CN113302311A - 流通池 - Google Patents
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Abstract
一种流通池的示例包括基底以及所述基底上的阳离子聚合物水凝胶。所述阳离子聚合物水凝胶包括阳离子部分，所述阳离子部分i)整合到初始聚合物水凝胶的单体单元中，或ii)通过连接基附接到所述初始聚合物水凝胶的所述单体单元。所述流通池还包括附接到所述阳离子聚合物水凝胶的扩增引物。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2019年8月1日提交的美国临时申请序列号62/881,597的权益；该临时申请的内容以引用方式全文并入本文。
背景技术
存在希望由双链DNA(dsDNA)靶分子产生片段化和标记的脱氧核糖核酸(DNA)分子的文库的多种方法和应用。通常，目的是由较大dsDNA分子生成较小DNA分子(例如，DNA片段)以用作DNA测序反应中的模板。这些模板可使得能够获得短读取长度。在数据分析过程中，可以将重叠短序列读段进行比对，以重建较长的核酸序列。在一些情况下，可以使用预测序步骤(诸如对特定核酸分子进行条形码编码)来简化数据分析。
发明内容
本文所公开的第一方面是一种流通池，该流通池包括基底；基底上的阳离子聚合物水凝胶，该阳离子聚合物水凝胶包括阳离子部分，该阳离子部分i)整合到初始聚合物水凝胶的单体单元中，或ii)通过连接基附接到初始聚合物水凝胶的单体单元；以及附接到阳离子聚合物水凝胶的扩增引物。
在第一方面的一个示例中，单体单元为N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺；阳离子部分为鏻阳离子；并且鏻阳离子置换N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺的溴。在一个示例中，鏻阳离子选自由以下项组成的组：三(羟甲基)鏻阳离子、三(羟丙基)鏻阳离子、四(羟甲基)鏻阳离子和三(2-羧乙基)鏻阳离子。
在第一方面的另一个示例中，i)单体单元包括末端叠氮基团，并且连接基包括炔烃基团；或者ii)单体单元包括末端炔烃基团，并且连接基包括叠氮基团。在一个示例中，阳离子部分包括质子化胺基团、锍离子、季铵阳离子或它们的组合。在另一个示例中，单体单元为N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺；并且阳离子部分为N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子。在又一个示例中，连接基还包括可裂解二硫键、可光解键、可裂解磷酸二酯键或它们的组合。
在第一方面的再一个示例中，单体单元为N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺；连接基包括末端炔烃基团和末端溴；并且阳离子部分为置换末端溴的鏻阳离子。
在第一方面的一个示例中，基底包括被空隙区域隔开的多个凹入部，并且其中阳离子聚合物水凝胶位于凹入部中的每一个内。在一个示例中，基底还包括多个室，并且其中多个凹入部的子集位于多个室中的每一个的周界内。
应当理解，本文所公开的流通池的任何特征可以任何期望的方式和/或构型组合在一起，以实现如本公开所述的益处，包括例如实现正电荷以吸引并在空间上限制文库片段。
本文所公开的第二方面是一种方法，该方法包括：将包括可带正电的部分的流体引入流通池，该流通池包括初始聚合物水凝胶，该初始聚合物水凝胶具有选自由可带负电的原子、叠氮基团和炔烃基团组成的组的表面部分；以及附接到初始聚合物水凝胶的扩增引物；以及在一定温度下将初始聚合物水凝胶在流体中温育一段时间，从而形成包括阳离子部分的阳离子聚合物水凝胶。
在第二方面的一个示例中，可带正电的部分置换初始聚合物水凝胶的可带负电的原子。在一个示例中，表面部分为可带负电的原子；可带负电的原子为溴；并且可带正电的部分选自由以下项组成的组：三(羟甲基)膦、三(羟丙基)膦、四(羟甲基)膦和三(2-羧乙基)膦。在一个示例中，流体还包括pH在6至12范围内的缓冲液。在一个示例中，温度在约18℃至约65℃的范围内，并且时间在约1.5分钟至约5分钟的范围内。
在第二方面的另一个示例中，表面部分为叠氮基团或炔烃基团；并且可带正电的部分通过连接基共价附接到表面部分。在一个示例中，表面部分为叠氮基团；连接基为炔烃基团；并且阳离子部分包括质子化胺基团、锍离子、季铵阳离子或它们的组合。在一个示例中，表面部分为炔烃基团；连接基为叠氮基团；并且阳离子部分包括质子化胺基团、锍离子、季铵阳离子或它们的组合。在一个示例中，化合物包括附接到连接基的可带正电的部分，并且其中该化合物为炔丙基溴化胆碱。在一个示例中，流体包括水。在一个示例中，温度在约18℃至约60℃的范围内，并且时间在约30分钟至约12小时的范围内。在一个示例中，该方法还包括将催化剂、配体和还原剂与流体一起添加到流通池中。
应当理解，该方法的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，该方法和/或流通池的特征的任何组合可一起使用，和/或与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如实现正电荷以吸引并在空间上限制文库片段。
本文所公开的第三方面是一种试剂盒，该试剂盒包括流通池，该流通池包括基底；初始聚合物水凝胶，该初始聚合物水凝胶位于基底上并且具有选自由可带负电的原子、叠氮基团和炔烃基团组成的组的表面部分；以及附接到初始聚合物水凝胶的扩增引物；以及包括可带正电的部分的流体，该可带正电的部分将与表面部分相互作用或反应以形成包括阳离子部分的阳离子聚合物水凝胶。
应当理解，该试剂盒的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，该试剂盒和/或方法和/或流通池中任一者的特征的任何组合可一起使用，和/或与本文所公开的任何示例组合以实现如本公开所述的益处，包括例如实现正电荷以吸引并在空间上限制文库片段。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1是示出本文所公开的方法的示例的流程图；
图2A和图2B是一起示出图1的方法的半示意性透视图，其中图2A示出了流通池的包括初始聚合物水凝胶的一部分，并且图2B示出了流通池的包括带正电的(阳离子)聚合物水凝胶的一部分；
图3是示出阳离子聚合物水凝胶的一个示例的形成的化学式；
图4是示出阳离子聚合物水凝胶的另一个示例的形成的化学式；
图5A和图5B一起描绘了示出阳离子聚合物水凝胶的又一个示例的形成的化学式；
图6是本文所公开的流通池的另一个示例的一部分的半示意透视图；
图7是本文所公开的流通池的又一个示例的一部分的半示意透视图；并且
图8A至图8C是本文所公开的络合物的不同示例的示意图；
图9A是比较流通池上的释放的DNA文库片段的倒置显微图像(其中图像的原始深色部分已被倒置成白色，并且图像的原始浅色部分已被倒置成黑色)，该比较流通池在玻璃基底的单个通道中包括未处理的水凝胶；
图9B是图9A的比较流通池的释放的DNA文库片段和未处理的水凝胶的相互作用的示意图；
图10A是实施例流通池上的释放的DNA文库片段的倒置显微图像(其中图像的原始深色部分已被倒置成白色，并且图像的原始浅色部分已被倒置成黑色)，该实施例流通池在玻璃基底的单个通道中包括用三(羟丙基)-膦处理的水凝胶；并且
图10B是图10A的实施例流通池的释放的DNA文库片段和经处理的水凝胶的相互作用的示意图。
具体实施方式
本文所公开的流通池的示例包括聚合物水凝胶表面处的正电荷和扩增引物。聚合物水凝胶表面处的正电荷有助于吸引并在空间上限制从随后引入流通池的载体中释放的文库片段。
文库片段是较大核酸样品的单链、大小相似(例如，<1000bp)的脱氧核糖核酸(DNA)片或由较大核酸样品的核糖核酸(RNA)片产生的互补脱氧核糖核酸(cDNA)片，并且这些片段的两端分别具有接头。带正电的水凝胶表面将吸引从单个载体释放的带负电的文库片段。这将减少整个流通池表面上文库片段的随机结合，并且将减少或防止文库片段接种在流通池的侧壁上。因此，文库接种效率得以改善。
改善的接种效率可具有许多优点和有益效果。例如，当接种效率得以改善时，可降低文库输入要求。又如，改善的接种效率可以产生至少基本上匀化的簇密度。在测序过程中，当将核苷酸掺入簇的相应模板链中时，各个簇产生荧光信号的“空间云”。簇的限制可以至少减少空间云串扰和/或重叠，并且还可以改善空间云的识别。此外，因为从任何单个簇获得的读段可由相同样品生成，所以它们可用于通过以生物信息学方式将短读段拼接在一起来重建样品。
本文所公开的方法的示例将正电荷引入到初始聚合物水凝胶的表面，同时保持表面的测序相容性。
定义
除非另外指明，否则本文所用的术语应理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数两者，除非上下文另有明确指示。如本文所用的术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举要素或方法步骤。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等意指结合该示例描述的特定要素(例如，特征、结构、组成、构型和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可或可不存在于其他示例中。另外，应当理解，用于任何示例的所述要素可在各种示例中以任何合适的方式组合，除非上下文另有明确指示。
在本公开(包括权利要求)通篇中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和说明有小波动，诸如由于处理中的变化引起的。例如，这些术语可以指小于或等于规定值的±5％，诸如小于或等于规定值的±2％，诸如小于或等于规定值的±1％，诸如小于或等于规定值的±0.5％，诸如小于或等于规定值的±0.2％，诸如小于或等于规定值的±0.1％，诸如小于或等于规定值的±0.05％。
接头：可以例如通过连接或标记与核酸分子融合的线性寡核苷酸序列。在一些示例中，接头与引入流通池的任何靶序列的3'端或5'端基本上不互补。合适的接头长度可在约10个核苷酸至约100个核苷酸或约12个核苷酸至约60个核苷酸或约15个核苷酸至约50个核苷酸的范围内。接头可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些示例中，接头包括一个或多个位置处的一个或多个可裂解基团。在一些示例中，接头可以包括与引物(例如，包括通用核苷酸序列(诸如P5或P7序列)的引物)的至少一部分互补的序列。在一些示例中，接头可以包括有助于下游错误校正、识别或测序的索引或条形码序列。该索引对于核酸分子(例如，片段)的样品或来源可以是唯一的。在一些示例中，接头可以包括测序引物序列或测序结合位点。可将不同接头的组合掺入核酸分子(诸如DNA片段)中。
