KR102659588B1 - Gng8 유전자를 결손시킨 뇌신경발달장애 동물 모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Gng8 유전자를 결손시킨 동물 모델에 관한 것으로, 본 발명의 GNG8(G protein subunit γ 8) 유전자 결손 마우스는 현저한 기억력 감소 및 인지 장애를 가지며, GNG8 유전자 결손으로 인해 특정 뇌 부위에서 콜린성 신경전달물질이 감소함으로써 뇌발달장애로 인한 공간 기억 및 인지기능 저하를 나타내므로, 상기 동물 모델을 고삐핵(habenular) 관련 뇌발달장애, 특히 뇌신경발달장애 등의 원인론과 병리를 연구하는 데 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 Gng8 유전자를 결손시킨 동물 모델에 관한 것이다.
기억은 의식적 또는 무의식적인 상태에서 과거의 일을 생각해내는 능력을 말한다. 기억은 기술의 습득, 습관 등이 포함되는 무의식적인 비서 술성 기억(nondeclarative memory)과 과거에 일어났던 사실이나 사건과 같이 의식적으로 재생이 가능한 서술성 기억(declarative memory)으로 나눌 수 있다. 그러나, 운전이나 피아노를 치는 것과 같은 복잡한 행동도 습관화 되면 무의식적으로 행할 수 있듯이 반복에 의하여 서술성 기억이 비서술성 기억으로 전환될 수 있다. 서술성 기억은 현재 주어지는 정보에 집중하고 수초 동안만 임시로 저장하는 작업기억(working memory), 수시간 내지 수일간 기억이 지속되는 단기기억(short-term memory), 오랜 시간이 지난 과거의 일을 기억하는 장기기억 (remote memory) 등으로 구분된다. 단기기억은 현재 진행되고 있는 사건에 대한 기억이 장기기억으로 전환되는 기간을 포함한다. 이 기간 동안 기억으로서의 저장이 취약하여 망각되기 쉬우나, 일단 장기기억으로 저장되면 뇌에 심각한 손상이 있는 경우에도 쉽게 잊어버리지 않는다. 기억은 세 가지 단계로 이루어질 수 있는데, 첫 번째로 새로운 정보 또는 지식을 외워서 뇌에 입력하는 입력 단계, 두 번째는 상기 뇌에 입력된 정보 또는 지식을 뇌에 저장하는 저장 단계, 세 번째는 상기 저장된 정보 또는 지식을 다시 생각하는 회상 단계가 그것이다. 상기 세 단계 중에 어느 하나라도 이상이 생기면 정보 또는 지식을 정확하게 기억할 수 없게 되는 현상 즉, 기억력 저하 내지 감퇴가 일어날 수 있다. 상기 기억력의 저하 내지 감퇴는 뇌조직의 신경세포에서 아세틸콜린에스터라제의 작용으로 인한 아세틸콜린의 양의 감소, βA(β-amyloid) 등으로 유발된 신경독성 등의 다양한 원인으로 인한 뇌세포의 괴사가 원인인 것으로 알려져 있으며, 알츠하이머병, 지적장애, 자폐 스펙트럼 장애(ASD), 주의력 결핍/과잉행동장애(ADHD)와 같은 뇌신경발달장애의 주된 증상 중 하나이다. 이와 같은 기억·학습력을 관장하는 뇌 부위로 해마, 전전두엽피질, 편도체 등이 주로 보고 된다. 간뇌의 시상상부측에 위치한 고삐핵(habenula)은 니코틴 중독 등에 관여한다고 주로 알려져 있다. 고삐핵에는 인지 기능 조절에 중요한 신경전달물질인 아세틸콜린성 뉴런이 많이 분포하고 있고, 해마와 상호 투사하는 내측중격(medial septum)이 고삐핵에도 투사하므로 기억에도 관여할 수 있음을 시사한다.
