JP2023534847A - Ｉｌ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本願は、一本鎖可変フラグメント足場システムおよび第２のサイトカインに融合されたＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子を含む二重サイトカイン融合タンパク質組成物、薬学的組成物および／またはそれらの製剤に関し、その第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのヒンジ領域に連結される。本願は、癌、炎症性疾患または炎症性障害ならびに免疫疾患または免疫障害および免疫介在性疾患または免疫介在性障害を処置するためにその二重サイトカイン融合タンパク質組成物を使用する方法にも関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年７月２０日出願の米国仮出願第６３／０５４，２０８号に基づく優先権を主張している。この優先権基礎出願の開示は、その全体が参照により本明細書中に援用される。

発明の分野
本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、インターロイキン－１０（「ＩＬ－１０」）を他の炎症性サイトカインおよび免疫調節性サイトカインと組み合わせて含む新規の二重サイトカイン融合タンパク質、炎症性疾患もしくは炎症性症状および免疫疾患もしくは免疫症状を処置する方法、ならびに／または癌を処置する方法に関する。

緒言
もともとはサイトカイン合成阻害因子と命名されたＩＬ－１０（Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｉｎｈｂｉｔｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ：Ａｎ ａｕｔｏｒｅｇｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＬ－１０ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，１９９１）は、炎症反応を抑制することが知られており（Ｆｅｄｏｒａｋ，２０００）、かつより最近では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化して、インターフェロンγ（「ＩＦＮγ」）依存性の抗腫瘍免疫応答を誘導することが知られている（Ｍｕｍｍ Ｊ．，２０１１）、多面的サイトカインである。ＩＬ－１０は、ＩＦＮγと構造が似ている非共有結合性のホモ二量体サイトカインである。ＩＬ－１０は、ＩＬ１０レセプター１（ＩＬ１０Ｒ１）の２つのサブユニットおよびＩＬ－１０レセプター２（ＩＬ１０Ｒ２）の２つのサブユニットからなるＩＬ－１０レセプターに結合する（Ｍｏｏｒｅ，２００１）。ＩＬ－１０レセプター複合体は、ほとんどの造血細胞の表面上に発現され、マクロファージおよびＴ細胞上で最も高発現される。ＩＬ－１０は、免疫抑制性サイトカイン（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０００）と免疫賦活性サイトカイン（Ｍｕｍｍ，２０１１）の両方であると報告されており、クローン病患者のＩＬ－１０処置の臨床評価では、逆の用量反応（Ｆｅｄｏｒａｋ，２０００；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０００）がもたらされたのに対して、ＰＥＧ化ＩＬ－１０による癌患者の処置は、用量漸増性の強力な抗腫瘍応答をもたらした（Ｎａｉｎｇ，２０１８）。ＰＥＧ化ＩＬ－１０による抗腫瘍応答には、内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＩＦＮγが必要である（Ｍｕｍｍ，２０１１）。ＰＥＧ化ＩＬ－１０で腫瘍担持動物を処置すると、腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞が増加し、１細胞あたりでＩＦＮγが増加する。しかしながら、ごく最近では、ＰＥＧ化ＩＬ－１０で処置された癌患者は、免疫刺激の証拠をもたらすが、抗腫瘍応答の増大はもたらさない（Ｓｐｉｇｅｌ，２０２０）。

インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）は、抗腫瘍免疫応答を誘導すると知られている４ヘリックスバンドルの多面的サイトカインである（Ｊｉａｎｇ，２０１６）だけでなく、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの無制御の活性化および分泌ならびに制御性Ｔ細胞の拡大に起因して強い毒性も示す（Ｃｈｉｎｅｎ，２０１６）。このため、多くのグループが、ＩＬ－２の毒性を低下させることを目指して、ＩＬ－２を変異させて高親和性レセプターとの結合を低下させようと試みた（Ｃｈｅｎ，２０１８）。これらのムテインは、実質的な臨床的成功を収めなかった（Ｂｅｎｔｅｂｉｂｅ，２０１９）。このことは、ＩＬ－２の潜在的な致死毒性を低減するために他の機序を採用しなければならないことを示唆している。

ＩＬ－１０は、ＮＫとＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方が分泌する、ＩＬ－２によって駆動されるＩＦＮγの産生を抑制すると報告されている（Ｓｃｏｔｔ，２００６）が、ＩＬ－２によって誘導されるＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖の補因子として作用するとも報告されている（Ｇｒｏｕｘ，１９９８）。ゆえに、ＩＬ－２とＩＬ－１０とが、免疫系の細胞を同時活性化するのか、または互いに打ち消しあうのかは不明である。
インターロイキン－４（「ＩＬ－４」）は、典型的なＴｈ２駆動型サイトカインと考えられている４ヘリックスバンドルの多面的サイトカインであり（ＭｃＧｕｉｒｋ，２０００）、マクロファージによる代替活性化を引き起こすことに主に関連している（Ｂａｌｃｅ，２０１１）。ＩＬ－４は、主にアレルギー反応および喘息に関連した炎症を引き起こすことに関連している（Ｓｔｅｉｎｋｅ，２００１；Ｒｙａｎ，１９９７）。さらに、ＩＬ－４にはいくらかの癌細胞増殖を抑制する能力があるため（Ｌｅｅ，２０１６；Ｇｏｏｃｈ，１９９８）、癌患者は、ＩＬ－４で安全に処置された（Ｄａｖｉｓ，２００９）。ＩＬ－４は、炎症促進性サイトカインの単球分泌を抑制すると報告されているが（Ｗｏｏｄｗａｒｄ，２０１２）、抗原提示細胞をプライミングし、細菌に曝露された単球による炎症促進性サイトカインの分泌を引き起こすことができるため、強力な抗炎症性サイトカインとは考えられていない（Ｖａｒｉｎ，２０１０）。
驚くべきことに、重要なＩＬ－１０レセプター結合ドメイン領域に１つまたはそれを超えるアミノ酸置換（配列番号３の成熟ＥＢＶ ＩＬ－１０アミノ酸配列のアミノ酸位置３１、７５またはその両方における置換）を有するエプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）ＩＬ－１０バリアントは、ＥＢＶ ＩＬ－１０がＩＬ－１０レセプターに結合してそれを活性化する能力を変化させることが発見された。これらの改変には、ＩＬ－１０レセプターに対するＥＢＶ ＩＬ－１０の親和性を高める能力が含まれていた。本発明者は、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子が、免疫疾患、炎症性疾患または炎症性症状を処置することができるＩＬ－１０レセプターアゴニストとして作用すること、および癌の処置においてＩＬ－１０レセプターアゴニストとして作用することを発見した。本発明者は、モノマーのＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントを、非免疫原性の可変重鎖（「ＶＨ」）領域および可変軽鎖（「ＶＬ」）領域を含む足場システムに組み込むことによって、得られたＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子の半減期が延長され、その分子が適切に折り畳まれ、機能的に活性であることも発見した。その足場システムに組み込まれたＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントは、炎症細胞（例えば、単球／マクロファージ／樹状細胞）と免疫細胞（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）の両方に対するＩＬ－１０の機能が強化されたことを示した。米国出願第１６／８１１，７１８号として２０２０年３月６日出願の米国特許第１０，８５８，４１２号（その全体が参照により援用される）を参照のこと。本願は、炎症性疾患、免疫疾患および／または癌を処置するために、ＩＬ－１０の生物学的作用を相加的または相乗的に強化する新しい融合タンパク質構造の一部としてＩＬ－１０と別のサイトカインとの両方を送達する、以前報告されたＥＢＶ ＩＬ－１０足場システムの改変に焦点を当てている。

米国特許第１０，８５８，４１２号明細書

Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｉｎｈｂｉｔｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ：Ａｎ ａｕｔｏｒｅｇｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＬ－１０ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，１９９１ Fedorak, R. (2000). Recombinant Human Interlekin 10 in the Treatment of Patients with Mild to Moderately Active Crohn's Disease. Gastroenterology, 1473-1482. Mumm, J. (2011). IL-10 induces IFNg-Mediated Tumor Immunity. Cancer Cell. Mumm, J. B. (2011). IL-10 Elicits IFNg-Dependent Tumor Immune Surveillance. Cancer Cell. Moore, K. W. (2001). Interleukin 10 and the Interleukin 10 Receptor. Annual Reviews Immunology. Schreiber, S. (2000). Safety and Efficacy of Recombinant Human Interleukin 10 in Chronic Active Crohn's Disease. Gastroenterology, 1461-1472. Naing, A. (2018). PEGylated IL-10 (Pegilodecakin) Induces Systemic Immune Activation, CD8+ T cell Invigoration and Polyclonal T cell Expansion in Cancer Patients. Cancer Cell. Spigel, D. R. (2020). Randomized phase II study of pembrolizumab (P) alone versus pegilodecakin (PEG) in combination with P as first-line (1L) therapy in patients (pts) with stage IV non-small cell lung cancer (NSCLC) with high PD-L1 expression (CYPRESS 1). ASCO, (p. 9563). Jiang, T. (2016). Role of IL-2 in cancer immunotherapy. Oncoimmunology. Kirchner, G. I. (1998). Pharmacokinetics of human Interleukin-2 in advanced renal cell carcinoma patients following subcutaneous application. British Journal Clinical Pharmacology. Chinen, T. (2016). An essential role for IL-2 receptor in regulatory T cell function. Nature Immunology. Chen, X. (2018). A novel human IL-2 mutein with minimal systemic toxicity exerts greater antitumor efficacy than wild-type IL-2 . Cell Death and Disease. Bentebibe, S.-E. (2019). A First-in-Human Study and Biomarker Analysis of NKTR-214, a Novel IL2Raf Biased Cytokine, in Patients with Advanced or Metastatic Solid Tumors. Cancer Discovery. Scott, M. J. (2006). Interleukin-10 suppresses natural killer cell but not natural killer T cell activation during bacterial infection. Cytokine. Groux, H. (1998). Inhibitory and Stimulatory Effects of IL-10 on Human CD8+ T cells. The Journal of Immunology. McGuirk, P. (2000). A Regulatory Role for Interleukin 4 in Differential Inflammatory Responses in the Lung following Infection of Mice Primed with Th1- or Th2-Inducing Pertussis Vaccines. Infection and Immunity. Balce, D. R. (2011). Alternative activation of macrophages by IL-4 enhances the proteolytic capacity of their phagosomes through synergistic mechanisms. Blood. Steinke, J. W. (2001). Th2 cytokines and asthma Interleukin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4 receptor antagonists. Respiratory Research. Ryan, J. J. (1997). Interleukin-4 and its receptor: Essential mediators of the allergic response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. Lee, H. L. (2016). Tumor growth suppressive effect of IL-4 through p21-mediated activation of STAT6 in IL-4Rα overexpressed melanoma models. Oncotarget. Gooch, J. L. (1998). Interleukin 4 Inhibits Growth and Induces Apoptosis in Human Breast Cancer Cells. Cancer Research. Davis, I. D. (2009). A Phase I and Pharmacokinetic Study of Subcutaneously-Administered Recombinant Human Interleukin-4 (rhuIL-4) in Patients with Advanced Cancer. Growth Factors. Woodward, E. A. (2012). The anti-inflammatory actions of IL-4 in human monocytes are not mediated by IL-10, RP105 or the kinase activity of RIPK2. Cytokine. Varin, A. (2010). Alternative activation of macrophages by IL-4 impairs phagocytosis of pathogens but potentiates microbial-induced signalling and cytokine secretion. Blood.

発明の様々な態様の要旨
本開示は、概して、二重サイトカイン融合タンパク質に関する。

したがって、第１の態様において、本開示は、モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントまたは可変重鎖（「ＶＨ」）領域および可変軽鎖（「ＶＬ」）領域に融合された第１のサイトカインとしてのＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントならびに第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質に関し、第２のサイトカインは、抗原結合フラグメントのＶＨ領域とＶＬ領域との間に連結されている。ある特定の実施形態において、第１のサイトカインは、ＩＬ－１０（例えば、ヒト、マウス、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）またはＥＢＶ ＩＬ－１０型またはＩＬ－１０バリアント分子であるがこれらに限定されない）であり、ＩＬ－１０バリアントは、ＩＬ－１０レセプター結合ドメインに影響する１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を有する。この融合タンパク質は、第２のサイトカインも含み、そのサイトカインは、第１のサイトカインとは異なるサイトカインであって、第１および第２のサイトカインが、その融合タンパク質によって特定の抗原をターゲットにしているかまたは抗原結合フラグメントのＶＨおよびＶＬ領域によって半減期が延長されているとき、相加効果または相乗効果があるように、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子とタンデムで働く、サイトカインである。融合タンパク質は、抗体、その抗体フラグメントまたは抗原結合部分のＶＨおよびＶＬ領域によって認識される標的抗原に二重サイトカイン融合タンパク質を向ける、ＶＨおよびＶＬ領域を含む抗体、抗体フラグメントまたは抗原結合部分も含む。ある特定の実施形態において、抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖである。

なおも別の態様において、本開示は、式（Ｉ）：
ＮＨ_２－（ＩＬ１０）－（Ｘ^１）－（Ｚ_ｎ）－（Ｘ^２）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ
の二重サイトカイン融合タンパク質に関し、式中、
「ＩＬ１０」は、ＩＬ－１０のモノマーであり、そのＩＬ－１０は、ヒト、マウス、ＣＭＶもしくはＥＢＶ ＩＬ－１０またはそのバリアントであり、より好ましくは、ＩＬ１０は、配列番号１、３、９、１０、１１、１２、１４または１６から選択される配列を含むモノマーであり；
「Ｘ^１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ^２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；Ｘ^１がＶＬであるとき、Ｘ^２はＶＨであるか、またはＸ^１がＶＨであるとき、Ｘ^２はＶＬであり；
「Ｚ」は、ＩＬ－１０以外のサイトカインであり；
「ｎ」は、０～２から選択される整数である。

なおも別の態様において、本開示は、式（ＩＩ）
ＮＨ_２－（ＩＬ１０）－（Ｌ）－（Ｘ^１）－（Ｌ）－（Ｚ_ｎ）－（Ｌ）－（Ｘ^２）－（Ｌ）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ
のＩＬ－１０融合タンパク質に関し、式中、
「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、９、１０、１１、１２、１４または１６から選択されるモノマー配列であり；
「Ｌ」は、任意のリンカーであり、より好ましくは、そのリンカーは、配列番号３９、４０または４１から選択され；
「Ｘ^１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；「Ｘ^２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；Ｘ^１がＶＬであるとき、Ｘ^２はＶＨであるか、またはＸ^１がＶＨであるとき、Ｘ^２はＶＬであり；
「Ｚ」は、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－βまたは腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
「ｎ」は、０～２から選択される整数である。

他の態様において、本開示は、二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。

他の態様において、本開示は、二重サイトカイン融合タンパク質を作製し、精製する方法に関する。１つの実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質を作製する方法は、二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸を組換え的に発現させる工程を含む。

他の態様において、本開示は、癌を処置する方法に関し、その方法は、それを必要とする被験体に有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を投与する工程を含む。

他の態様において、本開示は、炎症性疾患または炎症性症状を処置する方法に関し、その方法は、それを必要とする被験体に有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を投与する工程を含む。好ましくは、炎症性疾患は、クローン病、乾癬および／または関節リウマチである。