捕获位点：流通池表面的已经被物理改性和/或用允许定位络合物或样品的化学性质改性的一部分。在一个示例中，捕获位点可包括化学捕获剂。
载体：能够具有包含在其中的测序文库的水凝胶支持物，或能够具有附接到其表面的即用测序核酸片段的固体支持物。
化学捕获剂：能够附接、保留或结合到靶分子(例如，络合物或样品)的材料、分子或部分。一种示例性化学捕获剂包括与靶分子的靶核酸的至少一部分互补或附接到靶分子的捕获核酸(例如，捕获寡核苷酸)。另一个示例性化学捕获剂是连接分子。对于天然DNA或RNA样品，连接分子可包括一端上的核酸结合部分，诸如经由电荷或疏水相互作用结合的嵌入剂。对于细胞样品，连接分子可包括细胞膜结合部分(例如，抗表面蛋白的抗原)或膜穿透部分(例如，一端上的磷脂)。又一个示例性化学捕获剂包括能够结合靶分子(或结合附接到靶分子的连接部分)的受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)的成员。化学捕获剂的再一个示例是能够与靶分子形成静电相互作用、氢键或共价键(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、Diels-Alder等)的化学试剂。
络合物：载体，诸如水凝胶支持物或固体支持物，以及附接到载体或包含在载体内的即用测序核酸片段。载体还可包括结合对的一个成员，其另一个成员是捕获位点的一部分。
外部固定剂：与已经引入流通池通道或室的络合物或样品不可混溶的气体、液体或粘性介质。气体外部固定剂可用于在络合物或样品周围产生液滴。气体外部固定剂的示例是以合适的流速引导通过流通池的空气。例如，空气可用于从流通池抽吸含有络合物或样品的流体，其形成含有络合物或样品的液体的液滴。所形成的液滴用作扩散屏障。液体或粘性介质用于防止从络合物释放或在流通池表面上的室内形成的测序文库扩散。外部固定剂可以形成扩散屏障，因为测序文库或任何其他多核苷酸在外部固定剂中几乎没有溶剂化。液体形式的示例性外部固定剂包括疏水性油，诸如矿物油、硅油、全氟化油、氟化碳油(例如，得自3M的FLUORINERTTM Electronic Liquid FC40)或它们的组合。粘性介质形式的示例性外部固定剂包括含有聚合物(例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等)、葡聚糖、蔗糖、甘油等的缓冲液。在一些示例中，粘性介质是温度响应性凝胶。温度响应性凝胶在非接种温度下是非粘性的，并在接种温度下变成粘性介质。温度响应性凝胶的示例包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)/合成锂皂石纳米颗粒复合物。
片段：遗传物质的一部分或片(例如，DNA、RNA等)。
水凝胶或水凝胶基质：可透过液体和气体的半刚性聚合物材料。形成水凝胶的聚合物材料可以是线性的，或者经由共价键、离子键或氢键轻度交联。在一个示例中，水凝胶包括约60％至约90％的流体(诸如水)以及约10％至约30％的聚合物。水凝胶可为多孔的，即包括开放/空隙空间。孔隙度是水凝胶的分数体积(无量纲)，即测量材料中的空隙空间，是空隙体积占总体积的分数，以0与100％之间的百分比(或0与1之间的分数)表示。在一个示例中，水凝胶的孔隙度可在约50％(0.5)至约99％(0.99)的范围内。孔隙度可足以允许试剂(例如，酶、化学品和较小尺寸的寡核苷酸(小于50个碱基对，例如引物))扩散，但阻止较大尺寸的核酸分子(例如，样品、片段等)扩散。
如本文所用的术语“阳离子聚合物水凝胶”是指具有阳离子部分的初始聚合水凝胶，该阳离子部分i)整合到单体单元中的一个中，或ii)通过连接基附接到单体单元中的一个上。如本文所用的术语“初始聚合物水凝胶”是指在引入阳离子部分的任何反应/相互作用之前的聚合水凝胶。阳离子聚合物水凝胶在本文中也可称为带正电的水凝胶。
水凝胶支持物：具有至少基本上球形形状的水凝胶(例如，水凝胶珠粒)，其可以在其中含有测序文库。
核酸分子：任何长度的核苷酸的聚合物形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。该术语可指单链或双链多核苷酸。
“靶”或“模板”核酸分子可指待分析的序列。
核酸分子中的核苷酸可包括天然存在的核酸及其功能类似物。功能类似物的示例能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核苷酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核苷酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于DNA中)或核糖(例如，存在于RNA中)。类似结构可以具有替代的糖部分，包括本领域已知的多种糖部分中的任一种。核苷酸可以包括天然或非天然碱基。天然DNA可以包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种，并且天然RNA可以包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种。可使用任何非天然碱基，诸如锁核酸(LNA)和桥核酸(BNA)。
可带正电的部分：可带正电的部分可以是携带或可以携带正电荷的任何官能团。在一个示例中，可通过置换反应将正电荷引入可带电部分。在其他示例中，可带正电的部分在特定pH(例如，生理pH)下携带正电荷。
引物：可以与所关注靶序列杂交的核酸分子。在一个示例中，引物用作底物，核苷酸可以通过聚合酶聚合到该底物上。例如，扩增或捕获引物可以用作模板扩增和簇生成的起始点。又如，合成的核酸链可包括引物(例如，测序引物)可以与之杂交的位点，以便引发与合成的核酸链互补的新链的合成。任何引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些示例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。引物长度可以为任何数量的碱基长，并且可以包括多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
样品：遗传物质的任何来源，诸如细胞、微生物群或核酸。在一些示例中，细胞是单细胞，包括原核细胞或真核细胞。在一些示例中，细胞是哺乳动物细胞、人细胞或细菌细胞。在一些示例中，核酸是长DNA分子，包括病毒核酸、细菌核酸或哺乳动物核酸。在一些示例中，样品经由插入与固体支持物(例如，珠粒)表面结合的转座子来结合(作为片段)。
即用测序核酸片段：遗传物质在3'和5'端具有接头的一部分(片段)。在即用测序核酸片段中，每个接头包括已知的通用序列(例如，其与流通池上的引物的至少一部分互补)和测序引物序列。两个接头还可包括索引(条形码或标签)序列。在一个示例中，一侧(例如，P5侧)可含有珠粒(或其他固体支持物)索引，并且另一侧(例如，P7侧)可含有样品索引。即用测序核酸片段可经由插入转座子与固体支持物(例如，珠粒)的表面结合，或者通过结合对或其他可裂解连接基直接固定。即用测序核酸片段也可包含在水凝胶支持物内。
接种：将适配的片段(例如，即用测序核酸片段)固定在本文所公开的流通池的示例的水凝胶上。
测序文库：一种或多种靶核酸分子的核酸片段的集合，或这些片段的扩增子。在一些示例中，片段在其3'和5'端连接到一个或多个接头。在一些示例中，测序文库由一种或多种靶核酸分子制备并且是络合物的一部分。
固体支持物：由刚性或半刚性材料制成的小主体，其形状的特征在于例如球形、椭圆形、微球形或其他公认的颗粒形状，无论是具有规则还是不规则的尺寸。固体支持物可以具有与其附接的测序文库。可用于固体支持物的示例性材料包括但不限于玻璃；塑料，诸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一种材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(得自The Chemours Co的
)；多糖或交联多糖，诸如琼脂糖或琼脂糖凝胶；尼龙；硝化纤维；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅；碳纤维、金属；无机玻璃；光纤束，或多种其他聚合物。示例性固体支持物包括可控孔玻璃珠、顺磁珠、氧化钍溶胶、琼脂糖凝胶珠、纳米晶体和本领域已知的其他固体支持物，如例如在来自Bangs Laboratories,Fishers Ind.的Microsphere Detection Guide中所述。
标记：通过转座体修饰核酸分子(例如，DNA或RNA样品)，以在单个步骤中片段化核酸分子并将接头连接到片段的5'和3'端。标记反应可用于制备测序文库，特别是包括固体支持物的络合物。标记反应将随机样品片段化和接头连接组合成单个步骤，这提高了测序文库制备过程的效率。
转座体：整合作用酶(例如，整合酶或转座酶)和包含整合识别位点(例如，转座酶识别位点)的核酸。
通用核苷酸序列：两个或更多个核酸分子共有的序列区域，其中这些分子也具有彼此不同的区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用通用捕获核酸(即，具有与引物的至少一部分互补的序列的接头)的群体捕获若干不同核酸。类似地，存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用通用测序结合位点(测序引物序列)的群体扩增或复制若干不同核酸。
制备带正电的流通池表面的方法
用于形成流通池的示例的方法100的示例在图1中示出。如所描绘的，方法100的一个示例包括：将包括可带正电的部分的流体引入流通池，该流通池包括初始聚合物水凝胶，该初始聚合物水凝胶具有选自由可带负电的原子、叠氮基团和炔烃基团组成的组的表面部分，以及附接到初始聚合物水凝胶的扩增引物(附图标号102)；以及在一定温度下将初始聚合物水凝胶在流体中温育一段时间，从而形成包括阳离子部分的阳离子聚合物水凝胶(附图标号104)。
方法100还在图2A和图2B中示意性地示出。
如图2A所示，在方法100开始时，流通池10P(其为图2B所示的流通池10的前体)包括基底12、基底12上的初始聚合物水凝胶14'以及附接到初始聚合物水凝胶14'的扩增引物18。
