KR100888748B1

KR100888748B1 - 불포화 생물분자를 이용한 키토산 하이드로젤과 이의제조방법

Info

Publication number: KR100888748B1
Application number: KR1020070058822A
Authority: KR
Inventors: 노인섭; 김미숙
Original assignee: 서울산업대학교 산학협력단
Priority date: 2007-06-15
Filing date: 2007-06-15
Publication date: 2009-03-17
Also published as: KR20080110274A

Abstract

본 발명은, 분자구조 중간에 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물분자, 바람직하게는 불포화 지방산 또는/그리고 올리고펩타이드와 공유결합 된 키토산 유도체가 싸이올 작용기를 갖는 물질과의 가교결합을 유도함으로써 합성된 키토산 하이드로젤의 합성에 관한 것이다. 제조된 키토산 하이드로젤의 구성성분이 모두 불포화지방 생물분자와 생리활성물질로 구성되기 때문에 생체적합성 하이드로젤의 특성을 가지며, 상기 키토산 하이드로젤에 생리활성 물질이나 약물을 화학적으로 결합시켜 제조한 키토산 약물전달체, 조직재생용 하이드로젤 및 이에 물리적으로 담지시킨 생리활성 물질 전달체를 제공한다. 또한, 상기 키토산 하이드로젤 및 생리활성 물질 전달체를 제조하는 방법을 제공한다.

키토산 유도체, 엔(-ene) 생물분자, 하이드로젤, 생리활성 물질 전달체, 조직재생유도용 지지체

Description

불포화 생물분자를 이용한 키토산 하이드로젤과 이의 제조방법 {Unsaturated Biomolecule Grafting-based Chitosan Hydrogel and Manufacturing Method Therefor}

도 1은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 하이드로젤의 디지털 사진이다[(A) chitosan : linoleic acid: PEO-6SH를 이용하여 합성한 하이드로젤]

도 2는 본 발명의 방법에 의하여 제조된 키토산-리놀레이트-폴리에틸렌옥사이드 하이드로젤의 표면상에 골세포 배양을 진행한 결과의 광학현미경 사진이다.

도 3은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 키토산-리놀레이트-폴리에틸렌옥사이드 하이드로젤의 내부에 골세포 배양을 진행한 결과의 광학현미경 사진이다

도 4는 본 발명의 방법에 의하여 제조된 키토산-리놀레이트-폴리에틸렌옥사이드 하드로젤 내부에 평활근 세포의 배양을 진행한 결과이다.

도 5은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 RGD 펩타이드가 포함된 키토산-리놀레이트-폴리에틸렌옥사이드-펩타이드 하이드로젤에 세포배양을 진행한 결과이다.

도 6은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 키토산-리놀레이트-폴리에틸렌옥사이드 하이드로젤 내부에 섬유아세포의 세포배양을 진행한 결과이다.

도 7은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 키토산-리놀레이트의 FTIR 결과로, (A)는 키토산을 나타내며, (B)는 키토산-리놀레이트 (C)는 키토산-리놀레이트-폴리 에틸렌옥사이드 하이드로젤 샘플을 나타낸다.

도 8은 본 발명의 본 발명의 방법에 의해 제조된 키토산-리놀레이트-폴리에틸렌옥사이드 하이드로젤 샘플의 시간에 따른 중량의 변화 측정값을 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명의 방법에 의해 제조된 샘플에 대한 원소분석기를 이용한 표면구성원소의 측정 결과 그래프이다[(A): 키토산, (B): 키토산-리놀레이트].

도 10은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 키토산-리놀레이트의 ¹H-NMR 결과이다[(A): 키토산, (B): 리놀레산, (C): 키토산-리놀레이트].

본 발명은 키토산 하이드로젤, 이를 이용한 생리활성물질 전달체, 및 이의 제조방법에 관한 것으로 생체재료 및 약물전달 기술분야와 관련된 것이다.

더욱 상세하게는, 키토산의 아민말단기에 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물생물분자를 결합시켜 키토산유도체를 합성하는 기술, 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물분자와 공유결합 된 키토산 유도체를 싸이올 작용기를 갖는 물질과 공유결합시킴으로써 형성된 키토산 하이드로젤 합성기술, 및 생리활성 물질을 담지시킨 생리활성 물질 전달체에 관한 것이다.

본 기술분야는 종래기술은 키토산을 기능성식품, 응집제와 같은 환경처리물질로 응용하는 기술이라고 할 수 있다. 키토산(chitosan)은 게, 새우 등 갑각류의 껍질에 존재하는 키틴(chitin)을 고온, 강알칼리로 처리하여 탈아세틸화 시킨 생물분자 물질로서, 분자내 유리 아미노기 작용기가 존재하므로, 화학, 의학, 농업, 화장품 및 식품산업분야 등에 현재 다양하게 이용되고 있다. 의학/생명소재/의공학 분야에서는 약물 혹은 세포 전달담체(drug or cell delivery carriers)와 인공피부, 인공연골, 인공골 등과 같은 인체조직 재생에 필요한 지지체(scaffolds for tissue engineering) 소재로 연구되고 있는 기술이다.

키토산을 이용한 그 동안의 연구들은 주로 조직재생을 위한 소재, 건강보조식품으로 활용하는 기술이었다. 현재 연구되고 있는 조직재생 소재개발로는 "키토산으로 표면 코팅된 조직재생용 생분해성 고분자제제 및 그 제조방법", "조직공학용 다공성 고분자 지지체의 제조방법", "키토산-히알루론산으로 이루어진 이온성 복합지지체", "생체흡수성 신경도관 및 이의 제조방법", "연골세포에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드, 세포외기질을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자기질 및 그의 제조방법", "세포에 부착하는 올리고펩타이드" 등이 특허로 보고되고 있다. 또한 종래에는 건강보조식품소재로서 키토산을 양계, 콩나물 재재를 위한 사료로 사용하는 경우가 대표적 종래기술에 포함될 수 있다. 키토산의 아민기의 양하전과 DNA의 음하전을 이용한 이온결합 complex에 의한 DNA 전달체로 사용하는 기술을 연구측면에서의 종래기술로 볼 수 있다.

그러나 최근에는 지혈작용(올리고당의 혈액응고 방지특성), 생리활성물질 전달체(하이드로젤 소재 및 DNA-키토산 결합체로서 약물전달시스템으로 사용특성), 조직공학용 지지체(피부재생용 지지체) 등과 같은 다양한 키토산 고유의 생물학적 특성이 우수함에도 불구하고 키토산 생물학적 고유기능을 잘 활용하지 못하는 문제점이 있다. 이러한 현실로 말미암아, 키토산을 고부가가치의 제품으로 생산하지 못하여, 저가의 건강기능보조식품, 가축사료 등과 같은 키토산 상품화가 주류를 이루고 있는 것이 현실이다. 또한, 이러한 단계의 저급의 키토산 소재 생산에 비하여 제조공정단계에서 환경문제를 유발시키는 문제가 더 심각할 수 있다.

그러므로, 고기능성/고부가가치 소재(예: 의약품소재)의 키토산으로 전환으로 상품화를 유도할 수 있는 기술을 개발할 필요성이 있다. 따라서 최근에 캐나다에서 키토산을 의약품소재로 개발하여 매우 고가로 판매하고 있는 예에서 보는 바와 같이, 고기능성 및 고가의 의약품, 약물전달체, 조직공학제품 소재로 전환할 수 있는 기술개발 필요성이 있다.