他の態様において、本開示は、免疫疾患または免疫症状を処置する方法に関し、その方法は、それを必要とする被験体に有効量の二重サイトカイン融合タンパク質を投与する工程を含む。

他の態様において、本開示は、敗血症および／または敗血症性ショックならびにそれらの関連症候を処置、阻害および／または緩和する方法に関する。

上記の代表的な態様の単純化された要旨は、本開示の基本的な理解をもたらすのに役立つ。この要約は、企図されるすべての態様の広範な概要ではなく、すべての態様の重要または重大なエレメントを特定することも、本開示のいずれかまたはすべての態様の範囲を線引きすることも、意図していない。その唯一の目的は、以下の本開示のより詳細な説明の前置きとして、１つまたはそれを超える態様を単純化した形態で提示することである。前述のことの達成のために、本開示の１つまたはそれを超える態様は、請求項に記載され例示的に指摘される特徴を含む。

図１は、米国特許１０，８５８，４１２に記載されているＩＬ－１０サイトカイン融合タンパク質の模式図である。

図２は、本開示において具体化される二重サイトカイン融合タンパク質の模式図であり、その二重サイトカイン融合タンパク質は、末端に連結されたＩＬ－１０モノマー（またはＩＬ－１０バリアント）を含み、第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のリンカーに組み込まれる。

図３は、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬに連結されたＤＶ０７（ＥＢＶ ＩＬ－１０のＩＬ－１０レセプター高親和性バリアント）ならびにＩＬ－２を含む２つのサイトカインを代替形態で含む融合タンパク質（「ＳＬＰ－ＩＬ－２」と呼ばれる）の模式図であり、そのＩＬ－２は、最もＣ末端のＩＬ－１０モノマーのカルボキシ末端に融合されている。

図４は、単球／マクロファージからのＴＮＦα分泌の減少率に関して、ＳＬＰ－ＩＬ－２を、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、およびＩＬ－１０とＩＬ－２との組み合わせと比較している用量設定研究（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）である。

図５は、単球からのＴＮＦα分泌の減少率に関して、ＤＫ２^１０をＩＬ－１０およびＤｅｇｆｒＤＶ０７（ＳＬＰバリアント３；配列番号３１）と比較する用量設定研究である。

図６は、ＳＬＰとＤＫ２^１０とを比較するＴ細胞ＩＦＮγ増強アッセイである。暗灰色のバーは、両方のサイトカンの血清トラフ治療濃度を表し、薄灰色のバーは、ＤＫ２^１０の予想される必要治療濃度を表している。

図７は、ＩＬ－２媒介性のＩＦＮγ誘導に関する、ＮＫ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＬ－１０の影響を測定するためのアッセイである。暗灰色のバーは、両方のサイトカンの血清トラフ治療濃度を表し、薄灰色のバーは、ＤＫ２^１０の予想される必要治療濃度を表している。

図８は、Ｔ細胞におけるモデル抗原提示に対するサイトカインの影響を計測するアッセイである。

図９は、抗原曝露後のＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγの誘導を計測するアッセイである。

図１０は、Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７またはＤＫ２^１０で処置されたマウスにおける抗腫瘍効果を比較しているインビボＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ^＋）腫瘍モデルマウス研究である。

図１１は、Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７またはＤＫ２^１０で処置されたマウスの体重を比較しているインビボＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ^＋）腫瘍モデルマウス研究である。

図１２は、Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７およびＤＫ２^１０で処置されたマウスの生存率を比較しているインビボＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ^＋）腫瘍モデルマウス研究である。

図１３は、単球からのＴＮＦα分泌の減少率に関する、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、およびＩＬ－１０とＩＬ－４についての用量設定研究である。

図１４は、単球からのＴＮＦα分泌の減少率に関する、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－４とＤｅｂｏＷｔＥＢＶ、およびＤｅｂｏＷｔＥＢＶ単独についての用量設定研究である。

図１５は、ＤｅｂｏＷｔＥＢＶおよびＩＬ－４をＤｅｂｏＷｔＥＢＶ単独に対して比較しているＴ細胞ＩＦＮγ増強アッセイである。

図１６は、単球／マクロファージによるＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌の抑制に関して、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＤｅｂｏＤＶ０６、およびＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＤＶ０６を評価する用量設定研究である。

図１７は、ＤＫ４^１０型と命名されたクラスの分子の模式図である。

図１８は、単球／マクロファージによるＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌の抑制に関して、ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６（別名「４ＤｅｂｏＤＶ０６」）を、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＤｅｂｏＤＶ０６、およびＩＬ－４と組み合わされるＩＬ－１０と比較して評価している用量設定研究である。

図１９は、ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６（別名「４ＤｅｂｏＤＶ０６」）を、ＣＤ８＋Ｔ細胞に関して、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＤｅｂｏＤＶ０６、およびＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＤＶ０６と比較して評価している用量設定研究である。

図２０は、非グリコシル化型（Ｎ３８Ａ）および高親和性型（Ｔ１３Ｄ）のヒトＩＬ－４を含むＤＫ４^１０クラスの分子のメンバーであるＩＬ－４ＨＡＤｅｇｌｙｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ＨＡＤｅｇｌｙｍＣＤ１４ＤＶ０７をマクロファージ／単球によるＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌の抑制に関して評価し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、およびＤＫ４^１０型のＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６（別名「４ＤｅｂｏＤＶ０６」）と比較している、用量設定研究である。

図２１は、非グリコシル化型のＩＬ４をもたらすＮ３８Ａにおける単一置換を含むＤＫ４^１０クラスの分子のメンバーであるＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７を単球／マクロファージによるＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌の抑制に関して評価し、ＩＬ－１０と比較している、用量設定研究である。

図２２は、非グリコシル化型のＩＬ４をもたらすＮ３８Ａにおける単一置換を含むＤＫ４^１０クラスの分子のメンバーであるＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７を評価し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ誘導の媒介に関してＩＬ－１０と比較している、用量設定研究である。

図２３は、非グリコシル化型のＩＬ４をもたらすＮ３８Ａにおける単一置換を含むＤＫ４^１０クラスの分子のメンバーであるＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６を単球／マクロファージによるＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌の抑制に関して評価し、ＩＬ－１０と比較している、用量設定研究である。

図２４は、非グリコシル化型のＩＬ４をもたらすＮ３８Ａにおける単一置換を含むＤＫ４^１０クラスの分子のメンバーであるＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６をＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ誘導の媒介に関して評価し、ＩＬ－１０と比較している、用量設定研究である。

図２５は、ＬＰＳ投与の前および後に、ＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６で処置されたマウスの生存率を比較しているインビボ敗血症マウスモデル研究である。

詳細な説明
例示的な態様は、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質を作製する方法、ならびに炎症性疾患または炎症性症状、免疫疾患または免疫症状を処置するため、癌を処置および／または予防するために、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質を使用する方法の文脈において本明細書中に記載される。当業者は、以下の説明が単なる例証であって、決して限定することを意図していないことを理解するだろう。本開示の利益を有する当業者には容易に他の態様が示唆されるだろう。次に、添付の図面に図示されるような例示的な態様の実行について詳細に言及する。図面および以下の説明全体にわたって、可能な範囲内で、同じまたは類似の項目について言及するために同じ参照表示を使用する。

本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価ないくつかの方法および材料を、記載される様々な実施形態の実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書中で説明する。

別段示されない限り、本明細書中に記載される実施形態は、当業者に周知の分子生物学、生化学、薬理学、化学および免疫学の従来の方法および手法を用いる。ヒト、マウス、ＣＭＶおよび／またはＥＢＶ型のＩＬ－１０を含むがこれらに限定されないＩＬ－１０バリアントをデザインおよび製作するための一般的な手法の多く、ならびにＩＬ－１０バリアントを試験するためのアッセイは、容易に利用可能であり、当該分野で詳述されている、周知の方法である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。Ｎ末端のアルデヒドベースのＰＥＧ化化学も当該分野で周知である。

定義
以下の用語は、本明細書中で論じられる様々な実施形態を説明するために使用され、以下に示されるように定義されると意図されている。

様々な実施形態を説明する際に本明細書中で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段内容が明確に定めない限り、複数の指示対象を含む。

用語「約」とは、記載の数値または数値範囲からの０．０００１～５％の逸脱のことを指す。１つの実施形態において、用語「約」とは、記載の数値または数値範囲からの１～１０％の逸脱のことを指す。１つの実施形態において、用語「約」とは、記載の数値または数値範囲からの最大２５％の逸脱のことを指す。より具体的な実施形態において、用語「約」とは、野生型配列と比べたとき、ヌクレオチド配列の相同性またはアミノ酸配列の相同性に関する１～２５％の差異のことを指す。

用語「インターロイキン－１０」または「ＩＬ－１０」とは、非共有結合的に接合してホモ二量体を形成する２つのサブユニットを含むタンパク質のことを指し、ここで、ＩＬ－１０は、２つの６ヘリックスバンドル（ヘリックスＡ～Ｆ）のインターカレート二量体である。本明細書中で使用されるとき、別段示されない限り、「インターロイキン－１０」および「ＩＬ－１０」とは、ヒトＩＬ－１０（「ｈＩＬ－１０」；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５６３；または米国特許第６，２１７，８５７号）のタンパク質（配列番号１）もしくは核酸（配列番号２）；マウスＩＬ－１０（「ｍＩＬ－１０」；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｍ３７８９７；または米国特許第６，２１７，８５７号）のタンパク質（配列番号７）もしくは核酸（配列番号８）；またはウイルスＩＬ－１０（「ｖＩＬ－１０」）を含むがこれらに限定されない任意の形態のＩＬ－１０のことを指す。ウイルスＩＬ－１０ホモログは、ＥＢＶまたはＣＭＶ（それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００７６０５およびＤＱ３６７９６２）に由来し得る。ＥＢＶ－ＩＬ１０という用語は、ＩＬ－１０のタンパク質（配列番号３）または核酸（配列番号４）のＥＢＶホモログのことを指す。ＣＭＶ－ＩＬ１０という用語は、ＩＬ－１０のタンパク質（配列番号５）または核酸（配列番号６）のＣＭＶホモログのことを指す。本明細書中で使用される用語「モノマーの」ＩＬ－１０またはＩＬ－１０の「モノマー」とは、非共有結合的に接合されたとき、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０のホモ二量体を形成する、ＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０の個々のサブユニットのことを指す。用語「野生型」、「ｗｔ」および「天然の」は、対象の特定のＩＬ－１０の起源の種において自然界で通常見られるようなタンパク質（例えば、ＩＬ－１０、ＣＭＶ－ＩＬ１０またはＥＢＶ ＩＬ－１０）の配列のことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。したがって、例えば、用語「野生型」または「天然の」ＥＢＶ ＩＬ－１０は、自然界で最もよく見られるアミノ酸配列に対応するだろう。

用語「バリアント」、「アナログ」および「ムテイン」とは、所望の活性、例えば、抗炎症活性を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体のことを指す。一般に、用語「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」、「バリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）」、「アナログ」および「ムテイン」は、ポリペプチドに関するとき、天然の分子と比べて１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加、置換（本質的に保存的であり得るもの）および／または欠失を有する天然のポリペプチド配列および構造を有する化合物のことを指す。したがって、用語「ＩＬ－１０バリアント」、「バリアントＩＬ－１０」、「ＩＬ－１０バリアント分子」ならびにそれらの文法上の変化形および複数形はすべて、野生型ＩＬ－１０と配列同一性または相同性が概して１～２５％異なるＩＬ－１０のアミノ酸（または核酸）配列のことを指す等価な用語であると意図されている。したがって、例えば、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント分子は、１つまたはそれを超えるアミノ酸（またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）の付加、置換および／または欠失を有することによって野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０と異なる分子である。したがって、１つの形態において、ＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントは、約１％～２５％の配列相同性の差異（これは結果的に約１～４２個のアミノ酸の差異になる）を有することによって配列番号３の野生型配列と異なるものである。１つの実施形態において、ＩＬ－１０バリアントは、Ｖ３１Ｌアミノ酸変異（「ＤＶ０５」；配列番号１２）、Ａ７５Ｉアミノ酸変異（「ＤＶ０６」；配列番号１４）、またはＶ３１ＬとＡ７５Ｉの両方のアミノ酸変異（「ＤＶ０７」；配列番号１６）を含むＥＢＶ ＩＬ－１０である。

用語「融合タンパク質」とは、通常は天然に存在しないタンパク質の新規の配置をもたらす、２つまたはそれを超えるタンパク質またはポリペプチドの組み合わせまたは結合体化のことを指す。融合タンパク質は、２つまたはそれを超えるタンパク質またはポリペプチドの共有結合の結果である。融合タンパク質を構成する２つまたはそれを超えるタンパク質は、アミノ末端（「ＮＨ_２」）からカルボキシ末端（「ＣＯＯＨ」）まで、任意の立体配置で配置され得る。したがって、例えば、１つのタンパク質のカルボキシ末端が、別のタンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかと共有結合的に連結され得る。例示的な融合タンパク質は、モノマーのＩＬ－１０またはモノマーのバリアントＩＬ－１０分子を、１つまたはそれを超える抗体可変ドメイン（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）または一本鎖可変領域（「ｓｃＦｖ」）と組み合わせることを含み得る。融合タンパク質はまた、二量体を形成し得るか、または同じタイプの他の融合タンパク質と会合して、融合タンパク質複合体をもたらし得る。融合タンパク質の複合化体は、場合によっては、非複合体化融合タンパク質と比べて、融合タンパク質の機能性を活性化し得るかまたは増大させ得る。例えば、１つまたはそれを超える抗体可変ドメインを有するモノマーのＩＬ－１０またはモノマーのバリアントＩＬ－１０分子は、ＩＬ－１０レセプターに結合する能力が限定的であるかまたは低下していることがあるが；しかしながら、その融合タンパク質が複合体化されると、モノマー型のＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０分子は、ホモ二量体になり、可変ドメインが会合して、機能的なダイアボディになる。

用語「ホモログ」、「相同性」、「相同」または「実質的に相同」とは、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間または少なくとも２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントのことを指す。配列が、それらの分子の規定の長さにわたって少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約８０％～８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％～９８％の配列同一性を示すとき、それらの配列は、互いに相同である。

用語「配列同一性」とは、ヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとの正確な対応のことを指す。配列同一性は、１００％の配列同一性から５０％の配列同一性までの範囲であり得る。パーセント配列同一性は、配列をアラインメントし、アラインメントされた２つの配列間の正確な一致数を数え、参照配列の長さで除算し、結果に１００を乗算することによって、２つの分子（参照配列および参照配列に対する同一性パーセントが不明な配列）の間の配列情報を直接比較することを含むがこれに限定されない種々の方法を用いて求めることができる。同一性パーセントの特定を支援するために、容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することができる。

用語「被験体」、「個体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物のことを指す。哺乳動物としては、マウス、げっ歯類、サル、ヒト、家畜、競技用動物およびある特定のペットが挙げられるが、これらに限定されない。