基底12通常为刚性的并且不溶于水性液体。合适的基底12的示例包括环氧硅氧烷、多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)或其衍生物、玻璃、改性玻璃、塑料、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅(氧化硅(SiO2))、熔融二氧化硅、基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅、改性硅(例如，掺杂硼的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、五氧化钽(TaO5)或其他氧化钽(TaOx)、氧化铪(HfO2)、无机玻璃等。POSS的示例可以是Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的POSS，该文献以引用方式全文并入。适用于基底12的塑料的一些示例包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自The Chemours Co.的
)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的
)、聚酰亚胺等。基底12还可以是玻璃或硅或POSS，在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂层。合适的基底12的另一个示例是绝缘体上硅基底。
基底12的形式可以是晶片、面板、矩形片材、管芯或任何其他合适的构型。在一个示例中，基底12可以是直径在约2mm至约300mm范围内的圆形晶片或面板。作为一个更具体的示例，基底12是直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个示例中，基底12可以是其最大尺寸为至多约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。作为一个具体示例，基底12是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。虽然已经提供了示例性尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基底12。
图2A所示的基底12具有限定在其中的通道20。可使用部分地取决于基底12的材料的任何合适的技术将通道20限定在基底12中。在一个示例中，将通道20蚀刻到玻璃基底12中。在另一个示例中，可使用光刻、纳米压印光刻等将通道20图案化到树脂基底12中。在又一个示例中，可将单独的材料(未示出)施加到基底12上，使得单独的材料限定通道20的壁，并且基底12限定通道20的底部。
在一个示例中，通道20具有直线构型。通道20的长度和宽度可分别小于基底12的长度和宽度，使得基底表面22的围绕通道20的部分可用于粘结到盖(未示出)。在一些情况下，每个通道20的宽度可以为至少约1mm、至少约2.5mm、至少约5mm、至少约7mm、至少约10mm或更大。在一些情况下，每个通道20的长度可以为至少约10mm、至少约25mm、至少约50mm、至少约100mm或更大。每个通道20的宽度和/或长度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。在一个示例中，通道20是正方形(例如，10mm×10mm)。
当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定通道壁的单独材料时，每个通道20的深度可以是单层厚的。对于其他示例，每个通道20的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约30μm的范围内。除了吸引释放的文库片段的带正电的聚合物水凝胶之外，该深度也可有助于阻断释放的文库片段在相邻通道20之间侧向扩散，例如当使用多个通道20时。在另一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个通道20的深度大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
虽然图2A中示出了单个通道20，但应当理解，基底12可包括彼此流体分离的多个通道(例如，2、3、4、8个等)。
在图2A所示的示例中，通道20中具有初始聚合物水凝胶14'。在整合或附接阳离子部分16(图2B)之前，水凝胶可被称为初始聚合物水凝胶14'(参见图2A)。在整合或附接阳离子部分16之后，水凝胶可被称为阳离子聚合物水凝胶14(参见图2B)。
初始聚合物水凝胶14'可为至少两种不同单体单元的共聚物。初始聚合物水凝胶14'可由如下表示：(M1)n(M2)m，其中M1为第一单体单元，M2为第二单体单元，n为1至50,000范围内的整数，并且m为1至100,000范围内的整数。在阳离子聚合物水凝胶14中，M1可用M1'(参考图3所述)或M1”(参考图4所述)替代，但M2、n和m与针对初始聚合物水凝胶14'所述的相同。现在将更详细地描述单体单元M1、M2中的每一者的示例。
单体单元M1中的一个包括选自由可带负电的原子、叠氮基团和炔烃基团组成的组的表面部分。可带负电的原子可以是易于置换的任何基团，诸如相对较弱的亲核物质。可带负电的原子的一些具体示例包括卤素，诸如溴、碘等。
单体单元M1的这些表面部分中的每一种能够被扩增引物18置换或共价附接到该扩增引物。例如，溴能够被引物18的5'端上的硫代磷酸酯基团置换。又如，叠氮基团能够共价连接到引物18的5'端上的炔烃基团。再如，炔烃基团能够共价连接到引物18的5'端上的叠氮基团。
单体单元M1的这些表面部分中的每一种还可以使阳离子部分16能够附接到初始聚合物水凝胶14'，以生成阳离子聚合物水凝胶14。
在一些示例中，单体单元M1的表面部分被阳离子部分16置换，因此阳离子部分16整合到单体单元M1中。换句话讲，阳离子部分16在表面部分已附接的相同位置附接到单体单元M1。例如，表面部分可以是比阳离子部分16更弱的氧化还原物质，并且可发生置换反应，其中表面部分与阳离子部分16交换。可置换表面部分的示例是可带负电的原子，诸如溴。
在其他示例中，表面部分与连接基反应，以将阳离子部分16附接到单体单元M1。例如，叠氮基团能够共价连接到连接基的末端炔烃基团。再如，炔烃基团能够共价连接到连接基的末端叠氮基团。
由于单体单元M1的表面部分具有多官能性，应当理解，单体单元M1的一些表面部分将附接扩增引物18，并且一些表面部分将被阳离子部分16置换或将附接到该阳离子部分。在一些情况下，所附接的扩增引物18的量是所附接的阳离子部分16的量的约10倍至约50倍。
包括本文所公开的表面部分并且可以与其他单体单元M2共聚的任何单体单元M1可用于形成初始聚合物水凝胶14'。在一个示例中，单体单元M1(包括表面部分)还包括丙烯酰胺单元：
也可使用丙烯酰胺单元的变型，例如烯烃中的碳可以任选地被取代或N可以任选地被取代。其他丙烯酰胺单元的示例包括甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、乙基丙烯酰胺等。
包括丙烯酰胺单元和作为可带负电的原子的溴两者的单体单元M1的一个具体示例为N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(brapa)：
也可使用N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺的变型，例如烷基链-(CH2)-可在1至50的范围内，并且/或者-(CH2)-中的每一者可以任选地被取代。
包括丙烯酰胺单元和叠氮基团两者的单体单元M1的一个具体示例为N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺：
也可使用N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺的变型，例如烷基链-(CH2)-可在1至50的范围内，并且/或者-(CH2)-中的每一者可以任选地被取代。包括丙烯酰胺单元和叠氮基团两者的单体单元M1的另一个示例如下表示：
其中R1为H或C1-C4烷基；R2为H或C1-C4烷基；L为包括直链的连接基团，其具有2至20个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个环成员。包括丙烯酰胺单元和叠氮基团两者的单体单元M1的又一个示例如下表示：
其中R3a选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；R3b选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；并且L1选自任选地取代的亚烷基连接基团或任选地取代的杂亚烷基连接基团。
包括丙烯酰胺单元和炔烃基团两者的单体单元M1的一个具体示例为N-炔丙基丙烯酰胺：
应当理解，其他单体单元M1可用于形成初始聚合物水凝胶14'，只要将它们用本文所公开的一个表面部分官能化即可。
任何单体单元M1可与第二单体单元M2共聚以形成初始聚合物水凝胶14'。第二单体单元M2的示例包括丙烯酰胺单元、N,N-二甲基丙烯酰胺单元：
其中R4a选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；R4b选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；并且L2选自任选地取代的亚烷基连接基团或任选地取代的杂亚烷基连接基团。第二单体单元M2不包括第一单体单元M1的表面部分(例如，可带负电的原子、叠氮基团或炔烃基团)。
在其他示例中，单体单元M1可与丙烯酰胺单元(例如，单体单元M2)和N,N-二甲基丙烯酰胺(例如，单体单元M3)两者共聚以形成初始聚合物水凝胶14'。在这些示例中，初始聚合物水凝胶14'可由(M1)n(M2)m(M3)q表示，其中n为1至50,000的整数，m为1至100,000的整数，并且q为1至100,000的整数。在相应的阳离子聚合物水凝胶14中，M1可用M1'(参考图3所述)或M1”(参考图4所述)替代，但M2、M3、n、m和q与针对初始聚合物水凝胶14'所述的相同。
在一些示例中，初始聚合物水凝胶14'((M1)n(M2)m或(M1)n(M2)m(M3)q)(以及相应的阳离子聚合物水凝胶14)可为线性共聚物或轻度交联共聚物。初始聚合物水凝胶14'的分子量可在约10kDa至约1500kDa的范围内，或者在具体示例中可为约312kDa或约500kDa。阳离子聚合物型水凝胶14的分子量可高于其相应的初始聚合物水凝胶14'，这取决于整合到其中的阳离子部分16或附接到其上的阳离子部分16和连接基。
