KR101655435B1 - 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 다공성, 생분해성 및 서방성 특성을 가진 다층 하이브리드 지지체 - Google Patents

Abstract

다공성 및 생분해성 고분자 지지체의 기공 내부 및 상기 고분자 지지체의 한 표면 또는 양 표면 상에 고분자 하이드로젤이 형성된 구조를 가지며, 상기 고분자 하이드로젤은 가교결합제를 따로 사용하지 않는 마이클타입 첨가반응 메커니즘에 의해 형성되는 것임을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체가 개시된다. 본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 연조직과 경조직을 동시에 재생할 수 있다.

Description

연조직과 경조직 동시 재생을 위한 다공성, 생분해성 및 서방성 특성을 가진 다층 하이브리드 지지체{Multi-layered hybrid scaffold with porous, biodegradable and controlled-release for simultaneous regeneration of soft and hard tissues}

본 발명은 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 다공성, 생분해성 및 서방성 특성을 가진 다층 하이브리드 지지체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 다공성 및 생분해성 고분자 지지체의 기공 내부 및 그의 표면 상에 고분자 하이드로젤을 형성하고, 생체활성물질을 서로 다른 속도로 서방출 할 수 있도록 함으로써 연조직과 경조직을 동시에 재생할 수 있는 다층 하이브리드 지지체에 관한 것이다.

근골격계와 같은 경조직은 주변에 연조직과 연계되어 인체조직을 유지하고 있다. 최근 세계인구의 급속한 고령화와 당뇨, 골다공증 등의 만성질환으로 인해 치유능력이 저하된 고령 환자군의 의료수요가 증가하고 있는데, 이러한 환자들에 대해서는 특히 연조직(상피조직)과 경조직(골)을 동시에 재생함으로써 더욱 완전한 조직으로의 복원이 가능하다.

이러한 연조직/경조직의 재생을 위해서는 2 가지 조직을 동시에 재생시키는 방법이 필요함에도 불구하고, 지금까지는 하이브리드 조직을 동시에 재생할 수 있는 다기능성의 생체재료가 개발되어 있지 않다. 특히 골조직과 연조직은 기계적/생물학적 물성 그리고 손상되었을 때 조직재생속도가 서로 다르므로, 이를 고려한 연조직/골조직의 재생을 유도하는 기술이 필요하다.

치과 조직은 연조직과 경조직이 동시에 재생되어야 하는 대표적인 조직이며, 특히 치조골 조직의 재생에 응용되는 생체재료인 치과용 차폐막은 경조직 결손부위에 연조직의 하방 침투억제를 주요 목적으로 하고 있다.

차폐막의 종류는 우수한 공간 유지능력은 있으나 차폐막의 노출빈도로 재수술이 필요한 비흡수성 차폐막과, 재수술은 필요 없으나 공간유지능력이 낮고, 흡수가 필요 이상으로 빠른 특징을 가진 흡수성 차폐막이 있으며, 이를 치과에서는 치조골 재생시술에 사용되고 있다. 그러나, 현재까지 제품화된 비흡수성 및 흡수성 차폐막은 골재생만 가능하기 때문에 완전한 치주조직 재생이 불가능하다는 단점이 있다. 이를 보완하기 위해, 상피재생을 촉진하는 동시에 골 재생을 촉진하는 이상적인 차폐막의 기능을 가진 제조법이 필요함에도 불구하고, 경조직과 연조직을 동시에 재생할 수 있는 조직재생용 지지체에 대한 개발은 보고되지 않고 있다.

차폐막의 소재로 적용되는 고분자로는 현재 poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 고분자가 상용되고 있으며, PLGA 고분자는 흡수성 차폐막의 일종으로 체내 안정성과 흡수성을 가지며 세포독성이 없다는 점과 흡수기간을 조절하고 차폐막의 형태를 부여하기 쉬운 장점을 가지는 것으로 알려져 있음에도 불구하고, 생분해 및 흡수과정에서 국소적인 염증반응을 일으키는 것으로 보고되고 있다(Burg KJL, Porter S, Kellam JF. Biomaterials development for bone tissue engineering. Biomaterials 2000;21:2347-59.) 이러한 PLGA 차폐막의 단점을 보완하기 위해 차폐막을 화학적/물리적으로 개질시키려는 시도가 행해지고 있으며, 그 중 하나가 히알론산(hyaluronic acid: HA)을 PLGA 와 결합시켜 세포 친화성을 높이고 생체적합성을 증가시키는 방법이 보고되고 있다. (Toole BP. Hyaluronan in morphogenesis. Semin Cell Dev Biol 2001;12:79-87.)