본 발명자들은 이러한 요구에 상응하여, 키토산의 생물학적 기능을 최대한 살리고, 고부가가치의 하이드로젤을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자와 공유결합 된 키토산 유도체 및 싸이올 작용기를 갖는 물질이 가교결합하고 있는 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 키토산 하이드로젤에 생리활성 물질을 화학적 결합 혹은 물리적 담지 시킨 생리활성 물질 전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 키토산 하이드로젤을 제조하는 방법 및 상기 키토산 하이드로젤을 이용하여 생리활성물질/약물 전달체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자와 공유결합 된 키토산 유도체 및 싸이올 작용기를 갖는 물질이 가교결합하고 있는 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤을 제공한다.

또한, 상기 키토산 하이드로젤에 생리활성 물질을 담지시킨 생리활성 물질 전달체 및 생리활성 물질이 화학적으로 가교결합 된 조직재생 유도용 지지체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 용어, "생물분자"는 인위적인 실험을 통해 합성한 분자가 아닌, 생명체로부터 얻어지는 분자를 의미하는 것이다.

본 발명에서 용어, "분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자"는 일반식 CnH₂n의 구조를 가지는 에틸렌계 탄화수소로서, 어미가 -엔(-ene)으로 끝나는 이름으로 명명되는 화합물을 의미한다. 이는 탄소 원자 사이에 이중 결합, 즉 시그마(σ)결합 1개와 파이(π)결합 1개가 이루어져 있는 구조를 특징으로 가지는 분자 화합물이다. 그러므로, "엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자"란 인위적인 합성에 의해 제조되지 않고 생명체에 존재하는, 탄소 원자 사이의 이중결합을 지니고 있는 -엔(-ene)으로 끝나는 이름으로 명명되는 화합물로서, 그 생물분자 구조의 특징상 대부분 탄소간의 이중결합이 분자구조의 중간에 존재하는 경우가 많다. 이에 반해, 인위적으로 합성한 엔 작용기를 가지는 합성분자의 경우에는 분자구조의 말단에 엔 작용기를 가지는 경우가 많다.

본 발명에서는 생체적합성이 우수한, 분자구조의 중간에 엔 작용기가 존재하는 생물분자를 사용한다. 본 발명에서 "엔 작용기를 가지는 분자", "엔 불포화 작용기를 가지는 분자", "엔 화합물"로 사용하는 용어도 모두 이를 지칭하는 용어이다. 본 발명의 "분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자"의 바람직한 예로서 불포화지방산(unsaturated lipid), 대사물질(metabolites) 및 페로몬(pheromones) 등이 포함된다.

본 발명에서 용어, "하이드로젤"은 충분한 양의 수분을 보유하고 있는 친수성 고분자의 3차원적 구조를 의미한다. 본 발명의 목적상, 하이드로젤은 키토산 하이드로젤이다.

본 발명에서 용어, "생리활성 물질"이란 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단 등에 사용되는 물질을 의미하고, 특정 물질이나 분류에 제한되지 않는다. 이런 생리활성 분자에는 유기 합성 화합물, 추출물, 단백질, 펩타이드, 핵산, 지질, 탄수화물, 스테로이드, 세포외기질 물질 및 세포 등을 포함한다. 본 발명에서 사용하고 있는 용어 "약물"도 상기 생리활성 물질에 포함될 수 있다. 또한, 임의의, 희석제, 방출 지연제, 비활성 오일, 결합제 등의 당 기술 분야에서 다양한 부형제가 선택적으로 혼합될 수 있다.

본 발명에서 용어, "생리활성 물질 전달체"는 생리활성 물질을 담지 혹은 화학적으로 결합시켜 생체내로 전달할 수 있는 장치를 의미한다.

본 발명에서 용어, "조직재생 유도용 생리활성 지지체"는 조직재생의 유도기능을 가진 펩타이드를 키토산의 네트워크에 화학적으로 결합시켜 새로운 키토산-펩타이드로 구성되는 하이드로젤 물질을 의미한다.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물분자와 공유결합 된 키토산 유도체가, 싸이올 작용기를 갖는 물질과 가교결합으로 형성된 키토산 하이드로젤에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 키토산은 탈아세틸화 된 키토산으로, 바람직하게는 60% 이상 탈아세틸화된 수용성 키토산, 보다 바람직하게는 약 85% 탈아세틸화 된 수용성 키토산이다. 또한, 1 내지 1,000 kDa의 크기를 갖는 키토산이고, 보다 바람직하게는 5 kDa 내지 200 kDa의 크기를 갖는 키토산이다. 키토산은 생체 친화성이 우수하고, 항원성이 낮으며 생체 내에서 분해 흡수되는 특징을 가지므로 의료용 재료로 바람직하다.

본 발명의 하이드로젤에 사용되는 키토산 유도체는, 예를 들어 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물분자가 불포화지방산(unsaturated lipid)인 경우에, 그 말단의 카르복실산 작용기와 키토산의 아민 작용기가 공유결합하여 형성된다. 즉, 상기 결합에 의해 엔(-ene) 생물분자를 함유하는 키토산 유도체가 형성되는 것이다.

이와 같이, 수용성 키토산과 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물분자를 화학적으로 결합시켜 키토산-엔(-ene) 화합물을 일차 합성한 다음, 키토산-엔(-ene) 화합물의 엔(-ene) 그룹(작용기)과 싸이올 작용기를 가진 물질간의 화학결합을 Michael type 반응으로 유도시켜 젤을 합성한다.

키토산과 공유결합 될 수 있는 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 분자에는 불포화지방산(unsaturated lipid), 대사물질(metabolites) 및 페로몬(pheromones) 등이 있다. 구체적으로 예를 들면, 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linonenic acid), 올레산(oleic acid), 팔미틱산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 미드산(mead acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 시스-에이코사-펜타에노산(cis-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoic acid), 시스-도코사-테트라엔산(cis-docosa-7,10,13,16-tetraenlic acid), 시스-도코사-펜타엔산(cis-docosa-4,7,10,13,16-pentaenoic acid), 옥타-트리에노산(octa-5,9,12-trienoic acid; colombinic acid), 메틸-하이드록시에코산-테트라에노에이트(methyl-hydroxy-5,8,12,14-tetraenoate), 로렌센나인(laurencenynes), 운데카-테트라 센(undeca-1,3,5,8-tetracenes), 하이드록시에이코사펜타엔산 (hydoxyeicosapentaenic acid), 하이드로퍼옥시에이코사테트로에논산(hydroperoxyeicostetraenic acid), 포스포티딜에타놀아민(phosphatidylethanolamine; 18:2, 18:3, 20:4, 22:6 등)포스파티딕산(phohspatidic acid; 18:2, 22:6 등), 포스파디딜글라이세롤(phosphatidylglycerols; 18:2, 18:3, 22:6 등), 포스포티딜세린(phosphatidylserines; 22:6 등), 이노시톨(Inositol; 20:4 등) 등과 같은 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물분자들이 포함된다.

