JP4262921B2 - リズムを有する発現をもたらすＰｅｒｉｏｄ１プロモーターが導入されたトランスジェニック哺乳動物 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institute of Health）から授与された助成金第MH 56647号の下で、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現（rhythmical expression）を誘導する、単離されたPeriod 1（Per1）プロモーターDNAに関する。また、本発明は、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子であって、本プロモーターDNAの制御下にある遺伝子を含むDNA構築物にも関する。本発明はさらに、本構築物が導入されたトランスジェニック哺乳動物にも関する。本トランスジェニック哺乳動物は、概日リズムが関与する疾患および障害に対する医薬品をスクリーニングするために有用である。
【０００３】
背景技術
近年、細菌および哺乳動物などの多様な生物において概日リズムの基礎をなす分子機構に関する情報が急速に増大しているが、多細胞生物における概日系の構成に関する極めて重要な疑問には未だに回答が得られていない。一方、これらの疑問に答えるために用いることができる新たな重要なツールが得られるようになった（A. J. Millar、S. R. Short、N. H. Chua、S. A. Kay、Plant Cell、1992、4、1075；T. Kondoら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1993、90、5672；J. D. Plauts、M. Kaneko、J. C. Hall、S. Kay、Science、1997、278、1632）。
【０００４】
視交叉上核（SCN）は哺乳動物における主要な概日ペースメーカであるが、概日振動のために必要な分子機構は、驚くほど多数の末梢組織にも含まれていると考えられ（U. Albrecht、Z. S. Sun、G. Eichele、C. C. Lee、Cell、1997、91、1055；D. P. Kingら、Cell、1997、89、641；L. P. Shearman、M. J. Zylka、D. R. Weaver、L. F. Kolakowski Jr.、S. M. Reppert、Neuron、1997、19、1261；H. Teiら、Nature、1997、389、512；N. Koikeら、FEBS letters、1998、441、427；Y. MiyamotoおよびA. Sancar、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1998、95、6097；M. J. Zylka、L. P. Shearman、D. R. Weaver、S. M. Reppert、Neuron、1998、20、1103）、幾つかの場合では、SCNがなくてもこれらの脊椎動物組織が概日振動を発現することが示されている（R. V. Andrews、Gegenbauers Morph. Jahrb. Leipzing、1971、117、89；G. TosiniおよびM. Menaker、Science、1996、272、419；A. Balsalobre、F. Damiola、U. Schibler、Cell、1998、93、929；D. Whitmore、N. S. Foulkes、U. Strahle、P. Sassone-Corsi、Nat Neurosci、1998、1、701）。しかし、多組織系における振動の間の詳細な関係は未だに不明である。
【０００５】
発明の開示
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNAを提供することを目的とする。また、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子であって、本プロモーターDNAの制御下にある遺伝子を含むDNA構築物、および本DNA構築物の用途も提供する。さらに、本構築物が導入されたトランスジェニック哺乳動物およびその用途を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者らは、哺乳動物の概日系が階層的に構成されており、SCN内の自律性概日振動子（self-sustained circadian oscillator）が末梢の減衰性概日振動子を同調させることによって、多数の顕在的リズムの間で、複雑な位相関係が生じる（その存在は、以下に示唆されており、正常機能にとってほぼ確実に重要である（F. Halberg、Cold Spring Harbor Symposia in Quantitative Biology、1960、25、289；M. C. Moore-EdeおよびF. M. Sulzman、行動神経生物学ハンドブック4．生物リズム（Handbook of Behavioral Neurobiology 4. Biological Rhythms）、J. Aschoff編（Plenum Press、New York、1981）、pp. 215〜241、第12章））と仮説を立てた。この仮説から導き出される予想には、1）SCN（速い）と移動行動などの概日出力指標（遅い）の間に位相変位率の差があること；および2）末梢組織において減衰性概日振動子が存在することが含まれるが、これらに限定されることはない。
【０００７】
これらの予想を検証するために、本発明者らは、マウスPer1プロモーターの制御下でルシフェラーゼをリズムを有するように発現するトランスジェニックラットおよびマウスの系統を作製し、それらを用いて哺乳動物の概日系の構成を検討した。これらのラットおよびマウスの培養視交叉上核（SCN）からの発光は、一貫して確固たるリズムを呈した。光周期変位に続いて、SCNからの概日リズムの発光は、移動行動におけるリズムの発光よりも速く追随した。ラットの肝臓、肺、および骨格筋も概日リズムを発現し、これはインビトロでは2〜7回の周期の後に減衰した。これらの観察所見により、SCN内の自律性概日振動子が末梢の減衰性概日振動子を同調させて順応性のある位相制御を維持していることが示唆される。
【０００８】
本発明で提示するデータは、光周期変位に反応して、SCN内の中枢の概日振動子が、それらによって調節されることが知られる少なくとも1つのリズムを有する行動よりも速く変位することを示している。このことは、同調された正常状態において、概日系の特徴である同調性を明らかに乱すものであり、「時差ぼけ(jet lag)」および交代制勤務に伴う障害の原因である可能性がある。いくつかの末梢組織に減衰性概日振動子が存在することと併せて考えると、この位相変位の結果は本発明者らの仮説を支持する。
【０００９】
中枢の概日ペースメーカが速く変位することは理論的考察から予想され、ショウジョウバエおよび齧歯類では間接的に示されている（C. S. Pittendrigh、「季節性生殖周期における生物時計（Biological Clocks in Seasonal Reproductive Cycles）」、B. K. FollettおよびD. E. Follett編、John Wright and Sons Ltd、Bristol、1981、pp.1〜35；M. U. Gillete、「視交叉上核―心の時計（Suprachiasmatic Nucleus. Mind's Clock）」、D. C. Klein、R. Y. Moore、S. M. Reppert編、Oxford University Press、New York、1991、第6章；M. Takamure、N. Murakami、K. Takahashi、H. Kuroda、T. Etoh. Phsiol. Behav.、1991、50、443；J. D. Best、E. S. Maywood、K. L. Smith、M. H. Hastings、J. Neurosci.、1999、19、828）。本発明で提示するデータは、SCN内の概日性自己調節フィードバックループの主要な構成分子であるPer1の発現が、同調性光周期のいずれの方向への大きな位相変位にも速く追従することを直接的に示している。本発明のトランスジェニック哺乳動物により、光周期の大きな位相変位の後の末梢性振動の位相変位軌道を観察することが可能になる。末梢組織および中枢のペースメーカにおける軌道の間または移動活動との間の関連も、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いて調べることができる。さらに、SCNならびに末梢組織における概日振動の検出が可能なこれらのトランスジェニック哺乳動物を用いて、多くの組織における概日振動子を調節する新規な刺激、遺伝子、因子および試薬をスクリーニングすることもできる。
【００１０】
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNAを提供することを目的とする。また、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子であって、本プロモーターDNAの制御下にある遺伝子を含むDNA構築物、および本DNA構築物の用途も提供する。本発明はまた、本構築物を有する宿主細胞、およびその用途も提供する。さらに、本発明は、本構築物が導入されたトランスジェニック哺乳動物も提供する。本トランスジェニック哺乳動物は、概日リズムが関与する疾患および障害に対する医薬品をスクリーニングするために有用である。
【００１１】
具体的には、本発明は以下のものに関する：
（１）プロモーターが、哺乳動物の体内で機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNA；
（２）プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、上記(1)記載の単離Period 1プロモーターDNA；
（３）齧歯類がマウスである、上記(2)記載の単離Period 1プロモーターDNA；
（４）哺乳動物が齧歯類である、上記(1)記載の単離Period 1プロモーターDNA；
（５）Period 1プロモーターおよび該プロモーターと機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、該遺伝子が哺乳動物の体内で該プロモーターの制御下でリズムを有するように発現される、組換えDNA；
（６）Period 1プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、上記(5)記載の組換えDNA；
（７）Period 1プロモーターがマウスPeriod 1プロモーターである、上記(5)記載の組換えDNA；
（８）遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、上記(5)記載の組換えDNA；
（９）哺乳動物が齧歯類である、上記(5)記載の組換えDNA；
（１０）遺伝子がPeriod 1プロモーターDNAの制御下でリズムを有するように発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１１）遺伝子がレポーター遺伝子である、上記(10)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１２）レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、上記(11)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１３）哺乳動物が齧歯類である、上記(10)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１４）齧歯類がマウスおよびラットからなる群より選択される、上記(13)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１５）Period 1プロモーターがマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターである、上記(10)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１６）上記(10)記載の哺乳動物の子孫；
（１７）上記(1)〜(9)のいずれか一項に記載のDNAを含む形質転換体；
（１８）形質転換体が上記(10)〜(16)のいずれか一項に記載の哺乳動物に由来する、上記(17)記載の形質転換体；
（１９）上記(17)記載の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）該形質転換体を該化合物で処理する段階；および
（b）処理した形質転換体における該導入遺伝子の発現を測定する段階
を含む方法；
（２０）上記(10)記載の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）該哺乳動物を該化合物で処理する段階；および
（b）処理した哺乳動物における該導入遺伝子の発現を測定する段階
を含む方法。
【００１２】
以下に本発明をさらに詳細に例示する。本明細書で引用するすべての文献は参照として組み入れられる。
【００１３】
1 ．本発明の DNA
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNAを提供する。
【００１４】
本明細書において「リズムを有する発現（rhythmical expression）」とは、概日リズムに従って遺伝子の発現レベルが変動する、概日リズムに基づく周期的発現を意味する。
【００１５】
具体的には、本発明は以下の「P-1」〜「P-4」に記載のDNAを提供する。
「P-1」：プロモーターが哺乳動物の体内で機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNA。
「P-2」：前記プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、「P-1」に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
「P-3」：前記齧歯類がマウスである、「P-2」に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
「P-4」：前記哺乳動物が齧歯類である、「P-1」に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
【００１６】
本明細書において「単離DNA」とは、DNAがその天然の環境から分離されたことを意味する。単離DNAの5'および3'隣接領域はその本来の状態から切り離されているか、またはそれらの配列は本来の配列とは異なっている。単離DNAは精製されたものであってもよく、他のDNA成分を含む不純なものであってもよい。本発明の単離DNAには以下のものが含まれる：プラスミド、ファージ、および他のベクター中に挿入されたDNA断片；PCRによって増幅されたDNA産物；ならびに合成DNA。単離DNAをその本来の位置（例えば、染色体上）に戻す場合にも、それは依然として「単離DNA」であるとみなされる。
【００１７】
本発明は、本プロモーターと機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導することを特徴とする、単離Period 1プロモーターDNAを提供する。本明細書において「Period 1プロモーター」とは、転写調節活性を有しており、哺乳動物Period 1（Per1）遺伝子プロモーターに由来するDNAのことを意味する。Period 1プロモーターの例には、例えば、ヒト（Hida, A.ら、Genomics、2000、65、224〜233；アクセッション番号AB030817）、サルおよび他の霊長類に由来するもののほか、マウス（Hida, A.ら、Genomics、2000、65、224〜233；アクセッション番号AB030818）およびラットを含む齧歯類に由来するものがある。
【００１８】
Period 1プロモーターは、例えば、マウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターDNAなどをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによってゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、哺乳動物ゲノムDNAから単離することができる。代替的な方法としては、Period 1遺伝子のコード領域の部分断片（例えば、cDNA断片）をプローブとして用いてゲノムライブラリーをスクリーニングし、その5'隣接領域を単離することができる。ハイブリダイゼーションを用いる以外に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって哺乳動物ゲノムDNAからPeriod 1プロモーターを直接的に増幅することもできる。
【００１９】
本明細書で用いる「プロモーター」とは、翻訳開始部位の上流領域を意味し、発現調節領域全体が含まれる。
【００２０】
本発明のDNAを、ホスホアミダイト法または亜リン酸トリエステル法などの、核酸の化学合成を利用した標準的な方法によって製造することもできる。
【００２１】
本発明のPeriod 1プロモーターは、機能的に連結した遺伝子をリズムを有するように発現させることが可能な限り、野生型Period 1プロモーターを含むDNAの全体であっても一部であってもよい。例えば、本発明のPeriod 1プロモーターは、内因性Period 1遺伝子の翻訳開始コドンの上流にある2.0Kbまたはそれ以上、好ましくは5.2kbまたはそれ以上、より好ましくは5.7kbまたはそれ以上、最も好ましくは6.2kbまたはそれ以上の断片を含みうる。機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導することを特徴とする本発明のDNAは、上記のDNAよりも短いDNAであってもよい。
【００２２】
好ましくは、本発明のDNAは1つまたは複数のE-ボックス（E-box）を含む。E-ボックス（CACGTG）は、CLOCK-BMAL1複合体の結合部位である（Gekakis, N.ら、Science、1998、280、1564〜1569）。本発明のDNAは、好ましくは3つまたはそれ以上のE-ボックスを含み、より好ましくは4つまたはそれ以上、最も好ましくは5つまたはそれ以上のE-ボックスを含む。本発明のDNAは、内因性Period 1遺伝子に含まれる他の転写調節配列を含んでもよい。このような転写調節配列には一般に、cAMP応答配列（CRE）、SP1ボックス、CAATボックス、CTF／NF-1結合部位などが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明のDNAの1つの好ましい態様では、少なくとも3つまたはそれ以上、より好ましくは4つまたはそれ以上、さらにより好ましくは好ましくは5つまたはそれ以上のE-ボックスを含む、内因性ゲノムDNAスパン（ゲノムDNAの連続断片）を含むDNAである。
【００２３】
本発明のプロモーターDNAには、転写活性が維持される限り、エンハンサーまたは他の機能配列を含むものが含まれる。本発明のDNAは、内因性Period 1プロモーター転写開始部位の少なくとも1つ含むことが好ましい。転写開始部位は例えば、5'-RACEによって得られたcDNA配列を解析することによって解明することができる。プライマー伸長を行い、その結果得られた産物をシークエンシングゲル（例えば、6％ポリアクリルアミドおよび8M尿素ゲル）を用いて分離することにより、これらの部位を決定することも可能である。
【００２４】