본 발명은 상기한 종래기술의 한계를 극복하기 위하여 안출되었다. 즉, 본 발명의 목적은 다공성 및 생분해성 고분자 지지체의 기공 내부 및 그의 표면 상에 고분자 하이드로젤을 형성함으로써 연조직과 경조직을 동시에 재생할 수 있는 다층 하이브리드 지지체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 생분해성 고분자 지지체의 생분해 과정에서 유발되는 국소적 산성화로 인한 염증 발생을 억제할 수 있는 다층 하이브리드 지지체를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 다층 하이브리드 지지체는 다공성 및 생분해성 고분자 지지체의 기공 내부 및 상기 고분자 지지체의 한 표면 또는 양 표면 상에 고분자 하이드로젤이 형성된 구조를 가지며, 상기 고분자 하이드로젤은 아크릴 작용기와 같은 알파-베타 불포화탄화수소 작용기를 가지는 고분자와 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP) 작용기, 아민 작용기, 시스틴을 가진 펩타이드 또는 리포아마이드의 싸이올과 같은 친핵체 작용기를 가지는 고분자 간의 마이클 첨가반응에 의하여 형성되는 것이다.

상기 다공성 및 생분해성 고분자 지지체는 폴리락타이드, 폴리글라이콜락타이드, 폴리(락타이드-글라이콜라이드) 공중합체, 폴리카프롤락톤, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 마이클 첨가반응을 하는 상기 아크릴 작용기를 가지는 고분자와 상기 TCEP 또는 리포아마이드 작용기를 가지는 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 셀룰로오스, 키토산, 피브린 및 콘드로이틴설페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 고분자 하이드로젤은 생체활성물질을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 생체활성물질은 경조직 및 연조직의 조직재생 촉진을 위한 성장인자, 염증저해제, DNA, 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 성장인자는 골형성 성장인자(BMP), 섬유아세포 성장인자(FGF) 및 혈소판 유래 성장인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 약물은 테트라사이클린 및 디메틸옥살릴글리신(DMOG)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 다층 하이브리드 지지체는 3층으로 이루어진 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 다층 하이브리드 지지체는 다공성이 유도된 생분해성 고분자 층의 생분해 과정에서 유발되는 국소적 산성화로 인한 염증를 억제하기 위하여 중화작용을 할 수 있는 히알루론산과 같은 천연고분자를 상기 생분해성 고분자 층에 유도된 기공 안쪽과 양쪽 표면에 중화기능의 주사형 하이드로젤을 제공함으로써 산성화로 인하여 발생되는 기존의 폴리(락타이드-글라이콜라이드) 차폐막 지지체의 문제점을 해결하는 발명의 효과를 가진다.

또한 본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 종래의 차폐막 제품은 하나의 고분자 층을 이용하여 조직재생을 하는 것으로서, 주로 하나의 조직재생만을 목표로 하는 것인데 반하여, 골 조직 및 상피조직재생을 동시에 촉진하는 발명의 효과를 가진다.

또한 본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 기능적으로 분리된 표면층과 중간층, 반대 표면층에 경조직 혹은 연조직에 맞는 생체활성물질을 선택적으로 적용하여 치료용 약물전달체, 조직공학 지지체 등으로 사용하면 여러 약물을 필요한 부분에 선택적으로 동시에 제공할 수 있는 특성을 가진다.

또한, 마이클타입 첨가반응을 유도할 수 있는 2 종류의 용액을 사용하여 제조하는 다층 하이브리드 지지체 제조방법은 라디칼 중합 혹은 효소 등을 이용하여 가교결합을 유도함으로써 지지체 양쪽 표면에 하이드로젤 형성시켜서 제조하는 다층 하이브리드 지지체 제조 방법들과 비교할 때, 마이클타입 첨가반응을 이용한 방법은 생체활성물질의 활성도를 유지하고, 가교결합을 유도할 때 발생되는 부산물/유해물질이 발생되지 않는 방법이며, 자발적으로 진행되는 가교결합 반응을 사용하는 장점을 가진다.