用語「投与する」には、本願の活性成分がその意図される機能を発揮できる投与経路が含まれる。

「治療有効量」は、例えば、本明細書中に記載されるＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質を投与することに関するとき、ある特定の生物学的活性を促進するのに十分な量のＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントまたはその融合タンパク質のことを指す。これらには、例えば、骨髄性細胞の機能の抑制、クッパー細胞の活性の増強、および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞もしくは増強されたＣＤ８^＋Ｔ細胞活性への任意の影響の欠如、ならびにマスト細胞のＦｃレセプターアップレギュレーションの遮断または脱顆粒の防止が含まれる可能性がある。したがって、「有効量」は、病状の症候または徴候を回復させるかまたは予防することになる。有効量は、診断を可能にするかまたは容易にするのに十分な量も意味する。

用語「処置する」または「処置」は、疾患または症状の影響を低減する方法のことを指す。処置は、単に症候ではなく、疾患または症状の根本原因そのものを低減する方法のことも指し得る。処置は、本来のレベルからの任意の減少であり得、疾患、症状または疾患もしくは症状の症候の完全な消失であり得るが、これらに限定されない。

以下の表は、本開示において言及されるＩＬ－１０を含む様々なＩＬ－１０融合タンパク質および二重サイトカイン融合タンパク質に対する定義を提供している。

二重サイトカイン融合タンパク質の構造
本開示は、その全体が参照により援用される米国特許１０，８５８，４１２（米国出願番号１６／８１１，７１８として出願）に以前に記載されたＩＬ－１０融合タンパク質の実施形態に対する改善を提供する。そのＩＬ－１０融合タンパク質の改善は、先に記載されたＩＬ－１０融合タンパク質に第２のサイトカイン分子を組み込むことを含む。図１は、米国特許１０，８５８，４１２に記載されている以前に開示されたＩＬ－１０融合タンパク質構築物の１つを表している模式図である。このＩＬ－１０融合タンパク質は、各端におけるＩＬ－１０の２つのモノマー（すなわち、アミノ末端に第１のＩＬ－１０モノマーおよびカルボキシ末端に第２のＩＬ－１０モノマー）を特徴とする、ＶＨとＶＬとのｓｃＦｖ足場上に構築されている。この一次足場システムは、ヒト抗エボラ抗体から得られたｓｃＦｖを含む。米国特許１０，８５８，４１２に記載されているＩＬ－１０融合タンパク質は、ＶＨにおけるＣＤＲ１～３およびＶＬにおけるＣＤＲ１～３を有する６つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む。必要に応じて、そのＶＨおよびＶＬ領域は、ＩＬ－１０融合タンパク質を特定の抗原にターゲッテングすることができる。これは、ＶＨとＶＬとの対の６つのＣＤＲ領域（ＶＨにおける３つのＣＤＲおよびＶＬにおける３つのＣＤＲ）を、レセプターもしくは抗原ターゲッテング抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＨおよびＶＬからの６つのＣＤＲ領域で置換することによって達成される。６つのＣＤＲおよびフレームワーク領域を置換および最適化できること、ならびにこれらのＣＤＲを本明細書中に記載されるｓｃＦｖ足場に移植できることは、当業者に周知であり、当業者によって実施されている。これらの６つのＣＤＲ領域は、当業者であれば目的の特定の標的に基づいて決定することが可能である任意のモノクローナル抗体からの６つのＣＤＲと置換可能である。

第１の態様において、本願は、ＩＬ－１０および少なくとも１つの他のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質に関し、その二重サイトカイン融合タンパク質は、米国特許１０，８５８，４１２に以前に記載されたＩＬ－１０融合タンパク質と比べて、複合型のまたは相乗的な機能性を有する。図２は、ＩＬ－１０を含む改善された二重サイトカイン融合タンパク質の代表図である。特に、改善された二重サイトカイン融合タンパク質は、ＶＨとＶＬとのｓｃＦｖから構成される同じまたは実質的に同じ足場システムを適応させ、ＩＬ－１０の２つのモノマーが、アミノ末端およびカルボキシ末端において二重融合タンパク質を終端させる。第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのヒンジ領域であるｓｃＦｖのＶＨ領域とＶＬ領域との間で融合されることによって、ＩＬ－１０融合タンパク質に結合体化される。この二重サイトカイン融合タンパク質は、機能的なタンパク質複合体を形成することができ、ＩＬ－１０のモノマーが、ホモ二量体化して機能的なＩＬ－１０分子になり、ＶＨ領域とＶＬ領域とが、会合して抗原結合および抗原認識を可能にするｓｃＦｖ複合体を形成する対を形成する。

ある特定の実施形態において、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、式Ｉ
ＮＨ_２－（ＩＬ１０）－（Ｘ^１）－（Ｚ_ｎ）－（Ｘ^２）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ
を有する構造であり、式中、
「ＩＬ－１０」は、例えば、ヒト、マウス、ＣＭＶまたはＥＢＶ ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子であるがこれらに限定されない、任意のＩＬ－１０モノマーであり；
「Ｘ^１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；
「Ｘ^２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨ領域またはＶＬ領域であり、
ここで、Ｘ^１がＶＬであるとき、Ｘ^２はＶＨであるか、またはＸ^１がＶＨであるとき、Ｘ^２はＶＬであり；
「Ｚ」は、第２のサイトカインであり、その第２のサイトカインは、ＩＬ－１０以外のサイトカインであり；
「ｎ」は、０～２から選択される整数である。

別の実施形態において、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、式ＩＩ
ＮＨ_２－（ＩＬ１０）－（Ｌ）－（Ｘ^１）－（Ｌ）－（Ｚ_ｎ）－（Ｌ）－（Ｘ^２）－（Ｌ）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ
を有する構造であり、式中、
「ＩＬ－１０」は、ＩＬ－１０モノマーであり；
「Ｌ」は、リンカー、好ましくは、配列番号３９、４０または４１のリンカーであり；
「Ｘ^１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；
「Ｘ^２」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；
ここで、Ｘ^１がＶＬであるとき、Ｘ^２はＶＨであるか、またはＸ^１がＶＨであるとき、Ｘ^２はＶＬであり；
「Ｚ」は、第２のサイトカインであり；
「ｎ」は、０～２から選択される整数である。

１つの実施形態において、ＩＬ－１０モノマーは、ヒト（配列番号１）、ＣＭＶ（配列番号５）、ＥＢＶ（配列番号３）またはマウス（配列番号７）を含む任意の形態のＩＬ－１０を含む。別の実施形態において、ＩＬ－１０モノマーは、米国特許１０，８５８，４１２に記載されているものを含む、改変型またはバリアント型のＥＢＶ ＩＬ－１０（配列番号３）である。好ましい実施形態において、ＥＢＶ ＩＬ－１０は、配列番号３においてアミノ酸位置３１（本明細書中で「ＤＶ０５」と呼ばれる）、７５（本明細書中で「ＤＶ０６」と呼ばれる）またはその両方（本明細書中で「ＤＶ０７」と呼ばれる）に１つまたはそれを超える置換を含む。なおも別の実施形態において、ＩＬ－１０モノマーは、配列番号９、１０、１１、１２、１４または１６の配列である。ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子の第１および第２のモノマーはそれぞれ、図１に表されているように融合タンパク質の末端に位置する（すなわち、アミノ末端に第１のモノマーおよびカルボキシ末端に第２のモノマー）。

別の実施形態において、ＶＨおよびＶＬ領域は、抗体、抗体フラグメントまたはその抗原結合フラグメントからのものである。その抗原結合フラグメントには、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｖ－ＮＡＲ、ダイアボディまたはナノボディが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ＶＨおよびＶＬは、一本鎖可変フラグメント（「ｓｃＦｖ」）からのものである。

別の実施形態において、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、単一の抗体からのＶＨとＶＬとの対を含む。そのＶＨとＶＬとの対は、ＩＬ－１０またはそのバリアントのモノマーがホモ二量体化して機能性ＩＬ－１０分子になることができ得るように、ＩＬ－１０またはそのバリアントのモノマーが付着し得る足場として作用する。ゆえに、当業者は、融合タンパク質において使用されるＶＨとＶＬとの足場が、ＩＬ－１０モノマーもしくはＩＬ－１０モノマーバリアントの適正なホモ二量体化に必要とされる所望の物理的特質ならびに／またはＶＨおよびＶＬのターゲッテング能力を維持したいという要望に基づいて選択され得ることを認識するだろう。同様に、当業者は、ＶＨとＶＬとの対における６つのＣＤＲ（ＶＨからの３つのＣＤＲおよびＶＬからの３つのＣＤＲ）を他の抗体からの６つのＣＤＲで置換して、特異的にターゲッテングする融合タンパク質を得てもよいことも理解するだろう。１つの実施形態において、任意のモノクローナル抗体のＶＨからの３つのＣＤＲおよびＶＬからの３つのＣＤＲ（すなわち、ＶＨとＶＬとの対）が、配列番号１８、２０、２１、２３、２４または２５を含む足場システムに移植され得る。融合タンパク質が、いずれの特定の抗原を標的にするようにも意図されていない場合、ＶＨとＶＬとの対が、いずれの特定の抗原も標的としない（またはインビボにおいて少ない存在量の抗原である）足場として選択され得ることも想定される（例えば、抗ＨＩＶおよび／または抗エボラ抗体からのＶＨとＶＬとの対）。したがって、ある実施形態において、本願のＩＬ－１０融合タンパク質は、ヒト抗エボラ抗体からのＶＨとＶＬとの対、より好ましくは、配列番号１８、２１または２５の配列を含み得る。融合タンパク質は、一連の１～４つの可変領域を含み得る。別の実施形態において、可変領域は、同じ抗体からのものであってもよいし、少なくとも２つの異なる抗体からのものであってもよい。

別の実施形態において、抗体可変鎖またはＶＨとＶＬとの対またはＶＨとＶＬとの対の６つのＣＤＲの標的特異性は、タンパク質、細胞レセプターおよび／または腫瘍関連抗原を標的にするものを含み得るが、これらに限定されない。別の実施形態において、任意のＶＨとＶＬとの対からのＣＤＲ領域が、上に記載された足場システムに移植され得、そのような足場は、好ましくは、Ｄｅｂｏと呼ばれるシステム（図１に模式的に表されている）を含み、ＩＬ－１０モノマーが、ヒト抗エボラ抗体のＶＨおよびＶＬ領域を含むｓｃＦｖに連結され、第２のサイトカインが、ｓｃＦｖのヒンジ領域において連結される（図２に模式的に表されている）。より好ましくは、Ｄｅｂｏ足場システムへの移植は、配列番号１８、２０、２１、２３、２４または２５の配列を含む足場において行われる。なおも別の実施形態において、可変領域またはＶＨとＶＬとの対またはＶＨとＶＬとの対の６つのＣＤＲは、様々な疾患（例えば、癌）に関連する抗原または健康な被験体の血清中に通常見られないもしくはめったに見られない抗原を標的にする抗体、例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＦＧＦＲ、ＧＰＣ３、または他の腫瘍関連抗原、ＭＡｄＣａｍ、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＣＤ１４または他の炎症関連細胞表面タンパク質、ＨＩＶおよび／もしくはエボラに対する抗体からの可変領域から得られる。したがって、１つの実施形態において、可変領域は、例えば、抗ＥＧＦＲ、抗ＭＡｄＣａｍ、抗ＨＩＶ（Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２０１８，９２（１８）：ｅ００６４１１－１９）、抗ＩＣＡＭ、抗ＶＣＡＭ、抗ＣＤ１４または抗エボラ（米国出願公開２０１８／０１８０６１４（その全体が参照により援用される）、特に、表２、３および４に記載されているｍＡｂ）抗体から得られるかまたはそれらに由来する。別の実施形態において、可変領域は、ＩＬ－１０がその生物学的効果を誘発するのを可能にするように、ＩＬ－１０などのサイトカインの濃度を特定の標的領域に濃縮することができる抗体から得られるかまたはそれらに由来する。このような抗体には、ある特定の罹患領域において過剰発現もしくはアップレギュレートされているレセプターもしくは抗原を標的にする抗体、または影響を受けたある特定の領域において特異的に発現される抗体が含まれ得る。例えば、可変領域は、いくつかの例を挙げれば、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）；ＣＤ５２；ＣＤ１４；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３またはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；およびＳＲ－Ｊ１に特異的な抗体から得られ得る。ＩＬ－１０（例えば、ヒト、ＣＭＶまたはＥＢＶ）またはバリアントＩＬ－１０分子（本明細書中に記載される）のモノマーが、可変領域（ＶＨまたはＶＬ）のアミノ末端またはカルボキシ末端に結合体化され、その結果、そのモノマーＩＬ－１０またはバリアントＩＬ－１０分子は、互いに二量体化することができる。好ましい実施形態において、ＩＬ－１０（またはバリアントＩＬ－１０）のモノマーは、式ＩまたはＩＩに従ってＶＨとＶＬとの対に融合され、ここで、ＩＬ－１０モノマーは、ＥＢＶ ＩＬ－１０、ＤＶ０５、ＤＶ０６またはＤＶ０７型のＩＬ－１０である。

二重サイトカイン融合タンパク質または二重サイトカイン融合タンパク質複合体は、抗原ターゲッテング機能も有し得る。二重サイトカイン融合タンパク質または二重サイトカイン融合タンパク質複合体は、互いに会合して抗原結合部位またはＡＢＳを形成することができるＶＨとＶＬとの対を含み得る。いくつかの配置において、ＩＬ－１０モノマーまたはそのＩＬ－１０バリアントモノマーは、抗原結合部位を含む末端に共有結合的に連結され得る。可変領域は、被験体における抗原性を低下させる１つまたはそれを超えるアミノ酸を変更することによって、さらに改変され得る（例えば、付加、減算または置換によって）。可変領域に対する他の改変としては、ＶＨおよびＶＬ領域の６つのＣＤＲ領域の外側に見られ、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ領域の安定性および発現を高めるのに役立つ、アミノ酸の置換、欠失または付加が挙げられ得る。例えば、それらの改変には、配列番号２７、２９、３１または３３に記載されている改変が含まれ得、ここで、それらのＣＤＲ領域は、抗ＥＧＦＲ抗体のＶＨおよびＶＬ領域から得られ、それらのＣＤＲの外側の領域は、ｓｃＦｖを安定化するように最適化され、かつ／または発現を増加させるように最適化されており、これは、ｓｃＦｖのＶＨ領域とＶＬ領域との間に第２のサイトカインを連結する基礎として使用され得る。これらのタイプの改変が当業者の権限内にあることを実証するために、ＣＤＲ領域およびＣＤＲの外側の領域に対する類似の改変を、ＤＶ０７を含み、かつヒトＨＥＲ２を標的にするＤＫ２^１０型の分子（すなわち、ＤＫ２^１０ｈｅｒ２）、例えば、配列番号５２～５４または５５、より好ましくは、配列番号５４（バリアント４）または５５（バリアント５）に記載されているものに対して行った。さらに、ＣＤＲ領域およびＣＤＲの外側の領域に対する改変を、ＤＶ０６を含み、かつヒトＣＤ１４を標的にするＤＫ４^１０型の分子（すなわち、ＤＫ４^１０ＣＤ１４ＤＶ０６）、例えば、配列番号５６～５８または５９、より好ましくは、配列番号５６（バリアント２）に記載されているものに対して行った。これらおよび他の改変を、ＤＶ０７を含み、かつヒトＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２を標的にするＤＫ２^１０型の分子；またはＤＶ０６を含み、かつヒトＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２を標的にするＤＫ４^１０型の分子に対して行ってもよい。当業者であれば、ｓｃＦｖを安定化させる他の改変を判断することおよび／または発現の目的のために配列を最適化することが可能だろう。