本発明のDNAは、好ましくは内因性Period 1遺伝子の第1エクソンを含む。本発明のDNAは、好ましくは内因性Period 1遺伝子の第1イントロンも含みうる。Period 1遺伝子の第1イントロンは、Period 1遺伝子の発現の調節に関与している可能性がある。本発明のDNAは、好ましくは、内因性Period 1遺伝子の第2エクソンに含まれると考えられる5'非翻訳領域（UTR）全体またはその一部を含んでもよい。エクソンに含まれる5'-UTRおよび／またはイントロンは、遺伝子の発現の調節に関与する配列を含みうる。本発明のDNAは、好ましくは内因性Period 1遺伝子の翻訳開始コドンを含んでもよい。本発明のDNAは、Period 1遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）全体またはその一部を含んでもよい。
【００２５】
また、本発明のDNAは、好ましくは、哺乳動物Period 1遺伝子の上流領域で同定される保存されたセグメントを少なくともいずれか1つ含んでもよい。保存されたセグメントは一般に、2つまたはそれ以上のPeriod 1上流領域を比較することによって有意に保存された領域として特定されうる。保存されたセグメントは通常、ドットプロット解析、またはコンピュータアルゴリズムを用いる整列化によって抽出することが可能である。ヒトおよびマウスのPeriod 1遺伝子のゲノム構造は、ヒダ（Hida, A.）ら（Genomics、2000、65、224〜233；参照として本明細書に組み入れられる）に詳細に記載されている。前記の通り、ヒトおよびマウスのPeriod 1遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれアクセッション番号AB030817およびAB030818により開示されている。他の哺乳動物Period 1遺伝子の構造は、上記の参考文献に従って決定および整列化することができる。本発明のDNAの具体例の一つは、ヒダ（Hida, A.）ら（Genomics、2000、65、224〜233）においてI、II、III、IV、VおよびVIと特定された内因性哺乳動物Period 1遺伝子の保存されたセグメントを少なくとも1つ、好ましくは2つまたはそれ以上、より好ましくは3つまたはそれ以上、さらにより好ましくは4つ〜6つ（全部）含むDNAである。
【００２６】
本発明のDNAに含まれるマウス由来のPeriod 1プロモーターDNAを含むDNA構築物を配列番号：1に例示する。この配列では、マウスPeriod 1に由来する領域は23〜6787位のヌクレオチドである。本発明のDNAには、この領域または類似領域を含むDNAが含まれる。このDNAは、マウスPeriod 1遺伝子の上流領域のうち、5つの内因性E-box領域、転写開始部位、第1イントロンによって隔てられた第1エクソンおよび第2エクソン、ならびに第2エクソン内における翻訳開始コドンを有する。この領域に対応するヒトPeriod 1配列は、アクセッション番号AB030817に開示したヒトPeriod 1遺伝子配列の1〜6573位のヌクレオチドである。本発明のDNAは、ヒトPeriod 1のこの領域または類似領域の配列を含むDNAであってもよい。また、他の哺乳動物Period 1配列の相同領域を用いることも可能である。
【００２７】
真核生物の遺伝子配列では、多型を呈する場合がある。このような多型によって、遺伝子の本質的な機能または遺伝子の発現に影響を及ぼすことなく、1つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、および／または挿入されうる。一般にプロモーター活性は、仮に1つまたは複数のヌクレオチドが改変されたとしても維持されることが多い。したがって、本発明のDNAには、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する特性が維持される限り、上に例示したマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーター配列と比べて改変されたヌクレオチド配列を有するDNAも含まれる。
【００２８】
Period 1プロモーター配列は、適宜人工的に改変することができる。本発明のDNAは、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導し、且つ内因性Period 1プロモーター配列の1つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入および／または付加されたヌクレオチド配列を含むDNAを含む。内因性プロモーター配列の改変は当業者には日常的に行われている。例えば、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するのに必須ではないヌクレオチドまたは配列は欠失または置換してもよい。さらに、リズムを有する発現の調節に関与しうる、E-ボックスなどのDNA配列を挿入または付加してもよい。Period 1プロモーター配列を他のプロモーター配列と組み合わせて、異種プロモーター、融合プロモーター、またはキメラプロモーターを作製してもよい。組み合わせる他のプロモーターに制限はない。このようにして改変されたプロモーターも、本発明の「Period 1プロモーター」に含まれる。
【００２９】
また、本発明のDNAには、配列番号：1の23〜6787位のヌクレオチドからの配列を含むDNAとハイブリダイズするDNAを含むDNAであって、それと機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導しうるDNAも含まれる。ハイブリダイゼーション条件は適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションは例えば、6×SSPE、5×デンハルト液、0.5％SDS、100μg／ml変性サケ精子DNA、および50％ホルムアミドを含む混合液中で、通常は42℃、より低いストリンジェンシーでは32℃、またはより高いストリンジェンシーでは65℃で行うことができる。
【００３０】
本発明のDNAがリズムを有するように発現されるか否かは、DNAの下流に機能的に連結した遺伝子が、概日リズムを有する哺乳動物の体内の細胞内に配置された場合に、概日リズムに従ってリズムを有するように発現されうるか否かを検出することによって確認することができる。例えば、本発明のDNAが導入された細胞を有する哺乳動物において、そのDNAの発現を経時的に検出する。または、体内の細胞を取り出して、発現を観察してもよい。一例を挙げると、本発明のDNAを含む細胞または組織を体内に含む哺乳動物を、通常の光周期（例えば、LD 12：12）の下で一定期間（例えば、1週間）またはそれ以上にわたって飼育する。続いて、その細胞または組織を取り出し、そのDNA発現を、細胞または組織を取り出した直後から定期的に検出する。検出は例えば、恒暗（DD）下で行う。これらの検出により、下流遺伝子のリズムを有する発現が対象となるDNAによって誘導されることが示されれば、そのDNAがリズムを有する発現を誘導するということができる。検出に用いる哺乳動物に特に制限はないが、齧歯類が適している。より具体的には、マウスまたはラットを用いる。例えば、通常のウィスターラットまたはC57／B6マウスがある。本発明のDNAによって誘導されたリズムを有する発現は、概日リズムに従った発現の変動によって検証することができる。至適条件下では、本発明のDNAは恒暗（DD）条件下でも下流遺伝子のリズムを有する発現を少なくとも1サイクル（1日）またはそれ以上、好ましくは2サイクル（2日）またはそれ以上、より好ましくは3サイクル（3日）またはそれ以上、さらにより好ましくは4サイクル（4日）またはそれ以上（例えば、1〜2週間またはそれ以上）誘導する。リズムを有する発現の持続性はアッセイ条件および組織によって変わる可能性がある。
【００３１】
本発明のDNAはベクターDNA中に含まれていてもよい。また、これは中間体としてRNAの形態をとってもよい。例えば、本発明のDNA（またはRNA）は、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、YACおよびBACを含む人工染色体、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）を含むウイルス、または転位因子などの中に含まれていてもよい。必要に応じて、本発明のDNAに選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を連結してもよい。
【００３２】
要約すると、本発明のDNAは、哺乳動物の体内で、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するのに有用である。本発明のDNAは、哺乳動物の体内で、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導することを特徴とする、単離Period 1プロモーターDNAである。さらに本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するための、本発明の上記DNAの使用に関する。本発明はまた、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を検出するための、本発明の上記DNAの使用にも関する。
【００３３】
本発明は、Period 1プロモーターおよびその下流に機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、その遺伝子が哺乳動物の体内で前記Period 1プロモーターの制御下でリズムを有するように発現されるような組換えDNAを提供する。このような遺伝子には、本発明の上記のPeriod 1プロモーターDNAの下流に遺伝子が機能的に連結したものが含まれる。具体的には、以下の「G-1」〜「G-4」に記載のDNAが本発明に含まれる。
「G-1」：Period 1プロモーターおよびそれと機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、前記遺伝子が哺乳動物の体内で前記プロモーターの制御下でリズムを有するように発現される、組換えDNA。
「G-2」：前記Period 1プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、「G-1」に記載の組換えDNA。
「G-3」：前記Period 1プロモーターがマウスPeriod 1プロモーターである、「G-1」に記載の組換えDNA。
「G-4」：前記遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、「G-1」に記載の組換えDNA。
「G-5」：前記哺乳動物が齧歯類である、「G-1」に記載の組換えDNA。
【００３４】
本明細書において「組換えDNA」とは、天然の状態とは異なる様式で連結しているものをいう。「組換えDNA」は遺伝子工学によって作製されうる。単離DNAを含むDNAも「組換えDNA」に含まれる。
【００３５】
本明細書で「機能的に連結した」とは、遺伝子がプロモーターの制御下で発現されるような様式で連結していることを意味する。本発明のDNAの場合には、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子が、そのプロモーターの調節下でリズムを有するように発現される。このようなリズムを有する発現は一般的には、概日リズムを有する哺乳動物の体内の細胞に本DNAを導入した際に起こる。プロモーターと、そのプロモーターによって発現が制御される遺伝子との間には、プロモーターによって誘導される遺伝子のリズムを有する発現に影響を及ぼさない限り、任意の長さのヌクレオチド配列を挿入することができる。プロモーターによって発現が制御される遺伝子は、好ましくはプロモーターの下流、より好ましくはそのすぐ下流に位置する。
【００３６】
連結される遺伝子に特に制限はなく、任意の遺伝子を用いることができる。例えば、遺伝子が、構造蛋白質、マーカー蛋白質、酵素、受容体、チャンネル、膜蛋白質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、リガンド、または他の生理活性因子などの、所望の蛋白質をコードしてもよい。本発明のDNAは1つまたは複数の遺伝子を含みうる。遺伝子は天然遺伝子であってもよく、人工的に改変または構築された遺伝子であってもよい。連結した遺伝子を含む本発明のDNAを、概日リズムを有する多細胞生物の体内の細胞内に配置することにより、所望の遺伝子を概日リズムに従ってリズムを有するように発現させることができる。本発明の1つの好ましい態様では、レポーター遺伝子をPeriod 1プロモーターの下流に連結させる。このようなDNAは、インビボまたは組織中での概日リズムを検出するのに有用である。
【００３７】
使用するレポーター遺伝子には、その発現が検出可能である限り制限はない。レポーター遺伝子の発現は、転写物、翻訳産物、または翻訳産物の活性もしくは機能を検出することによって直接的または間接的に検出することができる。レポーター遺伝子として、公知の任意のレポーター遺伝子を使用することができる。その例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β-D-グルクロニダーゼ遺伝子、β-D-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子などがある。本発明では、レポーター遺伝子としては、細胞に浸潤を与えずにその発現を検出することが可能であるものが好ましい。レポーター遺伝子としては、その発現を高感度に検出でき、且つ発現の時間的パターンの区別が容易になる程度に発現産物の代謝回転が速いものが好ましい。好適なものの例として、ルシフェラーゼ遺伝子がある。ルシフェラーゼアッセイ法により、生細胞、組織、器官、さらには個体における遺伝子の発現を実時間で検出することができる。
【００３８】
上記のPeriod 1プロモーターDNAの任意のものを、遺伝子と連結されるPeriod 1プロモーターDNAとして使用することができる。遺伝子がリズムを有するように発現される限り、野生型Period 1プロモーターまたはその部分断片を使用することができる。本発明のDNAに含まれるマウス由来のPeriod 1プロモーターを含むレポーター遺伝子構築物を配列番号：1に例示する。この配列では、マウスPeriod 1に由来する領域は23〜6787位のヌクレオチドに由来する。マウス由来のPeriod 1プロモーターDNAを使用する他に、上記のヒトまたは他の哺乳動物のPeriod 1由来のDNAをPeriod 1プロモーターDNAとして使用することもできる。Period 1プロモーターDNAは改変配列を含んでもよい。Period 1遺伝子由来のプロモーターDNAがPeriod 1蛋白質をコードするORFまたはその一部を含む場合には、Period 1プロモーターDNAの下流に連結される遺伝子をこのORFとインフレーム形式で連結させ、融合蛋白質として発現させることができる。または、遺伝子を独立して発現させてもよい。
【００３９】
Period 1プロモーターDNAと連結した遺伝子を含むDNAにおいて、DNAに含まれる遺伝子は、概日リズムを有する哺乳動物の体内の細胞内で概日リズムに従ってリズムを有するように発現される。遺伝子がリズムを有するように発現されるか否かは、前記の通り、哺乳動物の体内または体外で遺伝子の発現を定期的に検出することによって確認することができる。
【００４０】
遺伝子を含む本発明のDNAは、ベクターDNA中に含まれていてもよい。また、これは中間体としてRNAの形態をとってもよい。例えば、本発明のDNA（またはRNA）は、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、YACおよびBACを含む人工染色体、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）を含むウイルス、または転位因子などの中に含まれていてもよい。必要に応じて、本発明のDNAに選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を連結してもよい。
【００４１】
要約すると、遺伝子を含む本発明の組換えDNAは、哺乳動物の体内で遺伝子のリズムを有する発現を誘導するのに有用である。本発明のDNAは、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、その遺伝子が哺乳動物の体内でPeriod 1プロモーターの制御下でリズムを有するように発現されるような組換えDNAに関する。本DNAは、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するためのPeriod 1プロモーターDNA構築物であってもよい。本発明は、遺伝子を含む本発明の上記のDNAを、遺伝子のリズムを有する発現の誘導に使用することに関する。また、本発明は、遺伝子を含む本発明の上記のDNAを、遺伝子のリズムを有する発現の検出に使用することにも関する。
【００４２】
2 ．本発明の DNA を有する形質転換体
本発明は、本発明のDNAを有する形質転換体を提供する。使用する形質転換体はそれが本発明のDNAを含む限りは制限はなく、その例には細胞、組織、器官、および個体などが含まれる。本発明のDNAを有する限り、形質転換体には、細菌、酵母、哺乳動物、植物、昆虫などの原核生物および真核生物が含まれる。1つの好ましい態様において、本発明のDNAは、概日リズムを有する多細胞真核生物に由来する細胞を宿主として使用する。より好ましくは、宿主として哺乳動物細胞が使用される。哺乳動物の例には、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどが含まれるが、これらには限定されることはない。本発明のDNAを有する哺乳動物細胞は、哺乳動物の体内に移植された際に、このDNAを概日リズムに従ってリズムを有するように発現しうる。本発明に用いる宿主細胞の形態に制限はない。これは浮遊細胞などの遊離形態であってもよく、組織または器官を形成するものであってもよい。これは個体であってもよい。宿主細胞には受精卵、初期胚、胚性幹（ES）細胞なども含まれる。これらの細胞は、後述のトランスジェニック哺乳動物の作製に有用である。トランスジェニック哺乳動物に由来する組織または細胞も本発明の形質転換体に含まれる。これらの組織または細胞としては、初代培養物、その継代培養物、または樹立細胞系が可能である。トランスジェニック哺乳動物自体も形質転換体に含まれる。
【００４３】
本発明のDNAを宿主細胞に導入するためには、公知のトランスフェクション法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、電気穿孔法、リポフェクション法、微量注入(microinjection)法などを用いて、DNAを哺乳動物細胞に導入することができる。ウイルスを介した感染によってDNAを導入してもよい。宿主細胞は本発明のDNAを一過的に有するものであっても安定的に有するものであってもよい。好ましくは、本発明のDNAは宿主細胞の染色体に組み込まれている。宿主細胞は本発明のDNAの1つまたは複数のコピーを有しうる。レポーターアッセイ法においてより強い発現が得られるため、組み込まれるコピー数は多数であることが好ましいと考えられる。例えば、本発明の形質転換細胞は、本発明のDNAを二倍体ゲノム当たり、約3つまたはそれ以上、好ましくは約4つまたはそれ以上、より好ましくは約5つまたはそれ以上のコピー数で含んでもよい。コピー数は、本発明のDNAをプローブとして使用したサザンブロット解析によって評価することができる。
【００４４】
3 ．トランスジェニック哺乳動物
本発明は、Period 1プロモーターの制御下で遺伝子がリズムを有するように発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００４５】
具体的には、以下の「Tg-1」〜「Tg-7」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