한편, 해마 및 피질부위의 콜린성 시스템(cholinergic system)의 손상 및 기능저하 (콜린신경계통의 기능 장애)가 알츠하이머 질환의 특징적 증상인 기억과 인지 기능 장애에 기여하는 것으로 알려져 있다. 전뇌의 Meynert 기저핵(basal nucleus of Meynert) 콜린성 뉴런은 측두엽, 해마 및 편도체(amygdala)와 연관되어 기억과 인지 기능에 관계하게 되는데, 알츠하이머 질환자의 뇌에서는 측두엽에서 78%, 해마에서 60%, Meynert 기저핵에서는 67%까지 신경세포가 감소하는 것으로 알려져 있다. 뇌세포가 세포독성에 의해 손상을 입게 되면 어떠한 정보의 전달, 즉 신경전달물 질의 대사에 장애가 있게 되며 이것이 기억인지장애를 일으키는 원인이 된다. 이미 많은 연구자들이 알츠하이머 병에서 아세틸콜린(acetylcholine)과 이의 합성에 관계되는 효소(choline acetyltransferase)의 선택적인 감소를 꾸준히 보고하여 왔다. 더구나, 알츠하이머병 환자의 뇌에서는 정상적인 사람의 뇌기능에 비해 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor), 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarinic acetylcholine receptor)의 감소뿐만 아니라 콜린의 재흡수와 아세틸콜린의 분비 기능 또한 저하되어 있다.
이러한 콜린신경계통의 장애를 완화시키기 위해 여러 가지 콜린성 약물이 개발되었으나, 그 중 현재까지 가장 효과적이고 많이 쓰이고 있는 것은 아세틸콜린분해효소 억제제(acetylcholinesterase Inhibitor: AchEI)이다. 현재 FDA의 승인을 얻어 시판되고 있는 것은 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민 (galanthamine)이 있으며, 이들 약물은 시냅스 틈에서 아세틸콜린의 분해를 억제하여 농도를 높여줌으로써 치료효과를 나타낸다. 이들 약물은 초반에는 인지 기능이나 일상생활의 호전을 보이나 9개월에서 1년 정도 지나면 투여 이전 상태로 돌아간다는 점에서 병의 진행을 근본적으로 막지 못하며, 아세틸콜린의 증가로 인한 오심, 설사, 식욕감퇴, 현기증, 근육 경련, 수면 장애 등의 부작용이 있어왔다.
본 발명의 목적은 뇌신경발달장애 동물 모델 제작용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 뇌신경발달장애 동물 모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 뇌신경발달장애 동물 모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 뇌신경발달장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 뇌신경발달장애의 조기 진단 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 뇌신경발달장애의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 뇌신경발달장애의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 GNG8 유전자를 결손(knock-out)시킨 뇌신경발달장애 동물 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌신경발달장애 동물 모델 제작용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌신경발달장애 동물 모델의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌신경발달장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GNG8을 포함하는 뇌신경발달장애의 조기 진단 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 GNG8의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경발달장애 진단용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 뇌신경발달장애의 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서는 신규한 GNG8(G protein subunit γ 8) 유전자 결손 마우스를 제작하였으며, 상기 결손 마우스가 현저한 기억력 감소 및 인지 장애를 가지는 것을 행동학적 실험을 통해 확인하였고, GNG8 유전자 결손으로 인해 특정 뇌 부위에서 콜린성 신경전달물질이 감소함으로써 뇌발달장애로 인한 공간 기억 및 인지기능 저하를 나타내는 것을 확인하였으므로, 상기 동물 모델을 고삐핵(habenular) 관련 뇌발달장애, 특히 뇌신경발달장애 등의 원인론과 병리를 연구하는 데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 WT 마우스의 내측 고삐핵(medial habenula, MHb), 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN) 및 내측중격(medial septum, MS)에서의 Gng8 단백질의 발현량을 면역조직화학염색으로 확인하고 정량한 도이다 (***p<0.001).