이외에도 3층 고분자 지지체 각각이 서로 다른 생분해 속도를 가지고 있으므로 생체활성물질의 방출속도를 조절할 수 있는 기능을 제공할 수 있는 장점을 가진다. 이러한 3층 지지체는 서로 다른 조직을 동시재생에 서로 다른 조직으로의 재생을 촉진하는 발명의 효과를 가진다. 예를 들면, dimethyloxalylglycine (DMOG)은 혈관생성을 촉진하고, tetracycline 은 항염증제로 작용하며, fibroblast growth factor는 연조직 재생을 촉진하고, bone morphogenic protein-2(BMP-2)는 골조직 재생을 촉진하는 특성을 이용하여 3층의 하이브리드 지지체에 제공하여 염증방지, 혈관생성, 연조직 및 경조직의 재생을 촉진하는데 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 실시예 2의 2단계 과정의 실시예 1에서 제조된 다공성 PLGA의 기공 내로 원심분리를 이용한 히알루론산 유도체 용액의 침투 유도법.
도 2은 본 발명에 따라 제조된 실시예 3의 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 제조 도식도(A) 및 제조된 3층 하이브리드 지지체(B).
도 3는 본 발명에 따라 제조된 PLGA와 다공성 PLGA 디스크 양면과 기공에 히알루론산(5%)이 첨가된 3층 다공성/생분해성 지지체의 단면에 대한 전자현미경 관찰. 중간층의 PLGA 다공성 디스크 (A), 5% 히알루론산으로 코팅된 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체(B), 및 5%의 히알루론산 용액을 기공 내부로 침투시킨 하이브리드 PLGA 지지체(C).
도 4는 단층의 PLGA가 분해 될 때, 산성을 띠는 조건과 유사한 산성용액(pH 5.0)에 일정량의 히알루론산 첨가량에 의한 용액의 pH 변화 측정.
도 5은 본 발명에 따라 제조된 PLGA와 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 표면에서의 in vitro 섬유아세포 부착성 및 증식성 평가.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 PLGA와 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 표면에서의 섬유아세포의 in vitro 세포생존성 평가(14일). 다공성 PLGA(대조군) 표면에서의 세포생사여부 형광이미지(A) 및 10%의 히알루론산이 코팅된 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체(B).
도 7은 본 발명에 따라 제조된 항생제(tetracycline)가 함유된 마이크로입자로부터의 약물 방출거동 측정결과.
도 8은 본 발명에 따라 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 3층 다공성/생분해성 지지체를 토끼 두개골에 이식하여 8주 후 H&E 염색한 결과. Collagen 지지체(Bio-Gide)(A), PLGA 지지체(B), 5% HA gel이 유도된 3층 PLGA 지지체 (C), 10% HA gel이 유도된 3층 PLGA 지지체(D). (왼쪽 40X, 오른쪽 100X), (arrowhead: defect margin, NB: new bone, CM: collagen membrane, AT: adipose tissue, FT: fibrous tissue, HS: hydrogel scaffold).

이하, 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 연조직과 경조직을 동시에 재생할 수 있는 것이다.

이를 위하여, 본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 먼저 생분해성 고분자 지지체를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 생분해성 고분자 지지체는 그 내부에 기공이 형성된 다공성 고분자 지지체이다. 기공을 형성하기 위하여 발포제와 같은 포로젠(porogen) 혹은 프린팅 기법 등이 사용된다. 본 발명에서 사용되는 다공성 생분해성 고분자 지지체는 예를 들어, 폴리락타이드, 폴리글라이콜락타이드, 폴리(락타이드-글라이콜라이드) 공중합체, 폴리카프롤락톤, 젤라틴, 콜라겐 등으로 형성될 수 있다.

본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 또한 고분자 하이드로젤을 포함한다. 이러한 고분자 하이드로젤은 다공성 생분해성 고분자 지지체의 내부에 형성된 기공에 코팅되고, 또한 다공성 생분해성 고분자 지지체의 한 표면 또는 바람직하게는 양 표면 상에 코팅된다.

다공성 생분해성 고분자 지지체의 기공 및 양 표면에 형성되는 고분자 하이드로젤은 아크릴 작용기를 가지는 고분자와 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP) 또는 리포아마이드 작용기를 가지는 고분자 간의 마이클 첨가반응에 의하여 형성된다. 마이클 첨가반응에 의하여 고분자 간의 가교가 이루어짐으로써 하이드로젤화가 완성된다. 마이클 첨가반응을 하는 아크릴 작용기를 가지는 고분자와 TCEP 또는 리포아마이드 작용기를 가지는 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 셀룰로오스, 키토산, 콘드로이틴설페이트 등이 포함될 수 있다. 이 중에서 히알루론산, 콘드로이틴설페이트와 같은 다당류의 천연 고분자를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 물질은 일반적으로 친수성을 띠게 된다.

본 명세서에서는 아크릴 작용기를 가지는 고분자는 고분자-아크릴레이트, 예를 들어 히알루론산-아크릴레이트로 표현된다. 히알루론산-아크릴레이트는 간단하게 HA-Ac로 표현될 수 있다. 또한 TCEP 또는 리포아마이드 작용기를 가지는 고분자는 고분자-TCEP 또는 고분자-리포아마이드, 예를 들어 히알루론산-TCEP 또는 히알루론산-리포아마이드로 표현될 수 있다. 히알루론산-TCEP는 간단하게 HA-TCEP로 표현될 수 있다.