「Tg-1」：上記「P-1」〜「P-4」のいずれか1つに記載のPeriod 1プロモーターDNAの制御下で遺伝子がリズムを有するように発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-2」：前記遺伝子がレポーター遺伝子である、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-3」：前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-4」：前記哺乳動物が齧歯類である、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-5」：前記齧歯類がマウスおよびラットからなる群より選択される、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-6」：前記Period 1プロモーターがマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターである、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-7」：「Tg-1」に記載の哺乳動物の子孫。
【００４６】
以下の哺乳動物も上記のトランスジェニック哺乳動物に含まれる。
「Tg-8」：導入遺伝子が前記Period 1プロモーターの制御下でリズムを有するように発現される、上記の「G-1」〜「G-5」のいずれか1つに記載のDNAを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-9」：前記遺伝子がレポーター遺伝子である、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-10」：前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-11」：前記哺乳動物が齧歯類である、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-12」：前記齧歯類がマウスおよびラットからなる群より選択される、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-13」：前記Period 1プロモーターがマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターである、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-14」：「Tg-8」に記載の哺乳動物の子孫。
【００４７】
このようなトランスジェニック哺乳動物は、上記の本発明のDNAを導入することによって作製することができる。本発明のトランスジェニック哺乳動物において、導入された遺伝子は構成的にリズムを有する発現を示してもよく、または通常は発現されないが、発現を誘導した後のみにリズムを有するように発現されてもよい。この発現は例えば、外的刺激または環境変化によって誘発するものであってもよい。このような発現系は、例えば、Cre-loxP系を用いることによって実施することができる。または、別の誘導性プロモーターとのキメラプロモーターの使用も想定される。発現は全身性であってもよく、細胞、組織または器官に特異的であってもよい。
【００４８】
トランスジェニック哺乳動物は公知の方法に従って作製することができ、用いる方法に特に制限はない。例えば、受精卵を採取し、注入ピペットを用いる微量注入法によって卵の雄性前核に遺伝子を注入する。または、本発明のDNAを胚性幹（ES）細胞に導入し、選択したES細胞を微量注入によって受精卵（胚盤胞）に注入する。卵管に卵を戻す動物を用意し（偽妊娠雌など）、各個体に約10〜15個の卵を移植する。
【００４９】
初代（子孫）への導入遺伝子の導入は、尾の先端からゲノムDNAを抽出し、サザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によって導入遺伝子を検出することによって確認する。導入遺伝子の発現は、導入遺伝子に応じた適切な方法によって検出することができる。導入遺伝子の転写物はノーザンハイブリダイゼーションまたはRT-PCR法によって検出することができる。蛋白質に対して特異的な抗体を用いるウエスタンブロット法による検出も可能である。異種トランスジェニック哺乳動物は、生殖系列に遺伝子が導入されたキメラ動物と正常動物を交配することによって得られる。同型トランスジェニック哺乳動物は、異種トランスジェニック哺乳動物を互いに交配することによって得られる。本発明のトランスジェニック哺乳動物には、これらの子孫も含まれる。
【００５０】
本発明の非ヒト哺乳動物には、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯類のほか、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、およびウシなどがある。本発明の動物としては齧歯類が好ましく、特にマウスまたはラットが好ましい。
【００５１】
実施例には、Period 1プロモーターの下流に連結したレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むDNAが導入されたトランスジェニックマウスおよびラットを記載している。ルシフェラーゼをレポーターとして発現する本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いることにより、所望の組織におけるルシフェラーゼ活性を検出することによって、転写の経時的変化を実時間で検出することが可能である。トランスジェニック齧歯類の培養視交叉上核（SCN）からの発光は一貫して確固たるリズムを呈した。注目されるのは、ラットSCN培養物からのリズムがインビトロで最大32日間続いたことである。これらの結果から、本発明のDNAがそれ自体で概日リズムに従った遺伝子の発現を十分に誘導しうることが直接的に証明された。
【００５２】
驚くべきことに、レポーター遺伝子の発現の概日振動は、検討したすべての末梢組織で明瞭に観察された。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、好ましくは、導入遺伝子が末梢組織中でリズムを有するように発現されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。末梢組織には、肝臓、肺、および骨格筋が含まれるが、これらに限定されることはない。これらの末梢組織は、SCNリズムとは7〜12時間の位相遅延がある光出力の概日リズムを示した。末梢組織での発現がSCNに対して遅延したパターンを示したことは、多器官から構成される複雑な哺乳動物の生物リズムの正常な協調性を反映したものと考えられる。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、末梢組織における概日リズムの検出にも有用である。
【００５３】
具体的には、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、Period 1の機能および発現制御を調べるため、概日リズムと関係のある時差ぼけまたは睡眠障害の機序を解明するため、ならびに概日リズム障害の治療に有用な化合物のスクリーニングおよび試験を目的として用いる哺乳動物モデルを開発するために有用である。
【００５４】
4 ．アッセイ法およびスクリーニング
レポーター遺伝子を発現する本発明のDNAを含む形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用いて、種々の試験またはスクリーニングを行うことができる。さまざまな任意の条件下でこれらの組織または細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を調節する刺激もしくは化合物の効果を評価すること、またはこれらをスクリーニングすることが可能である。刺激には温度、光、運動、および他のショックが含まれる。使用する化合物に制限はない。本発明は特に、本発明の形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物に導入されたPeriod 1プロモーターによって誘導される発現を改変する化合物を、その形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用いて試験またはスクリーニングする方法に関する。
【００５５】
本発明の試験またはスクリーニングの方法としては、以下の「M-1」および「M-2」に記載の方法が挙げられる。
「M-1」：本発明の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）前記形質転換体を前記化合物で処理する段階；および
（b）処理した形質転換体における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
「M-2」：本発明の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）前記哺乳動物を前記化合物で処理する段階；および
（b）処理した哺乳動物における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
【００５６】
本発明の方法は、Period 1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングするために有用である。本方法はまた、概日リズム障害に対する医薬品をスクリーニングするためにも有用である。特に、以下に挙げるスクリーニング法が本発明によって可能となる。
【００５７】
概日リズム睡眠障害の治療に有用な医薬品の試験またはスクリーニングの方法であって、
（a）本発明の形質転換体またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその医薬品で処置する段階；および
（b）処置した形質転換体または哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
【００５８】
本発明の試験またはスクリーニングの方法に使用する化合物に特に制限はない。その例には、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成性の低分子化合物、天然または合成性の高分子化合物、組織または細胞の抽出物、微生物の培養上清、植物または海洋生物に由来する天然成分などが含まれるが、これらに限定されることはない。遺伝子ライブラリーまたはcDNA発現ライブラリーなどの発現産物を使用してもよい。化合物による処置の方法に特に制限はない。インビトロでの処置は、例えば化合物を培養液に添加して細胞を化合物と接触させたり、微量注入またはトランスフェクション試薬を用いて化合物を細胞内に導入することなどにより実施しうる。インビボでの治療の方法には、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または腹腔内注射；経口投与、経腸投与、筋肉内投与、または鼻腔内投与；眼への投与；注射もしくはカテーテルを介した脳内投与、脳室内投与、または末梢器官内投与などの、当業者に公知の方法が含まれる。化合物は適宜組成物として投与する。例えば、それを水、生理食塩水、緩衝液、塩、安定剤、保存剤、懸濁剤などと混合することができる。
【００５９】
レポーター遺伝子の発現は、哺乳動物または細胞が生きたまま測定することもでき、細胞を可溶化した後に測定することもできる。例えば、生組織におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定するために、実施例に示すように光電子増倍管により、または本明細書に参照として組み入れられるヤマザキ（Yamazaki, S.）ら（Science、2000、288、682〜685）に記載された他の類似の検出器により、生物発光を連続的に測定することが可能である。可溶化した組織または細胞におけるルシフェラーゼ活性は、例えば、ルシフェラーゼレポーター二重アッセイ系（Dual-Luciferase Reporter Assay System）（Promega）などを使用して測定することができる。レポーター遺伝子の発現は、時間的または空間的に測定することができる。発現リズムの位相、振幅、および／または周期を検出することによって発現を分析することもできる。本発明の方法により、化合物の即時的または長期的な効果（位相変化を含む）の評価が可能となる。化合物の投与によってこれらの発現が改変されれば、その化合物はPeriod 1遺伝子の発現を調節する薬剤候補となる。このような化合物は、睡眠障害を含むさまざまな概日リズム障害に対する医薬品として適用されることが期待される。例えば、レポーター遺伝子の発現の振動をリセットまたは開始する薬剤は、ペースメーカの位相を後退または前進させると期待される。したがって、これらの薬剤は脱同調した発現パターンを正常な同調に導くために使用することができる。本発明によってスクリーニングされる医薬品は、薬剤の治療効果を評価するために、概日リズム障害モデルとなるように誘導した本発明のトランスジェニック哺乳動物に投与される。
【００６０】
トランスジェニック哺乳動物における遺伝子の発現を検出する場合、測定する器官に特に制限はなく、これには視床下部のSCNを含む中枢神経系（CNS）および末梢神経系（PNS）、ならびに肝臓、肺、および骨格筋を非制限的に含む他の末梢組織が含まれる。本発明で開示する系は、SCNおよび末梢組織におけるPeriod 1発現の位相関係および同調機構を評価するために有用である。
【００６１】
本発明の系は、Period 1の発現を調節すると推定される多くの因子を同定するために使用されうる。概日リズムと関係のある新規なインビボ因子および遺伝子が本発明の系を用いて同定されれば、これらの因子および遺伝子の発現のインビボでの振動を評価することができる。それにより、SCNおよび末梢組織の振動位相を制御する因子を単離することが可能である。これらは概日リズムに関与する新規な遺伝子および蛋白質であると考えられ、これらを標的として用いることにより、新規薬剤のスクリーニングが可能になると考えられる。このようなスクリーニングはインビボおよびインビトロのどちらでも行える。
【００６２】
具体的には、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いるインビボでのスクリーニング方法は以下の段階を含む：
（a）概日リズムが既に決定されているトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与する段階；
（b）トランスジェニック哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出し、発現リズムを検証する段階；
（c）化合物の投与後のレポーター遺伝子の発現リズムを投与前のものと比較する段階；および
（d）発現リズムの位相、周期、または振幅を改変する化合物を選択する段階。
【００６３】
レポーター遺伝子の発現リズムは、生きた動物の体内でのレポーター遺伝子の発現リズムを検出する方法；切り出した組織を培養することによって発現の変動を連続的に観察する方法；または動物組織の抽出物を定期的に調製して、各時点での発現レベルを検出する方法によって検出可能である。例えば、適した方法（例えば、静脈内注射、腹腔内投与、脳室内投与など）により、適切なタイミングでトランスジェニック動物にルシフェリンを投与する。続いてこの動物を麻酔し、CCDカメラによってルシフェラーゼ発光を計測することにより、レポーター遺伝子の発現部位および発現レベルを決定する。個々の動物の発現リズムを確認するために、この測定を数時間毎に数回ずつ行う（Sweeney TJら、「生きた動物における腫瘍細胞クリアランスの可視化（Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals）」、PNAS、1999、96、12044〜12049；およびContag PRら、「生きた哺乳動物における生物発光標識（Bioluminescent indicators in living mammals）」、Nature Medicine、1998、4、245〜247を参照のこと）。
【００６４】
前記の通り、インビトロでも本発明を用いて新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。このようなインビトロスクリーニング法は以下の段階を含む：
（a）本発明の形質転換体、または本発明のトランスジェニック哺乳動物に由来する組織もしくは細胞を培養する段階；
（b）形質転換体または組織もしくは細胞を適切な期間にわたって化合物で処理し、さらに培養を続ける段階；
（c）レポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出する段階；および
（d）（b）の処理後にレポーター遺伝子の発現リズム（位相、周期、および振幅）を改変する化合物を選択する段階。
【００６５】
本明細書において、本発明のトランスジェニック哺乳動物に由来する組織または細胞は、初代培養物または樹立細胞系の細胞であってもよい。本明細書で用いる組織、細胞などに制限はないが、SCN、視床下辺縁細胞、末梢神経などが好ましい。化合物による処理は、例えば、化合物を添加しておいた溶媒中に組織、細胞などを一定期間、浸漬することによって行ってもよい。レポーター遺伝子の発現リズムの変化を測定する場合には、発現リズムがあらかじめ決定された同一の組織もしくは細胞、または化合物による処理を受けていない対照組織または細胞を用いた比較を行ってもよい。
【００６６】
上記のインビボおよびインビトロのスクリーニング方法において、光刺激などの刺激処理を、化合物の投与または処理とともに行ってもよい。
【００６７】
本発明の試験またはスクリーニングの方法により同定された化合物は、所望の概日リズム疾患または障害に対する医薬品として用いることができる。これらの薬剤は、適宜薬学的に許容される担体、溶質、および溶媒と組み合わせることによって医薬組成物として製剤化することができる。本薬剤は、時差症候群、交代制勤務による睡眠障害、睡眠相後退症候群、および不規則性睡眠覚醒障害などの疾患または障害に対して適用することができる。
【００６８】
本発明のスクリーニング法によって単離された化合物を医薬品として用いる場合には、それを患者に直接的に投与することもでき、またはそれを公知の医薬品製剤法によって医薬組成物の形態に製剤化することもできる。例えば、それを薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせた後に投与することができる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、吸入液などの形態でありうる。化合物の含有量は適宜決定してよい。これらは例えば、通常は動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または経口投与によって患者に投与することができ、このような方法は当業者に公知である。投与量は患者の体重、年齢、投与方法、および症状により変動するが、当業者であれば投与量を適宜選択することができる。一般に、投与量は薬剤の有効血中濃度および代謝時間により異なるが、1日当たりの維持用量は約0.001mg／kg〜1g／kg、好ましくは0.01mg／kg〜100mg／kg、より好ましくは0.1mg／kg〜10mg／kgであると考えられる。投与は1日当たり1回から複数回であってもよい。化合物がDNAによってコードされうる場合には、遺伝子治療を行うためにDNAを遺伝子治療用ベクターに組み入れることが可能である。
【００６９】
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例を参照することによって本発明を例示するが、これはそれを制限するものとみなされるべきではない。
【００７０】
実施例 1 ：トランスジェニックラットの作製
本発明者らは、マウスPer1遺伝子プロモーターがルシフェラーゼレポーターと連結している、新規のトランスジェニックラットモデルを作製した（図1A）。