本领域的普通技术人员将认识到，反复出现的“n”和“m”或“n”、“m”和“q”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于初始聚合物水凝胶14'/阳离子聚合物水凝胶14结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
为了将初始聚合物水凝胶14'引入通道20中，可生成共聚物((M1)n(M2)m或(M1)n(M2)m(M3)q)的混合物，然后将其施加到基底12。在一个示例中，共聚物可存在于混合物(例如，与水或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂或者浸渍或浸涂或者正压或负压下材料流或者另一种合适的技术将共聚物混合物施加到基底表面22。
在一些示例中，可活化基底表面22(包括暴露在通道20中的部分)，然后可向其施加共聚物混合物。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在基底表面22上。在另一个示例中，可将基底表面22暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到共聚物的表面活化剂(例如，-OH基团)。在其他示例中，等离子灰化之后进行硅烷化可用于活化基底表面22。
根据共聚物，可将所施加的混合物暴露于固化过程，以在表面22上形成初始(共价键合的)聚合物水凝胶14'。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。然后可进行抛光，以便从基底12的周界处的表面22移除初始聚合物水凝胶14'，同时使表面22上的初始聚合物水凝胶14'在通道20中至少基本上完整。
流通池10P还包括扩增引物18。
可进行接枝过程，以将扩增引物18接枝到通道20中的初始聚合物水凝胶14'。在一个示例中，扩增引物18可以通过引物18的5'端处或其附近的单点共价附接固定到初始聚合物水凝胶14'。该附接使i)引物18的接头特异性部分自由地退火至其同源即用测序核酸片段，以及ii)3'羟基基团自由用于引物延伸。任何合适的共价附接均可用于此目的。可使用的封端的引物的示例包括炔烃封端的引物(例如，其可附接到初始聚合物水凝胶14'的叠氮表面部分)、硫代磷酸酯封端的引物(例如，其可附接到初始聚合物水凝胶14'的溴表面部分)或叠氮封端的引物(例如，其可附接到初始聚合物水凝胶14'的炔烃表面部分)。合适的引物18的具体示例包括在Illumina Inc.销售的商业流通池的表面上使用P5和P7引物，以在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM、ISEQTM和其他仪器平台上进行测序。
在一个示例中，接枝可涉及流动通过沉积(例如，使用暂时性结合或永久性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配或通过将引物18附接到通道20中的初始聚合物水凝胶14'的另一种合适方法。这些示例性技术中的每一种可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包括引物、水、缓冲液和催化剂。利用接枝方法中的任一种，引物18与通道20中的初始聚合物水凝胶14'的反应性基团(例如，单体单元M1的表面部分)反应，并且对周围基底12不具有亲和力。因此，引物20选择性地接枝到通道20中的初始聚合物水凝胶14'。
引物溶液或混合物中引物18的浓度可使得初始聚合物水凝胶14'的单体单元M1的一些表面部分保持可用于相互作用或反应，以引入阳离子部分16(图2B)。
如图2A所示，将包括可带正电的部分26的流体24引入流通池10P中。在一定温度下使初始聚合物水凝胶14'在流体24中温育足以形成包括阳离子部分16的阳离子聚合物水凝胶14(图2B所示)的一段时间。
所用的流体24和可带正电的部分26可取决于初始聚合物水凝胶14'，并且具体地，取决于初始聚合物水凝胶14'中单体单元M1的表面部分。温育温度和时间还可取决于可带正电的部分26和初始聚合物水凝胶14'。
可带正电的部分26的一些示例将自身整合到初始聚合物水凝胶14'的单体单元M1中，以形成包括阳离子部分16的阳离子聚合物水凝胶14。当阳离子部分16“整合到初始聚合物水凝胶的单体单元中”时，是指阳离子部分16已置换初始聚合物水凝胶14'的单体单元M1的表面部分。在该示例中，表面部分为可带负电的原子，并且可带正电的部分26为比可带负电的原子更强的氧化还原物质。例如，单体单元M1的可带负电的原子为溴，并且可带正电的部分选自由以下项组成的组：三(羟甲基)膦、三(羟丙基)膦、四(羟甲基)膦和三(2-羧乙基)膦。这些膦可带正电的部分中的任一种可以置换初始聚合物水凝胶14'的单体单元M1的溴原子，使得相应的鏻阳离子变成阳离子聚合物水凝胶14的单体单元M1'(参见图3)的一部分。表1示出了用于溴的置换反应的可带正电的部分26，以及整合到阳离子聚合物水凝胶14的单体单元M1'中的相应阳离子。在这些示例中的每一个中，抗衡离子为溴化物(Br-)。
表1
| 可带正电的部分 | 相应阳离子 |
| 三(羟甲基)膦 | 三(羟甲基)鏻阳离子 |
| 三(羟丙基)膦 | 三(羟丙基)鏻阳离子 |
| 四(羟甲基)膦 | 四(羟甲基)鏻阳离子 |
| 三(2-羧乙基)膦 | 三(2-羧乙基)鏻阳离子 |
置换反应的示例在图3中示出。在该示例中，初始聚合物水凝胶14'为无硅烷丙烯酰胺，包括作为第一单体单元M1的N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺和作为第二单体单元M2的丙烯酰胺。当暴露于包括可带正电的部分26(其在该示例中为三(羟丙基)膦)的流体24时，可带正电的部分26置换初始聚合物水凝胶14'的可带负电的原子。置换反应的结果为阳离子聚合物水凝胶14，其包括附接到单体单元M1'的阳离子部分16(其在该示例中为三(羟丙基)鏻阳离子)，其中溴已附接到单体单元M1。
在图3所示的示例中，流体24可包括pH在6至12范围内的缓冲液。例如，缓冲液可为Tris缓冲液或乙醇胺缓冲液。流体24中可带正电的部分26的浓度可在约1mM至约500mM的范围内。在一个示例中，流体24中可带正电的部分26的浓度可在约50mM至约400mM的范围内。在另一个示例中，流体24中任何膦可带正电的部分26的浓度可为约100mM。
在该示例中，温育温度在约18℃至约65℃的范围内，并且温育时间在约1.5分钟至约5分钟的范围内。
应当理解，图3所示的示例性反应是置换反应的一个示例，并且可使用其他单体单元M1(例如，包括另一个可置换表面部分)、M2和/或其他可带正电的部分26。
可带正电的部分26的其他示例通过连接基28(图4)附接到初始聚合物水凝胶14'的单体单元M1，以形成包括阳离子部分16的阳离子聚合物水凝胶14。当阳离子部分16“通过连接基附接到聚合物水凝胶的单体单元”时，是指初始聚合物水凝胶14'的单体单元M1的表面部分与连接基28反应以附接阳离子部分16。
在该示例中，表面部分为叠氮基团或炔烃基团，并且可带正电的部分26通过机连接基28共价附接到表面部分。在一个示例中，(单体单元M1的)表面部分包括末端叠氮基团，并且连接基28包括炔烃基团。在另一个示例中，(单体单元M1的)表面部分包括末端炔烃基团，并且连接基28包括叠氮基团。
除了叠氮基团或炔烃基团之外，连接基28还可包括链，该链可以是单个–CH2-单元，可包括若干–CH2-单元、若干CH2CH2O-单元、寡核苷酸链或另一条聚合物链。在一个示例中，连接基28是双功能DNA寡核苷酸。所谓“双官能”，是指DNA寡核苷酸连接基的一端具有可以附接到初始聚合物水凝胶14'的一个端基和可以附接到阳离子部分16的另一个端基。
连接基28的任何示例也可以是可裂解的。所谓“可裂解的”是指连接基28包括可裂解键，因此可以从流通池表面去除阳离子部分16。例如，连接基28可包括可裂解二硫键、可光解键、可裂解磷酸二酯键或它们的组合。例如，DNA寡核苷酸的磷酸二酯键可经由酶促裂解来裂解。又如，连接基28可包括可裂解二硫键(S-S)或可光解键(例如，包括硝基苄基基团的连接基，诸如可光解间隔物：
(购自Integrated DNA Technologies)。在一个示例中，可裂解键位于末端叠氮或炔烃基团与可带正电的部分26之间。连接基28中的可裂解键可能是期望的，使得例如在接种文库片段之后、在从裂解物中提取DNA之后等，可从阳离子聚合物水凝胶14去除阳离子部分16。阳离子部分16的裂解将去除正电荷，并且流通池表面将回复到其初始电荷态(例如，在引入阳离子部分16之前的电荷)。
在该示例中，可带正电的部分26可以是携带或可以携带正电荷并且可以附接到连接基28的任何基团。例如，可带正电的部分26可以是可以在生理pH下携带正电荷(从而产生质子化胺基团：R-NH3 +作为阳离子部分16)的胺基团，诸如聚赖氨酸、聚酰胺基胺等，或可以在大多数pH下携带正电荷(从而产生季铵阳离子：
作为阳离子部分16)的季铵盐，或锍离子：
在一些示例中，初始聚合物水凝胶14'可包括不同的可带正电的部分26的组合。
在一些示例中，将可带正电的部分26附接到连接基28，并且将所得化合物30(图4)掺入被引入流通池10P的流体24中，以生成阳离子聚合物水凝胶14。这些化合物30可商购获得或可合成。作为合适的化合物30的示例，含叠氮化物或含炔烃的连接基28可附接到胺基团、季铵基团或锍离子的R基团中的任一个。化合物30的一个示例为炔丙基溴化胆碱：
其包括附接到N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子(其为季铵阳离子的胆碱类)的炔烃连接基28。化合物30的其他示例包括叠氮乙基-SS-乙胺：
其包括附接到胺基团(其可以形成质子化胺)的含叠氮化物的连接基28，或者炔丙基-SS-乙胺：
其包括附接到胺基团(其可以形成质子化胺)的含炔烃的连接基28。这两种特定连接基28在烷基链中包括叠氮基团(N3)或炔烃基团(C≡C)以及可裂解二硫键(S-S)。
利用连接基28将可带正电的部分26附接到初始聚合物水凝胶14'的示例在图4中示出。在该示例中，初始聚合物水凝胶14'包括作为第一单体单元M1的N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺和作为第二单体单元M2的丙烯酰胺。当暴露于包括可带正电的部分26的流体24(其在该示例中为炔丙基溴化胆碱)时，第一单体单元M1的叠氮基团和化合物30的炔烃基团发生铜催化的叠氮-炔烃环加成(CuAAC)反应。CuAAC反应的结果为阳离子聚合物水凝胶14，其包括附接到单体单元M1'的三唑的阳离子部分16(其在该示例中为N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子)。