ＶＨとＶＬとの対は、複数の抗体に対して得られたＣＤＲ領域がグラフトまたは移植され得る足場を形成する。そのような抗体ＣＤＲ領域としては、上に記載された公知の抗体が含まれる。上に記載されたＶＨとＶＬとの足場におけるＣＤＲ領域は、ＣＤＲの移植／挿入に利用可能な以下の数のアミノ酸位置を含み得る；

好ましい実施形態において、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、以前に記載された足場ＩＬ－１０融合タンパク質を含み、ここで、ＶＨとＶＬとの対は、抗エボラ抗体（例えば、配列番号１９、２７、２９、３１および３３に記載されているもの）に由来し、その抗エボラ抗体からの６つのＣＤＲ領域は、除去され、特定のターゲッテング抗体のＶＨとＶＬとの対が移植される（例えば、ＥＧＦＲ；ＣＤ５２；ＣＤ１４；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＣＤ１４、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；およびＳＲ－Ｊ１であるがこれらに限定されない）。ある実施形態において、６つの抗エボラＣＤＲ領域は、抗ＥＧＦＲ、抗ＭＡｄＣＡＭ、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＰＤＧＦＲまたは抗ＣＤ１４からの６つのＣＤＲ領域で置換される。好ましい実施形態において、ＩＬ－１０融合タンパク質は、上に記載された抗体からのＣＤＲのいずれかが移植され得る配列番号１８、２０、２１、２３、２４または２５の配列である。より好ましい実施形態において、ＩＬ－１０融合タンパク質は、配列番号１９、２２または２６の配列である。好ましい実施形態において、第２のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮαであるがこれらに限定されない）は、配列番号１８～２７、２９、３１または３３の配列を有するＩＬ－１０融合タンパク質の、ヒト抗エボラ抗体から得られるｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のヒンジ領域において連結される。

なおも別の実施形態において、第２のサイトカインは、図２に描かれているように、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間に融合される。第２のサイトカインは、第２のサイトカインがその機能特性を保持するようにＶＨ領域とＶＬ領域との間に結合体化される。１つの実施形態において、第２のサイトカインは、ＩＬ－１０モノマーとは異なる。別の態様において、第２のサイトカインは、ＩＬ－１０である。１つの実施形態において、第２のサイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－βまたは腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１またはＩＬ－１３である。好ましい実施形態において、ＩＬ－１０およびＩＬ－２またはＩＬ－４を含む二重サイトカイン融合タンパク質における第２のサイトカイン。より好ましい実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質は、配列番号３５、４６～５８または５９の配列である。なおも別の実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質は、ＤＶ０５、ＤＶ０６またはＤＶ０７から選択されるＩＬ－１０バリアント分子を含み；そのＩＬ－１０バリアント分子は、ヒト抗エボラ抗体からのＶＨおよびＶＬ領域を含む足場システム（すなわち、Ｄｅｂｏ）に連結されており、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ１４、抗ＶＥＧＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＭＡｄＣＡＭまたは抗ＰＤＧＦＲから選択される抗体からのＣＤＲがＤｅｂｏに移植され；ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮαから選択される第２のサイトカインが、ＶＨとＶＬとの対のヒンジ領域において連結されている。最も好ましい実施形態において、二重サイトカインは、配列番号３５、４６～５８または５９の融合タンパク質である。

さらに他の実施形態において、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質は、リンカーを組み込んでいる。当業者は、リンカーまたはスペーサーを用いることにより、様々な融合タンパク質部分の適正な空間的配置が達成されることを承知しており、ゆえに、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質の形成において使用するのに適切なリンカーを選択できる。より好ましい実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、ランダムなアミノ酸配列（例えば、ＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）またはＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１））抗体の定常領域であり得る。定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥに由来し得るが、これらに限定されない。１つの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、定常重鎖（「ＣＨ」）領域１、ＣＨ_２またはＣＨ_３である。より好ましい実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、配列番号４０のランダムなアミノ酸配列である。別の態様において、リンカーまたはスペーサーは、少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合をさらに含み得る。

他の態様において、本開示は、ＩＬ－１０および第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。ゆえに、１つの実施形態は、配列番号３５、４６～５８または５９に示されているタンパク質をコードする核酸配列を含む。好ましい実施形態において、その核酸配列には、ＤＫ２^１０ｅｇｆｒ（配列番号６０）、ＤＫ２^１０ｈｅｒ２（配列番号６２または６３）、ＤＫ４^１０ＣＤ１４ＤＶ０６もしくはＤＫ４^１０ｎｇＤＶ０６ＣＤ１４（配列番号６１）、またはそれらの７０～９９％の配列相同性を共有する核酸配列が含まれる。別の実施形態において、その核酸配列は、ＤＶ０７を含み、ヒトＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２を標的にする、ＤＫ２^１０型；またはＤＶ０６を含み、ヒトＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ２を標的にする、ＤＫ４^１０型の分子をコードする。ＩＬ－１０および第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、記載される二重サイトカイン融合タンパク質の機能特性を変化させない改変も含み得る。そのような改変は、従来の組換えＤＮＡの手法および方法を用いる。例えば、特定のアミノ酸配列の付加または置換が、合成オリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異誘発法（これらの方法は当該分野で周知である）を用いて、核酸（ＤＮＡ）レベルでＩＬ－１０配列に導入され得る。好ましい実施形態において、ＩＬ－１０および第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子は、ＩＬ－１０バリアント分子の機能を変化させない挿入、欠失または置換（例えば、縮重コード）を含み得る。ＩＬ－１０バリアントおよび本明細書中に記載される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に起因してアミノ酸配列とは異なることがあり、上述の配列と７０～９９％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同であり得る。したがって、本開示の実施形態は、配列番号３５、４６～５８または５９のタンパク質をコードする核酸配列を含むが、遺伝暗号の縮重に起因して７０～９９％異なる。

本明細書中に記載される二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、そのタンパク質の発現、産生または分泌を補助する周知の配列をさらに含み得る。そのような配列としては、例えば、リーダー配列、シグナルペプチドおよび／または翻訳開始部位／配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）が挙げられ得る。本明細書中に記載されるヌクレオチド配列は、様々な発現系／ベクターへの挿入を可能にする１つまたはそれを超える制限酵素部位も含み得る。

別の実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子療法において直接使用され得る。１つの実施形態において、本願のバリアントＩＬ－１０分子または融合タンパク質は、変異ＩＬ－１０タンパク質の直接投与および変異ＩＬ－１０タンパク質をコードするベクターによる遺伝子療法をはじめとした当該分野で公知の方法によって送達され得る。遺伝子療法は、プラスミドＤＮＡまたはウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど）を用いて達成され得る。いくつかの実施形態において、本願のウイルスベクターは、ウイルス粒子として投与され、他の実施形態では、プラスミドとして（例えば、「裸の」ＤＮＡとして）投与される。

ヌクレオチド配列を送達するための他の方法には、当該分野で既に公知のものが含まれる。これらには、細胞透過性ペプチド、疎水性部分、静電気的複合体、リポソーム、リガンド、リポソームナノ粒子、リポタンパク質（好ましくは、ＨＤＬまたはＬＤＬ）、葉酸が標的にするリポソーム、抗体（例えば、葉酸レセプター、トランスフェリンレセプター）、ターゲッテングペプチドまたはアプタマーによる、ＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアント分子をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはそれらのバリアントであるがこれらに限定されない）の送達が含まれ得る。ＩＬ－１０バリアント分子をコードするヌクレオチド配列は、直接注射、注入、パッチ、包帯、ミストもしくはエアロゾルまたは薄膜送達によって被験体に送達され得る。ヌクレオチド（またはタンパク質）は、サイトカイン刺激のターゲッテング送達が望まれる任意の領域に向けられ得る。これらとしては、例えば、肺、消化管、皮膚、肝臓、頭蓋内注射による脳、超音波ガイド下注射による深在性で転移性の腫瘍病変が挙げられ得る。

別の態様において、本開示は、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質を調製し、精製する方法に関する。例えば、本明細書中に記載される二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸配列が、融合タンパク質を組換え的に作製するために使用され得る。例えば、従来の分子生物学およびタンパク質発現の手法を用いて、本明細書中に記載される二重サイトカイン融合タンパク質が、哺乳動物細胞系から発現され、精製され得る。これらの系には、周知の真核細胞発現ベクターシステムおよび宿主細胞が含まれる。種々の好適な発現ベクターを使用してよく、それらは、当業者に周知であり、バリアントＩＬ－１０分子および融合タンパク質の発現および導入に使用することができる。これらのベクターとしては、例えば、ｐＵＣ型ベクター、ｐＢＲ型ベクター、ｐＢＩ型ベクター、ｐＧＡ型、ｐＢｉｎｌ９、ｐＢＩ１２１、ｐＧｒｅｅｎシリーズ、ｐＣＡＭＢＲＩＡシリーズ、ｐＰＺＰシリーズ、ｐＰＣＶ００１、ｐＧＡ４８２、ｐＣＬＤ０４５４１、ｐＢＩＢＡＣシリーズ、ｐＹＬＴＡＣシリーズ、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ１、ｐＧＰＴＶシリーズおよびウイルスベクターなどが挙げられる。周知の宿主細胞系には、ＣＨＯ細胞における発現が含まれるがこれに限定されない。

二重サイトカイン融合タンパク質を保有する発現ベクターは、ベクターの機能性に必要な他のベクター構成要素も含み得る。例えば、ベクターは、シグナル配列、タグ配列、プロテアーゼ識別配列、選択マーカー、ならびに二重サイトカイン融合タンパク質の適正な複製および発現に必要な他の配列である制御配列（例えば、プロモーター）を含み得る。ベクターにおいて利用される特定のプロモーターは、種々の宿主細胞型において二重サイトカイン融合タンパク質の発現を駆動できる限り、特に限定されない。同様に、Ｔａｇプロモーターのタイプも、そのＴａｇ配列が、発現されるバリアントＩＬ－１０分子の精製がより単純または容易にする限り、限定されない。これらとしては、例えば、６－ヒスチジン、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＡＴ、ＨＮ、Ｓ、ＴＦ、Ｔｒｘ、Ｎｕｓ、ビオチン、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＲＣＦＰ、ＧＦＰなどが挙げられ得る。プロテアーゼ認識配列は、特に限定されず、例えば、Ｘａ因子、トロンビン、ＨＲＶ、３Ｃプロテアーゼなどの認識配列が使用され得る。選択されるマーカーは、形質転換されたイネ植物細胞を検出できる限り、特に限定されず、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを使用することができる。

上に記載された二重サイトカイン融合タンパク質は、製造プロセス中の融合タンパク質の回収または精製を補助する追加のアミノ酸配列も含み得る。これらには、様々な配列修飾または親和性タグ（例えば、プロテインＡ、アルブミン結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、ＦＬＡＧエピトープ、ガラクトース結合タンパク質、ヒスチジンタグおよび当該分野で周知の他の任意のタグであるがこれらに限定されない）が含まれ得る。例えば、Ｋｉｍｐｌｅら（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２０１３，７３：Ｕｎｉｔ ９．９，Ｔａｂｌｅ ９．９１（その全体が参照により援用される））を参照のこと。１つの態様において、親和性タグは、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４２）のアミノ酸配列を有するヒスチジンタグである。このヒスチジンタグは、最終生成物から除去されてもよいし、そのまま残されてもよい。別の実施形態において、親和性タグは、融合タンパク質（例えば、本明細書中に記載される融合タンパク質のＶＨ領域）に組み込まれるプロテインＡ修飾である。当業者は、本明細書中に記載される任意の二重サイトカイン融合タンパク質配列が、当該分野において説明されているように抗体フレームワーク領域内にアミノ酸の点置換を挿入することによって、プロテインＡ修飾を組み込むように改変され得ることを理解するだろう。

別の態様において、上記タンパク質、および二重サイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子は、治療有効量の二重サイトカイン融合タンパク質ならびに薬学的キャリアおよび／または薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物として製剤化され得る。薬学的組成物は、通常使用される緩衝剤、賦形剤、保存剤、安定剤を用いて製剤化され得る。二重サイトカイン融合タンパク質を含む薬学的組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と混合される。様々な薬学的キャリアが、当該分野で公知であり、薬学的組成物において使用され得る。例えば、キャリアは、本願の二重サイトカイン融合タンパク質組成物を患者に送達するのに適した任意の適合性の無毒性物質であり得る。好適なキャリアの例としては、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンクス液が挙げられる。キャリアには、２９００（Ｌ６４）、３４００（Ｐ６５）、４２００（Ｐ８４）、４６００（Ｐ８５）、１１，４００（Ｆ８８）、４９５０（Ｐ１０３）、５９００（Ｐ１０４）、６５００（Ｐ１０５）、１４，６００（Ｆ１０８）、５７５０（Ｐ１２３）および１２，６００（Ｆ１２７）という分子量を有するものを含むがこれらに限定されない当業者に広く公知の任意のポロキサマーも含まれ得る。キャリアには、乳化剤も含まれ得、これらとしては、いくつか例を挙げれば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０が挙げられるがこれらに限定されない。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性キャリアも使用され得る。そのキャリアには、等張性および化学的安定性を高める物質、例えば、緩衝剤および保存剤などの添加物も含まれ得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８４）を参照のこと。治療薬および診断薬の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態で、生理的に許容され得るキャリア、賦形剤または安定剤と混合することによって調製され得る。

薬学的組成物は、所望の治療結果を提供するのに十分な治療有効量で患者に投与するために製剤化され得る。好ましくは、そのような量は、最小限の負の副作用を有する。１つの実施形態では、投与される二重サイトカイン融合タンパク質の量は、炎症性疾患または炎症性症状を処置または予防するのに十分であり得る。別の実施形態において、投与される二重サイトカイン融合タンパク質の量は、免疫疾患または免疫障害を処置または予防するのに十分であり得る。さらに別の実施形態において、投与される二重サイトカイン融合タンパク質の量は、癌を処置または予防するのに十分であり得る。投与される量は、患者によって異なることがあり、被験体または患者の疾患または症状、患者の全般的な健康状態、投与方法、副作用の重症度などを考慮することによって決定される必要があり得る。

特定の患者に対する有効量は、治療される症状、患者の全般的な健康状態、投与方法、投与経路および投与用量ならびに副作用の重症度などの因子に応じて異なることがある。患者に投与される適切な用量は、通常、処置に影響を及ぼすことが当該分野で公知であるかもしくは疑われているかまたは処置に影響を及ぼすと予測されるパラメータまたは因子を用いて、臨床医によって決定される。一般に、用量は、最適な用量よりやや少ない量から開始され、その後、あらゆる負の副作用と比べて所望のまたは最適な効果が達成されるまで、少量ずつ増加される。重要な診断尺度としては、例えば、炎症の症候または産生される炎症性サイトカインのレベルの尺度が挙げられる。