상기에서 마이클타입 첨가반응을 위한 반응물질의 하나로서 아크릴 작용기를 가지는 고분자를 제시하였는데, 여기에서 아크릴 작용기는 카보닐 작용기로서 알파-베타 불포화탄화수소 작용기에 대한 대표적 예시를 나타내는 것이며, 이외에도 메타크릴레이트 작용기를 가지는 고분자와 같은 물질이 본 발명에서 마이클타입 첨가반응을 위한 반응물질로 사용될 수 있음은 물론이다. 또한 마이클타입 첨가반응에서 아크릴 작용기에 대한 짝이 되는 반응물질로서 TCEP 또는 리포아마이드 작용기를 가지는 고분자를 예시하였는데, 이외에도 시스틴을 가진 펩타이드, 아민 작용기를 가지는 고분자 등과 같이 친핵체 작용기를 가지는 고분자가 사용될 수 있다. 여기에서 리포아마이드 작용기 및 시스틴은 그것 내에 싸이올 작용기를 가지며, 이러한 싸이올 작용기가 마이클 첨가반응에서 친핵체로 작용한다.

이러한 고분자 하이드로겔은 생체활성물질을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 생체활성물질은 인체에 대한 조직재생을 위하여 일반적으로 사용되는 물질이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 조직재생 촉진을 위한 성장인자, 염증저해제, DNA, 및 약물 등을 포함할 수 있다. 성장인자의 예로는 골형성 성장인자(BMP), 섬유아세포 성장인자(FGF) 및 혈소판 유래 성장인자 등을 들 수 있으며, 약물의 예로는 테트라사이클린 및 디메틸옥살릴글리신(DMOG) 등을 들 수 있다. 고분자 하이드로젤은 생체활성물질로서 세포를 포함할 수도 있다.

본 발명은 다공성 생분해성 고분자 지지체의 기공 및 양 표면에 서로 다른 특성의 고분자 하이드로젤을 형성함으로써 하나의 고분자 지지체 제품의 각 층이 서로 다른 생분해 속도와 생물학적, 기계적 및 화학적 특성을 갖게 할 수 있어 연조직 및 경조직의 동시적 재생에 대응할 수 있게 한다. 본 발명은 또한 그러한 각 층의 고분자 하이드로젤에 서로 다른 생체활성물질을 함유시킴으로써 연조직 및 경조직의 동시적 재생에 대응할 수 있게 한다.

즉, 본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 한쪽 층에서는 경조직 재생에 적합한 지지체의 역할을 제공하고, 동시에 다른 한쪽에서는 연조직 재생을 유도할 수 있는 기능을 제공할 수 있다. 또한 주사형 기술을 적용하여 다공성 생분해성 고분자 지지체의 양쪽 표면에 각각 연조직 및 경조직 재생에 적합한 생체활성물질이 내포된 고분자 하이드로젤 층을 형성함으로써 조직재생 속도, 재생조직의 양 그리고 기계적 물성 조절을 용이하게 할 수 있다.

또한 본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 다공성 생분해성 고분자 지지체의 생분해 및 흡수과정에서 나타나는 국소적인 산성화에 의한 염증반응을 고분자 하이드로젤 성분이 중화시켜 억제하기 때문에 부작용이 최소화된다.

또한 조직재생을 위한 기존의 차폐막, 예를 들어 골재생을 위한 차폐막에 생체활성물질을 전달하고자 할 경우에는 표면에 흡착시키는 방법을 사용하고 있으나, 흡착된 생체활성물질이 쉽게 방출되는 문제와 생체활성물질의 활성을 잃어버리는 문제점이 있었다. 이에 대하여, 본 발명의 다층 하이브리드 지지체는 고분자 하이드로젤에 생체활성물질을 내포함으로써 생체활성물질이 서서히 방출될 수 있게 하고 또한 그렇게 서서히 방출되는 생체활성물질이 계속적으로 활성을 가짐으로써 조직재생을 효과적으로 달성할 수 있게 해준다. 특히, 본 발명은 주사형 고분자 용액을 상온에서 단순 혼합하여 다공성 생분해성 고분자 지지체의 기공 내에 그리고 그 표면에 하이드로젤을 형성하기 때문에 온도에 민감한 생체활성물질의 활성을 잃지 않게 한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 제시한다. 다만, 하기의 실시예들은 본 발명의 예에 불과한 것이므로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

실시예

다공성 PLGA 지지체 내의 기공 내에 아크릴레이트 혹은 포스페이트 작용기를 가진 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산과 같은 당 화합물 유도체간의 마이클타입 첨가반응에 의한 화학결합을 통하여 형성된 용액을 저온에서 마이클타입 반응에 의한 겔화를 유도하고, 이후 건조를 통하여 지지체를 형성하여 하이브리드 disk 형태의 지지체를 제조하는 방법과 분석에 대한 실시예이다.

실시예 1: disk 형태의 다공성 PLGA 지지체 제조

1 단계 과정 : 0.18 g PLGA를 1 ml dioxane을 이용하여 18%(g/ml) 농도로 상온에서 하루동안 녹여 PLGA를 완전히 용해하였다.