본 발명의 구체적인 양태로서, 하이드로젤 제조를 위한 키토산 유도체로서, 리놀레산을 키토산과 공유결합시켜 키토산-리놀레이트를 합성할 수 있고, 또는 올레산을 키토산과 공유결합시켜 키토산-올레이트로 합성할 수 있다.

상기 키토산 유도체를 싸이올 작용기를 갖는 물질과 가교결합 시킴으로써 본 발명의 키토산 하이드로젤을 제조할 수 있다. 이 때, 엔(-ene) 불포화 작용기와 싸이올 작용기 비율은 용도에 따라 다양하게 조절가능하다. 상기 엔(-ene) 불포화 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 보다 바람직하게는 1:1이다.

키토산 유도체와 결합되는 싸이올 작용기를 갖는 물질에는 의료용 고분자로 적용되는 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 시스틴 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드, 폴리프로필렌 옥사이드(polypropylene oxide), 또는 알릴 글리시딜 에테르(allyl glycidyl ether) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 보다 바람직하 게는 시스틴 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 및 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide)이다. 이 외에도, 통상적인 유기합성에 의하여 유도될 수 있는 "싸이올기를 갖는 생체적합성 의료용 고분자"는 모두 가능하다.

일 구체예로, 하기 반응식 1과 같이 키토산-엔(-ene)의 작용기와 싸이올 작용기를 가진 분자인 폴리에틸렌옥사이드 싸이올 간의 Michael type 반응에 의해 키토산-폴리에틸렌옥사이드 하이드로젤을 합성할 수 있다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 키토산 하이드로젤에 있어서 키토산 유도체에 싸이올 작용기를 갖는 물질로 폴리에틸렌옥사이드 외에 시스틴 아미노산을 추가로 포함하는 펩타이드, 당 또는 단백질 등과 결합시킴으로써 합성된 키토산-펩타이드 하이드로젤을 합성할 수 있다.

상기 시스틴 아미노산을 포함하는 펩타이드는 세포부착성 및/또는 세포이동 및 증식유도가 가능한 아미노산 시퀀스(sequence)와 키토산 유도체와의 가교결합을 위한 시스틴 아미노산을 포함하는 펩타이드(예를 들면 RGD)와 콜라게네이즈(collagenase), 플라즈민 등과 같은 효소에 의하여 생분해가 조절되는 기능성을 가진 아미노산 시퀀스(예를 들면 CYKNRC)에 시스틴을 함유하는 펩타이드 혹은 상기의 서로 다른 기능을 포함하는 펩타이드를 일컫는다.

보다 구체적인 예로서, 상기 시스틴을 함유하는 펩타이드는 세포부착성의 RGD, RGDS, REDV, YIGSR 등의 올리고펩타이드 또는 시스틴을 포함하는 세포외기질 물질로 알려진 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 젤라틴(gelatin), 엘라스틴(elastin), 오스티오칼신(osteocalcin), 피브리노겐(fibrinogen), 피브로모듈린(fibromodulin), 테나신(tenascin), 라미닌(laminin), 오스티오폰틴(osteopontin), 오스티오넥틴(osteonectin), 퍼레칸(perlecan), 베르시칸(versican), 본 윌리브랜드 팩터(von Willebrand factor) 및 비트로넥틴(vitronectin)이 될 수 있으며, 특정효소에 의하여 분해되는 YKNR 유기합성 화합물 등이 포함될 수 있다. 여기서 RGE, REDV, YKNR, QPQGLAK 등은 아미노산의 단일글자 표기이며, 각각의 단일글자들은 arginine(R), glycineG), glutamic acid(E), aspartic acid (D), valine(V), tyrosine(Y), lysine(K), asparagine(N), glutamine(Q), proline(P), leucine(L), alanine(A)를 의미한다.

또한, 상기 키토산 하이드로젤에 있어서, 상기 키토산 유도체는 분자구조의 중간에 존재하는 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자 및, 이와 함께 분자구조의 말단에 엔(-ene) 작용기를 갖는 아크릴레이트 유도체와 공유결합시킴으로써 형성될 수 있다.

앞서 설명한 바대로 상기 "엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자"는 그 구조상 화합물의 말단이 아닌 중간에 -엔(ene) 작용기가 존재하고 있다. 따라서, 이와 함께 말단에 엔(-ene) 작용기를 갖는 아크릴레이트 유도체를 추가로 함유시킴으로써 하이드로젤 합성 시간을 단축할 수 있다. 즉, 상기 생물분자의 중간에 존재하는 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자 및 말단에 엔(-ene) 작용기를 갖는 아크릴레이트 유도체의 혼합물을, 키토산과 공유결합시킴으로서 하이드로젤 합성시간을 단축할 수 있다. 이 때, 생물분자의 중간에 존재하는 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자, 키토산 및 싸이올 작용기를 갖는 물질에 대한 설명은 상기와 같다.

말단에 엔(-ene) 작용기를 갖는 아크릴레이트 화합물을 첨가하여 하이드로젤 합성시간을 단축할 수 있는 이유는, 아크릴레이트와 싸이올 말단기 사이의 화학반응 진행시 발생하는 생물분자의 중간에 존재하는 엔의 입체장애(steric effect) 현상을 말단에 엔(-ene) 작용기를 갖는 아크릴레이트 화합물이 완화하는 역할을 하기 때문이다.

즉, 생물분자의 중간에 존재하는 엔(-ene) 작용기는 분자의 중간에 존재함으로써 불포화탄화수소를 이루고 있는 탄소가 2도(2^o) 탄소로 작용하여 입체장애가 발생하며, 이러한 결과는 마이클 타입 반응을 진행하고자 하는 싸이올기의 접근성을 방해함으로써 반응속도가 느린 반응으로 유도된다. 반면에, 분자의 말단에 존재하는 아크릴레이트의 불포화 반응탄소는 1도(1^o) 탄소로 작용하기 때문에 싸이올 말단기의 접근에 대하여 입체장애를 유발하는 기를 갖고 있지 않기 때문에 반응이 쉽게 진행된다. 또한 분자 말단의 메타아크릴이트 화합물은 생물분자의 중간에 존재하는 엔(-ene)과 비교하여 화합물의 크기가 작으므로, 엔트로피가 높아서 빠른 반응속도를 유도할 수 있다. 따라서 용도에 따라 분자구조의 중간에 존재하는 엔(-ene) 작용기를 가지는 생물분자와, 말단에 엔 작용기를 가지는 아크릴레이트 유도체 및 메타아크릴레이트 유도체를 적절히 혼합하여 싸이올기를 포함하는 화합물과 반응을 유도할 경우, 원하는 반응속도로 하이드로젤을 합성할 수 있다.