現在説明している二重サイトカイン融合タンパク質の投薬を決定するための方法は、米国特許１０，８５８，４１２号に記載されている方法と実質的に類似であり得る。概して、現在説明している二重サイトカイン融合タンパク質は、０．５マイクログラム／キログラム～１００マイクログラム／キログラムの範囲内の投薬を有し得る。二重サイトカイン融合タンパク質は、毎日、１週間に３回、１週間に２回、毎週、月２回または毎月投与され得る。有効量の治療薬は、症候を軽減することによって、炎症または疾患もしくは症状のレベルに影響を及ぼし得る。例えば、その影響は、疾患または症状が緩和されるか完全に処置されるような、少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％；少なくとも５０％；またはそれを超える影響のレベルを含み得る。

本願の組成物は、経口的に投与することもできるし、身体内に注射することもできる。経口で使用するための製剤は、バリアントＩＬ－１０分子を消化管内のプロテアーゼからさらに保護するための化合物も含み得る。注射は通常、筋肉内、皮下、皮内または静脈内注射である。あるいは、関節内注射または他の経路も、適切な状況において使用され得る。非経口的に投与される二重サイトカイン融合タンパク質は、好ましくは、薬学的キャリアおよび／または薬学的に許容され得る賦形剤と併せて単位投与量の注射剤の形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）として製剤化される。他の実施形態において、本願の組成物は、植え込み可能または注射可能な薬物送達系によって患者の身体に導入されることがある。

二重サイトカイン融合タンパク質の試験
複数のスクリーニングアッセイが公知であり、それらは、所望の生物学的機能を試験するために当業者に利用可能である。１つの実施形態において、所望の生物学的機能としては、抗炎症反応の低減、Ｔ細胞刺激の低減、Ｔ細胞機能の強化、クッパー細胞の機能性の強化およびマスト細胞の脱顆粒の低減が挙げられるが、これらに限定されない。

例えば、ＩＬ－１０の曝露により、Ｔ細胞がプライミングされて、Ｔ細胞レセプター刺激の際に、より多くのＩＦＮγが生成および分泌されることが知られている。同時に、ＩＬ－１０の曝露は、ＬＰＳに応答して単球／マクロファージから分泌されるＴＮＦα、ＩＬ－６および他の炎症促進性サイトカインの分泌を妨げる。ＩＬ－１０は、ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ_ｒｅｇの増殖も抑制する。１つの実施形態において、単球／マクロファージ抑制を最大にするが、刺激応答と抑制応答の両方を含むＴ細胞効果を欠く二重サイトカイン融合タンパク質が、ポジティブ選択され得る。１つの実施形態において、抗炎症効果が増大した二重サイトカイン融合タンパク質のスクリーニングは、自己免疫疾患、抗炎症性疾患またはその両方の処置のためにポジティブ選択され得る。別の実施形態において、クッパー細胞の捕捉性を強化し、Ｔ_ｒｅｇ抑制を欠く二重サイトカイン融合タンパク質が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および／または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の処置のために開発されるように選択され得る。なおも別の実施形態において、刺激応答と抑制応答の両方を含むＴ細胞の生物学的作用を最大にし、クッパー細胞の捕捉性が強化された二重サイトカイン融合タンパク質が、癌の処置のために開発されるように選択され得る。二重サイトカイン融合タンパク質をスクリーニングする様々なアッセイおよび方法が、同時係属中の米国特許１０，８５８，４１２（その全体が参照により援用される）に以前に記載されている。米国出願１６／８１１，７１８の明細書の３９～４２頁を参照のこと。

二重サイトカインを用いた処置方法および／または予防方法
他の態様において、本開示は、悪性の疾患もしくは症状または癌を処置および／または予防する方法に関し、その方法は、それを必要とする被験体に治療有効量の、ＩＬ－１０および第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質を投与する工程を含む。そのようなタンパク質は、ＤＫ２^１０型であり得、ここで、その融合タンパク質は、腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）を標的にする任意の抗体からのＣＤＲが移植されたヒト抗エボラ抗体から得られるＶＨとＶＬとの足場システムに連結されたＤＶ０７のモノマー；ならびにＶＨおよびＶＬのヒンジ領域の間に連結された第２のサイトカインであるＩＬ－２を含み得る。好ましい実施形態では、二重サイトカイン融合タンパク質は、ＤＶ０７のＥＢＶ ＩＬ－１０モノマーを含む。より好ましい実施形態において、ＥＢＶ ＩＬ－１０モノマーは、配列番号３のＥＢＶ ＩＬ－１０のアミノ酸位置３１（Ｖ３１Ｌ）および７５（Ａ７５Ｉ）に両方の置換を含む。より好ましい実施形態において、ＥＢＶ ＩＬ－１０は、配列番号１１または１６である。好ましい実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質は、抗エボラ抗体からのＶＨとＶＬとの対を含み、ここで、そのＣＤＲは、任意のＴＡＡターゲッテング抗体からの６つのＣＤＲで置換されている。好ましい実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質のＶＨおよびＶＬ領域は、配列番号３７のＶＨおよび配列番号３８のＶＬを含む。より好ましい実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質は、抗エボラ抗体からのＶＨとＶＬとの対を含み、そのＣＤＲは、抗ＥＧＦＲ抗体（配列番号２７、２９、３１または３３）からの６つのＣＤＲで置換されており、第２のサイトカインは、ｓｃＦｖのＶＨ領域とＶＬ領域との間に連結されている。他の実施形態において、６つのＣＤＲ領域は、抗Ｈｅｒ２ Ｎｅｕ；抗ＰＤＧＦＲ；抗ＶＥＧＦＲ１および抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ；抗ＨＥＲ３；または抗ＧＰＣ３からの６つのＣＤＲで置換されている。好ましくは、６つのＣＤＲは、抗ＥＧＦＲまたは抗ＨＥＲ２から得られる。別の好ましい実施形態において、第２のサイトカインは、ＩＬ－２である。最も好ましい実施形態では、癌を処置するために、配列番号３５（ＥＧＦＲを標的にする）または５２～５５（ＨＥＲ２を標的にする）の二重サイトカイン融合タンパク質が使用される。

さらに他の態様において、本開示は、炎症性疾患または炎症性症状を処置および／または予防する方法に関し、その方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の、ＩＬ－１０（またはそのバリアント、例えば、ＤＶ０６）および第２のサイトカイン（例えば、ＩＬ－４）を含む二重サイトカイン融合タンパク質を投与する工程を含む。好ましい実施形態において、炎症性疾患または炎症性障害としては、クローン病、乾癬および関節リウマチ（「ＲＡ」）が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなタンパク質は、ＤＫ４^１０型であり得、ここで、その融合タンパク質は、様々な炎症性／免疫レセプターまたはタンパク質を標的にする任意の抗体（例えば、抗ＣＤ１４、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ＭＡｄＣＡＭ）からのＣＤＲが移植されたヒト抗エボラ抗体から得られるＶＨとＶＬとの足場システムに連結されたＤＶ０６のモノマー；ならびにＶＨおよびＶＬのヒンジ領域の間に連結された第２のサイトカインであるＩＬ－４（配列番号４３）または非グリコシル化型のＩＬ－４（配列番号４４）を含み得る。ある実施形態において、ＩＬ－１０モノマーは、野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０、ＥＢＶ ＩＬ－１０の７５位に単一のアミノ酸置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント（ＤＶ０６）、またはＥＢＶ ＩＬ－１０の３１および７５位に２つのアミノ酸置換を有するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアント（ＤＶ０７）を含む。好ましい実施形態において、ＥＢＶ ＩＬ－１０モノマーは、野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０またはＤＶ０６である。より好ましい実施形態において、ＥＢＶ ＩＬ－１０は、配列番号３、９、１０、１１、１４または１６である。好ましい実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質は、ヒト抗エボラ抗体からのＶＨとＶＬとの対を有する足場システムを含む。より好ましい実施形態において、炎症性疾患または炎症性症状を処置するために使用される二重サイトカイン融合タンパク質は、ヒト抗エボラ抗体からのＶＨとＶＬとの対を含み、ここで、そのＣＤＲは、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体（好ましくは、ヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体）または抗ＣＤ１４抗体（好ましくは、ヒト抗ＣＤ１４抗体）または抗ＶＥＧＦＲ２（好ましくは、ヒト抗ＶＥＧＦＲ２抗体）のＶＨおよびＶＬからの６つのＣＤＲで置換されている。別の好ましい実施形態において、第２のサイトカインは、ＩＬ－４であり、好ましくは、Ｎ３８Ａ置換を有するＩＬ－４バリアント（配列番号４４）である。最も好ましい実施形態において、炎症性疾患には、抗ＣＤ１４抗体からのＣＤＲが抗エボラのＶＨとＶＬとのｓｃＦｖ足場システムに移植されている、ＤＶ０６またはＤＶ０７モノマーおよびＩＬ－４を含む二重サイトカイン融合タンパク質で処置される敗血症および／または敗血症性ショックが含まれる。好ましい実施形態において、二重サイトカイン融合タンパク質は、配列番号５６～５８または５９、より好ましくは、配列番号５６のＤＫ４^１０型である。別の好ましい実施形態において、炎症性疾患には、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体からのＣＤＲが抗エボラのＶＨとＶＬとのｓｃＦｖ足場システムに移植されている、ＤＶ０６モノマーおよびＩＬ－４を含む二重サイトカイン融合タンパク質で処置されるＩＢＤが含まれる。なおも別の好ましい実施形態において、炎症性疾患には、抗ＶＥＧＦＲ２抗体からのＣＤＲがヒト抗エボラのＶＨとＶＬとのｓｃＦｖ足場システムに移植されている、ＤＶ０６モノマーおよびＩＬ－４を含む二重サイトカイン融合タンパク質で処置される乾癬またはＲＡが含まれる。最も好ましい実施形態では、炎症または敗血症を低減するために、配列番号４６～５０、５６～５８もしくは５９（ＣＤ１４を標的にする）または５１（ＭＡｄＣＡＭを標的にする）の二重サイトカイン融合タンパク質が使用される。

なおも別の態様において、本開示は、免疫疾患または免疫症状を処置および／または予防する方法に関し、その方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の、ＩＬ－１０を含む二重サイトカイン融合タンパク質を投与する工程を含む。

他の実施形態において、本開示は、第２の治療薬、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、抗炎症剤または放射線照射を同時投与するまたはそれで処置する方法も企図し、当該分野で周知である。これらには、他の治療薬（例えば、以下：化学療法薬、インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮβ－１αおよびＩＦＮ－β－１β；ミエリン塩基性タンパク質を模倣するタンパク質；コルチコステロイド；ＩＬ－１阻害剤；ＴＮＦ阻害剤；抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ－６抗体、ＩＬ－１ｂｒ－Ｉｇ融合物、抗ＩＬ－２３抗体、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体；ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ｐ４０サブユニットに対する阻害性抗体）；ＩＬ－２２アンタゴニスト；小分子阻害剤、例えば、メトトレキサート、レフルノミド、シロリムス（ラパマイシン）およびそれらのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９；Ｃｏｘ－２阻害剤およびｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；ｐ３８阻害剤；ＴＰＬ－２；Ｍｋ－２；ＮＦｋβ阻害剤；ＲＡＧＥまたは可溶性ＲＡＧＥ；Ｐ－セレクチン阻害剤またはＰＳＧＬ－１阻害剤（例えば、小分子阻害剤、それらに対する抗体、例えば、Ｐ－セレクチンに対する抗体）；エストロゲンレセプターベータ（ＥＲＢ）アゴニストまたはＥＲＢ－ＮＦｋβアンタゴニストのうちの１つまたはそれを超えるものであるがこれらに限定されない）との併用処置が含まれ得る。

さらに、二重サイトカイン融合タンパク質との投与にとって有用な併用処置としては、ＴＮＦ阻害剤が挙げられ得、例えば、ＴＮＦに結合する、キメラ抗体、ヒト化抗体、実質的なヒト抗体、ヒト抗体もしくはインビトロにおいて作製された抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント；ＴＮＦレセプターの可溶性フラグメント、例えば、ｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦレセプターまたはそれらの誘導体、例えば、７５ｋｄＴＮＦＲ－ＩｇＧ（７５ｋＤ ＴＮＦレセプター－ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬ^ＴＭ）、ｐ５５ｋＤ ＴＮＦレセプター－ＩｇＧ融合タンパク質；およびＴＮＦ酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤が挙げられる。標準的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびシクロオキシゲナーゼ－２阻害剤を含むがこれらに限定されない抗炎症剤／抗炎症薬との他の併用処置。ＮＳＡＩＤには、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダクおよび／またはトルメチンが含まれ得る。本願に係る組成物において使用されるシクロオキシゲナーゼ－２阻害剤は、例えば、セレコキシブまたはロフェコキシブであり得る。

二重サイトカイン融合タンパク質と同時投与され得るおよび／または共製剤化され得る追加の治療薬としては、インターフェロン－β、例えば、ＩＦＮ－１αおよびＩＦＮβ－１β；ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）；コルチコステロイド；ＩＬ－１阻害剤；ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦレセプターの可溶性フラグメント、例えば、ｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦレセプターまたはそれらの誘導体、例えば、７５ｋｄＴＮＦＲ－ＩｇＧ；ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体；ならびにＩＬ－１２および／またはＩＬ－２３のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットのアンタゴニスト（例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－２３のｐ４０サブユニットに結合する阻害性抗体）；メトトレキサート、レフルノミドおよびシロリムス（ラパマイシン）またはそれらのアナログ、例えば、ＣＣＩ－７７９のうちの１つまたはそれを超えるものが挙げられる。他の治療薬としては、イミフィンジ（Ｉｍｆｉｍｚｉ）またはアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍｂ）が挙げられ得る。

ＮＡＳＨを処置する目的で、例えば、二重サイトカイン融合タンパク質は、スタチンおよび非スタチン薬などのコレステロール低下剤と併用され得る。これらの作用物質としては、シンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ゲムフィブロジル、フルバスタチン、コレスチラミン、フェノフィブラート、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸結合樹脂もしくは胆汁酸捕捉剤および／またはミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中に記載される二重サイトカイン融合タンパク質と同時投与され得る代表的な化学療法剤としては、以下の非網羅的リストが挙げられ得る：アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ^ＴＭ）；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ） ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル（ｃｈｉｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝産物、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ^ＴＭ，Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体。腫瘍に対してホルモンの作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびトレミフェン（フェアストン）を含む）；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体も、この定義に含められる。

実施例１：ＩＬ－１０とＩＬ－２との二重サイトカイン融合タンパク質のインビトロ研究
２つのサイトカインを腫瘍を標的にすることのインビトロ効果を評価するために、ＤＫ２^１０（配列番号３５）と呼ばれる二重サイトカイン融合タンパク質（構造の代表図として図２を参照のこと）を、以下の構成要素：
（ａ）ＥＧＦＲを標的にするＶＨとＶＬとの対を有するｓｃＦｖに結合したＤＶ０７（これはＩＬ－１０レセプターに高親和性で結合するＥＢＶ ＩＬ－１０バリアントである）の２つのモノマー（配列番号３１の「ＳＬＰ」と呼ばれるＩＬ－１０融合タンパク質）；および
（ｂ）ＩＬ－２サイトカイン（配列番号３６）
から構築し、ここで、そのＩＬ－２サイトカインは、ＥＧＦＲを標的にするｓｃＦｖ（配列番号３１のＳＬＰバリアント）のＶＨ（配列番号３７）とＶＬ（配列番号３８）との間のヒンジ（またはリンカー）領域において結合体化または連結されている。