【００７１】
6.7kbのマウスPer1ゲノム断片を、SV40後期遺伝子のポリアデニル化配列に隣接したホタルルシフェラーゼcDNAの第2コドンと直接的に連結させた。このmPer1断片は、5つの機能性E-box領域、転写開始部位、第1イントロンによって隔てられた第1エクソンおよび第2エクソン、ならびに第2エクソン内の翻訳開始コドンを含む（図1A）。予想された通り、レポーター遺伝子は一過的同時トランスフェクションアッセイ法においてClockおよびBmal1の協同作用によって誘導され、Cry1またはCry2のいずれかによって抑制された（A. Hidaら、データは示していない；Genomics、2000、65、224〜233を参照のこと）。直鎖状にしたレポーター断片を、ウィスターラット（Charles River Japan Inc.）の302個の受精卵に微量注入した（S. Hoshi、T. Ninomiya、M. Homma、A. Yuki、Anim. Biotechnol.、1990、1、175）。トランスジェニックラットをPCRによって同定し、導入遺伝子のコピー数をサザン解析によって決定した。60匹の離乳仔のスクリーニングによって6匹のトランスジェニックラット（雄5匹と雌1匹）を得た。この6匹の初代ラット(founder rat)はすべて正常に発育したが、これらのうち2匹はそれぞれ不妊またはモザイク性であった。4つのトランスジェニック系統の脳抽出物におけるルシフェラーゼ活性は、レポーター遺伝子のコピー数に概ね比例した。SCN内でルシフェラーゼ活性の概日性振動を示した1つのトランスジェニック系統（W(perl)1と命名）を選択し、以降の検討に使用した。W(perl)1には約12コピー／ゲノムの導入遺伝子が組み込まれており、脳内ルシフェラーゼ活性は1431相対発光単位（Turner Designs）／mg蛋白質であった。
【００７２】
雄性Per1-lucラットおよび雄性野生型対照の双方に関して、恒暗条件下でのホイール走行活動期間を測定した。トランスジェニックラット（8〜10週齢で測定）での期間は24.43±0.02時間（SEM、n=20）であった。これは6〜8週齢時に測定した野生型哺乳動物での期間（24.33±0.01時間、n=26）と極めて近く、このことは導入遺伝子が分子的な概日性時間の保持を破壊しないことを示している。
【００７３】
実施例 2 ：ラット組織の調製
得られたPer1-lucラットを明：暗（LD）12：12周期下で飼育し、いくつかの発光性組織を恒暗および恒温（36℃）条件下で培養した。SCN、骨格筋、肝臓、および肺の外植片を静的条件下（すなわち、培地を交換しない）で培養した。消灯の30〜60分前に、トランスジェニックラットをハロタンで麻酔した上で断頭術を施行した。脳を摘出し、冷ハンクス緩衝生理食塩水中に置いた。ビブロスライサー（Vibroslicer）を用いて作製したトランスジェニックラット脳の400μm厚の冠状断切片からSCN対を外植し、培養用膜（Millicell-CM、PICM030-50；Millipore）の上に載せた。膜および外植片をペトリ皿に入れてガラス板で覆い、シリコングリースで密封した。SCNは、1.2mlの培養液（無血清、低炭酸水素ナトリウム、フェノールレッド非添加のダルベッコ変法イーグル培地（13000-021、GIBCO BRL））に、10mM HEPES（pH 7.2）、B27（2％；17504-010、GIBCO BRL）、0.1mMルシフェリン（甲虫ルシフェリン、カリウム塩、Promega）、および抗生物質（25U／mlペニシリン、25μg／mlストレプトマイシン）を添加した35mmペトリ皿の中で培養した（M. E. Geuszら、Current Biology、1997、7、758）。筋肉、肝臓および肺を一対のメスを用いて解体し、約1mm厚および1〜2mm四方の切片とした上で、ミリセル（Millicell）膜を用いない点を除き、上記と同様に培養した。培養は恒暗および恒温（36±0.2℃）条件下で行い、個々の培養物からの光出力をハママツ（Hamamatsu）光電子増倍管検出装置を用いて連続測定した。生物発光は、HC135-01を改造した光電子増倍管（PMT）検出装置（HC135-11MOD Hamamatsu）を用いて測定した。PMT（R3550）は暗カウント数が室温で1秒当たり20カウント未満のものを特に選択し、プレ倍率を2倍に落とした。装置および培養物は遮光性の水ジャケット付きインキュベーター中に36℃で保ち、連続データ収集のためにIBM PC型コンピュータと接続した。PMTを培養物の約2cm上に配置し、カバーグラスを介して光子カウント数を計測し、1分間にわたり積算した。PMTからの暗カウント（非特異的カウント）数は36℃で1秒当たり約20〜40であった（M. E. Geuszら、Current Biology、1997、7、758）。
【００７４】
実施例 3 ：トランスジェニックマウスの作製
上記のトランスジェニックラット系統の作製と同様の方法を用いて、マウスPer1プロモーターの制御下でルシフェラーゼがリズムを有するように発現される、トランスジェニックマウス系統を作製した。
【００７５】
6.7kbのマウスPer1ゲノム断片を、SV40後期遺伝子のポリアデニル化配列に隣接したホタルルシフェラーゼcDNAの第2コドンと直接的に連結させた。このmPer1断片は、5つの機能性E-box領域、転写開始部位、第1イントロンによって隔てられた第1エクソンおよび第2エクソン、ならびに第2エクソン内の翻訳開始コドンを含む。予想された通り、このレポーター遺伝子は一過的同時トランスフェクションアッセイ法においてClockおよびBmal1の協同作用によって誘導され、Cry1またはCry2のいずれかによって抑制された。直鎖状にしたレポーター断片を、C57／B6マウスの63個の受精卵に微量注入した。トランスジェニックマウスをPCRによって同定し、導入遺伝子のコピー数をサザン解析によって決定した。8匹の離乳仔のスクリーニングによって1つのトランスジェニックマウス系統を得た。このトランスジェニックマウス（L1と命名）は正常に発育し、SCN内でルシフェラーゼ活性の概日性振動を示した。L1には約6コピー／ゲノムの導入遺伝子が組み込まれており、脳内ルシフェラーゼ活性は552相対発光単位（Turner Designs）／mg蛋白質であった。
【００７６】
実施例 4 ：ラット SCN の調製
消灯の30〜60分前に、トランスジェニックマウスをハロタンで麻酔した上で断頭術を施行した。脳を摘出し、冷ハンクス緩衝生理食塩水中に置いた。ビブロスライサー（Vibroslicer）を用いて作製した400μm厚の冠状断切片からSCN対を外植し、培養用膜（Millicell-CM、PICM030-50；Millipore）の上に載せた。膜および外植片をペトリ皿に入れてガラス板で覆い、シリコングリースで密封した。SCNは、1.2mlの培養液（無血清、低炭酸水素ナトリウム、フェノールレッド非添加のダルベッコ変法イーグル培地（13000-021、GIBCO BRL））に10mM HEPES（pH 7.2）、B27（2％；17504-010、GIBCO BRL）、0.1mMルシフェリン（甲虫ルシフェリン、カリウム塩、Promega）、および抗生物質（25U／mlペニシリン、25μg／mlストレプトマイシン））を添加した35mmペトリ皿の中で培養した。生物発光はHC135-01を改造した光電子増倍管（PMT）検出装置（HC135-11MOD Hamamatsu）を用いて測定した。装置および培養物は遮光性の水ジャケット付きインキュベーター中に36℃で保ち、連続データ収集のためにIBM PC型コンピュータと接続した。
【００７７】
実施例 5 ： SCN および末梢のリズムの検出
SCNからの発光は一貫して確固たるリズムを示し（N=48）、このことから、組換えmPer1-luc導入遺伝子が正常な概日性機構の制御下でリズムを有するように転写されることが示された。注目されるのは、SCNリズムが静的培養下で最大32日間続いたことである（図1B）。消灯3時間前または9時間前に屠殺した動物から得た予備データ（示していない）により、これらの屠殺時点はSCNリズムの位相に影響しないことが示されている。肝臓、肺、および骨格筋はいずれも、SCNリズムとは7〜12時間の位相遅延がある光出力の概日リズムを示した。SCNと末梢組織との間のこの位相差はインビボで観察された位相遅延と類似している（M. J. Zylkaら、Neuron、1998、20、1106）。重要な点は、これらのリズムがSCNから記録されたものほど確固としておらず、培養下で2〜6サイクル後には常に減衰したことである（図2）。
【００７８】
実施例 6 ：位相前進および位相後退の影響
光周期を6時間ずつ前進または後退させたが、これは各方向への高速大西洋横断飛行と概ね同様の処理である。位相前進は点灯を早めることによって行い、位相後退は消灯を遅らせることによって行った。
【００７９】
異種接合トランスジェニックラットを明：暗（LD）12：12周期下で飼育した。母体および仔を屠殺時まで群飼した。母体および仔を含むケージを光制御した箱に移し、明暗サイクルを6時間ずつ前進または後退させた。ケージの底面から約35cm上に配置した40W蛍光灯（F40CW／RS／EW、Philips）から照射した。光強度は30〜60μW／cm２であり、これはケージレベルでは約100〜200ルクスに相当する。屠殺時点で哺乳動物は15〜41日齢であった。雄性および雌性ラットの両方を用いたが、性差は認められなかった。
【００８０】
光周期の位相変位から1サイクル後または6サイクル後に哺乳動物を屠殺し、位相変位の程度を評価するためにSCNを培養した。すべての哺乳動物でSCN内のリズムは急速かつ明瞭に位相変位を呈し、光周期をいずれの方向に変位させた後にもほぼ完全に1サイクル分変位した。この変位から6サイクル後には、SCNリズムは光周期との定常的な関係を完全に再び取り戻した。光周期変位はSCNの周期性振幅に対して認めうる影響を及ぼさなかった（図3および図4）。
【００８１】
実施例 7 ：無傷ラットにおける位相前進および位相後退の影響
本発明者らは無傷ラットにも同一の位相変位パラダイムを適用し、光周期変位の前後で移動活動リズムを記録した。
【００８２】
雄性異種接合トランスジェニックラットを離乳させ、4週齢の時点で個々のホイール走行ケージに移した。それらを以前に与えていたものと同じ明：暗条件下で飼育した。移して2日後に哺乳動物をペントバルビタールナトリウムで麻酔し、腹膜腔に無線送信機（VM-FH、MiniMitter）を移植した。一般的活動はデータ探索系（Data Quest system）（Data Science Intl.）を用いて観測した。照明条件は組織培養実験に用いたものと同一とした。2週間同調させた後、明：暗サイクルを前進または後退させた。
【００８３】
ほとんどの行動的または生理的な概日リズムと同じように、これらの光周期変位に対するラットの活動リズムの反応は即時的ではなく、非対称性であった。新たな位相への同調は光周期の後退後の方が前進後よりも早く起こった。図5に示したトランスジェニックラットの一般的活動の記録でもこれが認められた。行動の周期性は、同一の処理を行った哺乳動物から切り出した培養SCNから測定された周期性とは明らかに異なって変位した。
【００８４】
実施例 8 ：トランスジェニックマウス由来の SCN のリズムの検出
SCNからの発光は一貫して確固たるリズムを呈し、このことから、組換えmPer1-luc導入遺伝子が正常な概日性機構による制御下でリズムを有するように転写されることが示された（図6）。
【００８５】
産業上の利用可能性
本発明は、所望の遺伝子を概日リズムに従ってリズムを有するように発現するDNAを提供する。また、本発明は、所望の遺伝子を概日リズムに従ってリズムを有するように発現するトランスジェニック哺乳動物も提供する。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、中枢神経系および末梢組織における概日振動を観測するために用いることができる。
【００８６】
複数の時間帯にまたがる高速移動、および勤務時間の急激な変化はいずれも、位相が変位した光（および他の環境）周期にSCNを曝露されることで、ヒトの概日系に対する入力信号に突然の大きな変化を引き起こす。上記の実施例で用いた位相変位パラダイムは、西から東（位相前進）および東から西（位相後退）への高速大西洋横断飛行と類似している。
【００８７】
多細胞生物では、概日振動子は、環境周期と関連して生物体の活動を調節する生物時計として働き、内的な時間的枠組みを提供する多組織系へと組織化されると考えられる。哺乳動物は比較的サイズが大きく、複数の器官が体内で協調して働いている。本発明では、これらの末梢組織の振動位相にSCNのものと比べて遅延が認められた。概日性機構を特徴づける多くのリズム間の位相関係に順応性があるならば、そのような位相関係を破壊すると有害な結果を招くと考えられる。これこそが、子午線をまたぐ高速移動による疲労感や、さらに重大なことに米国の労働人口の20％以上が行っている交代制勤務スケジュールによる疲労感の一般的な説明である可能性が高い（米国議会技術評価局（U.S. Congress, Office of Technology Assessment）、「生物リズム：労働者への影響（Biological Rhythms：Implications for the Worker）」、OTA-BA-463（U.S. Government Printing Office、Washington、DC、1991）。
【００８８】
本発明により、中枢のペースメーカであるSCNに加えて、脳内領域および末梢神経系、または末梢器官および組織における振動の関係を解析することが可能となる。本発明のDNAまたはトランスジェニック哺乳動物は、時差症候群、交代制勤務による睡眠障害、睡眠相後退症候群、および不規則性睡眠覚醒障害などの、概日リズムが関与する障害を治療するための化合物をスクリーニングするために有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1（A）は、マウスPer1-luc導入遺伝子の概略図を示す。太線はmPer1断片を示し、白抜きバーと斜線入りボックスはそれぞれルシフェラーゼ遺伝子およびポリアデニル化断片の位置を示す。丸印はE-ボックスを表す。図1（B）は、Per1-lucトランスジェニックラットから外植した培養SCNからの生物発光の代表的な概日リズムを示す。黒と白のバーは動物に対するそれ以前の明：暗条件を示す。外植は消灯直前（矢印）に行い、発光を直ちに観測した。主観的昼の中央部をピークとする約24時間のリズムがインビトロで32日間続き、その時点で培養物をアッセイから取り出した。2週間以上にわたって維持したいくつかのSCN培養物では、その期間を通じて周期性が持続した。Per1-lucトランスジェニックラットの別の系統である「W(perl)5」ではこれよりも強度の低い同様の周期性が認められた。この系統でも、SCNリズムは主観的昼の中央部にピークがあり、インビトロで28日間持続した。
【図２】 同一の動物「W(perl)1」に由来するいくつかの組織からインビトロで示された概日リズムを示す。同じ動物に由来する種々の組織は、異なる位相関係を有する概日リズムを発現している。組織は消灯直前（矢印）に外植した。SCNは主観的昼の中央部にピークのある明瞭な概日リズムを示したが、骨格筋、肝臓および肺からのリズムはすべて主観的夜の中央部前後にピークがあった。筋肉、肝臓、および肺におけるリズムは、常に2〜6サイクル後には減衰した。
【図３】 位相前進性および位相後退性の光周期におけるSCN振動子の再同調を示す。インビボでの明：暗の履歴により、培養SCNにおける概日性Per1-luc発現の位相が決定される。位相変位のない動物（対照）、前進した動物、および後退した動物から採取したSCN由来の生物発光を当初の明暗サイクルに対してプロットした（0は位相変位前に点灯した時点である）。その当初の光周期を延長したものを図の下部に示す。x軸は「カウント／分」であるが、わかりやすいように軌跡を垂直方向に移動させている。
【図４】 SCNにおける光周期の6時間の後退および前進後の急速な再同調を示す。位相変位のない対照のSCN概日リズム、および光周期を6時間前進（+）または後退（-）させた後の動物のSCNリズムの平均ピーク時間を示す。培養物における最初のピークをピーク時間の決定に用い、これは各サイクルにおける最高点での時間を検出することによって行った。位相変位から1回目（○）および6回目（●）の全サイクルでの平均ピーク時間を示す（バーは±SEMを示す）。各丸印の脇に動物数を示す。消灯3時間前または9時間前に屠殺した哺乳動物から得た予備データ（示していない）により、これらの屠殺時点がSCNリズムの位相に影響しないことが示されている。
【図５】 位相前進性および位相後退性の光周期におけるPer1-lucトランスジェニックラットからの代表的な移動活動記録を示す。移植した送信機を用いて一般的活動性を観測し、ダブルプロット表示を行った。当初の明：暗サイクル（図の上部の黒および白のバー）から、矢印で示した日に、6時間前（左図）または6時間後（右図）に位相を変位させた（新たな光周期は図の下部に白および黒のバーで示している）。光周期前進後の最初の5サイクルでの消灯時のマスキング（バースト状の活動）に注意されたい。明から暗への移行が移動に及ぼす直接的作用は夜行性齧歯類で一般に認められ、時計によって制御された行動の位相を示すものではない。完全な再同調に至るまで肉眼観察によって計測したところ、位相前進後には約6.2±0.5サイクル（SEM、n=10）、位相後退後には1.8±0.3サイクル（SEM、n=10）を要した。斜線入りの三角印は、SCNピーク時を図4にプロットした動物の屠殺時点を示している（位相変位後の1回目および6回目のサイクル）。以前に、ウィスターラットの同じ系統で、移動周期性において同様の位相変位軌道が観察されている（K. Honma、S. Honma、T. Hiroshige、「生物リズム（Biological Rhythms）」（Hokkaido University Press、Sapporo、1989）、日本語）。
【図６】 Per1-lucトランスジェニックマウスから外植した培養SCNからの生物発光の代表的な概日リズムを示す。黒と白のバーは動物に対するそれ以前の明：暗条件を示す。外植は消灯直前（矢印）に行い、発光を直ちに観測した。主観的昼の中央部をピークとする約24時間のリズムがインビトロで4日間続き、その時点で培養物をアッセイから取り出した。
【配列表】
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institute of Health）から授与された助成金第MH 56647号の下で、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現（rhythmical expression）を誘導する、単離されたPeriod 1（Per1）プロモーターDNAに関する。また、本発明は、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子であって、本プロモーターDNAの制御下にある遺伝子を含むDNA構築物にも関する。本発明はさらに、本構築物が導入されたトランスジェニック哺乳動物にも関する。本トランスジェニック哺乳動物は、概日リズムが関与する疾患および障害に対する医薬品をスクリーニングするために有用である。
【０００３】
背景技術
近年、細菌および哺乳動物などの多様な生物において概日リズムの基礎をなす分子機構に関する情報が急速に増大しているが、多細胞生物における概日系の構成に関する極めて重要な疑問には未だに回答が得られていない。一方、これらの疑問に答えるために用いることができる新たな重要なツールが得られるようになった（A. J. Millar、S. R. Short、N. H. Chua、S. A. Kay、Plant Cell、1992、4、1075；T. Kondoら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1993、90、5672；J. D. Plauts、M. Kaneko、J. C. Hall、S. Kay、Science、1997、278、1632）。