2 단계 과정 : 1 단계에서 제조된 PLGA 용액을 직경 10 mm의 폴리에틸렌(PE) 몰드에 붓고, 2.4 g ammonium bicarbonate (AB, 355~500 ㎛ 입자크기) 입자를 넣은 후, AB와 PLGA 용액을 혼합시켰다.

3 단계 과정 : 2 단계에서 제조된 혼합물을 액체질소를 이용하여 동결시킨 후, PE 몰드를 면도날로 제거한 다음, 동결된 원기둥 샘플을 영하 80℃ 동결 진공건조기에서 3일 동안 건조함으로써, 제조된 PLGA 내의 dioxane을 제거하였다.

4 단계 과정 : 3단계에서 건조된 원기둥 PLGA 샘플을 면도날을 이용하여 두께 1 mm 또는 2 mm 디스크 형태로 잘라서 지지체를 제조한 다음, 30℃의 4 L 증류수에 담지하고 1 시간 간격으로 증류수를 총 3번 교체하면서 gas foaming을 진행하여 AB를 제거함으로써 다공성의 디스크로 제조하였다.

5 단계 과정 : 4 단계에서 AB가 제거된 PLGA 샘플을 동결건조기에 보관하여 수분을 제거하여 다공성의 PLGA 디스크 지지체를 회수하였다.

실시예 2: 다공성 PLGA 지지체 내의 기공으로 히알루론산 용액 침투 유도

1 단계 과정 : 히알루론산-아크릴레이트(HA-Ac) 고분자 유도체 용액과 히알론산-트라이카복시에틸포스페이트(HA-TCEP) 작용기를 가진 히알루론산 유도체 고분자를 각각 phosphate buffered saline (PBS) 버퍼용액에 녹여 5% 농도의 전조용액을 만들었다.

2 단계 과정 : 실시예 1에서 제조된 직경 10 mm, 두께 2 mm의 디스크 형태의 다공성 PLGA 지지체를 원기둥 모양의 PE 몰드에 넣고, 실시예 2의 1 단계에서 준비한 2종류의 5% HA-Ac 및 HA-TCEP 히알루론산 유도체 전조용액을 1:1 비율로 혼합하였다. 다공성 PLGA 지지체 표면에 분주한 다음, 원심분리(3500 rpm, 5분)하여 PLGA 지지체의 기공 내로 히알루론산 혼합용액이 침투되도록 유도하였다(도 1).

3 단계 과정 : 2 단계에서 제조한 히알루론산 용액이 침투된 PLGA 지지체를 4 에서 1일 동안 냉장보관 한 후, -70에서 1일 동안 추가 보관하여 지지체 내에서의 히알루론산용액이 마이클 타입의 첨가반응에 의한 젤화를 유도하였다.

4 단계 과정 : 3 단계에서 젤화가 완료된 샘플을 -40℃에서 동결건조를 하루 동안 진행하여 다공성 지지체가 되도록 유도하여 샘플을 회수하였다.

실시예 3: 5% 또는 10% HA - AC , HA - TCEP 히알루론산 용액을 이용한 3층 구조의 디스크 형태의 지지체 제조

1 단계 과정 : HA-Ac와 HA-TCEP의 히알루론산 유도체 고분자 고체 시료를 각각 PBS 버퍼용액에 녹여 5% 농도의 히알루론산 유도체 전조용액을 만들었다.

2 단계 과정 : 실시예 1에서 제조된 직경 10 mm, 두께 1 mm의 디스크 형태의 다공성 PLGA 지지체에 원심분리를 이용하여 실시예 2의 2 단계와 동일하게 PLGA 내로 히알루론산 유도체 용액이 내부로 침투되도록 유도하였다.

3 단계 과정 : 테플론 몰드를 이용하여 2단계에서 진행된 히알루론산 혼합용액이 내부로 침투된 다공성의 PLGA 지지체 표면에 각각 5% 농도의 HA-Ac 용액, HA-TCEP 용액을 1:1 비율로 섞은 혼합용액을 분주하여 PLGA 지지체 상부에 얇은 디스크(두께 0.5 mm) 형태의 히알루론산 층이 코팅되도록 함으로써 2층의 샘플을 제조하였다.

4 단계 과정 : 3 단계에서 진행된 2층의 지지체 샘플의 하부층을 상부표면이 되도록 놓은 다음, 3단계 과정에서 히알루론산 유도체 용액으로 코팅하였던 방법과 동일하게 새로운 5% 또는 10% 히알루론산 유도체 혼합용액을 분주하여 두께 0.5 mm의 얇은 디스크 형태의 층을 제조함으로써, 히알루론산 고분자가 코팅된 3층의 히알루론산-PLGA-히알루론산 고분자 샘플을 제조하였다(도 2).