在图4所示的示例中，流体24可包括水。流体24中化合物30的浓度可在约100nM至约100μM的范围内。因为连接反应是CuAAC反应，所以流体24还可包括催化剂和配体，或催化剂、配体和还原剂。可将这些组分添加到流体24中，使得它们被引入流通池10P中。可使用产生铜(II)离子的任何铜催化剂，诸如CuSO4。可使用任何配体，诸如N,N,N',N”,N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDTA)。可使用任何还原剂，诸如抗坏血酸钠。在一个示例中，流体24包括约0.25摩尔％至约2摩尔％的铜催化剂和约5摩尔％至约10摩尔％的还原剂。
在该示例中，温育温度在约18℃至约60℃的范围内，并且温育时间在约30分钟至约12小时的范围内。又如，CuAAC反应的温育温度在约18℃至约22℃的范围内，并且时间在约60分钟(1小时)至约6小时或约6小时至约12小时的范围内。
应当理解，图4所示的示例性反应是附接反应的一个示例，并且可使用其他单体单元M1、M2、其他连接基28和/或其他可带正电的部分26。
在其他示例中，图3和图4中所示方法的组合可用于生成包括阳离子部分16的阳离子聚合物水凝胶14。一个示例在图5A和图5B中示出。
在该示例中，在一端包括末端叠氮化物或炔烃并且在另一端包括末端可带负电的原子(例如，溴、碘或另一种弱亲核物质)的连接基28'附接到初始聚合物水凝胶14'的单体单元M1的表面部分。当连接基28'包括末端叠氮化物时，单体单元M1的表面部分为炔烃，并且当连接基28'包括末端炔烃时，单体单元M1的表面部分为叠氮化物。连接反应可以与如参考图4所述类似的方式进行。这产生改性聚合物水凝胶14”，如图5A所示。
然后可将改性聚合物水凝胶14”暴露于如参考图3所述的置换反应。可将包括比改性聚合物水凝胶14”的可带负电的原子(例如，溴)更强的可带正电的部分26的流体24引入流通池10P中。如参考图3所述，可带正电的部分26将置换和替代可带负电的原子，以形成阳离子聚合物水凝胶14的另一个示例。
当温育在一定温度下进行合适的时间时，形成阳离子聚合物水凝胶14(如图5B所示)，其在其表面包括阳离子部分16和扩增引物18。
应当理解，图5A和图5B所示的示例性反应是置换和附接反应的一个示例，并且可使用其他单体单元M1(例如，包括另一个可置换表面部分)、M2、其他连接基28和/或其他可带正电的部分26。
具有带正电的(阳离子)聚合物水凝胶14的流通池10在图2B中示出。图2B所示的流通池10包括：基底12；基底12上的阳离子聚合物水凝胶14；阳离子部分16，该阳离子部分i)整合到阳离子聚合物水凝胶14的单体单元M1'中，或ii)通过连接基28、28'附接到聚合物水凝胶14的单体单元M1'；以及附接到阳离子聚合物水凝胶14的扩增引物18。
带正电的聚合物水凝胶14可以吸引被引入流通池10的带负电的络合物或样品，因此可不利用另外的捕获位点。
附加的流通池构造
虽然在图2B中示出了流通池构造的一个示例，但应当理解，也可使用其他流通池构造。
流通池10'的另一个示例在图6中示出。该示例类似于图2B所示的示例，不同的是基底12包括被空隙区域34隔开的多个凹入部32，并且阳离子聚合物水凝胶14(包括阳离子部分16)和扩增引物18位于凹入部32中的每一个内。在图6所示的示例中，将凹入部32限定在通道20中。
在该示例中，可将凹入部32图案化到基底12中。图案化可涉及将凹入部32蚀刻到基底12中和/或使用压印光刻。然后可将凹入部32用如本文所述的阳离子聚合物水凝胶14(包括阳离子部分16)和扩增引物18官能化。凹入部32之间的空隙区域34上不具有阳离子聚合物水凝胶14(包括阳离子部分16)或扩增引物18。这可能是由于初始聚合物水凝胶14'已从空隙区域34抛光。在凹入部32被官能化之后，可将附加材料36(例如，疏水材料)附接(例如，粘结、粘附等)到基底12(例如，在周边处)，以限定通道20在凹入部32周围的壁。
凹入部32可以任何合适的图案或布局分布在整个流通池10'上。当流通池10'包括多个通道20时，凹入部32的图案可以是相同的，或者凹入部32的不同图案可用于不同的通道20中。可设想凹入部32的许多不同图案/布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，凹入部32设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如平行四边形布局(即，矩形、正方形等)、三角形布局、圆形布局等。
每个凹入部32可具有任何合适的形状(和相应的三维几何形状)，诸如圆形(如图6所示)、椭圆形、多边形(例如，三角形、四边形、五边形等)等。
每个凹入部32的尺寸可通过其开口面积、直径和/或长度和宽度来表征。
每个凹入部开口所占据的面积可以被选择成使得络合物不能进入凹入部32。在一个示例中，每个凹入部开口的面积可以为至少约1×10-4μm2、至少1×10-3μm2、至少约1×10-2μm2、至少约0.1μm2、至少约0.5μm2、至少约1μm2或至少约4μm2。每个凹入部开口所占据的面积可以小于上文指定的值或介于它们之间。
在一些情况下，每个凹入部32的直径或长度和宽度可以为至少约1nm、至少约50nm、至少约100nm、至少约500nm或更大，只要尺寸小于通道直径或长度和宽度即可。凹入部直径的示例在约1nm至约500nm的范围内。凹入部直径的另一个示例在约300nm至约2μm的范围内。
凹入部32也可具有深度。例如，每个凹入部32的深度可以为至少约10nm、至少约50nm、至少约1μm、至多约2μm。应当理解，每个凹入部32的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
在一个示例中，凹入部32的纵横比(直径:深度)可在约1:1至约1:2或约1:1.25至约1:1.75的范围内。
在该示例中，相邻的凹入部32可被给定通道20内的空隙区域34隔开。平均凹入部节距表示从一个凹入部32的中心到相邻凹入部32的中心的间距(中心至中心间距)或从一个凹入部32的右边缘到相邻凹入部32的左边缘的间距(边缘至边缘间距)。凹入部32的布局或图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者布局或图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可以为例如至少约10nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm或更大，这取决于通道20的尺寸。另选地或除此之外，平均节距可以为例如至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小。凹入部32的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个与上限值中的一个之间。
流通池10”的另一个示例在图7中示出。该示例类似于图6所示的示例，不同的是基底12还包括多个室38、38'，并且其中多个凹入部32的子集位于多个室38、38'中的每一个的周界内。类似于图6，阳离子聚合物水凝胶14(包括阳离子部分16)和扩增引物18位于凹入部32中的每一个内。
在该示例中，可将凹入部32图案化到基底12中。图案化可涉及将凹入部32蚀刻到基底12中和/或使用压印光刻。然后可将凹入部32用如本文所述的阳离子聚合物水凝胶14(包括阳离子部分16)和扩增引物18官能化。凹入部32之间的空隙区域34上不具有阳离子聚合物水凝胶14(包括阳离子部分16)或扩增引物18。在凹入部32被官能化之后，可将附加材料36(例如，疏水材料)附接(例如，粘结、粘附等)到基底12(例如，在周边处)，以限定室38、38'在凹入部32的子集周围的壁。
室38、38'可以任何合适的图案或布局分布在整个基底12上。可设想室38、38'的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，室38、38'设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如平行四边形布局(即，矩形、正方形等)、三角形布局、圆形布局等。在一些示例中，布局或图案可以为呈行和列形式的室38、38'的x-y格式。
室38、38'可具有任何合适的形状，诸如正方形、圆形、椭圆形、多边形(例如，三角形、四边形、五边形等)等。
每个室38、38'的尺寸可通过其开口面积、直径和/或长度和宽度来表征。如图7所示，流通池10”具有位于室38、38'中的每一个内的多个凹入部32。因此，室38、38'的尺寸大于每个凹入部32的尺寸。换句话讲，室38、38'的一个或多个尺寸大于每个凹入部32的一个或多个尺寸。在该示例中，“尺寸”是指每个室开口或凹入部开口所占据的面积，和/或室38、38'或凹入部32的直径，和/或每个室38、38'或凹入部32的长度和宽度。在图7所示的示例中，室38、38'中的每一个的开口面积和直径大于凹入部32中的每一个的开口面积和直径。每个室38、38'的开口面积以及直径或长度和宽度取决于要位于室38、38'内的凹入部32的数量。
每个室开口所占据的面积可以被选择成使得络合物(其示例在图8A至图8C中示出)可以进入室38、38'。在一个示例中，每个室开口的面积可以为至少约1μm2、至少约10μm2、至少约100μm2或更大。每个室开口所占据的面积可以大于上文指定的值或介于它们之间。
在一些情况下，每个室38、38'的直径或长度和宽度可以为至少约1μm、至少约10μm、至少约20μm、至少约30μm、至少约40μm、至少约50μm、至少约100μm或更大。室直径的示例在约1μm至约1000μm的范围内。室直径的另一个示例在约10μm至约50μm的范围内。当室38、38'具有长度和宽度时，应当理解，长度和宽度可相同或不同。
室38、38'也可具有深度，其取决于用于形成室38、38'的技术。例如，当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定室38、38'的附加材料36时，每个室38、38'的深度可以是单层厚的。对于其他示例，每个室38、38'的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm或更大。在另一个示例中，深度为待引入室38、38'中的络合物的平均直径的至少约50％。在一个示例中，该深度可在约10μm至约30μm的范围内。除了吸引释放的文库片段的带正电的聚合物水凝胶14之外，室38、38'的深度可以有助于阻断释放的文库片段在相邻室38、38'之间侧向扩散。因此，可将释放的文库片段保持在室38、38'内而无需任何外部固定剂。在另一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个室38、38'的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