상기 말단에 엔(-ene) 작용기를 갖는 아크릴레이트 유도체는 아크릴레이트 작용기 또는 메타아크릴레이트 작용기를 갖는 물질로부터 유도될 수 있다. 구체적인 예로서, 아크릴산(acrylic acid), 메타아크릴산(methacrylic acid), 아디프산 하이드라자이드 다이아마이드 아크릴레이트, 아크릴아미드(acrylamide), 메타아크릴아미드(methacrylamide) 알킬-(메타)아크릴아미드[alkyl-(meth)acrylamide]. 엔-모노-(메타)아크릴아미드(N-mono-(meth)acrylamide), 엔,엔-디-씨₁-씨₄ -(메타)아크릴아미드(N,N-di-C₁ -C₄ alkyl-(meth)acrylamide), 엔-부틸(메타)아크릴레이트(N-butyl (meth)acrylate), 메틸(메타)아크릴레이트[methyl(meth)acrylate], 에틸(메타)아크릴레이트[ethyl(meth)acrylate], 아이소보닐(메타)아크릴레이트[isobornyl(meth)acrylate], 사이클로헥실(메타)아크릴레이 트[cyclohexyl(meth)acrylate], 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), 하이드록시에틸 메타아크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate), 하이드록시프로필 아크릴레이트(hydroxypropyl acrylate), 하이드록시프로필 메타아크릴레이트(hydroxypropyl methacrylate), 하이드록시부틸 아크릴레이트(hydroxybutyl acrylate), 엔-(2-하이드록시에틸)아크릴아미드[N-(2-hydroxyethyl) acrylamide], 엔-메틸아크릴아미드(N-methyl acrylamide), 엔-부톡시메틸아크릴아미드(N-butoxymethyl acrylamide), 엔-메톡시메틸아크릴아미드(N-methoxymethyl acrylamide), 엔-메톡시메틸메타아크릴아마이드(N-methoxymethyl methacrylamide), 2-아크릴아미도글리콜산(2-acrylamidoglycolic acid) 및 2-카복시에틸 아크릴레이트(2-carboxyethyl acrylate) 등을 포함한다.

상기 아크릴 작용기와 싸이올 작용기 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는4:1 내지 1:3, 더욱 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 가장 바람직하게는 1:1이며, 생물분자의 엔(-ene) 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 보다 바람직하게는 1:1이다. 그리고 생물분자의 엔(-ene) 작용기와 아크릴 작용기와의 몰 비는 100:1 내지 1:1, 바람직하게는 20:1 이다.

본 발명의 키토산 하이드로젤은 키토산과 생물분자로 구성되어 안전성이 매우 높은 화합물로 구성되었기에, 상처치유 패치, 주름개선 등의 성형재료, 미용재료, 관절염 치료제, 신경, 피부, 골 및 연골재생 등과 같은 조직재생용 지지체 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 키토산 하이드로젤은 세포의 부착유도 또는 젤의 분해가 가능한, 조직재생유도 생리활성 지지체로 사용될 수 있다. 특히, 상기 키토산-펩타이드 하이드로젤의 펩타이드는 아미노산 시스틴(cystein)을 포함하는 올리고펩타이드 혹은 단백질을 나타내며, 시스틴에 포함된 싸이올 작용기가 아크릴레이트 작용기와 반응하여 화학적으로 공유결합 하여 키토산-펩타이드 하이드로젤을 형성할 수 있다.

이러한 펩타이드의 아미노산 시퀀스에 의하여 세포의 부착과 증식(예를 들면, RGD) 혹은 지지체의 분해지점(예를 들면, YKNR)을 제공하는 역할을 하여 조직재생을 유도한다. 세포부착은 하이드로젤 혹은 젤 내부에 포함된 세포들의 부착이 가능하도록 하는 지점(focal contact or cell adhesion)을 제공한다. 또한 지지체의 분해펩타이드는 하이드로젤이 분해되도록 유도하며, 이에 따라 부착된 세포들이 지지체의 분해에 따라 분해되는 지점으로 세포이동과 증식 및 조직수복 (tissue restoration)을 유도하여 최종적으로 하이드로젤은 분해되어 제거되고, 하이드로젤이 차지하였던 공간은 세포가 분비한 세포외기질과 증식된 세포에 의하여 구성되는 새로운 재생조직이 대체하는 것이다.

또한, 본 발명의 키토산 하이드로젤은 생리활성 물질전달체로 사용할 수 있다. 키토산이 생체적합성(biocompatibility)을 지닌 물질로 공지되어 있고, 본 발명의 하이드로젤 제조방법은 용액상태의 두 가지 물질을 단순히 혼합함으로써 가능하므로, 준비된 두 가지의 용액에 생리활성물질을 포함시켜 하이드로젤을 제조할 수 있다. 생리활성물질이 포함된 두 가지 용액을 주사기를 사용하여 질병/상처부위 에 전달함으로써, 시간에 따라 생리활성물질이 포함된 하이드로젤 제조를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 하이드로젤은 생리활성물질 전달체로의 이용은 더욱 바람직하다.

따라서, 다른 양태로서 본 발명은, 상기 키토산 하이드로젤에 생리활성 물질을 화학적으로 결합시키거나 물리적으로 담지시킨 생리활성 물질 전달체에 관한 것이다.

이는 생리활성 물질을 담지 혹은 화학적으로 결합시켜 생체내로 전달할 수 있는 장치로서, 본 발명의 일 구체예에서는 키토산 하이드로젤 또는 키토산-펩타이드 하이드로젤에 생리활성 물질이 담지되어 생체내로 주사(injection) 방법으로 전달될 수 있다. 목적에 따라서는 생리활성 물질은 예정된 부위에서 예정된 시간에 걸쳐서 일정하게, 방출되도록 할 수 있다. 일 구체예로 상기 키토산 유도체에 생리활성을 조절할 수 있는 목적하는 약물을 결합시킨 다음, 하이드로젤을 형성시켜 약물전달체의 역할도 할 수 있다. 이때 추가로 다른 생리활성 물질을 하이드로젤에 함께 담지시켜 사용할 수 있다.

이런 주사가능한(injectable) 조절형 물질 전달체는, 환자 질병부위로의 전달율이 낮거나, 투여된 고가(high price)의 약물이 체외로 지나치게 빨리 소실되는 경우 혹은 복용에 따른 부작용이 큰 약물을 사용하는 경우에 유동하다. 즉, 약물을 질병부위에 직접 전달함으로써, 약물이 환부에 천천히 방출되도록 속도를 조절함으로써 약물의 농도를 오랫동안 치료 영역에 유지시키거나, 주사방법에 의하여 국소적으로 약물을 환부에 전달시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 키토산 하이드로젤에서, 젤에 화학적으로 결합된 약물의 종류와 농도, 젤의 물리적 강도 및 화학적 특징 및 젤의 분해속도 등에 따라서 생리활성 물질의 전달속도 등이 조절될 수 있다.

본 발명의 키토산 하이드로젤에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체내로 전달할 수 있는 유기합성 화합물에는 일반적으로 사용되는 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제 등이 있다.

항생제로는 테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 오플록사신, 레보플록사신, 시프로플록사신, 클라리스로마이신, 에리쓰로마이신, 세파클러, 세포탁심, 이미페넴, 페니실린, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 반코마이신 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항생제를 예시할 수 있다.

항암제로는 메토트렉세이트, 카보플라틴, 탁솔, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 에트포사이드, 파클리탁셀, 캄토테신, 사이토신 아라비노스 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항암제를 예시할 수 있다.

소염제로는 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 피록시캄, 플루비프로펜, 디클로페낙 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 소염제를 예시할 수 있다.

항바이러스제로는 아시콜로버, 로바빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항바이러스제를 예시할 수 있다.

항균제로는 케토코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 암포테리신-B, 그리세오풀빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항균제를 예시할 수 있다.

본 발명의 키토산 하이드로젤에 담지하여 생체내로 전달할 수 있는 단백질 및 펩타이드에는 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 다당류 및 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체를 예시할 수 있다.