【０００４】
視交叉上核（SCN）は哺乳動物における主要な概日ペースメーカであるが、概日振動のために必要な分子機構は、驚くほど多数の末梢組織にも含まれていると考えられ（U. Albrecht、Z. S. Sun、G. Eichele、C. C. Lee、Cell、1997、91、1055；D. P. Kingら、Cell、1997、89、641；L. P. Shearman、M. J. Zylka、D. R. Weaver、L. F. Kolakowski Jr.、S. M. Reppert、Neuron、1997、19、1261；H. Teiら、Nature、1997、389、512；N. Koikeら、FEBS letters、1998、441、427；Y. MiyamotoおよびA. Sancar、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1998、95、6097；M. J. Zylka、L. P. Shearman、D. R. Weaver、S. M. Reppert、Neuron、1998、20、1103）、幾つかの場合では、SCNがなくてもこれらの脊椎動物組織が概日振動を発現することが示されている（R. V. Andrews、Gegenbauers Morph. Jahrb. Leipzing、1971、117、89；G. TosiniおよびM. Menaker、Science、1996、272、419；A. Balsalobre、F. Damiola、U. Schibler、Cell、1998、93、929；D. Whitmore、N. S. Foulkes、U. Strahle、P. Sassone-Corsi、Nat Neurosci、1998、1、701）。しかし、多組織系における振動の間の詳細な関係は未だに不明である。
【０００５】
発明の開示
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNAを提供することを目的とする。また、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子であって、本プロモーターDNAの制御下にある遺伝子を含むDNA構築物、および本DNA構築物の用途も提供する。さらに、本構築物が導入されたトランスジェニック哺乳動物およびその用途を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者らは、哺乳動物の概日系が階層的に構成されており、SCN内の自律性概日振動子（self-sustained circadian oscillator）が末梢の減衰性概日振動子を同調させることによって、多数の顕在的リズムの間で、複雑な位相関係が生じる（その存在は、以下に示唆されており、正常機能にとってほぼ確実に重要である（F. Halberg、Cold Spring Harbor Symposia in Quantitative Biology、1960、25、289；M. C. Moore-EdeおよびF. M. Sulzman、行動神経生物学ハンドブック4．生物リズム（Handbook of Behavioral Neurobiology 4. Biological Rhythms）、J. Aschoff編（Plenum Press、New York、1981）、pp. 215〜241、第12章））と仮説を立てた。この仮説から導き出される予想には、1）SCN（速い）と移動行動などの概日出力指標（遅い）の間に位相変位率の差があること；および2）末梢組織において減衰性概日振動子が存在することが含まれるが、これらに限定されることはない。
【０００７】
これらの予想を検証するために、本発明者らは、マウスPer1プロモーターの制御下でルシフェラーゼをリズムを有するように発現するトランスジェニックラットおよびマウスの系統を作製し、それらを用いて哺乳動物の概日系の構成を検討した。これらのラットおよびマウスの培養視交叉上核（SCN）からの発光は、一貫して確固たるリズムを呈した。光周期変位に続いて、SCNからの概日リズムの発光は、移動行動におけるリズムの発光よりも速く追随した。ラットの肝臓、肺、および骨格筋も概日リズムを発現し、これはインビトロでは2〜7回の周期の後に減衰した。これらの観察所見により、SCN内の自律性概日振動子が末梢の減衰性概日振動子を同調させて順応性のある位相制御を維持していることが示唆される。
【０００８】
本発明で提示するデータは、光周期変位に反応して、SCN内の中枢の概日振動子が、それらによって調節されることが知られる少なくとも1つのリズムを有する行動よりも速く変位することを示している。このことは、同調された正常状態において、概日系の特徴である同調性を明らかに乱すものであり、「時差ぼけ(jet lag)」および交代制勤務に伴う障害の原因である可能性がある。いくつかの末梢組織に減衰性概日振動子が存在することと併せて考えると、この位相変位の結果は本発明者らの仮説を支持する。
【０００９】
中枢の概日ペースメーカが速く変位することは理論的考察から予想され、ショウジョウバエおよび齧歯類では間接的に示されている（C. S. Pittendrigh、「季節性生殖周期における生物時計（Biological Clocks in Seasonal Reproductive Cycles）」、B. K. FollettおよびD. E. Follett編、John Wright and Sons Ltd、Bristol、1981、pp.1〜35；M. U. Gillete、「視交叉上核―心の時計（Suprachiasmatic Nucleus. Mind's Clock）」、D. C. Klein、R. Y. Moore、S. M. Reppert編、Oxford University Press、New York、1991、第6章；M. Takamure、N. Murakami、K. Takahashi、H. Kuroda、T. Etoh. Phsiol. Behav.、1991、50、443；J. D. Best、E. S. Maywood、K. L. Smith、M. H. Hastings、J. Neurosci.、1999、19、828）。本発明で提示するデータは、SCN内の概日性自己調節フィードバックループの主要な構成分子であるPer1の発現が、同調性光周期のいずれの方向への大きな位相変位にも速く追従することを直接的に示している。本発明のトランスジェニック哺乳動物により、光周期の大きな位相変位の後の末梢性振動の位相変位軌道を観察することが可能になる。末梢組織および中枢のペースメーカにおける軌道の間または移動活動との間の関連も、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いて調べることができる。さらに、SCNならびに末梢組織における概日振動の検出が可能なこれらのトランスジェニック哺乳動物を用いて、多くの組織における概日振動子を調節する新規な刺激、遺伝子、因子および試薬をスクリーニングすることもできる。
【００１０】
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNAを提供することを目的とする。また、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子であって、本プロモーターDNAの制御下にある遺伝子を含むDNA構築物、および本DNA構築物の用途も提供する。本発明はまた、本構築物を有する宿主細胞、およびその用途も提供する。さらに、本発明は、本構築物が導入されたトランスジェニック哺乳動物も提供する。本トランスジェニック哺乳動物は、概日リズムが関与する疾患および障害に対する医薬品をスクリーニングするために有用である。
【００１１】
具体的には、本発明は以下のものに関する：
（１）プロモーターが、哺乳動物の体内で機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNA；
（２）プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、上記(1)記載の単離Period 1プロモーターDNA；
（３）齧歯類がマウスである、上記(2)記載の単離Period 1プロモーターDNA；
（４）哺乳動物が齧歯類である、上記(1)記載の単離Period 1プロモーターDNA；
（５）Period 1プロモーターおよび該プロモーターと機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、該遺伝子が哺乳動物の体内で該プロモーターの制御下でリズムを有するように発現される、組換えDNA；
（６）Period 1プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、上記(5)記載の組換えDNA；
（７）Period 1プロモーターがマウスPeriod 1プロモーターである、上記(5)記載の組換えDNA；
（８）遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、上記(5)記載の組換えDNA；
（９）哺乳動物が齧歯類である、上記(5)記載の組換えDNA；
（１０）遺伝子がPeriod 1プロモーターDNAの制御下でリズムを有するように発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１１）遺伝子がレポーター遺伝子である、上記(10)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１２）レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、上記(11)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１３）哺乳動物が齧歯類である、上記(10)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１４）齧歯類がマウスおよびラットからなる群より選択される、上記(13)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１５）Period 1プロモーターがマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターである、上記(10)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物；
（１６）上記(10)記載の哺乳動物の子孫；
（１７）上記(1)〜(9)のいずれか一項に記載のDNAを含む形質転換体；
（１８）形質転換体が上記(10)〜(16)のいずれか一項に記載の哺乳動物に由来する、上記(17)記載の形質転換体；
（１９）上記(17)記載の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）該形質転換体を該化合物で処理する段階；および
（b）処理した形質転換体における該導入遺伝子の発現を測定する段階
を含む方法；
（２０）上記(10)記載の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）該哺乳動物を該化合物で処理する段階；および
（b）処理した哺乳動物における該導入遺伝子の発現を測定する段階
を含む方法。
【００１２】
以下に本発明をさらに詳細に例示する。本明細書で引用するすべての文献は参照として組み入れられる。
【００１３】
1 ．本発明の DNA
本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNAを提供する。
【００１４】
本明細書において「リズムを有する発現（rhythmical expression）」とは、概日リズムに従って遺伝子の発現レベルが変動する、概日リズムに基づく周期的発現を意味する。
【００１５】
具体的には、本発明は以下の「P-1」〜「P-4」に記載のDNAを提供する。
「P-1」：プロモーターが哺乳動物の体内で機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、単離Period 1プロモーターDNA。
「P-2」：前記プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、「P-1」に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
「P-3」：前記齧歯類がマウスである、「P-2」に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
「P-4」：前記哺乳動物が齧歯類である、「P-1」に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
【００１６】
本明細書において「単離DNA」とは、DNAがその天然の環境から分離されたことを意味する。単離DNAの5'および3'隣接領域はその本来の状態から切り離されているか、またはそれらの配列は本来の配列とは異なっている。単離DNAは精製されたものであってもよく、他のDNA成分を含む不純なものであってもよい。本発明の単離DNAには以下のものが含まれる：プラスミド、ファージ、および他のベクター中に挿入されたDNA断片；PCRによって増幅されたDNA産物；ならびに合成DNA。単離DNAをその本来の位置（例えば、染色体上）に戻す場合にも、それは依然として「単離DNA」であるとみなされる。
【００１７】
本発明は、本プロモーターと機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導することを特徴とする、単離Period 1プロモーターDNAを提供する。本明細書において「Period 1プロモーター」とは、転写調節活性を有しており、哺乳動物Period 1（Per1）遺伝子プロモーターに由来するDNAのことを意味する。Period 1プロモーターの例には、例えば、ヒト（Hida, A.ら、Genomics、2000、65、224〜233；アクセッション番号AB030817）、サルおよび他の霊長類に由来するもののほか、マウス（Hida, A.ら、Genomics、2000、65、224〜233；アクセッション番号AB030818）およびラットを含む齧歯類に由来するものがある。
【００１８】
Period 1プロモーターは、例えば、マウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターDNAなどをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによってゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、哺乳動物ゲノムDNAから単離することができる。代替的な方法としては、Period 1遺伝子のコード領域の部分断片（例えば、cDNA断片）をプローブとして用いてゲノムライブラリーをスクリーニングし、その5'隣接領域を単離することができる。ハイブリダイゼーションを用いる以外に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって哺乳動物ゲノムDNAからPeriod 1プロモーターを直接的に増幅することもできる。
【００１９】
本明細書で用いる「プロモーター」とは、翻訳開始部位の上流領域を意味し、発現調節領域全体が含まれる。
【００２０】
本発明のDNAを、ホスホアミダイト法または亜リン酸トリエステル法などの、核酸の化学合成を利用した標準的な方法によって製造することもできる。
【００２１】
本発明のPeriod 1プロモーターは、機能的に連結した遺伝子をリズムを有するように発現させることが可能な限り、野生型Period 1プロモーターを含むDNAの全体であっても一部であってもよい。例えば、本発明のPeriod 1プロモーターは、内因性Period 1遺伝子の翻訳開始コドンの上流にある2.0Kbまたはそれ以上、好ましくは5.2kbまたはそれ以上、より好ましくは5.7kbまたはそれ以上、最も好ましくは6.2kbまたはそれ以上の断片を含みうる。機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導することを特徴とする本発明のDNAは、上記のDNAよりも短いDNAであってもよい。
【００２２】
好ましくは、本発明のDNAは1つまたは複数のE-ボックス（E-box）を含む。E-ボックス（CACGTG）は、CLOCK-BMAL1複合体の結合部位である（Gekakis, N.ら、Science、1998、280、1564〜1569）。本発明のDNAは、好ましくは3つまたはそれ以上のE-ボックスを含み、より好ましくは4つまたはそれ以上、最も好ましくは5つまたはそれ以上のE-ボックスを含む。本発明のDNAは、内因性Period 1遺伝子に含まれる他の転写調節配列を含んでもよい。このような転写調節配列には一般に、cAMP応答配列（CRE）、SP1ボックス、CAATボックス、CTF／NF-1結合部位などが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明のDNAの1つの好ましい態様では、少なくとも3つまたはそれ以上、より好ましくは4つまたはそれ以上、さらにより好ましくは好ましくは5つまたはそれ以上のE-ボックスを含む、内因性ゲノムDNAスパン（ゲノムDNAの連続断片）を含むDNAである。
【００２３】
本発明のプロモーターDNAには、転写活性が維持される限り、エンハンサーまたは他の機能配列を含むものが含まれる。本発明のDNAは、内因性Period 1プロモーター転写開始部位の少なくとも1つ含むことが好ましい。転写開始部位は例えば、5'-RACEによって得られたcDNA配列を解析することによって解明することができる。プライマー伸長を行い、その結果得られた産物をシークエンシングゲル（例えば、6％ポリアクリルアミドおよび8M尿素ゲル）を用いて分離することにより、これらの部位を決定することも可能である。
【００２４】
本発明のDNAは、好ましくは内因性Period 1遺伝子の第1エクソンを含む。本発明のDNAは、好ましくは内因性Period 1遺伝子の第1イントロンも含みうる。Period 1遺伝子の第1イントロンは、Period 1遺伝子の発現の調節に関与している可能性がある。本発明のDNAは、好ましくは、内因性Period 1遺伝子の第2エクソンに含まれると考えられる5'非翻訳領域（UTR）全体またはその一部を含んでもよい。エクソンに含まれる5'-UTRおよび／またはイントロンは、遺伝子の発現の調節に関与する配列を含みうる。本発明のDNAは、好ましくは内因性Period 1遺伝子の翻訳開始コドンを含んでもよい。本発明のDNAは、Period 1遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）全体またはその一部を含んでもよい。
【００２５】
また、本発明のDNAは、好ましくは、哺乳動物Period 1遺伝子の上流領域で同定される保存されたセグメントを少なくともいずれか1つ含んでもよい。保存されたセグメントは一般に、2つまたはそれ以上のPeriod 1上流領域を比較することによって有意に保存された領域として特定されうる。保存されたセグメントは通常、ドットプロット解析、またはコンピュータアルゴリズムを用いる整列化によって抽出することが可能である。ヒトおよびマウスのPeriod 1遺伝子のゲノム構造は、ヒダ（Hida, A.）ら（Genomics、2000、65、224〜233；参照として本明細書に組み入れられる）に詳細に記載されている。前記の通り、ヒトおよびマウスのPeriod 1遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれアクセッション番号AB030817およびAB030818により開示されている。他の哺乳動物Period 1遺伝子の構造は、上記の参考文献に従って決定および整列化することができる。本発明のDNAの具体例の一つは、ヒダ（Hida, A.）ら（Genomics、2000、65、224〜233）においてI、II、III、IV、VおよびVIと特定された内因性哺乳動物Period 1遺伝子の保存されたセグメントを少なくとも1つ、好ましくは2つまたはそれ以上、より好ましくは3つまたはそれ以上、さらにより好ましくは4つ〜6つ（全部）含むDNAである。
