB16F1-GFP腫瘍細胞（105個/マウス）をC57BL/6重症複合免疫不全（A）またはC57BL/6ヌード（B）マウスに注入した。腫瘍の大きさは週に2回モニターした。 CD4+、CD8+TまたはNK細胞枯渇マウスにおける、B16F1-IL-21細胞のin vivo増殖を示す線グラフである。A）腫瘍細胞注入の3、2および1日前の3回連続、および105個のB16F1-IL-1およびB16F1-GFP腫瘍細胞注入後の1日おきに、抗CD4または抗CD8mAbを注射することによって、C57BL/6にCD4+またはCD8+T細胞を枯渇させた。（アイソタイプ対照としてラットIgGを用いた。）B）腫瘍細胞注入の1日前に1回および105個のB16F1-IL-21およびB16F1-GFP腫瘍細胞注入後週2回、抗アシアロGM1 Abを注入することによって、C57BL/6にNK細胞を枯渇させた。（TおよびNK細胞枯渇のアイソタイプ対照として、それぞれラットIgGまたはウサギIgGを用いた。）腫瘍の大きさは図23において記載した通り週に2回モニターした。 B16F1-IL-21注入したマウスにおけるTRP-2特異的T細胞応答を示すグラフである。（A）抗IFNγAbでプレコーティングしたELISPOTプレートにおいて、B16F1-IL-1またはB16F1-GFPのいずれかを注入したマウス由来の同数の脾細胞（2〜4×105個）を、20UのIL-2の存在下で5μg/mlのTRP-2ペプチドで刺激した。24時間後、プレートを発現させ、スポット形成単位を計数した。結果はスポット形成単位数/100万個の脾細胞（SPU/100万個の脾細胞）として表されている。（B）B16F1-IL-21由来の脾細胞の細胞溶解活性または（C）対照B16F1-GFP注入マウスを、TRP-2またはOVAペプチド（対照）を加えたRMA-S細胞に対して試験した。細胞溶解活性は、標準的な4時間Cr51放出アッセイによって測定した。 IFNγ-/-およびIL-10-/-マウスにおけるB16F1-IL-21細胞のin vivo増殖を示す線グラフである。（A）IFNγ-/-マウスまたは（B）IL-10-/-マウスに105個のB16F1-IL-21またはB16F1-GFP腫瘍細胞のいずれかを注入し、腫瘍増殖を週に2回モニターした。 ナイーブなCD8+T細胞によるIL-21RおよびIL-21発現を示す棒グラフである。CD8+/CD62L+T細胞は、2C TCR TgマウスのLNから選別し、抗CD3（2.5ug/mlプレート結合型IL-21（12.5ng/ml）または抗CD28（7.5ug/mlプレート結合型）で刺激した。示された時間に、細胞を回収し、RNAを調製し、RPA解析を実施した。内部対照に対するホスホイメージャー解析によってサンプルを定量化した。（A）IL-21RバンドのRPA画素の定量。（B）IL-21バンドのRPA画素の定量。 CD8+T細胞の増殖に対するIL-21の作用を示す線グラフである。（A）IL-21はCD8+T細胞の抗原刺激を増強する。精製した2C CD8+T細胞を、示された量のIL-21を含む5:1のAPC:T比の照射したBalb/c脾細胞または同希釈の偽トランスフェクト上清で72時間刺激した（代表的実験、n=5）。（B）抗原刺激に対する、IL-21対IL-2、IL-12、IL-15の作用。2C T細胞を、3:1のT枯渇APC:T比および示された濃度のサイトカインで刺激した（n=3）。（C）IL-21はCD8+T細胞に直接作用して増殖を特異的に増強する。2C CD8+T細胞を抗CD3コーティングしたプレート（2.5ug/ml）で、示された力価のIL-21+/-mIL-21 Fc（20ug/ml）で刺激した（n=3）。（D）抗CD3 mAb刺激に対する、IL-21対IL-2、IL-12、IL-15の作用（5ug/mlプレート結合型）。 CD8+T細胞エフェクター機能の発生に対するIL-21の作用を示すグラフである。（A）IL-21はCTL生成を増強する。2C T細胞を照射したAPC（APC:T）およびIL-2（10U/ml）、IL-21（力価）または同希釈の偽上清で4日間刺激し、次いで、洗浄し、特異的標的として51-Cr標識したP815を用いる4時間CTLアッセイで計数し、求めた（代表的実験、n=3）。（B）IL-21は、CD8+T細胞からの溶解活性の誘導についてIL-12、IL-15に匹敵する。IL-2（5ng/ml）、IL-15（50ng/ml）、IL-12（5ng/ml）、IL-21（25ng/ml）を用いて、2C CD8+T細胞を刺激し、（A）においてと同様にCTL活性についてアッセイした。（C）初回抗原刺激の際のIL-21は、IFNgを産生する能力の増加をもたらす。2C T細胞を（B）において示されたように5日間刺激し、次いで、洗浄し、抗CD3+コーティングしたプレート（1ug/ml）で再刺激した。40時間上清でIFNg ELISAを実施した。

Claims (52)

  1. 免疫細胞活性を阻害または低下させるのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストおよび製薬上許容される担体を含む、関節炎疾患を治療または予防するための医薬組成物。
  2. 免疫細胞活性を阻害または低下させるのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニスト、他の治療薬および製薬上許容される担体を含む、関節炎疾患を治療または予防するための医薬組成物。
  3. 前記治療薬がサイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制薬、抗炎症薬、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞傷害性薬剤および細胞分裂停止薬からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記治療薬がＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−１２アンタゴニスト、ＩＬ−１５アンタゴニスト、ＩＬ−１７アンタゴニスト、ＩＬ−１８アンタゴニスト、ＩＬ−２２アンタゴニスト、Ｔ細胞枯渇剤、Ｂ細胞枯渇剤、メトトレキセート、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）（ラパマイシン）またはその類似体、Ｃｏｘ−２阻害剤、ｃＰＬＡ２阻害剤、ＮＳＡＩＤおよびｐ３８阻害剤からなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
  5. 前記ＴＮＦアンタゴニストがＴＮＦ受容体の可溶性断片である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 前記ＴＮＦアンタゴニストがｐ７５ヒトＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質である、請求項４に記載の医薬組成物。
  7. 前記治療薬がＩＬ−１５アンタゴニストである、請求項４に記載の医薬組成物。
  8. 前記治療薬がメトトレキセートまたはレフルノミドである、請求項４に記載の医薬組成物。
  9. 前記ラパマイシン類似体がＣＣＩ−７７９である、請求項４に記載の医薬組成物。
  10. 前記関節炎疾患が関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎および硬直性脊椎炎からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記関節炎疾患が関節リウマチである、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記関節炎疾患が若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎および硬直性脊椎炎からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
  13. 前記患者が哺乳類である、請求項１または２のいずれかに記載の医薬組成物。
  14. 前記患者がヒトである、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが抗ＩＬ２１Ｒもしくは抗ＩＬ２１抗体またはそれらの抗原結合断片である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１ＲアンタゴニストがヒトＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）ポリペプチドの断片を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 前記断片がヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインとヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ断片とを含んでなる、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインが配列番号２のアミノ酸２０付近〜２３５付近を含んでなる、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインが配列番号２のアミノ酸１付近〜２３５付近を含んでなる、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインが配列番号２のアミノ酸１付近〜２３５付近とヒトＩｇＧ１のＦｃ断片とを含んでなる、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記Ｆｃ断片がＦｃ受容体と結合しない、請求項１７に記載の医薬組成物。