相邻的室38、38'可被附加材料36的表面隔开。平均室节距表示从一个室38、38'的中心到相邻室38、38'的中心的间距(中心至中心间距)或从一个室38、38'的右边缘到相邻室38、38'的左边缘的间距(边缘至边缘间距)。室38、38'的布局或图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者布局或图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可以为例如至少约1μm、至少约5μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。在一个示例中，平均节距为室14的直径的2倍。室38、38'的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个与上限值中的一个之间。虽然已经提供了示例性平均室节距值，但应当理解，可使用其他平均室节距值。
凹入部32的每个子集位于多个室38、38'中的每一个的周界内。
虽然未在图6或图7中示出，但流通池10'的通道20或流通池10”的每个室38、38'可包括可以吸引被引入流通池10'或10”的络合物或样品的捕获位点。更具体地，通道20或室38、38'内的空隙区域34的至少一部分可包括捕获位点。
捕获位点可在物理上和/或化学上能够将络合物或样品固定在通道20或室38、38'中的基底12上(例如，空隙区域34上)。
捕获位点可位于任何合适的位置处。整个基底12上的捕获位点的位置可以是均一的或可以是不均一的。捕获位点可具有任何合适的形状、几何形状和尺寸，其可至少部分地取决于捕获位点(例如，贴片、孔、突起等)的构型，以及将被捕获位点捕获的络合物或样品的类型。
在一些示例中，捕获位点是施加在空隙区域34的一部分上的化学捕获剂。可使用本文所公开的化学捕获剂的任何示例。在一个示例中，可使用微接触印刷或另一种适宜的技术将相应的化学捕获剂沉积在期望的位置。
在其他示例中，捕获位点包括限定在基底12的表面中的孔。可根据所使用的基底12使用蚀刻或压印来形成孔。孔可具有任何合适的形状和几何形状，诸如本文针对凹入部32所述的那些。在一些示例中，孔不具有添加到其中的附加化学捕获剂。在这些示例中，开口尺寸使得络合物或样品能够自组装到相应的孔中(例如，基于形状)。在其他示例中，孔确实具有添加到其中的化学捕获剂。
捕获位点的其他示例包括孔以及在其表面上具有化学捕获剂的捕获珠。捕获珠的尺寸可被设定成配合到孔中。在一些示例中，捕获珠可与相邻的空隙区域34共平面或略微在其上方延伸，使得最终附接到其上的络合物或样品不被限制在孔内。在一个示例中，捕获珠选自由二氧化硅、超顺磁材料、聚苯乙烯和丙烯酸酯组成的组。本文所公开的化学捕获剂的任何实例可用在捕获珠的表面上，并且可在将捕获珠引入孔中之前涂布在捕获珠上。
捕获位点孔的深度可根据是否要向其引入化学捕获剂以及是否要向其引入捕获珠而有所不同。深度可被选择成至少容纳这些材料(即，将材料包含在孔内)。在一个示例中，孔的深度在约1nm至约5微米的范围内。
又如，捕获位点包括限定在基底12中的突起。突起为从相邻表面向外(向上)延伸的三维结构。突起可经由蚀刻、光刻、压印等产生。虽然任何合适的三维几何形状均可用于突起部捕获位点，但具有至少基本上平坦的顶部表面的几何形状可能是期望的。示例性突起几何形状包括球体、圆柱体、立方体、多边形棱柱(例如，矩形棱柱、六边形棱柱等)等。
可将不同的化学捕获剂施加在相应突起捕获位点的顶部表面上。可使用本文所公开的化学捕获剂的任何示例，并且可使用任何沉积技术来将化学捕获剂施加到突起的顶部表面。
应当理解，捕获位点类型的任何组合可在流通池10'、10”上一起使用(例如，捕获剂和孔)。
流通池10、10'、10”也被示出为没有粘结到基底12的盖。应当理解，流通池10、10'、10”的一些示例可具有粘结到基底12的至少一部分(例如，在表面22处)的盖。盖可位于表面22上，使得其限定单个流动通道20或多个流体分离的流动通道20，或者可或可不流体分离的多个室38、38'。
盖可以是对导向基底12的激发光透明的任何材料。例如，盖可以是玻璃(例如，硼硅酸盐、熔融二氧化硅等)、塑料等。合适的硼硅酸盐玻璃的可商购获得的示例为购自Schott North America,Inc.的D
合适的塑料材料(即环烯烃聚合物)的可商购获得的示例为购自Zeon Chemicals L.P.的
产品。
可使用任何合适的技术(诸如激光粘结、扩散粘结、阳极粘结、共熔粘结、等离子体活化粘结、玻璃熔块粘结或本领域已知的其他方法)将盖粘结到基底表面22。在一个示例中，间隔物层可用于将盖粘结到基底表面22。间隔物层可以是将基底12和盖中的至少一些密封在一起的任何材料。
在其他示例中，流通池10、10'、10”不包括盖，而是包括粘结在一起的两个基底12。在这些示例中，基底12的反应性表面(例如，聚合物水凝胶14、引物18)彼此面对。可使用针对盖和基底12所述的类似技术和材料将基底12粘结在一起。
试剂盒
流通池10P可以是试剂盒的一部分，其可用于将正电荷引入初始聚合物水凝胶14'。在一个示例中，试剂盒包括i)流通池10P，该流通池包括：基底12；初始聚合物水凝胶14'，该初始聚合物水凝胶位于基底12上并且具有选自由可带负电的原子、叠氮基团和炔烃基团组成的组的表面部分；以及附接到初始聚合物水凝胶14'的扩增引物18；以及ii)包括可带正电的部分26的流体24，该可带正电的部分将与表面部分相互作用或反应以形成包括阳离子部分16的阳离子聚合物水凝胶14。
本文所公开的流通池构造的任何示例(包括用于流通池10、10'、10”的那些)可用于试剂盒中的流通池10P中。此外，可使用基底12、初始聚合物水凝胶14'和扩增引物18的任何示例。此外，包括可带正电的部分26的流体24的任何示例可用于试剂盒中。
试剂盒可用于执行如本文所述的方法100。
与流通池一起使用的络合物
流通池10、10'、10”的示例可特别适合与本文所公开的络合物的示例一起使用。络合物包括载体(例如，水凝胶支持物或固体支持物)以及附接到载体或包含在载体内的即用测序核酸片段。合适的络合物的示例在图8A至图8C中示出。虽然描述了用于制备络合物的一些示例性方法，但应当理解，可使用其他方法，只要能将即用测序核酸片段附接到载体或包含在载体内即可。
图8A示出了络合物40A，其包括固体支持物42以及附接到固体支持物42的即用测序核酸片段44。
在一个示例中，为了形成该络合物40A，连接基序列52、52'通过结合对的一个构件46结合至固体支持物42。在一个示例中，该连接基序列52、52'包括第一测序引物序列(例如读段1测序引物序列)和与流通池10、10'、10”上的扩增引物18(例如P5)之一的至少一部分互补的第一序列(例如尿嘧啶修饰的P5序列)。该连接基序列52、52'结合至结合对(例如生物素)的一个构件46，使得其可结合至固体支持物42(其包括结合对的另一个构件(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等)的表面。该接头序列还可包括索引序列。
Y-接头可与转座酶(例如，两个Tn5分子)混合以形成转座体。Y-接头可包括彼此杂交的两个镶嵌末端序列。镶嵌末端序列中的一个可附接到另一个接头48、48'，该接头包括第二测序引物序列(例如，读段2测序引物序列)、与流通池10、10'、10”上的扩增引物18中的另一个(例如，P7)的至少一部分互补的第二序列(例如，尿嘧啶修饰的P7序列)，以及任选的索引/条形码序列。
然后可执行标记过程。可将包括样品(例如，DNA)的流体(例如，标记缓冲液)添加到转座体和具有与其结合的接头序列52、52'的固体支持物42中。当样品接触转座体时，DNA被标记(被片段化并被固体支持物42上的接头52、52'标记)，并且与Y-接头结合(例如，通过游离镶嵌末端序列的连接)。样品的连续标记导致在转座体之间存在多个桥接分子。桥接分子包裹在固体支持物42周围。转座体保持桥接分子的邻接性。为了完成即用测序片段44，进行进一步延伸和连接以确保样品片段50、50'附接到序列48和48'。
然后可经由十二烷基硫酸钠(SDS)处理或加热或蛋白酶K消化来去除转座酶。转座酶的去除留下附接到固体支持物42的即用测序核酸片段44。
所得的络合物40A在图8A中示出。桥接分子是即用测序核酸片段42，其各自包括片段50、50'以及在任一末端处附接的接头序列48和52或48'和50'。接头序列52、52'是最初与固体支持物42结合的那些，并且包括第一测序引物序列以及与流通池引物互补的第一序列。接头序列52、52'附接到结合络合物/对的一个成员46。接头序列48、48'来自Y-接头，并且包括与另一个流通池引物互补的第二序列以及第二测序引物序列。因为每个即用测序核酸片段44包括用于扩增(例如，桥扩增)和测序的合适接头，所以不进行PCR扩增。因此这些片段44是即用测序的。此外，因为文库片段44来自同一样品，所以片段44可适用于连接的长读段应用。
图8B示出了另一种络合物40B，其包括固体支持物42以及附接到固体支持物42的即用测序核酸片段44'。在一个示例中，在管中创建无PCR的核苷酸文库，然后将该文库与管中的固体支持物42杂交。在图8B所示的示例中，将具有结合对的一个成员46的引物(例如，接头52”、48”)添加到管中的文库片段50”中，然后使即用测序核酸片段44'与固体支持物42结合。在另一个示例中，固体支持物42可具有经由结合对(例如，支持物42上的抗生物素蛋白以及附接到引物的生物素)与其附接的引物。这些引物与附接到文库片段50”的接头52”杂交(因此引物和结合对成员位于片段的一端而非另一端)。在另一个示例中，可使用链置换酶进行延伸。这将产生完全双链的文库(例如，没有叉或Y-接头，如图8B所示)。可经由变性将即用测序核酸片段44'释放到流通池上。
图8C示出了络合物40C的示例，其包括水凝胶支持物54以及包含在水凝胶支持物54内的即用测序核酸片段44”。
为了形成该络合物40C，在存在样品(例如，遗传物质)的情况下将含有水凝胶单体和/或聚合物和交联剂的流体混合。可将该流体加载到矿物油或另一种合适的疏水流体中，并且乳化以产生液滴。可添加自由基引发剂，以使水凝胶单体和/或聚合物聚合和/或交联并形成水凝胶支持物54。