【００２６】
本発明のDNAに含まれるマウス由来のPeriod 1プロモーターDNAを含むDNA構築物を配列番号：1に例示する。この配列では、マウスPeriod 1に由来する領域は23〜6787位のヌクレオチドである。本発明のDNAには、この領域または類似領域を含むDNAが含まれる。このDNAは、マウスPeriod 1遺伝子の上流領域のうち、5つの内因性E-box領域、転写開始部位、第1イントロンによって隔てられた第1エクソンおよび第2エクソン、ならびに第2エクソン内における翻訳開始コドンを有する。この領域に対応するヒトPeriod 1配列は、アクセッション番号AB030817に開示したヒトPeriod 1遺伝子配列の1〜6573位のヌクレオチドである。本発明のDNAは、ヒトPeriod 1のこの領域または類似領域の配列を含むDNAであってもよい。また、他の哺乳動物Period 1配列の相同領域を用いることも可能である。
【００２７】
真核生物の遺伝子配列では、多型を呈する場合がある。このような多型によって、遺伝子の本質的な機能または遺伝子の発現に影響を及ぼすことなく、1つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、および／または挿入されうる。一般にプロモーター活性は、仮に1つまたは複数のヌクレオチドが改変されたとしても維持されることが多い。したがって、本発明のDNAには、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する特性が維持される限り、上に例示したマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーター配列と比べて改変されたヌクレオチド配列を有するDNAも含まれる。
【００２８】
Period 1プロモーター配列は、適宜人工的に改変することができる。本発明のDNAは、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導し、且つ内因性Period 1プロモーター配列の1つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入および／または付加されたヌクレオチド配列を含むDNAを含む。内因性プロモーター配列の改変は当業者には日常的に行われている。例えば、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するのに必須ではないヌクレオチドまたは配列は欠失または置換してもよい。さらに、リズムを有する発現の調節に関与しうる、E-ボックスなどのDNA配列を挿入または付加してもよい。Period 1プロモーター配列を他のプロモーター配列と組み合わせて、異種プロモーター、融合プロモーター、またはキメラプロモーターを作製してもよい。組み合わせる他のプロモーターに制限はない。このようにして改変されたプロモーターも、本発明の「Period 1プロモーター」に含まれる。
【００２９】
また、本発明のDNAには、配列番号：1の23〜6787位のヌクレオチドからの配列を含むDNAとハイブリダイズするDNAを含むDNAであって、それと機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導しうるDNAも含まれる。ハイブリダイゼーション条件は適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションは例えば、6×SSPE、5×デンハルト液、0.5％SDS、100μg／ml変性サケ精子DNA、および50％ホルムアミドを含む混合液中で、通常は42℃、より低いストリンジェンシーでは32℃、またはより高いストリンジェンシーでは65℃で行うことができる。
【００３０】
本発明のDNAがリズムを有するように発現されるか否かは、DNAの下流に機能的に連結した遺伝子が、概日リズムを有する哺乳動物の体内の細胞内に配置された場合に、概日リズムに従ってリズムを有するように発現されうるか否かを検出することによって確認することができる。例えば、本発明のDNAが導入された細胞を有する哺乳動物において、そのDNAの発現を経時的に検出する。または、体内の細胞を取り出して、発現を観察してもよい。一例を挙げると、本発明のDNAを含む細胞または組織を体内に含む哺乳動物を、通常の光周期（例えば、LD 12：12）の下で一定期間（例えば、1週間）またはそれ以上にわたって飼育する。続いて、その細胞または組織を取り出し、そのDNA発現を、細胞または組織を取り出した直後から定期的に検出する。検出は例えば、恒暗（DD）下で行う。これらの検出により、下流遺伝子のリズムを有する発現が対象となるDNAによって誘導されることが示されれば、そのDNAがリズムを有する発現を誘導するということができる。検出に用いる哺乳動物に特に制限はないが、齧歯類が適している。より具体的には、マウスまたはラットを用いる。例えば、通常のウィスターラットまたはC57／B6マウスがある。本発明のDNAによって誘導されたリズムを有する発現は、概日リズムに従った発現の変動によって検証することができる。至適条件下では、本発明のDNAは恒暗（DD）条件下でも下流遺伝子のリズムを有する発現を少なくとも1サイクル（1日）またはそれ以上、好ましくは2サイクル（2日）またはそれ以上、より好ましくは3サイクル（3日）またはそれ以上、さらにより好ましくは4サイクル（4日）またはそれ以上（例えば、1〜2週間またはそれ以上）誘導する。リズムを有する発現の持続性はアッセイ条件および組織によって変わる可能性がある。
【００３１】
本発明のDNAはベクターDNA中に含まれていてもよい。また、これは中間体としてRNAの形態をとってもよい。例えば、本発明のDNA（またはRNA）は、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、YACおよびBACを含む人工染色体、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）を含むウイルス、または転位因子などの中に含まれていてもよい。必要に応じて、本発明のDNAに選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を連結してもよい。
【００３２】
要約すると、本発明のDNAは、哺乳動物の体内で、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するのに有用である。本発明のDNAは、哺乳動物の体内で、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導することを特徴とする、単離Period 1プロモーターDNAである。さらに本発明は、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するための、本発明の上記DNAの使用に関する。本発明はまた、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を検出するための、本発明の上記DNAの使用にも関する。
【００３３】
本発明は、Period 1プロモーターおよびその下流に機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、その遺伝子が哺乳動物の体内で前記Period 1プロモーターの制御下でリズムを有するように発現されるような組換えDNAを提供する。このような遺伝子には、本発明の上記のPeriod 1プロモーターDNAの下流に遺伝子が機能的に連結したものが含まれる。具体的には、以下の「G-1」〜「G-4」に記載のDNAが本発明に含まれる。
「G-1」：Period 1プロモーターおよびそれと機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、前記遺伝子が哺乳動物の体内で前記プロモーターの制御下でリズムを有するように発現される、組換えDNA。
「G-2」：前記Period 1プロモーターが齧歯類またはヒトのPeriod 1プロモーターである、「G-1」に記載の組換えDNA。
「G-3」：前記Period 1プロモーターがマウスPeriod 1プロモーターである、「G-1」に記載の組換えDNA。
「G-4」：前記遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、「G-1」に記載の組換えDNA。
「G-5」：前記哺乳動物が齧歯類である、「G-1」に記載の組換えDNA。
【００３４】
本明細書において「組換えDNA」とは、天然の状態とは異なる様式で連結しているものをいう。「組換えDNA」は遺伝子工学によって作製されうる。単離DNAを含むDNAも「組換えDNA」に含まれる。
【００３５】
本明細書で「機能的に連結した」とは、遺伝子がプロモーターの制御下で発現されるような様式で連結していることを意味する。本発明のDNAの場合には、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子が、そのプロモーターの調節下でリズムを有するように発現される。このようなリズムを有する発現は一般的には、概日リズムを有する哺乳動物の体内の細胞に本DNAを導入した際に起こる。プロモーターと、そのプロモーターによって発現が制御される遺伝子との間には、プロモーターによって誘導される遺伝子のリズムを有する発現に影響を及ぼさない限り、任意の長さのヌクレオチド配列を挿入することができる。プロモーターによって発現が制御される遺伝子は、好ましくはプロモーターの下流、より好ましくはそのすぐ下流に位置する。
【００３６】
連結される遺伝子に特に制限はなく、任意の遺伝子を用いることができる。例えば、遺伝子が、構造蛋白質、マーカー蛋白質、酵素、受容体、チャンネル、膜蛋白質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、リガンド、または他の生理活性因子などの、所望の蛋白質をコードしてもよい。本発明のDNAは1つまたは複数の遺伝子を含みうる。遺伝子は天然遺伝子であってもよく、人工的に改変または構築された遺伝子であってもよい。連結した遺伝子を含む本発明のDNAを、概日リズムを有する多細胞生物の体内の細胞内に配置することにより、所望の遺伝子を概日リズムに従ってリズムを有するように発現させることができる。本発明の1つの好ましい態様では、レポーター遺伝子をPeriod 1プロモーターの下流に連結させる。このようなDNAは、インビボまたは組織中での概日リズムを検出するのに有用である。
【００３７】
使用するレポーター遺伝子には、その発現が検出可能である限り制限はない。レポーター遺伝子の発現は、転写物、翻訳産物、または翻訳産物の活性もしくは機能を検出することによって直接的または間接的に検出することができる。レポーター遺伝子として、公知の任意のレポーター遺伝子を使用することができる。その例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β-D-グルクロニダーゼ遺伝子、β-D-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子などがある。本発明では、レポーター遺伝子としては、細胞に浸潤を与えずにその発現を検出することが可能であるものが好ましい。レポーター遺伝子としては、その発現を高感度に検出でき、且つ発現の時間的パターンの区別が容易になる程度に発現産物の代謝回転が速いものが好ましい。好適なものの例として、ルシフェラーゼ遺伝子がある。ルシフェラーゼアッセイ法により、生細胞、組織、器官、さらには個体における遺伝子の発現を実時間で検出することができる。
【００３８】
上記のPeriod 1プロモーターDNAの任意のものを、遺伝子と連結されるPeriod 1プロモーターDNAとして使用することができる。遺伝子がリズムを有するように発現される限り、野生型Period 1プロモーターまたはその部分断片を使用することができる。本発明のDNAに含まれるマウス由来のPeriod 1プロモーターを含むレポーター遺伝子構築物を配列番号：1に例示する。この配列では、マウスPeriod 1に由来する領域は23〜6787位のヌクレオチドに由来する。マウス由来のPeriod 1プロモーターDNAを使用する他に、上記のヒトまたは他の哺乳動物のPeriod 1由来のDNAをPeriod 1プロモーターDNAとして使用することもできる。Period 1プロモーターDNAは改変配列を含んでもよい。Period 1遺伝子由来のプロモーターDNAがPeriod 1蛋白質をコードするORFまたはその一部を含む場合には、Period 1プロモーターDNAの下流に連結される遺伝子をこのORFとインフレーム形式で連結させ、融合蛋白質として発現させることができる。または、遺伝子を独立して発現させてもよい。
【００３９】
Period 1プロモーターDNAと連結した遺伝子を含むDNAにおいて、DNAに含まれる遺伝子は、概日リズムを有する哺乳動物の体内の細胞内で概日リズムに従ってリズムを有するように発現される。遺伝子がリズムを有するように発現されるか否かは、前記の通り、哺乳動物の体内または体外で遺伝子の発現を定期的に検出することによって確認することができる。
【００４０】
遺伝子を含む本発明のDNAは、ベクターDNA中に含まれていてもよい。また、これは中間体としてRNAの形態をとってもよい。例えば、本発明のDNA（またはRNA）は、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、YACおよびBACを含む人工染色体、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）を含むウイルス、または転位因子などの中に含まれていてもよい。必要に応じて、本発明のDNAに選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を連結してもよい。
【００４１】
要約すると、遺伝子を含む本発明の組換えDNAは、哺乳動物の体内で遺伝子のリズムを有する発現を誘導するのに有用である。本発明のDNAは、Period 1プロモーターと機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、その遺伝子が哺乳動物の体内でPeriod 1プロモーターの制御下でリズムを有するように発現されるような組換えDNAに関する。本DNAは、機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導するためのPeriod 1プロモーターDNA構築物であってもよい。本発明は、遺伝子を含む本発明の上記のDNAを、遺伝子のリズムを有する発現の誘導に使用することに関する。また、本発明は、遺伝子を含む本発明の上記のDNAを、遺伝子のリズムを有する発現の検出に使用することにも関する。
【００４２】
2 ．本発明の DNA を有する形質転換体
本発明は、本発明のDNAを有する形質転換体を提供する。使用する形質転換体はそれが本発明のDNAを含む限りは制限はなく、その例には細胞、組織、器官、および個体などが含まれる。本発明のDNAを有する限り、形質転換体には、細菌、酵母、哺乳動物、植物、昆虫などの原核生物および真核生物が含まれる。1つの好ましい態様において、本発明のDNAは、概日リズムを有する多細胞真核生物に由来する細胞を宿主として使用する。より好ましくは、宿主として哺乳動物細胞が使用される。哺乳動物の例には、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどが含まれるが、これらには限定されることはない。本発明のDNAを有する哺乳動物細胞は、哺乳動物の体内に移植された際に、このDNAを概日リズムに従ってリズムを有するように発現しうる。本発明に用いる宿主細胞の形態に制限はない。これは浮遊細胞などの遊離形態であってもよく、組織または器官を形成するものであってもよい。これは個体であってもよい。宿主細胞には受精卵、初期胚、胚性幹（ES）細胞なども含まれる。これらの細胞は、後述のトランスジェニック哺乳動物の作製に有用である。トランスジェニック哺乳動物に由来する組織または細胞も本発明の形質転換体に含まれる。これらの組織または細胞としては、初代培養物、その継代培養物、または樹立細胞系が可能である。トランスジェニック哺乳動物自体も形質転換体に含まれる。
【００４３】
本発明のDNAを宿主細胞に導入するためには、公知のトランスフェクション法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、電気穿孔法、リポフェクション法、微量注入(microinjection)法などを用いて、DNAを哺乳動物細胞に導入することができる。ウイルスを介した感染によってDNAを導入してもよい。宿主細胞は本発明のDNAを一過的に有するものであっても安定的に有するものであってもよい。好ましくは、本発明のDNAは宿主細胞の染色体に組み込まれている。宿主細胞は本発明のDNAの1つまたは複数のコピーを有しうる。レポーターアッセイ法においてより強い発現が得られるため、組み込まれるコピー数は多数であることが好ましいと考えられる。例えば、本発明の形質転換細胞は、本発明のDNAを二倍体ゲノム当たり、約3つまたはそれ以上、好ましくは約4つまたはそれ以上、より好ましくは約5つまたはそれ以上のコピー数で含んでもよい。コピー数は、本発明のDNAをプローブとして使用したサザンブロット解析によって評価することができる。
【００４４】
3 ．トランスジェニック哺乳動物
本発明は、Period 1プロモーターの制御下で遺伝子がリズムを有するように発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００４５】
具体的には、以下の「Tg-1」〜「Tg-7」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
「Tg-1」：上記「P-1」〜「P-4」のいずれか1つに記載のPeriod 1プロモーターDNAの制御下で遺伝子がリズムを有するように発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-2」：前記遺伝子がレポーター遺伝子である、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-3」：前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-4」：前記哺乳動物が齧歯類である、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-5」：前記齧歯類がマウスおよびラットからなる群より選択される、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-6」：前記Period 1プロモーターがマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターである、「Tg-1」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-7」：「Tg-1」に記載の哺乳動物の子孫。
【００４６】
以下の哺乳動物も上記のトランスジェニック哺乳動物に含まれる。