この二重サイトカイン融合タンパク質は、ＮＫ、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞からのＩＦＮγのＩＬ－２誘導に対するこれらの２つのサイトカインの併用効果を評価するために作製された。ＩＬ－２が、上に記載されたＳＬＰ構築物の最もＣ末端のＤＶ０７モノマーのＣ末端に連結されている、比較構築物もデザインし、用語「ＳＬＰ－ＩＬ－２」という構築物を作製した（図３）。

免疫系に対するＳＬＰ－ＩＬ－２（図３）およびＤＫ２^１０（配列番号３５、図２に模式的に表されている）の効果を試験するために、末梢血単球を、ＤＶ０７機能を評価するために磁気ビーズのポジティブ選択によって単離し、次いで、ＮＫ、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を同様にインビトロ試験のために単離した。ヒトの身体の皮下に注射された分子の曝露サイクルの異なる時点における免疫学的機能をモデル化するために、一連の細胞インビトロアッセイを設定した。

まず、単球／マクロファージに対するＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１０とＩＬ－２との組み合わせ、およびＳＬＰ－ＩＬ－２の効果を試験した。この試験は、ＩＬ－２単独では、ＬＰＳに応答した炎症促進性サイトカインであるＴＮＦαの分泌を抑制しないが、ＤＶ０７を含むＳＬＰ：ＩＬ－２構築物は、炎症促進性サイトカインの分泌を抑制できたことを示した。ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１０とＩＬ－２の組み合わせ、およびＳＬＰ－ＩＬ－２の用量設定を行った（図４）。予想外にも、これらのデータは、ＤＶ０７を含む構築物の機能が、ＩＬ－１０モノマーのＣ末端へのＩＬ－２サイトカインの付加（すなわち、ＳＬＰ－ＩＬ－２；図３）によって損なわれることも示唆している。

ヒト抗エボラ抗体から得られたｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のリンカーにＩＬ－２が組み込まれたＤＶ０７含有バリアントとしてデザインされたＤＫ２^１０（図２に模式的に表されている）の、単球／マクロファージに対する効果も評価して、この構築物がＩＬ－１０の機能を保持しているかを判断した。ＩＬ－１０、ＳＬＰ（配列番号３１のＤｅｇｆｒＤＶ０７の最適化済みバリアント）、およびＤＫ２^１０ｅｇｆｒ（配列番号３５）の用量設定を行ったところ（図５）、データは、最もＣ末端のＩＬ－１０モノマーのＣ末端にＩＬ－２を連結する（ＳＬＰ－ＩＬ－２）のとは異なり、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のリンカーへのＩＬ－２の予想外の組み込みが、ＳＬＰ（配列番号３１のＤＶ０７含有ＩＬ－１０融合タンパク質）の機能を損なわないことを示唆した。

Ｔ細胞に対するＤＫ２^１０ｅｇｆｒの直接的な効果を評価するために、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＬ－１０の主要な機能（主に、Ｔ細胞レセプターと会合したときのみ放出されるＩＦＮγの増強）を直接解明すると報告されているアッセイ（Ｃｈａｎ，２０１５；Ｍｕｍｍ Ｊ．，２０１１；Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，２０１２）を行った。

ＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０の必要治療濃度は、体循環における２～５ｎｇ／ｍＬであることが見出された（Ｍｕｍｍ Ｊ．，２０１１；Ｎａｉｎｇ Ａ．，２０１８；Ｎａｉｎｇ Ａ．，２０１６）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞ＩＦＮγアッセイは、１～１０ｎｇ／ｍＬにおいて最大のＴ細胞ＩＦＮγ増強を示すことから、これは、癌への適用に向けてＩＬ－１０の特異的効力を評価するための適切なモデルアッセイ系であることが示唆された。

高用量ＩＬ－２療法は、３７～４５ｕｇ／ｋｇに相当する６００，０００～７２０，０００Ｕ／ｋｇのＩＬ－２を５日間、８時間ごとに投与するものである（Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，２０１９）（ＩＬ－２の場合、１．１ｍｇ＝１８×１０６ＩＵ）。高用量ＩＬ－２の体循環におけるＣ_ｍａｘ濃度は、３７～４５ｎｇ／ｍＬ（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，１９９８）であり、トラフ曝露量は、約１０ｎｇ／ｍｌである。これらのデータは、抗原特異的Ｔ細胞機能の最大ＩＬ－２刺激が、インビトロにおいておよそ１０ｎｇ／ｍｌであることから、このアッセイの使用がＩＬ－２に対するＴ細胞応答の評価にも適切であることを示唆している。ゆえに、本発明者らは、このアッセイ形式において、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１０とＩＬ－２との組み合わせ、ＳＬＰ、およびＤＫ２^１０に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の応答を評価した（図６）。予想外にも、ＩＬ－２とＤＶ０７とをつなぐと（すなわち、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のリンカーにおいてＩＬ－２をＳＬＰにつなぐと）、どちらかの分子単独の効力が１００倍増加した（約１～１０ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬへ）。予想外にも、つながれていないＩＬ－２およびＩＬ－１０をこれらの濃度において加えても、ＩＦＮγの分泌は増強されなかった。このことは、ＩＬ－２とＤＶ０７とをつなぐ効果が、Ｔ細胞機能に対して相加効果または相乗効果よりも著しく大きな効果を導くことを示唆している。

ＩＬ－２毒性（血管漏出症候群）は、ＮＫ（Ａｓｓｉｅｒ，２００４）およびＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｓｉｖａｋｕｍａｒ，２０１３）、炎症促進性サイトカイン分泌（Ｇｕａｎ，２００７；Ｂａｌｕｎａ，１９９７）と関連する。ゆえに、本発明者らは、ＩＬ－１０が、血液から直接単離されたＮＫ細胞に対するＩＬ－２の炎症促進効果を弱めることができるかを評価した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞、（１）血液から直接単離された、（２）抗原プライミングをモデル化するために抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８＋サイトカインに曝露された、（３）腫瘍内の曝露をモデル化するために抗原プライミング後にサイトカインに曝露された、および（４）同族抗原との会合時に、抗原でプライミングされたＴ細胞の機能に対する曝露の影響（図７）。末梢血から直接単離されたＮＫ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、漸増量（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１０とＩＬ－２との組み合わせ、ＳＬＰ（配列番号３１のＤｅｇｆｒＤＶ０７の最適化済みバリアント）およびＤＫ２^１０ｅｇｆｒで４日間処置した（図７）。ＤＫ２^１０ｅｇｆｒの予想される必要投薬は、４日ごとに１回であることから、このインビトロ曝露は、Ｃ_ｍａｘの予想曝露量をはるかに超える高濃度のサイトカイン（最大１００ｎｇ／ｍＬ）を４日間モデル化すると示唆される。このデータから、個々のサイトカインとしてＩＬ－１０をＩＬ－２に付加するか、またはＤＫ２^１０ｅｇｆｒとしてＩＬ－１０をＩＬ－２につなぐと、５～１０ｎｇ／ｍＬにおいて、ＮＫ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌のＩＬ－２媒介性誘導がそれぞれ約５０％、約８０％および約５０％抑制されることが示された。０．０１ｎｇ／ｍＬという予想される治療用量では、組み合わされたサイトカインＤＫ２^１０ｅｇｆｒによってＩＦＮγは、ほとんどまたは全く誘導されない。

モデル抗原提示におけるサイトカイン曝露の効果（固定化された１０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３／２ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８）（Ｃｈａｎ，２０１５）も検討した（図８）。このデータから、ＩＬ－１０をＩＬ－２に付加すること、特に、ＤＫ２^１０ｅｇｆｒを介して、つながれたＩＬ－２とＩＬ－１０とを付加することにより、１０ｎｇ／ｍＬにおいて、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋のＩＦＮγ誘導がそれぞれ約７５％および約９０％抑制され、０．０１ｎｇ／ｍＬではＩＦＮγ誘導を示さないことが明らかになった。

最後に、同族腫瘍抗原との会合前の腫瘍内のＴ細胞輸送のモデル化するために、抗原曝露後のＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγの誘導を検討した（図９）。予想外にも、そのデータから、ＤＫ２^１０ｅｇｆｒと比べたときのＩＬ－２、個別に適用されたＩＬ－１０およびＩＬ－２の効果は、抗原をプライミングされたＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して異なる機能を発揮することが明らかになった。ＤＫ２^１０ｅｇｆｒの予想治療濃度において、ＤＫ２^１０ｅｇｆｒは、ＩＬ－２または個別に適用されたＩＬ－１０およびＩＬ－２よりもＩＦＮγ分泌を増強する。ＩＬ－１０およびＩＬ－２の予想治療濃度において、ＤＫ２^１０ｅｇｆｒ、ＩＬ－２、ならびに個別に適用されるＩＬ－１０およびＩＬ－２は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を同等に誘導する。これらのデータは、まとめると、ＩＬ－２とＩＬ－１０とをつなぐこと（ＤＫ２^１０の形態）により、ＩＬ－２の毒性に関連する炎症促進性サイトカインの分泌が抑制されるのと同時に、抗原特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の応答が増強されることを示している。注目すべきことに、これらの効果は、抗ＥＧＦＲ ＣＤＲを抗エボラｓｃＦｖ足場に移植しても影響を受けなかった。

実施例２：ＩＬ－１０とＩＬ－２との二重サイトカイン融合タンパク質のインビボ研究
安定発現型ヒトＥＧＦＲ ＣＴ２６マウス直腸結腸細胞株を作製することにより、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（ヒト抗エボラＳｃＦｖ足場から得られたＶＨおよびＶＬに６つの抗ＥＧＦＲ ＣＤＲが移植されたｓｃＦｖにＤＶ０７が融合されている；配列番号３１の「Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７」）を介してＤＶ０７を腫瘍微小環境にターゲッテングすると、ＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０と比べて優れた抗腫瘍機能が示されると以前に示されている。米国特許１０，８５８，４１２を参照のこと。同じインビボ腫瘍研究を用いて、ヒトＥＧＦＲを発現するＣＴ２６細胞マウス腫瘍細胞株においてＤＫ２^１０ｅｇｆｒを評価し、Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７と比較した。

ＣＴ２６（ｈＥＧＦＲ^＋）腫瘍担持Ｂ細胞ノックアウトＢａｌｂ／Ｃマウス（１００ｍｍ^３という平均値の腫瘍を有する）を、表１に示されている試験物質、用量および頻度で処置した。すべての試験物質を、首筋の皮下に投与した。すべての試験物質を、１５日間、毎日投薬した。

３日ごとに電子ノギスで腫瘍の長さおよび幅を計測し、腫瘍体積を算出した（（Ｌ×Ｗ^２）／２））。この実施例において、用語「Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７」は、ヒトＥＧＦＲにターゲッテングされたＤＶ０７であり；ＤＫ２^１０ｅｇｆｒは、「ＤＫ２^１０」と省略され、セツキシマブのＣＤＲが移植された抗エボラｓｃＦｖ足場を介してＤＶ０７と結合されたヒトＩＬ－２である。

方法
インビトロ細胞培養：ＣＴ２６^{（ｈＥＧＦＲ＋）}腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）を、完全ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳおよび１０ｕｇ／ｍＬピューロマイシンにおいて７０％培養密度まで生育した。植え込み前のインビトロでの細胞継代は３回までとした。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞培養プレートから細胞を取り出し、４００ｇ、４℃で１０分間、遠心して完全ＲＰＭＩで洗浄した。

腫瘍の植え込み：腫瘍細胞を、５０％成長因子低減マトリゲル、５０％ＲＰＭＩ中の１００μＬにおいて１×１０^５細胞／マウスで、Ｂ細胞ノックアウトマウスの右側腹部の皮下に植え込んだ。

結果
腫瘍成長に対するＤｅｇｆｒ：ＤＶ０７とＤＫ２^１０との比較：安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞上に存在するＥＧＦＲへの結合を介してＤＶ０７を腫瘍微小環境にターゲッテングすることが有効であることが以前に示されている。米国特許１０，８５８，４１２を参照のこと。同じ腫瘍システムを用いて、Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７とＤＫ２^１０とを比較した。

腫瘍を１週間に３回計測した（表２）。７５ｍｍ^３のＣＴ２６^{（ｈＥＧＦＲ＋）}腫瘍を有する雌Ｂａｌｂ／Ｃ Ｂ細胞ノックアウトマウスを、表２に示されている試験物質および投与頻度で皮下処置した。

この実験の場合、腫瘍抗原に対するマウスの免疫化を制限するために、ＣＴ２６^{（ｈＥＧＦＲ＋）}細胞を５０％成長因子低減マトリゲル中に１×１０^５細胞で植え込んだ。

１ｍｇ／ｋｇにおけるＤｅｇｆｒ：ＤＶ０７の抗腫瘍効果を、同じ用量のＤＫ２１０、ならびに２および４ｍｇ／ｋｇの用量と比較した（図１０）。ＤＫ２^１０を１ｍｇ／ｋｇで毎日投薬することにより、Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７を１ｍｇ／ｋｇで毎日投薬したときと比べて、優れた抗腫瘍機能が発揮される。２および４ｍｇ／ｋｇの用量のＤＫ２^１０は、１ｍｇ／ｋｇよりも大きな抗腫瘍機能を発揮する。

ＤＫ２^１０の安全性評価：ＤＫ２^１０投薬の安全性を試験するために、Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７およびＤＫ２^１０で処置された腫瘍担持マウスの体重を評価した（図１１）。Ｄｅｇｆｒ：ＤＶ０７またはＤＫ２^１０のいずれを投薬しても、マウスの体重に明らかな影響はない。

生存率に対するＤｅｇｆｒ：ＤＶ０７およびＤＫ２^１０の投薬の影響：ＤＫ２^１０に対するＣＴ２６^{（ｈｅｇｆｒ＋）}腫瘍担持マウスの生存率を評価した（図１２）。

ビヒクル処置マウスにおけるすべての腫瘍が、１７日目までにＩＡＡＣＵＣの規定で大きくなりすぎた。４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのＤＫ２１０ならびに１ｍｇ／ｋｇのＤｅｇｆｒ：ＤＶ０７の処置群では、３０日目にそれぞれ１００％、８０％、８０％および６０％のマウスが生存していた。

これらのデータは、まとめると、高親和性ＩＬ－１０バリアント（ＤＶ０７）をＩＬ－２に結合させ、両方の分子を腫瘍微小環境にターゲッテングする（ＤＫ２^１０ｅｇｆｒを介して）ことにより、治療的に有効な用量において明白なＩＬ－２媒介性の毒性が防がれることを示唆している。ヒト抗エボラ足場から得られたＶＨおよびＶＬ領域を含むｓｃＦｖ足場に抗ＥＧＦＲ ＣＤＲを移植しても、ＩＬ－１０とＩＬ－２との併用効果に影響はなく、むしろ抗ＥＧＦＲのＣＤＲは、ＤＫ２^１０分子を腫瘍微小環境中に濃縮させる手段として作用する。本発明者らは、腫瘍微小環境を標的にする任意の抗体（適切に最適化されている）からのＣＤＲを移植することにより、同じまたは類似の効果が観察されると考えている。