5 단계 과정 : 4 단계에서 제조된 3층의 히알루론산-PLGA-히알루론산 샘플을 4에서 1일 동안 보관한 다음, -70℃에서 1일 동안 추가적으로 보관하여 히알루론산 용액의 젤화(hydrogelation)를 유도하였다.

6 단계 과정 : 5 단계에서 젤화가 완료된 3층 구조의 히알루론산-PLGA-히알루론산 샘플을 -40℃ 에서 하루 동결건조 함으로써 5% 또는 10% HA-AC, HA-TCEP 히알루론산 유도체 용액을 이용한 3층의 히알루론산-PLGA-히알루론산 하이브리드 지지체를 제조하였다.

실시예 4: 10% HA - AC 용액과 HA - Lipoamide 용액을 이용한 3층 구조의 다공성/생분해성 지지체 제조

실시예 3의 5% 히알루론산 유도체 용액(HA-AC 및 HA-TCEP) 대신에 10% 용액(HA-AC, HA-lipoamide)을 사용하여 10% 히알루론산 용액을 PLGA 디스크 기공내부에 침투시고, 이후에 PLGA 디스크 양쪽 표면에 10% 히알루론산 용액으로 코팅시킨 후 하이드로젤을 형성시킴으로써 3층의 다공성 하이브리드 지지체를 제조하였다. 나머지 실시 방법은 실시예 3과 동일한 공정을 적용하였다.

실시예 5. 혈소판 풍부 플라즈마(platelet-rich-plasma; PRP)가 첨가된 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 제조

실시예 4의 10% HA-Lipoamide 유도체 용액을 PRP(150 μL/ gel mL)가 첨가된 농도 10% HA-Lipoamide 유도체용액으로 대체하여 PLGA 지지체 기공 내부에는 PRP이 함유된 히알루론산 젤이 침투되고, PLGA 외부표면에는 PRP가 첨가된 10% 히알루론산 젤에 의해 코팅된 3층의 다공성/생분해성 하이브리드 지지체를 제조하였다. 나머지 실시 방법은 실시예 3과 동일한 공정을 적용하였다.

실시예 6. 항생제 약물( tetracycline )이 함유된 마이크로입자 제조

1단계 과정 : butadiene diepoxide (BDDE)에 10%(v/v) 농도로 PLGA 고분자를 첨가하여 24시간 혼합하면서 BDDE 가교결합제가 포함된 PLGA 용액을 제조하였다 (PLGA-BDDE 용액).

2단계 과정 : 16%(v/v) 농도의 히알루론산을 4%의 NaOH 용액에 녹인 후 tetracycline 50 mg/ml를 첨가하여 항생제가 포함된 히알루론산 용액을 제조하였다.

3단계 과정 : Hexane에 Span80(Sigma-Aldrich, 미국)을 0.5%(v/v) 농도로 분주한 다음, 초음파 분산기(VCX 750, Sonic & Materials, Inc., 미국)를 이용하여 5분 동안 분산기의 80% 출력량으로 Span80 분산제를 Hexane에서 분산시킨다 (Hexane-Span80 용액).

4단계 과정 : 1단계의 PLGA-BDDE 용액과 2단계의 항생제가 포함된 히알루론산 용액을 1:1 (v/v)비율로 혼합하여 제조한 혼합용액을 3단계에서 제조한 Hexane-Span80 용액에 주사기를 이용하여 분주한 다음, 초음파분산기를 이용하여 출력량 80% 조건에서 30분 혼합용액을 분산시켜 항생제가 포함된 HA-PLGA 마이크로 입자를 제조하였다.

5단계 과정 : 항생제가 포함된 (HA-PLGA) 마이크로입자가 제조된 용액을 원심분리(3500 rpm, 1 분)하여 입자를 회수하여, tetracycline 약물이 함유된 PLGA-HA 입자를 제조하였다.

실시예 7. tetracycline 마이크로입자가 첨가된 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 제조

실시예 4의 10% 히알루론산 유도체 용액(HA-AC, HA-Lipoamide)을

실시예 6에서 제조된 약물이 함유된 (HA-PLGA) 마이크로입자를 첨가한 10% 히알루론산 유도체 용액으로 대체하여 하이브리드 지지체 제조를 진행하였다. tetracycline 약물 마이크로입자가 첨가된 10% 히알루론산용액을 PLGA 디스크 기공내부에 침투시켜 다공성/생분해성 히알루론산 하이브리드 지지체를 제조 하였다. 하이브리드 지지체 양쪽 표면에 tetracycline 약물이 함유된 히알루론산 젤 코팅 실시 방법은 실시예 5와 동일한 공정을 적용하였다.