「Tg-8」：導入遺伝子が前記Period 1プロモーターの制御下でリズムを有するように発現される、上記の「G-1」〜「G-5」のいずれか1つに記載のDNAを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-9」：前記遺伝子がレポーター遺伝子である、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-10」：前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-11」：前記哺乳動物が齧歯類である、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-12」：前記齧歯類がマウスおよびラットからなる群より選択される、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-13」：前記Period 1プロモーターがマウスまたはヒトのPeriod 1プロモーターである、「Tg-8」に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
「Tg-14」：「Tg-8」に記載の哺乳動物の子孫。
【００４７】
このようなトランスジェニック哺乳動物は、上記の本発明のDNAを導入することによって作製することができる。本発明のトランスジェニック哺乳動物において、導入された遺伝子は構成的にリズムを有する発現を示してもよく、または通常は発現されないが、発現を誘導した後のみにリズムを有するように発現されてもよい。この発現は例えば、外的刺激または環境変化によって誘発するものであってもよい。このような発現系は、例えば、Cre-loxP系を用いることによって実施することができる。または、別の誘導性プロモーターとのキメラプロモーターの使用も想定される。発現は全身性であってもよく、細胞、組織または器官に特異的であってもよい。
【００４８】
トランスジェニック哺乳動物は公知の方法に従って作製することができ、用いる方法に特に制限はない。例えば、受精卵を採取し、注入ピペットを用いる微量注入法によって卵の雄性前核に遺伝子を注入する。または、本発明のDNAを胚性幹（ES）細胞に導入し、選択したES細胞を微量注入によって受精卵（胚盤胞）に注入する。卵管に卵を戻す動物を用意し（偽妊娠雌など）、各個体に約10〜15個の卵を移植する。
【００４９】
初代（子孫）への導入遺伝子の導入は、尾の先端からゲノムDNAを抽出し、サザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によって導入遺伝子を検出することによって確認する。導入遺伝子の発現は、導入遺伝子に応じた適切な方法によって検出することができる。導入遺伝子の転写物はノーザンハイブリダイゼーションまたはRT-PCR法によって検出することができる。蛋白質に対して特異的な抗体を用いるウエスタンブロット法による検出も可能である。異種トランスジェニック哺乳動物は、生殖系列に遺伝子が導入されたキメラ動物と正常動物を交配することによって得られる。同型トランスジェニック哺乳動物は、異種トランスジェニック哺乳動物を互いに交配することによって得られる。本発明のトランスジェニック哺乳動物には、これらの子孫も含まれる。
【００５０】
本発明の非ヒト哺乳動物には、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯類のほか、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、およびウシなどがある。本発明の動物としては齧歯類が好ましく、特にマウスまたはラットが好ましい。
【００５１】
実施例には、Period 1プロモーターの下流に連結したレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むDNAが導入されたトランスジェニックマウスおよびラットを記載している。ルシフェラーゼをレポーターとして発現する本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いることにより、所望の組織におけるルシフェラーゼ活性を検出することによって、転写の経時的変化を実時間で検出することが可能である。トランスジェニック齧歯類の培養視交叉上核（SCN）からの発光は一貫して確固たるリズムを呈した。注目されるのは、ラットSCN培養物からのリズムがインビトロで最大32日間続いたことである。これらの結果から、本発明のDNAがそれ自体で概日リズムに従った遺伝子の発現を十分に誘導しうることが直接的に証明された。
【００５２】
驚くべきことに、レポーター遺伝子の発現の概日振動は、検討したすべての末梢組織で明瞭に観察された。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、好ましくは、導入遺伝子が末梢組織中でリズムを有するように発現されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。末梢組織には、肝臓、肺、および骨格筋が含まれるが、これらに限定されることはない。これらの末梢組織は、SCNリズムとは7〜12時間の位相遅延がある光出力の概日リズムを示した。末梢組織での発現がSCNに対して遅延したパターンを示したことは、多器官から構成される複雑な哺乳動物の生物リズムの正常な協調性を反映したものと考えられる。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、末梢組織における概日リズムの検出にも有用である。
【００５３】
具体的には、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、Period 1の機能および発現制御を調べるため、概日リズムと関係のある時差ぼけまたは睡眠障害の機序を解明するため、ならびに概日リズム障害の治療に有用な化合物のスクリーニングおよび試験を目的として用いる哺乳動物モデルを開発するために有用である。
【００５４】
4 ．アッセイ法およびスクリーニング
レポーター遺伝子を発現する本発明のDNAを含む形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用いて、種々の試験またはスクリーニングを行うことができる。さまざまな任意の条件下でこれらの組織または細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を調節する刺激もしくは化合物の効果を評価すること、またはこれらをスクリーニングすることが可能である。刺激には温度、光、運動、および他のショックが含まれる。使用する化合物に制限はない。本発明は特に、本発明の形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物に導入されたPeriod 1プロモーターによって誘導される発現を改変する化合物を、その形質転換体またはトランスジェニック哺乳動物を用いて試験またはスクリーニングする方法に関する。
【００５５】
本発明の試験またはスクリーニングの方法としては、以下の「M-1」および「M-2」に記載の方法が挙げられる。
「M-1」：本発明の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）前記形質転換体を前記化合物で処理する段階；および
（b）処理した形質転換体における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
「M-2」：本発明の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）前記哺乳動物を前記化合物で処理する段階；および
（b）処理した哺乳動物における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
【００５６】
本発明の方法は、Period 1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングするために有用である。本方法はまた、概日リズム障害に対する医薬品をスクリーニングするためにも有用である。特に、以下に挙げるスクリーニング法が本発明によって可能となる。
【００５７】
概日リズム睡眠障害の治療に有用な医薬品の試験またはスクリーニングの方法であって、
（a）本発明の形質転換体またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその医薬品で処置する段階；および
（b）処置した形質転換体または哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
【００５８】
本発明の試験またはスクリーニングの方法に使用する化合物に特に制限はない。その例には、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成性の低分子化合物、天然または合成性の高分子化合物、組織または細胞の抽出物、微生物の培養上清、植物または海洋生物に由来する天然成分などが含まれるが、これらに限定されることはない。遺伝子ライブラリーまたはcDNA発現ライブラリーなどの発現産物を使用してもよい。化合物による処置の方法に特に制限はない。インビトロでの処置は、例えば化合物を培養液に添加して細胞を化合物と接触させたり、微量注入またはトランスフェクション試薬を用いて化合物を細胞内に導入することなどにより実施しうる。インビボでの治療の方法には、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または腹腔内注射；経口投与、経腸投与、筋肉内投与、または鼻腔内投与；眼への投与；注射もしくはカテーテルを介した脳内投与、脳室内投与、または末梢器官内投与などの、当業者に公知の方法が含まれる。化合物は適宜組成物として投与する。例えば、それを水、生理食塩水、緩衝液、塩、安定剤、保存剤、懸濁剤などと混合することができる。
【００５９】
レポーター遺伝子の発現は、哺乳動物または細胞が生きたまま測定することもでき、細胞を可溶化した後に測定することもできる。例えば、生組織におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定するために、実施例に示すように光電子増倍管により、または本明細書に参照として組み入れられるヤマザキ（Yamazaki, S.）ら（Science、2000、288、682〜685）に記載された他の類似の検出器により、生物発光を連続的に測定することが可能である。可溶化した組織または細胞におけるルシフェラーゼ活性は、例えば、ルシフェラーゼレポーター二重アッセイ系（Dual-Luciferase Reporter Assay System）（Promega）などを使用して測定することができる。レポーター遺伝子の発現は、時間的または空間的に測定することができる。発現リズムの位相、振幅、および／または周期を検出することによって発現を分析することもできる。本発明の方法により、化合物の即時的または長期的な効果（位相変化を含む）の評価が可能となる。化合物の投与によってこれらの発現が改変されれば、その化合物はPeriod 1遺伝子の発現を調節する薬剤候補となる。このような化合物は、睡眠障害を含むさまざまな概日リズム障害に対する医薬品として適用されることが期待される。例えば、レポーター遺伝子の発現の振動をリセットまたは開始する薬剤は、ペースメーカの位相を後退または前進させると期待される。したがって、これらの薬剤は脱同調した発現パターンを正常な同調に導くために使用することができる。本発明によってスクリーニングされる医薬品は、薬剤の治療効果を評価するために、概日リズム障害モデルとなるように誘導した本発明のトランスジェニック哺乳動物に投与される。
【００６０】
トランスジェニック哺乳動物における遺伝子の発現を検出する場合、測定する器官に特に制限はなく、これには視床下部のSCNを含む中枢神経系（CNS）および末梢神経系（PNS）、ならびに肝臓、肺、および骨格筋を非制限的に含む他の末梢組織が含まれる。本発明で開示する系は、SCNおよび末梢組織におけるPeriod 1発現の位相関係および同調機構を評価するために有用である。
【００６１】
本発明の系は、Period 1の発現を調節すると推定される多くの因子を同定するために使用されうる。概日リズムと関係のある新規なインビボ因子および遺伝子が本発明の系を用いて同定されれば、これらの因子および遺伝子の発現のインビボでの振動を評価することができる。それにより、SCNおよび末梢組織の振動位相を制御する因子を単離することが可能である。これらは概日リズムに関与する新規な遺伝子および蛋白質であると考えられ、これらを標的として用いることにより、新規薬剤のスクリーニングが可能になると考えられる。このようなスクリーニングはインビボおよびインビトロのどちらでも行える。
【００６２】
具体的には、本発明のトランスジェニック哺乳動物を用いるインビボでのスクリーニング方法は以下の段階を含む：
（a）概日リズムが既に決定されているトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与する段階；
（b）トランスジェニック哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出し、発現リズムを検証する段階；
（c）化合物の投与後のレポーター遺伝子の発現リズムを投与前のものと比較する段階；および
（d）発現リズムの位相、周期、または振幅を改変する化合物を選択する段階。
【００６３】
レポーター遺伝子の発現リズムは、生きた動物の体内でのレポーター遺伝子の発現リズムを検出する方法；切り出した組織を培養することによって発現の変動を連続的に観察する方法；または動物組織の抽出物を定期的に調製して、各時点での発現レベルを検出する方法によって検出可能である。例えば、適した方法（例えば、静脈内注射、腹腔内投与、脳室内投与など）により、適切なタイミングでトランスジェニック動物にルシフェリンを投与する。続いてこの動物を麻酔し、CCDカメラによってルシフェラーゼ発光を計測することにより、レポーター遺伝子の発現部位および発現レベルを決定する。個々の動物の発現リズムを確認するために、この測定を数時間毎に数回ずつ行う（Sweeney TJら、「生きた動物における腫瘍細胞クリアランスの可視化（Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals）」、PNAS、1999、96、12044〜12049；およびContag PRら、「生きた哺乳動物における生物発光標識（Bioluminescent indicators in living mammals）」、Nature Medicine、1998、4、245〜247を参照のこと）。
【００６４】
前記の通り、インビトロでも本発明を用いて新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。このようなインビトロスクリーニング法は以下の段階を含む：
（a）本発明の形質転換体、または本発明のトランスジェニック哺乳動物に由来する組織もしくは細胞を培養する段階；
（b）形質転換体または組織もしくは細胞を適切な期間にわたって化合物で処理し、さらに培養を続ける段階；
（c）レポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出する段階；および
（d）（b）の処理後にレポーター遺伝子の発現リズム（位相、周期、および振幅）を改変する化合物を選択する段階。
【００６５】
本明細書において、本発明のトランスジェニック哺乳動物に由来する組織または細胞は、初代培養物または樹立細胞系の細胞であってもよい。本明細書で用いる組織、細胞などに制限はないが、SCN、視床下辺縁細胞、末梢神経などが好ましい。化合物による処理は、例えば、化合物を添加しておいた溶媒中に組織、細胞などを一定期間、浸漬することによって行ってもよい。レポーター遺伝子の発現リズムの変化を測定する場合には、発現リズムがあらかじめ決定された同一の組織もしくは細胞、または化合物による処理を受けていない対照組織または細胞を用いた比較を行ってもよい。
【００６６】
上記のインビボおよびインビトロのスクリーニング方法において、光刺激などの刺激処理を、化合物の投与または処理とともに行ってもよい。
【００６７】
本発明の試験またはスクリーニングの方法により同定された化合物は、所望の概日リズム疾患または障害に対する医薬品として用いることができる。これらの薬剤は、適宜薬学的に許容される担体、溶質、および溶媒と組み合わせることによって医薬組成物として製剤化することができる。本薬剤は、時差症候群、交代制勤務による睡眠障害、睡眠相後退症候群、および不規則性睡眠覚醒障害などの疾患または障害に対して適用することができる。
【００６８】
本発明のスクリーニング法によって単離された化合物を医薬品として用いる場合には、それを患者に直接的に投与することもでき、またはそれを公知の医薬品製剤法によって医薬組成物の形態に製剤化することもできる。例えば、それを薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせた後に投与することができる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、吸入液などの形態でありうる。化合物の含有量は適宜決定してよい。これらは例えば、通常は動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、または経口投与によって患者に投与することができ、このような方法は当業者に公知である。投与量は患者の体重、年齢、投与方法、および症状により変動するが、当業者であれば投与量を適宜選択することができる。一般に、投与量は薬剤の有効血中濃度および代謝時間により異なるが、1日当たりの維持用量は約0.001mg／kg〜1g／kg、好ましくは0.01mg／kg〜100mg／kg、より好ましくは0.1mg／kg〜10mg／kgであると考えられる。投与は1日当たり1回から複数回であってもよい。化合物がDNAによってコードされうる場合には、遺伝子治療を行うためにDNAを遺伝子治療用ベクターに組み入れることが可能である。
【００６９】
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例を参照することによって本発明を例示するが、これはそれを制限するものとみなされるべきではない。
【００７０】
実施例 1 ：トランスジェニックラットの作製
本発明者らは、マウスPer1遺伝子プロモーターがルシフェラーゼレポーターと連結している、新規のトランスジェニックラットモデルを作製した（図1A）。
【００７１】
6.7kbのマウスPer1ゲノム断片を、SV40後期遺伝子のポリアデニル化配列に隣接したホタルルシフェラーゼcDNAの第2コドンと直接的に連結させた。このmPer1断片は、5つの機能性E-box領域、転写開始部位、第1イントロンによって隔てられた第1エクソンおよび第2エクソン、ならびに第2エクソン内の翻訳開始コドンを含む（図1A）。予想された通り、レポーター遺伝子は一過的同時トランスフェクションアッセイ法においてClockおよびBmal1の協同作用によって誘導され、Cry1またはCry2のいずれかによって抑制された（A. Hidaら、データは示していない；Genomics、2000、65、224〜233を参照のこと）。直鎖状にしたレポーター断片を、ウィスターラット（Charles River Japan Inc.）の302個の受精卵に微量注入した（S. Hoshi、T. Ninomiya、M. Homma、A. Yuki、Anim. Biotechnol.、1990、1、175）。トランスジェニックラットをPCRによって同定し、導入遺伝子のコピー数をサザン解析によって決定した。60匹の離乳仔のスクリーニングによって6匹のトランスジェニックラット（雄5匹と雌1匹）を得た。この6匹の初代ラット(founder rat)はすべて正常に発育したが、これらのうち2匹はそれぞれ不妊またはモザイク性であった。4つのトランスジェニック系統の脳抽出物におけるルシフェラーゼ活性は、レポーター遺伝子のコピー数に概ね比例した。SCN内でルシフェラーゼ活性の概日性振動を示した1つのトランスジェニック系統（W(perl)1と命名）を選択し、以降の検討に使用した。W(perl)1には約12コピー／ゲノムの導入遺伝子が組み込まれており、脳内ルシフェラーゼ活性は1431相対発光単位（Turner Designs）／mg蛋白質であった。