구체적으로, 간 성장호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬, 성장호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 글루카콘-유사 펩타이드류 (GLP-1등), 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류(예: 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 등)와 인터루킨 수용체류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류(예: 글루코세레브로시데이즈(glucocerebrosidase), 이두로네이트-2-설파테이즈(iduronate-2-sulfatase), 알파-갈락토시데이즈-A, 아갈시데이즈 알파(agalsidase alpha), 베타, 알파-L-이두로니데이즈(alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜린에스터데이즈(butyrylcholinesterase), 키티네이즈(chitinase), 글루타메이트 디카르복실레이즈(glutamate decarboxylase), 이미글루세레이즈(imiglucerase), 리페이즈(lipase), 유리케이즈(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤레이즈(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티데이즈(neutral endopeptidase), 마이엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 종양괴 사인자(TNF, Tumor Necrosis Factor) 알파 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자 Ⅶ, 혈액인자 Ⅶa, 혈액인자 Ⅷ, 혈액인자 Ⅸ, 혈액인자 XIII, 플라즈미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키네이즈, 스트렙토키네이즈, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게네이즈 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자(bone morphogenic protein), 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예: 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin) 등), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트 로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예: scFv, Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 키토산 하이드로젤에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체내로 전달할 수 있는 핵산으로는 DNA, RNA, PNA, 올리고뉴클레오티드 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 키토산 하이드로젤에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체내로 전달할 수 있는 세포외기질 물질에는 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 비트로넥틴 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 키토산 하이드로젤에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체내로 전달할 수 있는 다당 물질에는 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 키토산 하이드로젤에 물리적으로 담지하여 생체내로 전달할 수 있는 세포에는 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 연골세포, 뼈세포, 피부세포, 슈반세포, 줄기세포 등을 예시할 수 있다.

실제 본 발명의 방법으로 제조된 하이드로젤을 세포 전달체로 이용하였을 때, 하이드로젤에 담지된 세포들이 증식되어 숫자가 증가하고 약 2-8주 후에는, 합성조건에 따라 하이드로젤이 분해되어 세포들이 세포배양 플라스크 표면에 부착됨을 확인할 수 있었다(도 3 내지 6). 이는 본 발명의 키토산 하이드로젤에 담지되는 생리 활성물질의 잔존수율과 활성이 안정적임을 시사한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a)수용성 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 키토산을, 분자구조의 중간에 존재하는 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자와 공유결합 시켜 키토산 유도체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 키토산 유도체를 싸이올 작용기를 갖는 물질과 가교결합 시키는 단계를 포함하는 키토산 하이드로젤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

(a) 단계는 키토산을 물에 녹여서 수용성 키토산 용액을 제조하는 단계이다. (b) 단계에서는 분자구조의 중간에 존재하는 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자와 키토산을, 반응유도물질을 이용하여 공유결합시킬 수 있다. 이 때, 반응유도물질로서 디에틸프로필 에틸카르보 디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 카르보 디이미드 (CDI) 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 디에틸프로필 에틸카르보 디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 반응유도물질로 사용하였으며, 키토산: 리놀레산: EDC의 몰 반응비는 다양하게 조절될 수 있다. 실제로 1: 2 4, 1: 4: 2 또는 1: 5: 5 등으로 다양하게 변화시켜 하이드로젤을 형성할 수 있다.

상기 키토산 하이드로젤을 제조하는 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 키토산을, 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자과 함께 아크릴레이트를 유도체와 공유결합시켜 하이드로젤 합성시간을 단축시킬 수 있다. 상기 엔(-ene) 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비율은 용도에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 상기 아크릴 작용기와 싸이올 작용기 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 4:1 내지 1:3, 더욱 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 가장 바람직하게는 1:1이며, 상기 엔(-ene) 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비는 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 3:1 내지 1:2이고, 보다 바람직하게는 1:1이다. 그리고 엔(-ene) 작용기와 아크릴 작용기와의 몰 비는 100:1 내지 1:1, 바람직하게는 20:1 이다. 이러한 몰 비는 제조하고자 하는 하이드로젤의 특성 및 용도에 따라 조절가능 하다.

상기 키토산 하이드로젤을 제조하는 방법에 있어서, 사용되는 키토산의 분자량, 엔(-ene) 작용기을 포함하는 생물분자의 종류, 키토산 농도와 키토산의 디아세틸화 정도, 사용하는 반응유도물질의 종류, 농도 및 pH, 반응시키는 엔(-ene) 작용기와 싸이올 작용기의 몰 비율 등 매우 다양한 요소에 따라 하이드로젤의 생물학적 특성, 물리적 강도 및 화학적 특성은 달라진다. 이런 모든 점을 고려하여 목적에 적합한 하이드로젤을 제조하도록 한다. 예를 들어, 키토산: 리놀레산: EDC의 몰 비 및 폴리에틸렌옥사이드에 결합된 싸이올기 개수에 따라 젤의 함수율이 달라질 수 있다. 또한, 키토산 용액농도가 감소함에 따라 형성되는 하이드로젤의 네트워크 기공크기가 증가함을 알 수 있었다.

상기 키토산 하이드로젤을 제조하는 방법에 있어서, 목적에 따라 생리활성 물질을 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합시키는 단계를 추가할 수 있다.

구체적인 예로서, 키토산 하이드로젤을 제조하는 하나의 방법은 수용성 키토산 용액을 제조하는 단계; 키토산을, 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자와 공유결합 시켜 키토산 유도체를 제조하는 단계; 생리활성 물질(약물)을 화학결합 시키는 단계; 키토산 유도체로부터 미반응 생물분자 반응물을 제거하는 단계; 키토산 유도체를 건조시키는 단계; 및 상기 키토산 유도체를 싸이올 작용기를 갖는 물질과 가교결합 시키는 단계를 포함한다.

또 다른 양태로서 본 발명은 (a) 수용성 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 키토산을, 분자구조의 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자와 공유결합 시켜 키토산 유도체를 제조하는 단계; (c) 생리활성 물질을 상기 키토산 유도체 또는 싸이올 작용기를 갖는 물질과 혼합하는 단계; 및 (d) 생리활성 물질을 화학적으로 결합시키거나 물리적으로 담지한 채 상기 키토산 유도체를 싸이올 작용기를 갖는 물질과 가교결합 시키는 단계를 포함하는 생리활성 물질 전달체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 각 단계에 대한 구체적인 설명은 상기와 같다.

본 발명의 키토산 하이드로젤로 생리활성 물질의 담지는 젤 제조과정 또는 젤 제조 후 사용 전에 할 수 있지만, 젤 제조과정 중 (c) 단계에서 생리활성 물질을 젤에 물리적 담지 혹은 화학적 결합을 유도하는 것이 바람직하다. 키토산 유도체 용액 또는 싸이올 작용기를 갖는 물질을 녹인 용액에 생리활성 물질을 혼합한 다음 하이드로젤 제조를 유도함으로써, 생리활성물질이 물리적으로 하이드로젤에 담지되도록 유도하거나, 공유결합 형태로 젤 네트워크 일부가 되도록 한다.