실시예 8: 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체의 동물이식

16주의 웅성 가토 두개골(New Zealand white rabbits)에 8 mm 직경, 높이 2 mm 의 골 결손부를 형성하였다. 각각의 결손부에 대조군인 Collagen 지지체(Bio-Gide)(A)와 실험군인 PLGA 지지체(B), 5% HA gel이 유도된 3층 PLGA 지지체 (C), 10% HA gel이 유도된 3층 PLGA 지지체(D)로 제조된 하이브리드 차폐막으로 골 결손부를 덮은 후, 흡수성 봉합사를 이용해 골막을 봉합하여 차폐막을 고정시킨 다음, 8주 동안 사육하였다 (참고문헌, Biomaterials Research, 유훈 외, accepted 2014-08-08). 동물을 희생시켜, 샘플을 적출하여 분석을 진행하였다.

분석 1. 전자 현미경에 의한 형태학적 관찰

실시예 1, 2, 3에서 제조한 disk 형태의 각각의 지지체를 건조된 상태에서 표면과 전단면을 gold 진공 코팅 처리한 다음, 전자현미경으로 샘플형태를 관찰하였다. 주사전자현미경을 이용하여 샘플의 표면과 단면의 형태를 200 배율로 관찰한 결과, PLGA 다공성 지지체에서는 지름이 약 400 ㎛ 기공이 균일하게 형성됨을 확인하였으며, 3 층 차폐막의 내부가 HA gel로 충진된 것과 표면의 HA gel이 코팅된 것이 관찰되었다. 또한 HA gel의 농도가 5%에서 10%로 높아짐에 따라 PLGA 디스크 기공 안에 히알루론산 gel이 많이 충전되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

분석 2. 히알루론산 첨가에 의한 pH 변화측정

단층의 PLGA 분해시 산성을 띠는 조건과 유사하게 증류수 10 mL를 0.1 M 염화수소를 이용하여 pH 5.0으로 조정한 후, 히알루론산(0.012 g)을 첨가하면서 샘플용액의 pH 변화를 pH 미터를 사용하여 관찰하였다. 일정량의 히알루론산이 첨가됨에 따라 pH가 5.9에서 6.1까지 올라가는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

분석 3. in vitro 섬유아세포 부착성 및 증식성

실시예 3에서 제조한 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 3층 다공성 생분해성 막 표면에 섬유아세포(10만)를 접종하여 14일간 in vitro 배양한 후 1, 3, 14일 각 시점에서 지지체 표면에서의 세포 증식성을 cell count kit-8 assay로 측정한 결과, 세포들이 증식하였음을 확인하였다(도 5).

분석 4. in vitro 섬유아세포 생존여부 확인

실시예 3에서 제조한 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 표면에 섬유아세포를 14일간 in vitro 배양한 다음, live & dead assay로 분석한 결과, PLGA 샘플표면 보다는 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 표면에서 배양된 섬유아세포들이 큰 세포덩어리를 이루며 생존함을 확인하였다(도 6).

분석 5.: 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체와 마이크로입자의 약물( Tetracycline ) 로딩 및 방출거동 분석

실시예 5에서 제조한 약물(tetracycline)이 함유된 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체와 마이크로입자를 PBS(10 ml) 버퍼용액에 침전시킨 다음, 12시간, 1일, 3일 각 시점에서 샘플을 담지한 용액을 마이크로피펫으로 추출(5 mL)하였다. 샘플로부터 용출된 용액에 tetracycline이 존재하는지를 365 nm 파장에서 UV-vis 흡광도를 측정하였다(도 7).

분석 6.: 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체의 생체활성물질 로딩 및 방출거동 분석

실시예 6에서 제조한 platelet-rich plasma(PRP)가 첨가된 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체를 버퍼용액(0.1% BSA)에 침전시킨 다음, 12시간, 1일, 3일, 7일 각 시점에서 샘플이 담지된 용액을 마이크로피펫으로 추출(1 mL)하였다. 성장인자 분석 kit [R&D system DY220(PDGF-BB kit), R&D system DY233(FGF basic kit)]와 ELISA 흡광측정기기(microplate reader)를 이용하여 추출된 용액 내에 혈소판에 포함되어 있던 PDGF 와 bFGF 성장인자가 존재하는지를 450 nm 파장에서 측정하였다. 샘플을 통하여 방출된 혈소판유래 성장인자(PDGF-BB, bFGF) 방출량을 정량적으로 측정한 결과, 시간이 지남에 따라 두 성장인자의 방출량이 증가하는 것으로 측정되었다. 따라서 성장인자와 같은 생체활성물질을 3층의 다공성/생분해성 하이브리드 지지체의 양쪽 표면에 존재하는 코팅 층에 포함시킬 수 있으며, 성장인자의 방출속도를 조절시킬 수 있음을 관찰하였다.