도 2는 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice)의 내측 고삐핵(medial habenula, MHb), MHb의 복측 아핵(MHb ventrolateral subnuclei, MHbV1), 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN) 및 앞쪽 아핵(Rostral subnucleus, IPR)에서의 Gng8 단백질 및 콜린아세틸전달효소(ChAT)의 발현량을 면역조직화학염색으로 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 WT 마우스의 MHb에서 아세틸콜린 및 콜린아세틸전달효소의 발현량을 ELISA 및 면역조직화학염색으로 정량한 도이다:
a: 효소결합면역흡착검사(ELISA)를 통해 확인한 MS, 내측 고삐핵(MHb) 및 해마(hippocompus, HC)의 아세틸콜린(ACh)의 발현량; 및
b: 면역조직화학염색으로 확인한 내측 고삐핵(MHb), 앞쪽 아핵(IPR) 및 중앙 아핵(IPC)의 Gng8 및 콜린아세틸전달효소(ChAT)의 발현량.
도 4는 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 WT 마우스의 기억력 및 인지기능 저하를 행동학적으로 분석하여 확인한 도이다:
a: Y자 미로 실험 결과;
b: 수동회피실험 결과; 및
c 및 d: 수중 미로 실험결과.
도 5는 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 WT 마우스에 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR) α4β2의 효능제를 농도별로 처리 후 기억력 및 인지기능 저하를 수중 미로 실험으로 분석하여 확인한 도이다:
a: 탈출 지연시간; 및
b: 표적 지역의 머문 시간.
도 6은 GNG8 유전자에서 결손된 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice)의 내측 고삐핵(medial habenula, MHb), MHb의 복측 아핵(MHb ventrolateral subnuclei, MHbV1), 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN) 및 앞쪽 아핵(Rostral subnucleus, IPR)에서의 Gng8 단백질 및 콜린아세틸전달효소(ChAT)의 발현량을 면역조직화학염색으로 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 WT 마우스의 MHb에서 아세틸콜린 및 콜린아세틸전달효소의 발현량을 ELISA 및 면역조직화학염색으로 정량한 도이다:
a: 효소결합면역흡착검사(ELISA)를 통해 확인한 MS, 내측 고삐핵(MHb) 및 해마(hippocompus, HC)의 아세틸콜린(ACh)의 발현량; 및
b: 면역조직화학염색으로 확인한 내측 고삐핵(MHb), 앞쪽 아핵(IPR) 및 중앙 아핵(IPC)의 Gng8 및 콜린아세틸전달효소(ChAT)의 발현량.
도 4는 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 WT 마우스의 기억력 및 인지기능 저하를 행동학적으로 분석하여 확인한 도이다:
a: Y자 미로 실험 결과;
b: 수동회피실험 결과; 및
c 및 d: 수중 미로 실험결과.
도 5는 본 발명의 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 WT 마우스에 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR) α4β2의 효능제를 농도별로 처리 후 기억력 및 인지기능 저하를 수중 미로 실험으로 분석하여 확인한 도이다:
a: 탈출 지연시간; 및
b: 표적 지역의 머문 시간.
도 6은 GNG8 유전자에서 결손된 서열을 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
일 측면에서, 본 발명은 GNG8(G protein subunit γ 8)를 포함하는 뇌신경발달장애 (또는 뇌발달장애)의 조기 진단 마커에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 뇌신경발달장애는 기억 저하, 학습력 저하 또는 인지 저하를 동반할 수 있으며, 콜린성 뇌신경발달장애 또는 인지 저하일 수 있다.