当形成络合物40C时，流体可以是水；单体可选自由以下项组成的组：丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基二丙烯酸酯、乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯、胶原单体以及它们的组合；并且/或者聚合物可选自由以下项组成的组：聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇(例如，具有在约100至约200,000范围内的重均分子量)、聚环氧丙烷、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚己内酯、聚(乙烯基磺酸)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原聚合物以及它们的组合。交联剂在水凝胶支持物54的聚合物中形成键，例如二硫键。交联剂可以是可逆的，因为其可以是交联的和非交联的，这取决于其所暴露的化学物质。例如，可逆交联剂为包含二硫键的双丙烯酰胺交联剂，其可以用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三-(3-羟丙基)膦(THP)分解。在一个示例中，交联剂选自由以下项组成的组：丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、双丙烯酰胺、1,4-二丙烯酰基哌嗪、N-N'-二烯丙基L-酒石酸二酰胺和N-N'-(1,2-二羟基乙烯)-双丙烯酰胺。在一个示例中，自由基引发剂可为光引发剂。光引发剂的示例包括偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰、伊红-5-异硫氰酸酯。可使用这种类型的自由基引发剂，因为它只有在暴露于适当波长的光时才会引发交联。在另一个示例中，自由基引发剂在暴露于自由基源时可引发交联。这种类型的自由基引发剂的示例为四甲基乙二胺(TEMED)。
样品被封装在水凝胶支持物54内，因为其尺寸足以使其不能穿过水凝胶支持物54的孔。在一些示例中，样品是DNA或RNA，并且长度为至少约100个核苷酸(例如，1,000个核苷酸或更多、10,000个核苷酸或更多、500,000个核苷酸或更多等)。在一些示例中，水凝胶支持物54的孔径是指基于多个孔的测定结果，孔的截面的平均直径或平均有效直径。非圆形横截面的有效直径等于具有与非圆形横截面相同的横截面积的圆形横截面的直径。在一个示例中，孔径在约10nm至约100nm的范围内。
文库制备然后可以在水凝胶支持物54内进行。多个试剂交换可通过水凝胶支持物54的孔发生。将样品和由其产生的任何文库片段保持在水凝胶基质内。文库制备可涉及片段化样品和添加将产生即用测序片段44”的接头。
在一个示例中，文库制备可经由在水凝胶支持物54内发生的标记来进行。所得的络合物40C在图8C中示出。接头序列包括用于扩增和测序的合适接头，因此所得的片段44”是即用测序的。又如，文库制备可使用聚合酶延伸进行，这会产生双链文库。该示例性文库需要在从水凝胶支持物54释放并接种之前变性。
涉及络合物的方法
本文所公开的方法的一些示例利用本文所公开的流通池10、10'、10”的示例以及络合物40A、40B或40C中的任一种。如上所述，络合物40A、40B或40C中的每一种包括从遗传物质的同一样品获得的即用测序片段。当络合物中的一种或几种在通道20或室38、38'内分离时，实现来自同一样品的文库的空间共定位。
在示例性方法中，例如通过一个或多个输入端口将络合物40A、40B或40C引入流通池10、10'、10”中。可将络合物40A、40B或40C引入流体(诸如Tris-HCl缓冲液或0.5x柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液)中。来自流体的至少一些络合物40A、40B或40C将沉降到通道20和/或室38、38'中的至少一些中。当使用流通池10时，络合物40A、40B或40C的带负电的即用测序片段44、44'、44”可被吸引到通道20中的带正电的聚合物水凝胶14。当使用流通池10'或10”时，带正电的聚合物水凝胶14被限定在凹入部32中。在这些示例的一些示例中，络合物40A、40B或40C可部分地由于通道20或室38、38'的深度而沉降并保留在通道20或室38、38'中。在这些示例的一些其他示例中，通道20或室38、38'可包括络合物40A、40B或40C附着的捕获位点。
应当理解，一些络合物40A、40B或40C可能不沉降，并且将在进一步处理之前从流通池10、10'、10”中移除这些络合物40A、40B或40C。还应当理解，一些通道20或室38、38'可接收络合物40A、40B或40C中的一种或多种，而其他通道20或室38、38'可不接收络合物40A、40B或40C。络合物40A、40B或40C分布在不包括捕获位点时可以是随机的，或者在包括捕获位点时可以是更可控的。
然后该示例性方法包括从流通池10、10'、10”中洗去未捕集的络合物40A、40B或40C。洗涤可涉及将流体引入流通池10、10'、10”中。该流动可推动尚未沉降的任何络合物40A、40B或40C通过流通池10、10'、10”的出口。
然后该方法的该示例包括引起捕集的络合物40A、40B或40C的载体(例如，固体支持物42或水凝胶支持物54)将即用测序核酸片段44、44'或44”释放到其中捕集有每种络合物40A、40B或40C的相应通道20或室38、38'中。
使载体(即，支持物42或54)释放即用测序核酸片段44、44'或44”可根据所用的络合物40A、40B或40C而有所不同。在一个示例中，载体是固体支持物42，并且该引起过程涉及将裂解剂引入流通池10、10'、10”。裂解剂可引发即用测序核酸片段44、44'从固体支持物42中化学、酶促或光化学释放。在这些示例中，另一种刺激(诸如热或光)可触发裂解剂从固体支持物42释放文库片段44或44'。例如，可引入游离的生物素作为裂解剂，并且加热至约92℃可用于诱导生物素-寡核苷酸从固体支持物42释放。
在其他示例中，使用络合物40C，因此载体为水凝胶支持物54。在这些其他示例中，引起文库释放可涉及加热流通池10、10'、10”，将裂解剂引入流通池10、10'、10”，或它们的组合。加热以从水凝胶支持物54释放文库片段44”可涉及加热至约90℃的温度。可加热整个流通池10、10'、10”，并且当络合物40C受热时，水凝胶支持物54可降解以释放片段44”。在一些示例中，裂解剂可包括一种或多种组分，这些组分可以使水凝胶支持物54解聚并从其中释放出即用测序片段44”。例如，裂解剂包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羟丙基)膦(THP)。在其他示例中，裂解剂为光。在这些示例中，用于形成水凝胶支持物54的交联剂可包括可光解部分，并且络合物40C暴露于适当波长的光可以裂解该部分并降解水凝胶支持物54。
即用测序核酸片段44、44'或44”的转运和接种部分地受阳离子聚合物水凝胶14的正电荷控制。即用测序核酸片段44、44'、44”是带负电的，因此被吸引到带正电的聚合物水凝胶14。因此，任何特定络合物40A、40B或40C的片段44、44'或44”将被限定在特定络合物40A、40B或40C被限定的通道20或室38、38'中。
除了阳离子聚合物水凝胶14的吸引力之外，通道20或室38、38'的深度也可限制即用测序核酸片段44、44'或44”的转运和接种，因此不会将外部固定剂引入流通池10、10'、10”中。
利用本文所公开的流通池10、10'、10”，阳离子聚合物水凝胶14可以在即用测序核酸片段44、44'或44”释放后立即吸引这些片段，这使得扩增引物18能够以相对限定的方式接种释放的即用测序核酸片段44、44'或44”。在一个示例中，接种通过片段44、44'或44”的第一序列或第二序列与引物18中的互补引物之间的杂交来完成。接种可在片段44、44'或44”和引物18的合适杂交温度下进行。
然后可以使用任何合适的方法(诸如簇生成)来扩增接种的测序文库。
在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3'延伸从杂交引物18复制即用测序核酸片段44、44'或44”。使原始的即用测序核酸片段44、44'或44”变性，从而使这些拷贝固定在通道20或凹入部32内。等温桥扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物18杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物18杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过特异性碱基裂解移除反义链，留下正向模板多核苷酸链。应当理解，成簇使得在每个通道20或凹入部32中形成多个模板即用测序核酸片段。
在簇生成后，阳离子部分16可从阳离子聚合物水凝胶14裂解。因此，流通池表面的电荷可被认为是可逆的。阳离子部分16的裂解可在阳离子部分16是可裂解的或经由可裂解连接基28、28'附接(例如，包括可裂解二硫键或可光解键或可裂解核苷酸键)时进行。阳离子部分16的裂解可通过光裂解、通过暴露于酸性条件(例如，如果连接基是酸不稳定的)或通过酶促裂解(例如，如果双官能DNA寡核苷酸用作连接基28、28'以附接阳离子部分16)来实现。阳离子部分16的裂解可以逆转流通池表面的电荷，这部分是因为附接到聚合物水凝胶14的模板即用测序核酸片段是带负电的。
在簇生成之后(并且在一些情况下，在阳离子部分16裂解之后)，可进行测序。本文所公开的流通池10、10'、10”的任何示例可用于多种测序方法或技术中，包括通常被称为合成测序(SBS)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等的技术。
例如，合成测序(SBS)反应可在诸如HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NOVASEQTM、NEXTSEQDXTM、ISEQTM、NEXTSEQTM或得自Illumina(加利福尼亚州圣地亚哥)的其他测序机系统上运行。在SBS中，监测测序引物沿模板即用测序核酸片段的延伸，以确定模板中核苷酸的序列。可阻断模板和任何流通池结合的引物18(未附接到拷贝)的3'端，以防止干扰测序反应，并且具体地，防止不期望的引发。基础化学过程可以是聚合(例如，由聚合酶催化)或连接(例如，由连接酶催化)。在特定基于聚合酶的SBS过程中，以模板依赖性方式将荧光标记的核苷酸添加到测序引物中，使得可以使用对添加到测序引物中的核苷酸的顺序和类型的检测来确定模板的序列。例如，为了引发第一SBS循环，可将一种或多种标记的核苷酸、DNA聚合酶等递送到流通池10中/通过该流通池等，在该流通池中，测序引物延伸引起标记的核苷酸被掺入。这种掺入可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统(未示出)可向流通池10、10'、10”提供激发光。