분석 7 : 약물 마이크로입자가 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체 양쪽 표면에 로딩된 형태의 분석

실시예 8에서 제조한 약물 마이크로입자가 첨가된 히알루론산 유도체 용액으로 코팅된 3층 다공성/생분해성 하이브리드 지지체의 단면을 면도칼로 잘라 광학현미경과 전자현미경으로 관찰한 결과, 하이브리드 지지체의 양쪽 표면에 마이크로입자가 로딩된 모습을 확인하였다.

분석 8. in vivo 토끼 두개골 결손부 이식 8주 후, HematoxylinEosin 염색을 통한 조직학적 분석

실시예 1, 2, 3에서 제조한 다공성/생분해성 지지체[PLGA 지지체(B), 5% HA gel 이 코팅된 3층 하이브리드 지지체 (C), 10% HA gel이 코팅된 3층 하이브리드 지지체(D)]과 콜라겐 차폐막(Bio-Gide)[(A) 대조군 샘플을 직경 8 mm의 토끼 두개골 결손부에 이식한 샘플을 이식 8주 후 적출하였다. 10% neutral formalin 용액으로 적출샘플을 고정시킨 후, 5% 질산용액에 담지하여 비탈회시켰다. 비탈회된 샘플을 파라핀에 심어 7 m의 두께로 삭정하고, hematoxylin & eosin(H&E)으로 샘플을 염색하여 신생골 형성 및 하이브리드 지지체의 흡수와 염증세포의 침윤상태 등을 관찰하였다. 광학현미경으로 염색된 상태를 확인한 결과에 따르면, 3층 구조의 생분해성/다공성 하이브리드 지지체 샘플이 콜라겐 차폐막과 단층의 PLGA 차폐막 샘플 보다 천천히 흡수되어 동물에서 더 오랫동안 샘플이 유지되는 것을 확인하였다(도 8). (왼쪽 40, 오른쪽 100)

(arrowhead: defect margin, NB: new bone, CM: collagen membrane, AT: adipose tissue, FT: fibrous tissue, HS: hydrogel scaffold)

Claims (9)

1. 다공성 및 생분해성 고분자 지지체의 기공 내부에 고분자 하이드로젤이 형성된 고분자 지지체층 및 상기 고분자 지지체층의 한 표면 또는 양 표면 상에 고분자 하이드로젤이 형성된 고분자 하이드로젤층으로 이루어진 2층 또는 3층의 구조를 가지며, 상기 고분자 지지체층과 상기 고분자 하이드로젤층은 서로 다른 생분해 속도 및 기계적 특성을 가지고, 상기 고분자 하이드로젤은 가교결합제를 따로 첨가하여 사용하지 않고, 알파-베타 불포화탄화수소 작용기를 가지는 고분자와 마이클타입 첨가반응의 친핵체 작용기를 가지는 고분자 간의 마이클타입 첨가반응 메커니즘에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 연조직과 경조직 동시 재생을 위한 다층 하이브리드 지지체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 마이클타입 첨가반응 메커니즘은 아크릴 작용기를 가지는 고분자와 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP) 작용기 또는 아민 작용기를 가지는 고분자, 또는 리포아마이드 또는 시스틴 형태로 싸이올 작용기를 가지는 고분자 간의 마이클 첨가반응에 의하여 형성되는 것임을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.
3. 제1항에 있어서,
   상기 다공성 및 생분해성 고분자 지지체는 폴리락타이드, 폴리글라이콜락타이드, 폴리(락타이드-글라이콜라이드) 공중합체, 폴리카프롤락톤, 젤라틴 및 콜라겐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.
4. 제2항에 있어서,
   상기 마이클 첨가반응을 하는 상기 아크릴 작용기를 가지는 고분자와 상기 TCEP 또는 리포아마이드 작용기를 가지는 고분자는 아크릴 작용기 또는 TCEP 또는 리포아마이드 작용기를 가지는 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 셀룰로오스, 키토산 및 콘드로이틴설페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.
5. 제1항에 있어서,
   상기 고분자 지지체층 및 상기 고분자 하이드로젤층에 형성되는 상기 고분자 하이드로젤은 서로 다른 생체활성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.
6. 제5항에 있어서,
   상기 생체활성물질은 조직재생 촉진을 위한 성장인자, 염증저해제, DNA, 및 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.
7. 제6항에 있어서,
   상기 성장인자는 골형성 성장인자(BMP), 섬유아세포 성장인자(FGF) 및 혈소판 유래 성장인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.
8. 제6항에 있어서,
   상기 약물은 테트라사이클린 및 디메틸옥살릴글리신(DMOG)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.
9. 제1항에 있어서,
   상기 다층 하이브리드 지지체는 3층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다층 하이브리드 지지체.

Images