일 구현예에서, GNG8 유전자는 뇌신경발달장애에 대해 특이적으로 발현이 감소할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 GNG8의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경발달장애의 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, GNG8의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 GNG8의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, GNG8의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 GNG8의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 GNG8 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 GNG8 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 Cas9 단백질(Cas9); 및 GNG8(G protein subunit γ 8) 유전자 단편에 상보적으로 결합할 수 있는 crRNA와 tracrRNA 간에 부분적인 염기-쌍 형성에 의해 형성된 회문 구조를 가진 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는, 뇌신경발달장애 동물 모델 제작용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 동물 모델은 인간을 제외한 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스, 생쥐, 토끼 등을 포함하는 모든 동물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 동물은 태반을 통해 태내의 태아를 기르는 동물일 수 있으며, 포유동물일 수 있고, 인간을 제외한 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스, 토끼, 래트, 모르모트 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 마우스인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, GNG8 유전자 단편은 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 뇌신경발달장애는 장기 기억력 감소 및 인지기능 저하를 동반할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터; 및 GNG8 유전자에 특이적인 sgRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "혼성화"는 하나 이상의 핵산이 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 핵산 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현"은 핵산이 DNA 주형으로부터(예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 이후에 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현 억제"란 표적 유전자의 발현 또는 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 경우에, RNA 분자는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 또 다른 경우에, 이들 서열은 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보좀의 생성시 번역되지 않는다. 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 특정 박테리아 세포에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열이다. 전사 및 번역을 좌우하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 수행하며, 하기 기술된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 발현될 목적 생성물을 암호화하는 핵산은 각 박테리아 세포에 대한 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 이는 조정 서열 예컨대, 본 명세서에 걸쳐 기술된 조정 서열, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종료 시그날을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "CRISPR(clustered, regular interspaced, short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated 9)" 시스템은 1987년에 외부 플라스미드와 바이러스의 분해와 관련된 '면역 시스템'으로 처음 발견되었으며, 그 이후로 상기 시스템은 여러 응용이 가능하고 매우 효율적인 유전체 편집 기술로 널리 사용되어져 왔다. 이는 흔히 유전자 가위라 불리는 endonuclease splicing 기술로서 1세대인 ZFNs(Zinc-Finger Nucleases)와, 2세대인 TALENs(Transcription Activator-like Effector Nucleases)보다 효율적이고 손 쉽게 유전자를 조작할 수 있는 이점이 있다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템은 특정 유전자 내에 표적 위치(target site)와 동일한 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)의 유도에 의해 Cas9의 특정 유전자 내 target site를 공격하여 유전자 삽입과 손실을 일으켜 유전자의 기능을 무력화하는 원리로 작동한다. 이와 같이 만약 염색체 내 특정 부분에 위치한 유전자에 인위적으로 삽입, 손실, 변형 등을 유도할 수 있다면 유전학 및 분자 생물학 연구뿐만 아니라 특정 유전자와 관련된 질병 연구에도 널리 활용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GNG8 유전자를 결손(knock-out)시킨 뇌신경발달장애 동물 모델에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 동물 모델은 장기 기억력 감소 및 인지기능 저하를 동반할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 동물 모델은 콜린성 뇌신경발달장애 또는 인지 저하 동물 모델일 수 있다.
일 구현예에서, GNG8 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있으며, GNG8 유전자에서 결손된 서열은 도 6과 같다.
일 구현예에서, 본 발명의 동물 모델은 내측 고삐핵(medial habenula, MHb) 및 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN)에서 GNG8 유전자가 발현되지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 동물 모델은 WT 마우스에 비해 내측 고삐핵의 앞쪽 아핵(Rostral subnucleus, IPR) 및 경간핵에서 콜린아세틸전달효소(choline acetyltransferase, ChAT)가 감소할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 동물 모델은 WT 마우스에 비해 내측 고삐핵에서 아세틸콜린이 감소할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 동물 모델은 WT 마우스에 비해 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN)에서 내측 고삐핵으로 투사하는 콜린아세틸전달효소가 감소할 수 있다.