実施例３：ＩＬ－１０とＩＬ－４との二重サイトカイン融合タンパク質
クローン病患者において、高用量ＩＬ－１０は、ＩＦＮγの増加と同時に抗炎症反応の減弱をもたらした。サイトカインをＩＬ－１０と組み合わせることにより、ＩＬ－１０の抗炎症機能が増強されるか、およびＩＬ－１０の刺激（ＩＦＮγ増強）機能が抑制されるかを判断するために、ＩＬ－１０とＩＬ－４との二重サイトカイン融合タンパク質を作製した。本発明者は、単球に対するＩＬ－１０とＩＬ－４との併用処置が、ＩＬ－１０またはＩＬ－４単独よりも強力にＬＰＳ誘導性炎症反応を抑制することを予想外に発見した（下記で詳細に論じる）。さらに、ＩＬ－４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１０媒介性ＩＦＮγ増強を抑制した。ＤＫ２^１０ｅｇｆｒ（上記の実施例１および２に記載された）をデザインするための類似の方法および理論的根拠を用いて、ＩＬ－４または様々なＩＬ－４バリアントを、融合構築物としてＩＬ－１０またはＩＬ－１０バリアントに結合して（代表図として図１７を参照のこと）、ＩＬ－１０の抑制機能を強化した。得られた分子クラスは、ＤＫ４^１０と呼ばれた。

表３は、サイトカインおよび様々なＤＫ４^１０融合分子を含む研究された様々な分子の要旨を提供している。

健康ドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）調製物に由来し、磁気ビーズポジティブ選択によって単離された、単球／マクロファージおよびＣＤ８＋Ｔ細胞に対する効果について、以下の分子および分子の組み合わせを試験した。
１．ＩＬ－４；
２．ＩＬ－１０；
３．ＩＬ－１０と組み合わされるＩＬ－４；
４．ＤｅｂｏＷｔＥＢＶ；
５．ＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＷｔＥＢＶ；
６．ＤｅｂｏＤＶ０６；
７．ＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＤＶ０６；
８．ＤｅｂｏＤＶ０７；
９．ＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＤＶ０７；
１０．野生型ＩＬ－４およびＤＶ０６を含むＤＫ４^１０（「４ＤｅｂｏＤＶ０６」）；
１１．ｍＣＤ１４をターゲットにした、高親和性の非グリコシル化ＩＬ－４（Ｔ１３Ｄ）およびＤＶ０６を含むＤＫ４^１０；
１２．ｍＣＤ１４をターゲットにした、高親和性の非グリコシル化ＩＬ－４（Ｔ１３Ｄ）およびＤＶ０７を含むＤＫ４^１０；
１３．ｍＣＤ１４をターゲットにした、非グリコシル化ＩＬ－４（Ｎ３８Ａ）およびＤＶ０６を含むＤＫ４^１０；
１４．ｍＣＤ１４をターゲットにした、非グリコシル化ＩＬ－４（Ｎ３８Ａ）およびＤＶ０７を含むＤＫ４^１０；ならびに
１５．ｍＭＡｄＣＡＭをターゲットにした、非グリコシル化ＩＬ－４およびＤＶ０６を含むＤＫ４^１０

方法
ＰＢＭＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の単離：抗ＣＤ１４（単球）または抗ＣＤ８（ＣＤ８＋Ｔ細胞）磁気マイクロビーズを用いて、マクロファージとＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を、ＰＢＭＣまたはｌｅｕｋｏｐａｋから磁石支援型細胞選別によって単離した。

細胞アッセイ－サイトカインおよびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）に対する単球／マクロファージ細胞応答：このアッセイでは、ＰＭＢＣ由来単球を、ＣＤ１４ポジティブ選択ビーズを用いて単離し、２×１０^５細胞／ウェルでプレーティングし、漸増量のサイトカインおよび１０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳに曝露する。１８時間後、分泌された炎症促進性サイトカインについてＥＬＩＳＡによって上清を評価する。ＴＮＦαの減少率をプロットして、サイトカインまたは試験物質がＬＰＳに対して発揮する影響を表示する。このアッセイは、末梢血中のサイトカインおよび細菌由来の炎症促進性産物に対する単球の応答を最も適切に模倣する。

細胞アッセイ－ＣＤ８＋Ｔ細胞：複数のＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイを使用した。はじめに、ＣＤ８＋ポジティブ磁気選択ビーズを用いて、ＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を得て、２×１０^５細胞／ウェルでプレーティングし、以下の条件下において漸増量のサイトカインまたは試験物質に曝露した。
（ｉ）４日間、単独、
（ｉｉ）３日間、結合した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８をサイトカインの存在下でプレーティングして、これらの分子が同族抗原提示に対する細胞の応答にどのように影響するかを模倣する、
（ｉｉｉ）３日間の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の後、抗原刺激された細胞が腫瘍に入る際にこれらのサイトカインおよび新規因子にどのように応答するかを模倣する、および
（ｉｖ）インビトロで曝露された細胞からの、Ｔ細胞レセプターによって引き起こされるＩＦＮγの分泌を４時間後に評価して、腫瘍微小環境におけるＴ細胞が同族抗原曝露にどのように応答するかを模倣する。

単球／マクロファージとＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を、０．１、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬまたは０．００１、０．０１、０．１、１および１０ｎｇ／ｍＬ（またはモル当量）における漸増量のヒトＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＤｅｂｏＷｔＥＢＶ、ＤｅｂｏＤＶ０６および様々なＤＫ４^１０融合分子に、述べたとおり一晩または３～４日間曝露し、すべての条件を２つ組で行った。これらの分子の抗炎症作用（単球／マクロファージ）と刺激作用（ＣＤ８＋Ｔ細胞）を用いて、最も効果的な抗炎症性のサイトカイン対を判断した。

タンパク質の計測：マクロファージ細胞培養液をＥＬＩＳＡによってＴＮＦαについてアッセイし、ＣＤ８＋Ｔ細胞培養液をＥＬＩＳＡによってＩＦＮγについてアッセイした。ＤｅｂｏＤＶ０６、４ＤｅｂｏＤＶ０６および様々なＤＫ４^１０融合分子を、各タンパク質のそれぞれの消衰係数を用いてＮａｎｏｄｒｏｐ ＯＤ２８０ ｎＭによって評価し、クマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルバンド強度によって濃度を確認した。

結果
ＩＬ－１０とＩＬ－４との組み合わせに対する理論的根拠の進展：ＩＬ－１０は、ＬＰＳに応答してマクロファージによるＴＮＦα分泌を抑制すると報告されている（Ｍａｌｅｆｙｔ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ Ａｎ Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＬ－１０ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，１９９１；Ｍｏｏｒｅ，２００１）。ＩＬ－４は、ヒト単球（Ｈａｒｔ，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４：Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｃａ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １，ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２，１９８９）およびヒト腹腔マクロファージ（Ｈａｒｔ，１９９１）からのＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌を抑制すると報告されている。

炎症性刺激としてのＬＰＳに応答した単球の炎症促進性サイトカイン分泌の抑制に対する、ＩＬ－４とＩＬ－１０とを組み合わせることの効果を明らかにするために、末梢血単球を、健康ドナーのＰＢＭＣから磁気ビーズポジティブ選択によって単離した。単離された単球を、漸増量のＩＬ－１０、ＩＬ－４およびＩＬ－１０とＩＬ－４との組み合わせに曝露した（図１３）。その漸増量（０．１、１、１０、１００ｎｇ／ｍＬ）のヒトＩＬ－１０、ＩＬ－４、およびＩＬ－１０とＩＬ－４との組み合わせに対する健康なヒトマクロファージの応答を評価すると、ＩＬ－１０単独とＩＬ－４単独の両方が、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌を抑制できることが実証される。しかしながら、ＩＬ－１０とＩＬ－４との組み合わせは、どちらかのサイトカイン単独よりもＴＮＦα分泌の抑制に優れている。

単球／マクロファージに対するＩＬ－４およびＤｅｂｏＷｔＥＢＶの効果：ＤｅｂｏＷｔＥＢＶは、ヒト抗エボラ抗体に由来する半減期が延長されたＶＨとＶＬとの足場システム（以前に米国特許１０，８５８，４１２に記載されている）に結合された野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０を含む。ＤｅｂｏＷｔＥＢＶは、ＴＮＦα分泌を抑制すると示されている。単離された単球を、漸増量のＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＤｅｂｏＷｔＥＢＶ、およびＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＷｔＥＢＶに曝露した（図１４）。ＩＬ－４とＤｅｂｏＷｔＥＢＶとの組み合わせは、ＩＬ－４またはＤｅｂｏＷｔＥＢＶ単独よりも優れた様式で、単球からのＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌を抑制する。

Ｔ細胞に対するＩＬ－４およびＤｅｂｏＷｔＥＢＶの効果：単球／マクロファージに対するＩＬ－１０とＩＬ－４との併用抑制効果を評価することに加えて、Ｔ細胞に対するＩＬ－４とＤｅｂｏＷｔＥＢＶとの併用効果も検討した（図１５）。ＤｅｂｏＷｔＥＢＶは、同じモル濃度のＩＬ－１０と比べて、より少ないＩＦＮγをＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導する。ＩＬ－４とＤｅｂｏＷｔＥＢＶとの組み合わせは、１００ｎｇ／ｍＬのＤｅｂｏＷｔＥＢＶ単独によって誘導されるものよりもＩＦＮγを減少させる。

単球／マクロファージに対するＩＬ－４およびＤｅｂｏＤＶ０６の効果：ＩＬ－１０の抑制効果を高めることができるかを判断するために、ＤＶ０６と表記されるＥＢＶ ＩＬ－１０の高親和性バリアントを評価した。ＤＶ０６は、点変異（Ａ７５Ｉ）を含み、野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０をＤＶ０６で置換することによってヒト抗エボラ抗体に由来する半減期が延長されたＶＨとＶＬとの足場システム（以前に米国特許１０，８５８，４１２に記載されている）に結合されている。単離された単球を、漸増量のＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＤｅｂｏＤＶ０６、およびＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＤＶ０６に曝露した（図１６）。ＤｅｂｏＤＶ０６は、ＤｅｂｏＷｔＥＢＶと比べて高い抑制機能を示し（図１５と比較）、ＤｅｂｏＤＶ０６とＩＬ－４との組み合わせは、ＬＰＳに対する単球／マクロファージの応答に対する抑制機能を同様に増大させる。ＩＬ－４とＤｅｂｏＤＶ０６との組み合わせは、ＩＬ－４またはＤｅｂｏＤＶ０６単独よりも優れた様式で、単球からのＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌を抑制する。

ＤｅｂｏＤＶ０６と結合されたＩＬ－４（ＤＫ４^１０型）の評価：データは、ＩＬ－４をＩＬ－１０バリアントであるＤＶ０６（野生型ＥＢＶ ＩＬ－１０の強親和性バリアント）と組み合わせることにより、どちらかの分子単独よりも優れた様式で、ＬＰＳ媒介性の単球の炎症反応が抑制されることを示唆している。したがって、半減期が延長された足場分子のＶＨとＶＬとの間のリンカーにＩＬ－４を発現させることによって、ＩＬ－４をＤｅｂｏＤＶ０６分子に結合して（図１７）、二重サイトカイン融合タンパク質の非ターゲッテング型である（すなわち、抗エボラ抗体からの６つのＣＤＲ領域を含む）、「ＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６」または「４ＤｅｂｏＤＶ０６」と表記されるＤＫ４^１０クラスの分子の第１のメンバーを作製した。

単球／マクロファージに対するＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６（ＤＫ４^１０型）の効果：ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６が、ＬＰＳ誘導性炎症反応を抑制するかを判断するために、単離された単球を、漸増量のＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＤｅｂｏＤＶ０６、ＩＬ－４と組み合わされるＩＬ－１０、およびＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６に曝露した（図１８）。ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６は、単球からのＬＰＳ誘導性ＴＮＦα分泌を、ＩＬ－４またはＤｅｂｏＤＶ０６単独よりも優れた様式で抑制するが、特に低濃度では、ＩＬ－４＋ＩＬ－１０ほどではない。

ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６（ＤＫ４^１０型）の効果：ＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６がＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγを増強および誘導する能力を検討し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＤｅｂｏＤＶ０６、およびＩＬ－４と組み合わされるＤｅｂｏＤＶ０６と比較した（図１９）。ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６は、ＤｅｂｏＤＶ０６＋ＩＬ－４の組み合わせと同様にＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を抑制する。

単球／マクロファージに対するＩＬ－４ＨＡＤｅｇｌｙＤｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ＨＡＤｅｇｌｙＤｍＣＤ１４ＤＶ０７（ＤＫ４^１０型）の効果：ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ＤｅｂｏＤＶ０６の製造において使用されたＩＬ－４アミノ酸配列は、グリコシル化されているとみられることが明らかになった。配列解析により、推定Ｎ結合型グリコシル化バリアントが、アミノ酸位置Ｎ３８に存在するが、グリコシル化は、機能には必要ないことが確認された（Ｌｉ，２０１３）。さらなる研究により、アミノ酸Ｔ１３をアスパラギン酸（Ｄ）で置換することにより、高親和性ＩＬ－４バリアントが生成されることが示唆された（米国特許６，０２８，１７６）。Ｎ３８ＡとＴ１３Ｄに置換を有する両方の点変異をＩＬ－４に導入し、マウスＣＤ１４からの６つのＣＤＲが移植されたＤｅｂｏ足場に連結し、組み込んだ（図２０）。このデータは、高親和性の非グリコシル化ＩＬ－４バリアント（すなわち、Ｎ３８ＡとＴ１３Ｄの両方の点変異を含む）が、同じ形式の野生型ＩＬ－４と比較して劣った機能をＤＫ４^１０連結形式において示すことを示唆している。

単球／マクロファージに対するＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７（ＤＫ４^１０型）の効果：Ｎ３８Ａ置換を含むＩＬ－４バリアントを含むＤＫ４^１０型のＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７の効果を、単離された単球を漸増量のＩＬ－１０、ＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６（別名「ＤＫ４^１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６」）およびＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７（別名「ＤＫ４^１０ｍＣＤ１４ＤＶ０７」）に曝露することによって、ＬＰＳ誘導性炎症反応の抑制についてアッセイすることによって評価した（図２１）。「ＩＬ－４ｎｇ」と呼ばれるＩＬ－４バリアントは、製造可能性を改善するために導入された非グリコシル化型のＩＬ－４（Ｎ３８Ａ置換を含む、配列番号４４）であり、「ｍＣＤ１４」は、Ｄｅｂｏ足場への、抗ｍＣＤ１４抗体からの６つのＣＤＲの移植を表している。両方のＤＫ４^１０（ＤＶ０６およびＤＶ０７のＩＬ－１０バリアントを含む）分子が、ＬＰＳ誘導性のＴＮＦα分泌を抑制する。