在一些示例中，荧光标记的核苷酸可以进一步包括可逆终止属性，一旦将核苷酸添加到模板中，该属性就会终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到模板中，使得随后的延伸直到递送解封闭剂以除去该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的示例，可以将解封闭剂递送到流通池等(在检测发生之后)。
洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可以重复SBS循环n次以将模板延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。
虽然已经详细描述了SBS，但应当理解，本文所述的流通池10、10'、10”可与其他测序方案一起用于基因分型，或用于其他化学和/或生物应用中。
其他流通池应用
虽然已经详细描述了测序，但应当理解，本文所述的流通池10、10'、10”可以用在需要带正电的表面的其他应用中。例如，带正电的聚合物水凝胶14可适用于从被引入流通池10、10'、10”的裂解物中提取DNA。例如，可将细胞引入通道20或室38、38'中，然后可引入裂解缓冲液。可将从细胞释放的DNA吸引到带正电的表面。外部固定剂(例如，油、空气)可或可不用于进一步帮助容纳提取的DNA。
又如，带正电的聚合物水凝胶14可用于在某些pH条件下排斥蛋白质，从而防止不需要的蛋白质在表面结合。在这些示例中，带正电的聚合物水凝胶14可或可不具有与其附接的扩增引物18。
本文所述的流通池10、10'、10”可用于需要可逆带电表面的其他应用中。可逆带电表面在阳离子部分16附接时可以是带正电的，而在阳离子部分16从其中裂解时可以是带负电的。带正电的表面可有助于吸引DNA，而带负电的表面可以有助于洗脱。带负电的表面对于将带正电的细胞(例如，细菌)牵拉到流通池表面也可能是期望的。
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供该实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
非限制性工作实施例
利用具有两个通道的玻璃基底来制备实施例流通池通道和比较例流通池通道。对两个通道均进行硅烷化，并且将PAZAM沉积在其上。然后，将P5和P7引物接枝到通道中的PAZAM。使用UV可固化粘合剂将盖粘结到基底，以流体隔离两个通道。
在60℃下将三(羟丙基)-膦(50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9)中的100mM THP)引入实施例通道中约2分钟。另一个(比较)通道不用混合物处理。
该实施例中使用的络合物包括固体支持物以及通过抗生物素蛋白-生物素连接基附接到固体支持物的即用测序核酸片段。络合物的文库片段类似于图8B中所示的那些。遵循TRUSEQTM平台(Illumina Inc.)方案在管中制备无PCR文库。通过与P7引物(其经由生物素附接到珠)杂交使文库与珠结合。将文库用Sytox绿染色。
通过使含有络合物(在杂交缓冲液中为200μL)的杂交缓冲液流过每个通道，将络合物引入实施例和比较例流通池通道。通过从络合物中释放文库片段来引发接种。通过将流通池加热至P7引物的解链温度以上来引发文库释放。使片段杂交并进行第一链延伸。用0.2M NaOH溶液去除固体支持物和未杂交片段。然后使用桥扩增进行成簇。
拍摄成簇之后实施例和比较例通道的显微照片，并且为了清楚起见，倒置原始着色。如图9A所示，未用三(羟丙基)-膦处理的比较通道在整个表面上具有相对均匀的文库接种。这可通过倒置显微照片中展开的较暗斑点来证实。图9B是比较流通池通道上络合物的文库释放的示意图。该图示描绘了通道的宽度，并且比例尺表示2D流通池内表面的视野的实际尺寸。如图9B的图示所示，文库片段转运和接种不受限制。
相比之下，如图10A所示，实施例通道(其用三(羟丙基)-膦处理)具有集中的DNA文库区域。这可通过倒置显微照片中集中的较暗斑点来证实。图10B是实施例流通池通道上络合物的文库释放的示意图。该图示描绘了通道的宽度，并且比例尺表示2D流通池内表面的视野的实际尺寸。如图10B所示，文库片段转运和接种受到限制，因为带负电的文库片段被吸引到带正电的流通池表面。这些结果说明，经三(羟丙基)膦处理的表面带正电，因此能够在DNA文库片段从络合物释放时吸引这些片段。
附加说明
此外，应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同它们被明确列举一样。例如，由约2mm至约300mm表示的范围应当解释为不仅包括明确列举的限值约2mm至约300mm，而且还包括单个值诸如约15mm、22.5mm、245mm等，以及子范围诸如约20mm至约225mm等。
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可修改所公开的示例。因此，上述说明应被认为是非限制性的。
Claims (23)
1.一种流通池，包括：
基底；
所述基底上的阳离子聚合物水凝胶，所述阳离子聚合物水凝胶包括阳离子部分，所述阳离子部分i)整合到初始聚合物水凝胶的单体单元中，或ii)通过连接基附接到所述初始聚合物水凝胶的所述单体单元；以及
附接到所述阳离子聚合物水凝胶的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的流通池，其中：
所述单体单元为N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺；
所述阳离子部分为鏻阳离子；并且
所述鏻阳离子置换所述N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺的溴。
3.根据权利要求2所述的流通池，其中所述鏻阳离子选自由以下项组成的组：三(羟甲基)鏻阳离子、三(羟丙基)鏻阳离子、四(羟甲基)鏻阳离子和三(2-羧乙基)鏻阳离子。
4.根据权利要求1所述的流通池，其中：
i)所述单体单元包括末端叠氮基团，并且所述连接基包括炔烃基团；或者
ii)所述单体单元包括末端炔烃基团，并且所述连接基包括叠氮基团。
5.根据权利要求4所述的流通池，其中所述阳离子部分包括质子化胺基团、锍离子、季铵阳离子或它们的组合。
6.根据权利要求4所述的流通池，其中：
所述单体单元为N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺；并且
所述阳离子部分为N,N,N-三甲基乙醇铵阳离子。
7.根据权利要求4所述的流通池，其中所述连接基还包括可裂解二硫键、可光解键、可裂解磷酸二酯键或它们的组合。
8.根据权利要求1所述的流通池，其中：
所述单体单元为N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺；
所述连接基包括末端炔烃基团和末端溴；并且
所述阳离子部分为置换所述末端溴的鏻阳离子。
9.根据权利要求1所述的流通池，其中所述基底包括被空隙区域隔开的多个凹入部，并且其中所述阳离子聚合物水凝胶位于所述凹入部中的每一个内。
10.根据权利要求9所述的流通池，其中所述基底还包括多个室，并且其中所述多个凹入部的子集位于所述多个室中的每一个的周界内。
11.一种方法，包括：
将包括可带正电的部分的流体引入流通池，所述流通池包括：
初始聚合物水凝胶，所述初始聚合物水凝胶具有选自由可带负电的原子、叠氮基团和炔烃基团组成的组的表面部分；以及
附接到所述初始聚合物水凝胶的扩增引物；以及
在一定温度下将所述初始聚合物水凝胶在所述流体中温育一段时间，从而形成包括阳离子部分的阳离子聚合物水凝胶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可带正电的部分置换所述初始聚合物水凝胶的所述可带负电的原子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中：
所述表面部分为所述可带负电的原子；
所述可带负电的原子为溴；并且
所述可带正电的部分选自由以下项组成的组：三(羟甲基)膦、三(羟丙基)膦、四(羟甲基)膦和三(2-羧乙基)膦。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述流体还包括pH在6至12范围内的缓冲液。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述温度在约18℃至约65℃的范围内，并且所述时间在约1.5分钟至约5分钟的范围内。
16.根据权利要求11所述的方法，其中：
所述表面部分为叠氮基团或炔烃基团；并且
所述可带正电的部分通过连接基共价附接到所述表面部分。
17.根据权利要求16所述的方法，其中：
所述表面部分为叠氮基团；
所述连接基为炔烃基团；并且
所述阳离子部分包括质子化胺基团、锍离子、季铵阳离子或它们的组合。
18.根据权利要求16所述的方法，其中：
所述表面部分为炔烃基团；
所述连接基为叠氮基团；并且
所述阳离子部分包括质子化胺基团、锍离子、季铵阳离子或它们的组合。
19.根据权利要求16所述的方法，其中化合物包括附接到所述连接基的所述可带正电的部分，并且其中所述化合物为炔丙基溴化胆碱。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述流体包括水。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述温度在约18℃至约60℃的范围内，并且所述时间在约30分钟至约12小时的范围内。
22.根据权利要求16所述的方法，还包括将催化剂、配体和还原剂与所述流体一起添加到所述流通池中。
23.一种试剂盒，包括：
流通池，所述流通池包括：
基底；
初始聚合物水凝胶，所述初始聚合物水凝胶位于所述基底上并且具有选自由可带负电的原子、叠氮基团和炔烃基团组成的组的表面部分；以及
附接到所述初始聚合物水凝胶的扩增引物；以及
包括可带正电的部分的流体，所述可带正电的部分将与所述表面部分相互作用或反应以形成包括阳离子部分的阳离子聚合物水凝胶。
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