【００７２】
雄性Per1-lucラットおよび雄性野生型対照の双方に関して、恒暗条件下でのホイール走行活動期間を測定した。トランスジェニックラット（8〜10週齢で測定）での期間は24.43±0.02時間（SEM、n=20）であった。これは6〜8週齢時に測定した野生型哺乳動物での期間（24.33±0.01時間、n=26）と極めて近く、このことは導入遺伝子が分子的な概日性時間の保持を破壊しないことを示している。
【００７３】
実施例 2 ：ラット組織の調製
得られたPer1-lucラットを明：暗（LD）12：12周期下で飼育し、いくつかの発光性組織を恒暗および恒温（36℃）条件下で培養した。SCN、骨格筋、肝臓、および肺の外植片を静的条件下（すなわち、培地を交換しない）で培養した。消灯の30〜60分前に、トランスジェニックラットをハロタンで麻酔した上で断頭術を施行した。脳を摘出し、冷ハンクス緩衝生理食塩水中に置いた。ビブロスライサー（Vibroslicer）を用いて作製したトランスジェニックラット脳の400μm厚の冠状断切片からSCN対を外植し、培養用膜（Millicell-CM、PICM030-50；Millipore）の上に載せた。膜および外植片をペトリ皿に入れてガラス板で覆い、シリコングリースで密封した。SCNは、1.2mlの培養液（無血清、低炭酸水素ナトリウム、フェノールレッド非添加のダルベッコ変法イーグル培地（13000-021、GIBCO BRL））に、10mM HEPES（pH 7.2）、B27（2％；17504-010、GIBCO BRL）、0.1mMルシフェリン（甲虫ルシフェリン、カリウム塩、Promega）、および抗生物質（25U／mlペニシリン、25μg／mlストレプトマイシン）を添加した35mmペトリ皿の中で培養した（M. E. Geuszら、Current Biology、1997、7、758）。筋肉、肝臓および肺を一対のメスを用いて解体し、約1mm厚および1〜2mm四方の切片とした上で、ミリセル（Millicell）膜を用いない点を除き、上記と同様に培養した。培養は恒暗および恒温（36±0.2℃）条件下で行い、個々の培養物からの光出力をハママツ（Hamamatsu）光電子増倍管検出装置を用いて連続測定した。生物発光は、HC135-01を改造した光電子増倍管（PMT）検出装置（HC135-11MOD Hamamatsu）を用いて測定した。PMT（R3550）は暗カウント数が室温で1秒当たり20カウント未満のものを特に選択し、プレ倍率を2倍に落とした。装置および培養物は遮光性の水ジャケット付きインキュベーター中に36℃で保ち、連続データ収集のためにIBM PC型コンピュータと接続した。PMTを培養物の約2cm上に配置し、カバーグラスを介して光子カウント数を計測し、1分間にわたり積算した。PMTからの暗カウント（非特異的カウント）数は36℃で1秒当たり約20〜40であった（M. E. Geuszら、Current Biology、1997、7、758）。
【００７４】
実施例 3 ：トランスジェニックマウスの作製
上記のトランスジェニックラット系統の作製と同様の方法を用いて、マウスPer1プロモーターの制御下でルシフェラーゼがリズムを有するように発現される、トランスジェニックマウス系統を作製した。
【００７５】
6.7kbのマウスPer1ゲノム断片を、SV40後期遺伝子のポリアデニル化配列に隣接したホタルルシフェラーゼcDNAの第2コドンと直接的に連結させた。このmPer1断片は、5つの機能性E-box領域、転写開始部位、第1イントロンによって隔てられた第1エクソンおよび第2エクソン、ならびに第2エクソン内の翻訳開始コドンを含む。予想された通り、このレポーター遺伝子は一過的同時トランスフェクションアッセイ法においてClockおよびBmal1の協同作用によって誘導され、Cry1またはCry2のいずれかによって抑制された。直鎖状にしたレポーター断片を、C57／B6マウスの63個の受精卵に微量注入した。トランスジェニックマウスをPCRによって同定し、導入遺伝子のコピー数をサザン解析によって決定した。8匹の離乳仔のスクリーニングによって1つのトランスジェニックマウス系統を得た。このトランスジェニックマウス（L1と命名）は正常に発育し、SCN内でルシフェラーゼ活性の概日性振動を示した。L1には約6コピー／ゲノムの導入遺伝子が組み込まれており、脳内ルシフェラーゼ活性は552相対発光単位（Turner Designs）／mg蛋白質であった。
【００７６】
実施例 4 ：ラット SCN の調製
消灯の30〜60分前に、トランスジェニックマウスをハロタンで麻酔した上で断頭術を施行した。脳を摘出し、冷ハンクス緩衝生理食塩水中に置いた。ビブロスライサー（Vibroslicer）を用いて作製した400μm厚の冠状断切片からSCN対を外植し、培養用膜（Millicell-CM、PICM030-50；Millipore）の上に載せた。膜および外植片をペトリ皿に入れてガラス板で覆い、シリコングリースで密封した。SCNは、1.2mlの培養液（無血清、低炭酸水素ナトリウム、フェノールレッド非添加のダルベッコ変法イーグル培地（13000-021、GIBCO BRL））に10mM HEPES（pH 7.2）、B27（2％；17504-010、GIBCO BRL）、0.1mMルシフェリン（甲虫ルシフェリン、カリウム塩、Promega）、および抗生物質（25U／mlペニシリン、25μg／mlストレプトマイシン））を添加した35mmペトリ皿の中で培養した。生物発光はHC135-01を改造した光電子増倍管（PMT）検出装置（HC135-11MOD Hamamatsu）を用いて測定した。装置および培養物は遮光性の水ジャケット付きインキュベーター中に36℃で保ち、連続データ収集のためにIBM PC型コンピュータと接続した。
【００７７】
実施例 5 ： SCN および末梢のリズムの検出
SCNからの発光は一貫して確固たるリズムを示し（N=48）、このことから、組換えmPer1-luc導入遺伝子が正常な概日性機構の制御下でリズムを有するように転写されることが示された。注目されるのは、SCNリズムが静的培養下で最大32日間続いたことである（図1B）。消灯3時間前または9時間前に屠殺した動物から得た予備データ（示していない）により、これらの屠殺時点はSCNリズムの位相に影響しないことが示されている。肝臓、肺、および骨格筋はいずれも、SCNリズムとは7〜12時間の位相遅延がある光出力の概日リズムを示した。SCNと末梢組織との間のこの位相差はインビボで観察された位相遅延と類似している（M. J. Zylkaら、Neuron、1998、20、1106）。重要な点は、これらのリズムがSCNから記録されたものほど確固としておらず、培養下で2〜6サイクル後には常に減衰したことである（図2）。
【００７８】
実施例 6 ：位相前進および位相後退の影響
光周期を6時間ずつ前進または後退させたが、これは各方向への高速大西洋横断飛行と概ね同様の処理である。位相前進は点灯を早めることによって行い、位相後退は消灯を遅らせることによって行った。
【００７９】
異種接合トランスジェニックラットを明：暗（LD）12：12周期下で飼育した。母体および仔を屠殺時まで群飼した。母体および仔を含むケージを光制御した箱に移し、明暗サイクルを6時間ずつ前進または後退させた。ケージの底面から約35cm上に配置した40W蛍光灯（F40CW／RS／EW、Philips）から照射した。光強度は30〜60μW／cm２であり、これはケージレベルでは約100〜200ルクスに相当する。屠殺時点で哺乳動物は15〜41日齢であった。雄性および雌性ラットの両方を用いたが、性差は認められなかった。
【００８０】
光周期の位相変位から1サイクル後または6サイクル後に哺乳動物を屠殺し、位相変位の程度を評価するためにSCNを培養した。すべての哺乳動物でSCN内のリズムは急速かつ明瞭に位相変位を呈し、光周期をいずれの方向に変位させた後にもほぼ完全に1サイクル分変位した。この変位から6サイクル後には、SCNリズムは光周期との定常的な関係を完全に再び取り戻した。光周期変位はSCNの周期性振幅に対して認めうる影響を及ぼさなかった（図3および図4）。
【００８１】
実施例 7 ：無傷ラットにおける位相前進および位相後退の影響
本発明者らは無傷ラットにも同一の位相変位パラダイムを適用し、光周期変位の前後で移動活動リズムを記録した。
【００８２】
雄性異種接合トランスジェニックラットを離乳させ、4週齢の時点で個々のホイール走行ケージに移した。それらを以前に与えていたものと同じ明：暗条件下で飼育した。移して2日後に哺乳動物をペントバルビタールナトリウムで麻酔し、腹膜腔に無線送信機（VM-FH、MiniMitter）を移植した。一般的活動はデータ探索系（Data Quest system）（Data Science Intl.）を用いて観測した。照明条件は組織培養実験に用いたものと同一とした。2週間同調させた後、明：暗サイクルを前進または後退させた。
【００８３】
ほとんどの行動的または生理的な概日リズムと同じように、これらの光周期変位に対するラットの活動リズムの反応は即時的ではなく、非対称性であった。新たな位相への同調は光周期の後退後の方が前進後よりも早く起こった。図5に示したトランスジェニックラットの一般的活動の記録でもこれが認められた。行動の周期性は、同一の処理を行った哺乳動物から切り出した培養SCNから測定された周期性とは明らかに異なって変位した。
【００８４】
実施例 8 ：トランスジェニックマウス由来の SCN のリズムの検出
SCNからの発光は一貫して確固たるリズムを呈し、このことから、組換えmPer1-luc導入遺伝子が正常な概日性機構による制御下でリズムを有するように転写されることが示された（図6）。
【００８５】
産業上の利用可能性
本発明は、所望の遺伝子を概日リズムに従ってリズムを有するように発現するDNAを提供する。また、本発明は、所望の遺伝子を概日リズムに従ってリズムを有するように発現するトランスジェニック哺乳動物も提供する。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、中枢神経系および末梢組織における概日振動を観測するために用いることができる。
【００８６】
複数の時間帯にまたがる高速移動、および勤務時間の急激な変化はいずれも、位相が変位した光（および他の環境）周期にSCNを曝露されることで、ヒトの概日系に対する入力信号に突然の大きな変化を引き起こす。上記の実施例で用いた位相変位パラダイムは、西から東（位相前進）および東から西（位相後退）への高速大西洋横断飛行と類似している。
【００８７】
多細胞生物では、概日振動子は、環境周期と関連して生物体の活動を調節する生物時計として働き、内的な時間的枠組みを提供する多組織系へと組織化されると考えられる。哺乳動物は比較的サイズが大きく、複数の器官が体内で協調して働いている。本発明では、これらの末梢組織の振動位相にSCNのものと比べて遅延が認められた。概日性機構を特徴づける多くのリズム間の位相関係に順応性があるならば、そのような位相関係を破壊すると有害な結果を招くと考えられる。これこそが、子午線をまたぐ高速移動による疲労感や、さらに重大なことに米国の労働人口の20％以上が行っている交代制勤務スケジュールによる疲労感の一般的な説明である可能性が高い（米国議会技術評価局（U.S. Congress, Office of Technology Assessment）、「生物リズム：労働者への影響（Biological Rhythms：Implications for the Worker）」、OTA-BA-463（U.S. Government Printing Office、Washington、DC、1991）。
【００８８】
本発明により、中枢のペースメーカであるSCNに加えて、脳内領域および末梢神経系、または末梢器官および組織における振動の関係を解析することが可能となる。本発明のDNAまたはトランスジェニック哺乳動物は、時差症候群、交代制勤務による睡眠障害、睡眠相後退症候群、および不規則性睡眠覚醒障害などの、概日リズムが関与する障害を治療するための化合物をスクリーニングするために有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1（A）は、マウスPer1-luc導入遺伝子の概略図を示す。太線はmPer1断片を示し、白抜きバーと斜線入りボックスはそれぞれルシフェラーゼ遺伝子およびポリアデニル化断片の位置を示す。丸印はE-ボックスを表す。図1（B）は、Per1-lucトランスジェニックラットから外植した培養SCNからの生物発光の代表的な概日リズムを示す。黒と白のバーは動物に対するそれ以前の明：暗条件を示す。外植は消灯直前（矢印）に行い、発光を直ちに観測した。主観的昼の中央部をピークとする約24時間のリズムがインビトロで32日間続き、その時点で培養物をアッセイから取り出した。2週間以上にわたって維持したいくつかのSCN培養物では、その期間を通じて周期性が持続した。Per1-lucトランスジェニックラットの別の系統である「W(perl)5」ではこれよりも強度の低い同様の周期性が認められた。この系統でも、SCNリズムは主観的昼の中央部にピークがあり、インビトロで28日間持続した。
【図２】 同一の動物「W(perl)1」に由来するいくつかの組織からインビトロで示された概日リズムを示す。同じ動物に由来する種々の組織は、異なる位相関係を有する概日リズムを発現している。組織は消灯直前（矢印）に外植した。SCNは主観的昼の中央部にピークのある明瞭な概日リズムを示したが、骨格筋、肝臓および肺からのリズムはすべて主観的夜の中央部前後にピークがあった。筋肉、肝臓、および肺におけるリズムは、常に2〜6サイクル後には減衰した。
【図３】 位相前進性および位相後退性の光周期におけるSCN振動子の再同調を示す。インビボでの明：暗の履歴により、培養SCNにおける概日性Per1-luc発現の位相が決定される。位相変位のない動物（対照）、前進した動物、および後退した動物から採取したSCN由来の生物発光を当初の明暗サイクルに対してプロットした（0は位相変位前に点灯した時点である）。その当初の光周期を延長したものを図の下部に示す。x軸は「カウント／分」であるが、わかりやすいように軌跡を垂直方向に移動させている。
【図４】 SCNにおける光周期の6時間の後退および前進後の急速な再同調を示す。位相変位のない対照のSCN概日リズム、および光周期を6時間前進（+）または後退（-）させた後の動物のSCNリズムの平均ピーク時間を示す。培養物における最初のピークをピーク時間の決定に用い、これは各サイクルにおける最高点での時間を検出することによって行った。位相変位から1回目（○）および6回目（●）の全サイクルでの平均ピーク時間を示す（バーは±SEMを示す）。各丸印の脇に動物数を示す。消灯3時間前または9時間前に屠殺した哺乳動物から得た予備データ（示していない）により、これらの屠殺時点がSCNリズムの位相に影響しないことが示されている。
【図５】 位相前進性および位相後退性の光周期におけるPer1-lucトランスジェニックラットからの代表的な移動活動記録を示す。移植した送信機を用いて一般的活動性を観測し、ダブルプロット表示を行った。当初の明：暗サイクル（図の上部の黒および白のバー）から、矢印で示した日に、6時間前（左図）または6時間後（右図）に位相を変位させた（新たな光周期は図の下部に白および黒のバーで示している）。光周期前進後の最初の5サイクルでの消灯時のマスキング（バースト状の活動）に注意されたい。明から暗への移行が移動に及ぼす直接的作用は夜行性齧歯類で一般に認められ、時計によって制御された行動の位相を示すものではない。完全な再同調に至るまで肉眼観察によって計測したところ、位相前進後には約6.2±0.5サイクル（SEM、n=10）、位相後退後には1.8±0.3サイクル（SEM、n=10）を要した。斜線入りの三角印は、SCNピーク時を図4にプロットした動物の屠殺時点を示している（位相変位後の1回目および6回目のサイクル）。以前に、ウィスターラットの同じ系統で、移動周期性において同様の位相変位軌道が観察されている（K. Honma、S. Honma、T. Hiroshige、「生物リズム（Biological Rhythms）」（Hokkaido University Press、Sapporo、1989）、日本語）。
【図６】 Per1-lucトランスジェニックマウスから外植した培養SCNからの生物発光の代表的な概日リズムを示す。黒と白のバーは動物に対するそれ以前の明：暗条件を示す。外植は消灯直前（矢印）に行い、発光を直ちに観測した。主観的昼の中央部をピークとする約24時間のリズムがインビトロで4日間続き、その時点で培養物をアッセイから取り出した。
【配列表】
Claims (16)
- 哺乳動物の体内で機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の単離Period 1プロモーターDNA。
（ａ）配列番号：1記載の塩基配列の第23位〜6787位を含むDNA
（ｂ）配列番号：１記載の塩基配列の第23位〜6787位からなる配列に１または数個の塩基が挿入、置換、欠失、付加したDNA
（ｃ）配列番号：１記載の塩基配列の第23位〜6787位からなるDNA - 哺乳動物の体内で機能的に連結した遺伝子のリズムを有する発現を誘導する、下記（ａ）または（ｂ）に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
（ａ）配列番号：２に記載の塩基配列を含むDNA
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列に１または数個の塩基が挿入、置換、欠失、付加したDNA - 哺乳動物が齧歯類である、請求項１または２に記載の単離Period 1プロモーターDNA。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のPeriod 1プロモーターおよび該プロモーターと機能的に連結した遺伝子を含む組換えDNAであって、該遺伝子が哺乳動物の体内で該プロモーターの制御下でリズムを有するように発現される、組換えDNA。
- 遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項４記載の組換えDNA。
- 哺乳動物が齧歯類である、請求項４記載の組換えDNA。
- 遺伝子が請求項１〜３のいずれか一項に記載のPeriod 1プロモーターDNAの制御下でリズムを有するように発現される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項７記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項８記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 哺乳動物が齧歯類である、請求項８記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 齧歯類がマウスおよびラットからなる群より選択される、請求項１０記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 請求項７記載の哺乳動物の子孫。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のDNAを含む形質転換体。
- 形質転換体が請求項７〜１２のいずれか一項に記載の哺乳動物に由来する、請求項１３記載の形質転換体。
- 請求項１３記載の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）該形質転換体を該化合物で処理する段階；および
（b）処理した形質転換体における該導入遺伝子の発現を測定する段階
を含む方法。 - 請求項７記載の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、
（a）該哺乳動物を該化合物で処理する段階；および
（b）処理した哺乳動物における該導入遺伝子の発現を測定する段階
を含む方法。
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