Ｔ細胞に対するＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７（ＤＫ４^１０型）の効果：Ｔ細胞に対するＩＬ－１０、ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６およびＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７（上に記載されたような）の刺激効果を評価した（図２２）。両方のＤＫ４^１０（ＤＶ０６およびＤＶ０７のＩＬ－１０バリアントを含む）分子が、ＩＬ－１０ほど、ＣＤ８＋Ｔ細胞からＩＦＮγの分泌を誘導しない。ＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６は、ＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０７と比べて、１～１００ｎｇ相当のモル濃度の曝露においてわずかに少ないＩＦＮγの分泌を誘導する。

単球／マクロファージに対するＩＬ－４ｎｇＤｍＤＭＡｄＣＡＭＤＶ０６（ＤＫ４^１０型）の効果：ＤＫ４^１０型のＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６の効果を、単球（ｍｏｎｏｃｙｃｔｅｓ）／マクロファージに対するＬＰＳ誘導性炎症反応の抑制をアッセイすることによって評価した。ＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６は、（１）グリコシル化されていないＩＬ－４ｎｇバリアント（Ｎ３８Ａ置換を含む）；（２）Ｄｅｂｏ足場へのマウス抗ＭＡｄＣＡＭ抗体からの６つのＣＤＲの移植；および（３）ＩＬ－１０バリアントＤＶ０６を含むＤＫ４^１０型の二重サイトカイン融合物である。単離された単球／マクロファージを、漸増量のＩＬ－１０またはＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６で処置した（図２３）。ＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６は、単球／マクロファージにおいてＬＰＳ誘導性のＴＮＦα分泌を抑制する。

Ｔ細胞に対するＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６（ＤＫ４^１０形式）の効果：Ｔ細胞に対するＩＬ－１０およびＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６（ＤＫ４^１０形式）の刺激効果も評価した（図２４）。ＩＬ－４ｎｇＤｍＭＡｄＣＡＭＤＶ０６は、ＩＬ－１０とは異なり、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を誘導しない。

結論
これらのデータは、ＩＬ－４バリアントおよびＩＬ－１０バリアントをヒト抗エボラ由来のＶＨ／ＶＬ足場システムに結合させることによって（すなわち、ＤＫ４^１０型）、これらの２つのサイトカインを共発現することができることを示唆している。ＩＬ－４バリアントとＩＬ－１０バリアントとの組み合わせは、ＶＨとＶＬとの足場システム内に存在するターゲッテングＣＤＲを問わず、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγの誘導を阻害するのと同時に、単球／マクロファージによるＬＰＳ誘導性の炎症反応を抑制する（抗ｍＣＤ１４および抗ｍＭＡｄＣＡＭからのＣＤＲを含むＤＫ４^１０の移植バージョンと４ＤｅｂｏＤＶ０６とを比較のこと）。

抗エボラ由来のＶＨとＶＬとの足場は、ＩＬ－４およびＩＬ－１０バリアントサイトカインを効果的に結合し、複数のターゲッテングＣＤＲのグラフトを受け入れることができる。ＩＬ－４ｎｇ（Ｎ３８Ａ置換に起因して、非グリコシル化ＩＬ－４をもたらすＩＬ－４バリアント）とＤＶ０６との組み合わせは、０．１～１００ｎｇ／ｍＬにおいて効果的にＬＰＳ媒介性のＴＮＦα分泌を抑制し、同じ用量範囲においてＣＤ８＋Ｔ細胞からの有意なＩＦＮγを誘導しない。

実施例４：敗血症の処置におけるＤＫ４^１０
ＩＬ－４ｎｇＤｍＣＤ１４ＤＶ０６（別名「ＤＫ４^１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６」）が、ＬＰＳ誘導性のＴＮＦα分泌を抑制することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγの誘導を抑えることが明らかになったので（図２１および図２２を参照のこと）、この分子を周知の従来の敗血症モデルにおいて検討した。

簡潔には、野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスを入手し、標準的なＩＡＣＵＣＵプロトコルに従って順化させた。これらのマウスを、標準的な固形飼料および水の自由摂取にて１２時間の明暗サイクルで維持した。

ビヒクル、ＤＫ４^１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６を、腹腔内ＬＰＳ投与（３５０ｍｇ／マウス）の前（「前」）または後（「後」）のいずれかの記載の時点において、１００ミリリットルのビヒクル緩衝液中の記載の用量で動物に皮下投与した。

４日間の順化の後、１群あたり５匹のマウスを以下のもので処置した：
（１）ＬＰＳ投与の３０分前に、１ｍｇ／ｋｇのＤＫ４１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６；および
（２）ＬＰＳ投与の３０分後に、１ｍｇ／ｋｇのＤＫ４１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６。

ＬＰＳ投与の４８時間後に、マウスを生存について評価した。ＬＰＳ投与の３０分前にＤＫ４１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６でマウスを処置すると、１００％の生存者率がもたらされ、ＬＰＳ投与の３０分後にＤＫ４１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６で処置すると、敗血症性ショックに対する保護作用が示された（図２５）。

このデータは、ＩＬ－１０バリアントをＩＬ－４バリアント（ＩＬ－４ｎｇ）に結合させ、マウス抗ＣＤ１４抗体からの６つのＣＤＲを有するＤｅｂｏ足場システムを介して（例えば、ＤＫ４^１０ｍＣＤ１４ＤＶ０６を使用して）それらの２つの分子を標的にすると、炎症反応が有意に減弱し、敗血症性ショックが処置されることを示唆している。

この書面による説明は、例を用いて、好ましい実施形態を含む本開示の態様を開示し、また、どんな当業者も、任意のデバイスまたはシステムの作製および使用、ならびに任意の組み込まれた方法の実行を含むそれらの態様を実施できるようにしている。これらの態様の特許を受けられる範囲は、請求項によって定義されており、当業者が思いつく他の例を含むことがある。そのような他の例は、請求項の文言と異ならない構造要素を有する場合、または請求項の文言と実質的に異ならない同等の構造要素を含む場合、請求項の範囲内に含まれると意図される。説明された様々な実施形態からの態様、ならびにそのような各態様に対する他の公知の等価物は、当業者によって、本願の原理に従って追加の実施形態および手法を構築するために併用および適合されることができる。

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Claims (39)

1. モノクローナル抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）または抗原結合フラグメントに融合されたＩＬ－１０のモノマーおよび第２のサイトカインを含む二重サイトカイン融合タンパク質であって、前記第２のサイトカインは、前記ｓｃＦｖまたは抗原結合フラグメントのＶＨ領域とＶＬ領域との間に融合される、二重サイトカイン融合タンパク質。
2. 式（Ｉ）
   ＮＨ_２－（ＩＬ１０）－（Ｘ^１）－（Ｚ_ｎ）－（Ｘ^２）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ（式Ｉ）
   の二重サイトカイン融合タンパク質であって、式中、
   「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、９、１０、１１、１２、１４または１６から選択されるモノマー配列であり；
   「Ｘ^１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；
   「Ｘ^２」は、前記第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；
   ここで、Ｘ^１がＶＬであるとき、Ｘ^２はＶＨであるか、またはＸ^１がＶＨであるとき、Ｘ^２はＶＬであり、
   「Ｚ」は、ＩＬ－１０以外のサイトカインであり；
   「ｎ」は、０～２から選択される整数である、二重サイトカイン融合タンパク質。
3. Ｘ^１およびＸ^２が、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶまたはエボラに特異的な前記第１のモノクローナル抗体から得られる、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
4. 前記ＶＬおよびＶＨが、抗ＨＩＶ抗体または抗エボラ抗体である前記第１のモノクローナル抗体から得られる、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
5. 前記抗ＨＩＶ抗体または抗エボラモノクローナル抗体からの前記ＶＬおよびＶＨが、第２の抗体からの６つのＣＤＲが移植された（で置換された）６つのＣＤＲを含む、請求項４に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
6. 前記第２の抗体が、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１から選択されるモノクローナル抗体である、請求項５に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
7. 前記第２のモノクローナル抗体からの前記６つの移植されたＣＤＲが、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体または抗ＶＥＧＦＲ２抗体由来の６つのＣＤＲを含み、前記６つのＣＤＲは、前記ＶＬのＣＤＲ１～３およびＶＨのＣＤＲ１～３を含む、請求項５に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
8. Ｚが、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－βまたは腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインである、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
9. Ｚが、ＩＬ－２、ＩＬ－４またはＩＬ－１５である、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
10. Ｚが、１という整数である、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
11. リンカーをさらに含む、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
12. 前記ＩＬ－１０が、配列番号３、１２、１４、１６である、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
13. 前記二重サイトカイン融合タンパク質が、配列番号３５、４６～５８または５９である、請求項２に記載の二重サイトカイン融合タンパク質。
14. 式（ＩＩ）
    ＮＨ_２－（ＩＬ１０）－（Ｌ）－（Ｘ^１）－（Ｌ）－（Ｚ_ｎ）－（Ｌ）－（Ｘ^２）－（Ｌ）－（ＩＬ１０）－ＣＯＯＨ（式ＩＩ）
    のＩＬ－１０融合タンパク質であって、式中、
    「ＩＬ－１０」は、配列番号１、３、９、１０、１１、１２、１４または１６から選択されるモノマー配列であり；
    「Ｌ」は、配列番号３９、４０または４１のリンカーであり；
    「Ｘ^１」は、第１のモノクローナル抗体から得られるＶＬまたはＶＨ領域であり；
    「Ｘ^２」は、前記第１のモノクローナル抗体から得られるＶＨまたはＶＬ領域であり；
    ここで、Ｘ^１がＶＬであるとき、Ｘ^２はＶＨであるか、またはＸ^１がＶＨであるとき、Ｘ^２はＶＬであり；
    「Ｚ」は、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターフェロン－α、－β、－γ、ＴＧＦ－βまたは腫瘍壊死因子－α、－β、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１１またはＩＬ－１３から選択されるサイトカインであり；
    「ｎ」は、０～２から選択される整数である、ＩＬ－１０融合タンパク質。
15. 前記ＶＬおよびＶＨが、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；ＳＲ－Ｊ１；ＨＩＶまたはエボラに特異的な前記第１の抗体から得られる、請求項１４に記載のＩＬ－１０融合タンパク質。
16. 前記ＶＬおよびＶＨが、ＨＩＶまたはエボラに特異的な前記第１の抗体から得られる、請求項１５に記載のＩＬ－１０融合タンパク質。
17. 前記抗ＨＩＶまたは抗エボラからの前記ＶＬおよびＶＨが、第２の抗体からの６つのＣＤＲが移植された（で置換された）６つのＣＤＲを含む、請求項１６に記載のＩＬ－１０融合タンパク質。
18. 前記第２の抗体が、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）；ＣＤ１４；ＣＤ５２；ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３もしくはＣＴＬＡ４などであるがこれらに限定されない様々な免疫チェックポイント標的；ＣＤ２０；ＣＤ４７；ＧＤ－２；ＶＥＧＦＲ１；ＶＥＧＦＲ２；ＨＥＲ２；ＰＤＧＦＲ；ＥｐＣＡＭ；ＩＣＡＭ（ＩＣＡＭ－１、－２、－３、－４、－５）、ＶＣＡＭ、ＦＡＰα；５Ｔ４；Ｔｒｏｐ２；ＥＤＢ－ＦＮ；ＴＧＦβ Ｔｒａｐ；ＭＡｄＣａｍ、β７インテグリンサブユニット；α４β７インテグリン；α４インテグリンＳＲ－Ａ１；ＳＲ－Ａ３；ＳＲ－Ａ４；ＳＲ－Ａ５；ＳＲ－Ａ６；ＳＲ－Ｂ；ｄＳＲ－Ｃ１；ＳＲ－Ｄ１；ＳＲ－Ｅ１；ＳＲ－Ｆ１；ＳＲ－Ｆ２；ＳＲ－Ｇ；ＳＲ－Ｈ１；ＳＲ－Ｈ２；ＳＲ－Ｉ１；またはＳＲ－Ｊ１から選択される抗体である、請求項１７に記載のＩＬ－１０融合タンパク質。
19. 前記第２の抗体からの前記６つの移植されたＣＤＲが、抗ＥＧＦＲ抗体からの６つのＣＤＲを含み、前記６つのＣＤＲは、前記ＶＬのＣＤＲ１～３およびＶＨのＣＤＲ１～３を含む、請求項１７に記載のＩＬ－１０融合タンパク質。
20. 前記融合タンパク質が、配列番号３５、４６～５８または５９である、請求項１４に記載のＩＬ－１０融合タンパク質。
21. 癌を処置する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項１、２または１４に記載の融合タンパク質を投与する工程を含む、方法。
22. 前記融合タンパク質が、抗ＨＩＶまたは抗エボラから選択される第１の抗体からのＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、前記第１の抗体の前記６つのＣＤＲ領域に、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体または抗ＶＥＧＦＲ２抗体から選択される第２の抗体からの６つのＣＤＲ領域が移植されている、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第１の抗体が、抗エボラ抗体であり、前記第２の抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体または抗ＶＥＧＦＲ２抗体から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記サイトカインまたは「Ｚ」が、ＩＬ－２である、請求項２１に記載の方法。
25. 「Ｚ」が、１という「ｎ」値を有する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記融合タンパク質が、０．０１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌで投与される、請求項２１に記載の方法。
27. 前記融合タンパク質が、０．０１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌで投与される、請求項２１に記載の方法。
28. 前記融合タンパク質が、配列番号３５ ５２～５４または５５である、請求項２１に記載の方法。
29. 炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項１、２または１４に記載の融合タンパク質を投与する工程を含む、方法。
30. 前記融合タンパク質が、抗ＨＩＶまたは抗エボラから選択される第１の抗体からのＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、前記第１の抗体の前記６つのＣＤＲ領域に、抗０ＣＤ１４抗体、抗ＭＡｄＣａｍ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１または抗ＶＥＧＦＲ２抗体からの６つのＣＤＲ領域が移植されている、請求項２９に記載の方法。
31. 前記サイトカイン「Ｚ」が、ＩＬ－４である、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 「Ｚ」が、１という「ｎ」値を有する、請求項２９に記載の方法。
33. 前記融合タンパク質が、０．０１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌで投与される、請求項２９に記載の方法。
34. 前記炎症性疾患が、敗血症、クローン病、関節リウマチ、乾癬および／または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、請求項２９に記載の方法。
35. 前記ＩＬ－１０モノマーが、配列番号１４のＤＶ０６である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記融合タンパク質が、抗エボラ抗体から選択される第１の抗体からのＶＬ領域およびＶＨ領域を含み、前記第１の抗体の前記６つのＣＤＲ領域に、抗ＣＤ１４抗体、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体または抗ＶＥＧＦＲ２抗体から選択される第２の抗体からの６つのＣＤＲ領域が移植されている、請求項２９に記載の方法。
37. 前記ＩＬ－１０モノマーが、配列番号１６のＤＶ０７である、請求項３４に記載の方法。
38. 前記融合タンパク質が、配列番号４６～５１、５６～５８または５９のタンパク質である、請求項２９に記載の方法。
39. 敗血症、敗血症性ショックおよび／またはそれらの関連症候を処置する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項１、２または１４に記載の融合タンパク質を投与する工程を含む、方法。

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