일 구체예로서, 생리활성 물질 전달체의 제조하는 방법은 수용성 키토산 용액을 제조하는 단계; 키토산을, 분자구조 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자와 공유결합 시켜 키토산 유도체를 제조하는 단계; 키토산 유도체로부터 반응물인 미반응 엔(-ene) 작용기를 포함하는 생물분자를 제거하는 단계; 키토산 유도체를 건조시키는 단계; 생리활성 물질을 상기 키토산 유도체 또는 싸이올 작용기를 갖는 물질과 혼합하는 단계; 및 상기 키토산 유도체를 싸이올 작용기를 갖는 물질과 가교결합 시키는 단계를 포함한다.

상기 생리활성 물질 전달체의 제조하는 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 키토산을, 분자구조 중간에 엔(-ene) 작용기를 갖는 생물분자 및 분자구조 말단에 엔(-ene) 작용기를 갖는 아크릴레이트 화합물과 공유결합을 시켜 키토산 유도체를 제조한 다음, 싸이올 화합물과 공유결합시킴으로써 하이드로젤 합성시간을 단축시킬 수 있다.

이하, 구체적인 실시예 및 비교예를 가지고 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예]

본 발명의 하이드로젤의 세포적합성 평가를 위하여 사용한 세포들은 동물로부터 수확한 세포이다. 평활근세포와 섬유아세포는 돼지의 경동맥을 절개한 다음, 중막(media tissue)과 외막(adventitia tissue)으로부터 각각 분리 및 in vitro 확장하여 낮은 계대의 세포(p5)들을 사용하였으며, 골세포(MC3T3)는 쥐의 두개골에서 분리 및 in vitro 확장하여 낮은 계대(p5)의 세포들을 사용하였다.

실시예 1: 리놀레산이 포함된 키토산 하이드로 젤

1 단계 과정: 약 85% 디아세틸화 된 수용성 키토산 (5∼10 kDa)을 물에 녹인 20 mL 와 리놀레산(linoleic acid)을 물에 녹인 용액 5 mL를 혼합한 다음, EDC를 첨가하여 4 시간동안 교반하면서 반응을 진행하였다. 생성용액을 동결진공건조기에서 동결 건조하여 키토산-리놀레이트 생성물을 획득하였다.

2 단계 과정: 1단계에서 제조한 키토산-리놀레이트와 싸이올 작용기를 가진 폴리에틸렌옥사이드 반응물을 용매에 녹여 2가지의 용액을 각각 제조하였다.

3단계 과정: 2단계에서 제조된 두 가지 용액을 혼합시킴으로써 하이드로젤을 제조하였다. 이때 리놀레이트의 엔(-ene) 작용기와 싸이올 작용기 비율을 다양하게 조절하여 각각의 용액을 일차적으로 제조하였다. 두 용액을 혼합한 다음, 반응용기를 upside-down 시킴으로써, 2일 안에 젤이 형성되는 것을 육안으로 관찰할 수 있었으며(도 1), 수용액에 100일 동안 침지한 이후에도 분해되지 않고 하이드로젤 형태를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. (도 1-A)

실시예 1에서 형성된 키토산 하이드로젤의 구성요소인 엔(-ene) 작용기와 싸이올 작용기를 1:1의 몰 비율로 변형시켜 제조된 하이드로젤을 디지털 사진기로 촬영하여 관찰한 결과, 증류수에 넣어 100일 동안 37^oC에서 관찰했을 때, 하이드로젤 형태를 유지하고 젤이 분해되지 않음을 확인하였다 (도 1).

키토산-리놀레이트 하이드로젤 샘플을 Fourier transformed infrared spectroscopy 로 평가한 결과, 키토산-리놀레이트(chitosan-2-carboxyethyl acrylate)의 샘플에서 1630 wavelength (cm^-1)에서 아마이드 피크를 확인함으로써 키토산과 리놀레이트가 공유결합을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 7).

리놀레산을 이용하여 합성된 키토산 하이드로젤을 동결건조 한 다음 증류수에서 중량변화를 시간 당 측정하여 2일 정도 지속한 결과, 제조된 하이드로젤이 약 6시간까지 중량이 증가하다가 10시간 이후부터는 더 이상 증가하지 않음을 확인함으로써, 초기에 하이드로젤이 물을 흡수하여 중량이 증가함을 확인하였다. 제조된 하이드로젤은 수용액에서 1주일 동안 분해되지 않음을 육안으로 확인하여 형태학적으로 안정한 하이드로젤을 합성하고 있음을 알 수 있었다. (도 8)

실시 예 1에서 합성한 키토산-리놀레이트를 화학원소분석기(ESCA)로 분석한 결과, 질소원소 비율의 증가 (7.04 %에서 7.55 %)와 질소피크의 변화를 관찰할 수 있었고, 키토산에 불포화 탄화수소 및 탄화수소 비율이 증가함을 알 수 있어 키토산에 리놀레산이 화학적으로 결합되어 있음을 알 수 있었다. (도 9)

실시 예 1에서 합성한 키토산-리놀레이트 및 건조한 키토산 하이드로젤 샘플을 용매에 녹여 FTIR로 분석한 결과 리놀레산 및 키토산 하이드로젤의 화학구조식에 아미드(amide) 결합이 존재함을 알 수 있어, 키토산에 리놀레산이 화학적으로 결합되어 있으며, 동시에 키토산 하이드로젤에 리놀레이트가 화학적으로 네트워크를 형성하고 있음을 알 수 있었다. (도 10)

실시예 2: 올레산이 포함된 키토산 하이드로 젤

실시예 1의 리놀레산 대신에 올레산 (oleic acid)을 사용하여 반응을 진행한 결과, 키토산-올레이트 (chitosan-olate) 생성물을 합성할 수 있었다. 합성된 키토산-올레이트와 싸이올기를 가진 폴리에틸렌옥사이드와의 반응을 실시예 1의 단계별 실험을 진행하여 하이드로젤을 합성하였다.

실시예 2에서 합성된 키토산-올레산을 이용하여 제조한 키토산 하이드로젤을 제조한 다음 100 mL 증류수에 1주일 넣은 다음 상온에서 관찰한 결과, 하이드로젤의 분해가 발생되고 있음을 관찰하였다.

실시예 3: CRGDC 펩타이드가 포함된 키토산 펩타이드 하이드로 젤

실시예 1의 2단계에서 하이드로젤 합성과정에서 싸이올 작용기를 가진 폴리에틸렌 옥사이드 용액에 CRGDC 펩타이드를 0.3% 첨가하여 반응을 진행한 결과, 키토산-펩타이드 하이드로젤을 합성할 수 있었다.

실시예 4: 키토산 하이드로젤 표면에서의 골세포 배양

실시예 1에서 합성한 키토산 하이드로젤 표면위에 골세포를 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 in vitro 배양하여 3일 동안 관찰한 결과, 세포의 부착과 뻗음이 진행되고 있음을 광학현미경으로 관찰하였을 때 세포증식성이 활발히 진행되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 2).