본 발명에서, "동물 모델"이란 인간의 질환과 아주 유사한 형태의 질환을 가진 동물 모델을 말한다. 인간의 질환 연구에 있어 질환 동물 모델이 의미를 갖는 것은 인간과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질환 연구에 있어 생체의학 동물 모델은 질환의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 동물 모델의 연구를 통해 질환과 관련된 발병기전을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
본 발명에서, "동물" 또는 "실험동물"이란 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로 부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류 (예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류 (예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 GNG8 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 및 Cas9 단백질을 혼합하여 마우스 수정란에 미세 투여하는 단계; 수정란에서 GNG8 유전자 결손 배아를 선별하는 단계; 선별한 배아를 암컷 마우스에 도입하여 GNG8 유전자 결손 마우스를 얻는 단계; GNG8 유전자 결손 마우스 간에 교배를 통하여 2세대 마우스를 얻는 단계; 및 2세대 마우스끼리 교배시켜 동형접합 재조합 마우스를 제작하는 단계를 포함하는, 뇌신경발달장애 동물 모델의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 뇌신경발달장애는 장기 기억력 감소 및 인지기능 저하를 동반할 수 있다.
일 구현예에서, GNG8 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 특정한 조성물을 도입하는 것을 의미하며, "도입", "주입", "주사" 또는 "감염"과 혼용되어 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 뇌신경발달장애 동물 모델에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 뇌신경발달장애의 증상 회복이 나타나는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 뇌신경발달장애 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 뇌신경발달장애의 증상 회복은:
ⅰ) 장기 기억력 감소 또는 인지기능 저하가 완화됨;
ⅱ) 내측 고삐핵 및 경간핵에서 GNG8 유전자 발현이 증가됨;
ⅲ) 내측 고삐핵의 앞쪽 아핵 및 경간핵에서 콜린아세틸전달효소가 증가함;
ⅳ) 내측 고삐핵에서 아세틸콜린이 증가함; 및
ⅴ) 경간핵에서 내측 고삐핵으로 투사하는 콜린아세틸전달효소가 증가함으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 본 발명에 의한 뇌신경발달장애 동물 모델에 후보 물질을 처리하고, 상기 후보물질에 의하여 뇌신경발달장애 증상이 예방되거나, 치료되거나, 대조군 물질에 비하여 예후가 증진된 경우에 후보물질을 뇌신경발달장애의 예방제 또는 치료제로 결정하는 것이다.
본 발명에서 "치료" 또는 "경감"이란 시험 물질 또는 후보 물질의 투여로 뇌신경발달장애의 증세를 치료, 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 구체적으로, "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능 여부를 포함한다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화 (palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 뇌신경발달장애 치료용 후보 화합물 (또는 시험 물질)은 단일 화합물, 화합물들의 혼합물 (예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품 (예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme) 일 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
뇌신경발달장애가 유발된 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 뇌신경발달장애 동물 모델에 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여 또는 경피 투여 등의 방법이 포함될 수 있고, 사료 또는 음용수에 포함시켜 경구 투여 형태로 섭식시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 시험 물질이 뇌신경발달장애 증상의 경감 또는 치료에 효과가 있는지 평가하기 위해서 대조군을 이용한 스크리닝이 함께 수행될 수 있다. 