  22. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが配列番号２９のアミノ酸配列（図１０Ａ〜１０Ｃ）またはそれと少なくとも９０％以上同一の配列を含んでなる、請求項１６に記載の医薬組成物。
  23. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが配列番号２５のアミノ酸配列（図８Ａ〜８Ｃ）またはそれと少なくとも９０％以上同一の配列を含んでなる、請求項１６に記載の医薬組成物。
  24. 免疫細胞活性を高めるのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストを含む、癌または感染性疾患を治療または予防するための医薬組成物。
  25. 前記免疫細胞がＣＤ８＋細胞であり、かつ、前記活性が高められたエフェクター細胞活性である、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記癌が充実性腫瘍、軟部組織腫瘍および転移性病変からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
  27. 前記感染性疾患が細菌、ウイルスまたは寄生虫感染である、請求項２４に記載の医薬組成物。
  28. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストを単独で含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
  29. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストおよび癌もしくは腫瘍細胞または病原体由来の抗原を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
  30. 抗原を含有し、有効アジュバント作用量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストと同時または逐次投与されるワクチン組成物であって、該同時または逐次投与の結果、患者における該抗原に対する保護的免疫応答を惹起する能力を高められるワクチン組成物。
  31. 前記抗原は、ウイルス、細菌および原虫からなる群から選択される病原体由来である請求項３０に記載のワクチン組成物。
  32. 前記抗原が癌または腫瘍細胞抗原由来のものである、請求項３０に記載のワクチン組成物。
  33. 前記抗原が癌細胞表面で発現される、請求項３２に記載のワクチン組成物。
  34. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストを、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１５から選択される１種以上のサイトカインを含む、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
  35. 前記患者が哺乳類である、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
  36. 前記患者がヒトである、請求項３５に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
  37. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストが配列番号１９として示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％以上同一である配列を含んでなるヒトＩＬ−２１ポリペプチドである、請求項２４〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物またはワクチン組成物。
  38. 成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、成熟ＮＫ細胞、マクロファージまたは巨核球のうちの１種以上から選択される免疫細胞の活性を調節するための医薬組成物であって、免疫細胞活性を調節するのに十分な量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストを含む医薬組成物。
  39. ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインとヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ断片とを含んでなる融合タンパク質。
  40. 前記ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインが配列番号２のアミノ酸２０付近〜２３５付近を含んでなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  41. 前記ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインが配列番号２のアミノ酸１付近〜２３５付近を含んでなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  42. 前記ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインが配列番号２のアミノ酸１付近〜２３５付近とヒトＩｇＧ１のＦｃ断片とを含んでなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  43. 前記Ｆｃ断片がＦｃ受容体と結合しない、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  44. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが配列番号２９のアミノ酸配列（図１０Ａ〜１０Ｃ）またはそれと少なくとも９０％以上同一の配列を含んでなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  45. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが配列番号２５のアミノ酸配列（図８Ａ〜８Ｃ）またはそれと少なくとも９０％以上同一の配列を含んでなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
  46. 請求項３９に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる宿主細胞。
  47. 請求項３９に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクター。
  48. 請求項３９に記載の融合タンパク質の生産方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞の培養物を、好適な培養培地で増殖させること、（ｂ）培養物から融合タンパク質を精製することを含んでなる方法。
  49. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが抗ＩＬ−２１もしくは抗ＩＬ−２１Ｒ抗体またはヒトＩＬ−２１Ｒの断片である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  50. 前記ＩＬ−２１／ＩＬ−２１ＲアンタゴニストがヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインとヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ断片とを含んでなる、請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. ワクチンとして有用な医薬組成物であって、ウイルス、細菌および寄生微生物からなる群から選択される病原微生物由来の抗原と有効アジュバント作用量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストとを、製薬上許容される担体中に含んでなる組成物。
  52. 癌細胞または腫瘍細胞抗原をＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストと組み合わせて、製薬上許容される担体中に含んでなる医薬組成物。
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