실시예 5: 내부에 골세포를 함유한 키토산 하이드로젤에서의 골세포 배양

실시예 1의 2단계에서 하이드로젤 합성과정에서 200,000 cells/mL 농도의 골세포(MC3T3)를 폴리에틸렌 옥사이드와 키토산-리놀레이트(chitosan-linolate)와 함께 혼합하여 하이드로젤의 합성을 진행하여 세포가 포함된 하이드로젤의 합성을 유도하였다. 한 달 동안 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 in vitro 세포배양하면서 하이드로젤 내부에서의 골세포 적합성 평가를 광학현미경으로 관찰하였다. (도 3)

실시예 6: 키토산 하이드로젤 표면에서의 평활근세포 배양

실시예 3의 하이드로젤에 평활근세포를 200,000 cells/cm²의 농도로 접종하 여 3일 동안 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 세포배양기에서 배양하면서 세포부착현상을 광학현미경으로 관찰한 결과, 세포의 부착과 증식이 진행되고 있음을 광학현미경으로 관찰할 수 있었다. (도 4)

실시예 7: 골세포의 세포부착성 및 증식성

실시예 6의 하이드로젤 합성과정에서 실시예 1의 2단계에서 합성된 키토산 리놀레이트와 CRGDC 펩타이드를 멸균 증류수에 녹인 5 μL 펩타이드 용액과 200,000 골세포가 포함된 세포현탁액을 마이크로코니컬 튜브(micro-conical tube)에 각각 준비하였다. 또 다른 마이크로코니컬 튜브에 싸이올기를 가진 폴리에틸렌옥사이드 용액 100 μL와 키토산 리놀레이트 용액 100 μL을 골세포 현탁액을 포함시킨 후 혼합함으로써 세포-펩타이드-폴리에틸렌옥사이드 용액으로 제조하였다. 상기의 세포-펩타이드-폴리에틸렌옥사이드 용액을 키토산-리놀레이트 용액과 혼합하여 골세포가 함유된 키토산-펩타이드 하이드로젤을 제조하여, 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 in vitro 세포배양을 4-챔버 슬라이드(chamber slide) 상에서 1개월 진행하면서 세포부착성, 증식성 등을 광학현미경으로 평가한 결과, 세포부착과 증식성이 현저히 증가함을 알 수 있었다. (도 5)

실시예 8: 섬유아세포의 세포부착성 및 증식성

실시예 6에서 평활근세포 대신에 섬유아세포를 하이드로젤에 포함시켜 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 in vitro 세포배양을 16일 동안 진행하면서 세포적합성 평가를 광학현미경으로 관찰한 결과, 세포부착과 응집(aggregation) 현상이 발생하고 있음을 현미경으로 관찰하였다 (도 6)

이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

본 발명에 의해 약물/세포가 포함된 하이드로젤을 개발하여 조직공학용 인공장기 재생, 주름개선제, 신경, 골 및 연골재생제 및 치료제, 화상치료 혹은 미용을 위한 드레싱제, 혹은 관절염 및 암 치료용의 약물전달체로 사용하면, 약물의 효율적 전달과 하이드로젤의 생분해에 따른 조직재생을 촉진할 수 있을 것으로 예측되며, 사용된 분자들이 모두 생물분자이므로 생체적합성이 우수하고 독성이 없을 것으로 예상된다. 예를 들면, 리놀레산과 공유결합 된 키토산용액과 싸이올 그룹을 가진 폴리에틸렌옥사이드용액을 혼합-분사시키면서 천천히 하이드로젤을 형성시켜 화상부위나 상처부위를 치료할 수 있다. 다른 예로써, 키토산-리놀레이트에 키토산-아크릴레이트(이전에 본 발명자에 의하여 취득한 유사화합물)를 혼합하여 용액으로 제조한 다음, 폴리에틸렌옥사이드와 혼합하여 하이드로젤을 합성할 경우 젤 형성시간을 단축시키고, 또한 그 시간을 조절할 수 있는 하이드로젤 합성방법으로 응용하고, 그 적용범위를 확대할 수 있을 것이다. 또 다른 예로써, 폴리에틸렌옥사이드 용액에 세포를 혼합시킨 다음, 키토산-리놀레이트 용액과 함께 혼합하여 주사기로 용액을 환자의 질병부위에 전달시켜, 원하는 시간 내에 다양한 물리적 특성을 가진 하이드로젤로 변형 가능하도록 유도시켜 복잡한 형태의 상처부위 조직을 복구시킬 수 있는 무독성의 조직재생 유도용 하이드로젤 지지체로 응용할 수 있다. 조직재생 지지체로서 치유부위에 따라 하이드로젤의 물리적 특성과 젤 합성 및 분해시간 조절이 가능하기 때문에, 적용하중에 따라 다양한 물리적 특성을 가진 하이드로젤로 응용이 가능하다. 또한 세포 대신에 생리활성물질을 물리적 담지 혹은 화학 적으로 결합시켜 조직재생 혹은 상처치유가 가능한 약물담체의 하이드로젤로 사용가능하다. 두 가지 용액을 혼합함으로써 순간적 혹은 정해진 시간 내에 하이드로젤이 형성되므로, 각기 다른 용기에 용액을 담아 분사(spray)형태로 두 가지 용액을 혼합하여 상처부위 치료방법으로 응용이 가능하다. 제조된 하이드로젤은 생체적 합성이 우수하므로 성형용 필러(filler)로 적용이 가능하며, 주사방법에 의하여 제공된 키토산 하이드로젤이 최종분해 되거나 혹은 첨가된 히알루론산/헤파란 설페이트/콘드로이틴 설페이트/더마탄 설페이트 등으로부터 제공되는 글루코사아민 단량체, 종양괴사인자(TNF) 알파 억제인자(inhibitor)들을 전달함으로써 관절염치료제로 가능할 것이다.

Claims

리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolnenic acid), 올레산(oleic acid), 팔미틱산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 미드산(mead acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 시스-에이코사-펜타에노산(cis-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoic acid), 시스-도코사-테트라엔산(cis-docosa-7,10,13,16-tetraenlic acid), 시스-도코사-펜타엔산(cis-docosa-4,7,10,13,16-pentaenoic acid), 옥타-트리에노산(octa-5,9,12-trienoic acid; colombinic acid), 메틸-하이드록시에코산-테트라에노에이트(methyl-hydroxy-5,8,12,14-tetraenoate), 로렌센나인(laurencenynes), 운데카-테트라센(undeca-1,3,5,8-tetracenes), 하이드록시에이코사펜타엔산 (hydoxyeicosapentaenic acid), 하이드로퍼옥시에이코사테트로에논산(hydroperoxyeicostetraenic acid), 포스포티딜에타놀아민(phosphatidylethanolamine) 포스파티딕산(phohspatidic acid),포스파디딜글라이세롤(phosphatidylglycerols), 포스포티딜세린(phosphatidylserines), 및 이노시톨(Inositol)로 이루어진 군에서 선택된 생물분자와 공유결합된 키토산 유도체 및

폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 시스틴 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리프로필렌 옥사이드(polypropylene oxide) 및 알릴 글리시딜 에테르(allyl glycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택된 물질이 가교결합하고 있는 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤.
리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolnenic acid), 올레산(oleic acid), 팔미틱산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 미드산(mead acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 시스-에이코사-펜타에노산(cis-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoic acid), 시스-도코사-테트라엔산(cis-docosa-7,10,13,16-tetraenlic acid), 시스-도코사-펜타엔산(cis-docosa-4,7,10,13,16-pentaenoic acid), 옥타-트리에노산(octa-5,9,12-trienoic acid; colombinic acid), 메틸-하이드록시에코산-테트라에노에이트(methyl-hydroxy-5,8,12,14-tetraenoate), 로렌센나인(laurencenynes), 운데카-테트라센(undeca-1,3,5,8-tetracenes), 하이드록시에이코사펜타엔산 (hydoxyeicosapentaenic acid), 하이드로퍼옥시에이코사테트로에논산(hydroperoxyeicostetraenic acid), 포스포티딜에타놀아민(phosphatidylethanolamine) 포스파티딕산(phohspatidic acid),포스파디딜글라이세롤(phosphatidylglycerols), 포스포티딜세린(phosphatidylserines), 및 이노시톨(Inositol)로 이루어진 군에서 선택된 생물분자와 공유결합된 키토산 유도체 및

아크릴산(acrylic acid), 메타아크릴산(methacrylic acid), 아디프산 하이드라자이드 다이아마이드 아크릴레이트, 아크릴아미드(acrylamide), 메타아크릴아미드(methacrylamide) 알킬-(메타)아크릴아미드[alkyl-(meth)acrylamide]. 엔-모노-(메타)아크릴아미드(N-mono-(meth)acrylamide), 엔,엔-디-씨₁-씨₄ -(메타)아크릴아미드(N,N-di-C₁ -C₄ alkyl-(meth)acrylamide), 엔-부틸(메타)아크릴레이트(N-butyl (meth)acrylate), 메틸(메타)아크릴레이트[methyl(meth)acrylate], 에틸(메타)아크릴레이트[ethyl(meth)acrylate], 아이소보닐(메타)아크릴레이트[isobornyl(meth)acrylate], 사이클로헥실(메타)아크릴레이트[cyclohexyl(meth)acrylate], 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), 하이드록시에틸 메타아크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate), 하이드록시프로필 아크릴레이트(hydroxypropyl acrylate), 하이드록시프로필 메타아크릴레이트(hydroxypropyl methacrylate), 하이드록시부틸 아크릴레이트(hydroxybutyl acrylate), 엔-(2-하이드록시에틸)아크릴아미드[N-(2-hydroxyethyl) acrylamide], 엔-메틸아크릴아미드(N-methyl acrylamide), 엔-부톡시메틸아크릴아미드(N-butoxymethyl acrylamide), 엔-메톡시메틸아크릴아미드(N-methoxymethyl acrylamide), 엔-메톡시메틸메타아크릴아마이드(N-methoxymethyl methacrylamide), 2-아크릴아미도글리콜산(2-acrylamidoglycolic acid) 및 2-카복시에틸 아크릴레이트(2-carboxyethyl acrylate)로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유도된 아크릴레이트 유도체와 공유결합하여 형성되는 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 키토산은 탈아세틸화된 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로 젤.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 시스틴 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 또는 단백질은 RGD, RGDS, REDV, YKNR, QPQGLAK 및 YIGSR의 올리고펩타이드 혹은 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 젤라틴(gelatin), 엘라스틴(elastin), 오스티오칼신(osteocalcin), 피브리노겐(fibrinogen), 피브로모듈린(fibromodulin), 테나신(tenascin), 라미닌(laminin), 오스티오폰틴(osteopontin), 오스티오넥틴(osteonectin), 퍼레칸(perlecan), 베르시칸(versican), 본 윌리브랜드 팩터(von Willebrand factor) 및 비트로넥틴(vitronectin)의 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤.
삭제
삭제
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 키토산 하이드로젤은 세포의 부착유도 또는 젤의 분해가 가능한, 조직재생 유도형 키토산 지지체로 사용되는 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤.
제1항 또는 제2항의 키토산 하이드로젤에 생리활성 물질을 화학적으로 결합시키거나 물리적으로 담지시킨 생리활성 물질 전달체.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
(a) 수용성 키토산 용액을 제조하는 단계;

(b) 키토산을, 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolnenic acid), 올레산(oleic acid), 팔미틱산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 미드산(mead acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 시스-에이코사-펜타에노산(cis-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoic acid), 시스-도코사-테트라엔산(cis-docosa-7,10,13,16-tetraenlic acid), 시스-도코사-펜타엔산(cis-docosa-4,7,10,13,16-pentaenoic acid), 옥타-트리에노산(octa-5,9,12-trienoic acid; colombinic acid), 메틸-하이드록시에코산-테트라에노에이트(methyl-hydroxy-5,8,12,14-tetraenoate), 로렌센나인(laurencenynes), 운데카-테트라센(undeca-1,3,5,8-tetracenes), 하이드록시에이코사펜타엔산 (hydoxyeicosapentaenic acid), 하이드로퍼옥시에이코사테트로에논산(hydroperoxyeicostetraenic acid), 포스포티딜에타놀아민(phosphatidylethanolamine) 포스파티딕산(phohspatidic acid),포스파디딜글라이세롤(phosphatidylglycerols), 포스포티딜세린(phosphatidylserines), 및 이노시톨(Inositol)로 이루어진 군에서 선택된 생물분자와 공유결합시켜 키토산 유도체를 제조하는 단계; 및

(c) 상기 키토산 유도체를 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 시스틴 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리프로필렌 옥사이드(polypropylene oxide) 및 알릴 글리시딜 에테르(allyl glycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택된 물질과 가교결합시키는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤 제조방법.
제20항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 생물분자와 키토산의 공유결합은 디에틸프로필 에틸카르보 디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 카르보 디이미드 (CDI)의 반응 유도물질을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 키토산 하이드로젤 제조방법.
삭제
삭제
(a) 수용성 키토산 용액을 제조하는 단계;

(b) 키토산을, 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolnenic acid), 올레산(oleic acid), 팔미틱산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 미드산(mead acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 시스-에이코사-펜타에노산(cis-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoic acid), 시스-도코사-테트라엔산(cis-docosa-7,10,13,16-tetraenlic acid), 시스-도코사-펜타엔산(cis-docosa-4,7,10,13,16-pentaenoic acid), 옥타-트리에노산(octa-5,9,12-trienoic acid; colombinic acid), 메틸-하이드록시에코산-테트라에노에이트(methyl-hydroxy-5,8,12,14-tetraenoate), 로렌센나인(laurencenynes), 운데카-테트라센(undeca-1,3,5,8-tetracenes), 하이드록시에이코사펜타엔산 (hydoxyeicosapentaenic acid), 하이드로퍼옥시에이코사테트로에논산(hydroperoxyeicostetraenic acid), 포스포티딜에타놀아민(phosphatidylethanolamine) 포스파티딕산(phohspatidic acid),포스파디딜글라이세롤(phosphatidylglycerols), 포스포티딜세린(phosphatidylserines), 및 이노시톨(Inositol)로 이루어진 군에서 선택된 생물분자와 공유결합시켜 키토산 유도체를 제조하는 단계;

(c) 생리활성 물질을 상기 키토산 유도체 또는 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 시스틴 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리프로필렌 옥사이드(polypropylene oxide) 및 알릴 글리시딜 에테르(allyl glycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택된 물질과 혼합하는 단계; 및

(d) 생리활성 물질을 화학적으로 결합시키거나 물리적으로 담지한 채 상기 키토산 유도체를 상기 (c) 단계의 물질과 가교결합시키는 단계

를 포함하는 제13항의 생리활성 물질 전달체 제조방법.
삭제