대조군이란 시험 물질 처리 후 유의한 변화를 관찰하기 적합한 동물 모델 실험군을 의미하는 것으로, GNG8 유전자가 결실되지 않은 동물 모델, 시험 물질로 처리되지 않은 동물 모델, 기존의 알려진 뇌신경발달장애 치료제로 처리한 동물 모델, 다른 유전자 혹은 유도방법을 통해 뇌신경발달장애가 유발된 동물 모델 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 측면에서 본 발명의 방법은 대조군 동물 모델을 제조하는 단계, 대조군 샘플에 후보 화합물을 처리하는 단계 및 후보 화합물이 뇌신경발달장애의 치료 또는 경감의 효과가 있는지를 대조군과 비교 평가하여 선정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 검사 대상체로부터 분리된 시료로부터 GNG8의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 b) 정상 대조군 시료의 상응하는 결과와 비교하는 단계를 포함하는 뇌신경발달장애의 조기 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인지기능 저하 마우스 모델 제작
시작코돈(ATG) 바로 뒤에 CRISPR RNA의 타겟 사이트(서열번호 2: 5'-CAACATGGCCAAGATTGCTG-3')를 디자인하고, sgRNA(single guide RNA) (crRNA+tracrRNA) 합성을 위해 벡터(pT7-gRNA)를 Esp3I로 절단하고 두 개의 올리고머 (서열번호 3: 5'-TAGGCAACATGGCCAAGATTGCTG-3', 서열번호 4: 5'-AAACCAGCAATCTTGGCCATGTTG-3')를 어닐링하여 벡터에 삽입 접합하였다. 클로닝된 벡터를 BamHI 제한효소로 절단하고 정제하여 sgRNA 합성을 위한 주형(template) DNA로 사용하고, MEGAshortscript T7 Kit(Ambion)를 사용하여 제조사 메뉴얼대로 sgRNA를 합성하고 페놀-클로로포름(phenol-chloroform) 정제법으로 정제하였다. 정제한 sgRNA를 정량하여 Cas9 단백질과 함께 혼합한 후, C57BL6/J 마우스 암컷과 수컷을 교배하여 얻은 수정란에 미세 투여하여 유전자 재조합을 실행하고 다시 암컷 마우스에게 넣어주어 키운 유전자 재조합 마우스를 C57BL6/J 마우스와 교배 후 낳은 자식끼리 다시 교배시켜 동형접합 재조합 마우스를 만들었다. 이후 근친교배를 통하여 안정된 재조합 마우스 (Gng8 KO mice)를 기억력 감소 표현형을 나타내는 인지기능 저하 마우스 모델로서 만든 후, 마우스들을 22~24℃에서 식사와 물의 자유 공급하면서 12시간 주야 주기로 사육하였다.
실시예 2. 인지기능 저하 마우스 모델의 생리학적 분석
2-1. Gng8 단백질 발현 패턴 분석
9주령 수컷 재조합 마우스 (Gng8 KO mice)를 펜토바비탈(80mg/kg, i.p.)로 마취한 후 헤파린(10U/ml)을 섞은 0.9% 생리식염수로 경심관류를 진행하고 4% 파라폼알데하이드(paraformaldehyde, PFA)를 이용하여 고정하였다. 뇌를 적출 후 4% 파라폼알데하이드(paraformaldehyde, PFA)를 이용하여 12시간 고정하고 30% 자당(Sucrose)에 4℃에서 48시간 인큐베이션하였다. 그 후 30μm로 동결절편을 하고 고삐핵(habenula) 및 경간핵(interpeduncular nucleus)을 PBST(인산완충생리식염수 및 0.05%~0.1 tween 20의 혼합물)에 3회 세척하고 0.5% 트리톤X-100(tritonX-100)을 포함한 PBST에 30분간 인큐베이션하였다. 그 후 PBST(인산완충생리식염수 및 0.05%~0.1 tween 20의 혼합물)로 3회 세척한 뒤 블로킹 용액 (인산완충생리식염수, 3% 소혈청알부민, 10% 정상혈청 및 0.1% 트리톤X-10을 혼합한 PBST)에 1시간 동안 처리하였다. 그 뒤, PBST (인산완충생리식염수 및 0.05%~0.1 tween 20의 혼합물)로 3회 세척하고 1% 소혈청알부민을 포함하는 면역염색 1차 항체 (항-Gng8 항체) 용액을 4℃에서 12시간 동안 처리하였다. 그 뒤, 조직을 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 3회 세척한 후 일치하는 2차 항체로 2시간 동안 실온에서 처리하였다. 조직을 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 세척한 후 DAPI가 포함된 VECTASHIELD(Vector laboratories Inc., CA, USA)로 처리하였다. 그 뒤, 공초점현미경(LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany and FV10i, Olympus, Waltham, MA, U.S.A.)으로 조직에서 내측 고삐핵(medial habenula, MHb), 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN) 및 내측중격(medial septum, MS)의 형광이미지를 촬영하고, ImageJ 프로그램으로 형광의 세기를 정량화하였다. 또한 두 이미지의 Colocalization을 비률을 측정하는 Mander의 계수를 Fiji image 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 데이터는 독립표본 t-검정으로 검사하였으며 모든 데이터는 SPSS 23(IBM, 일리노이, 미국)으로 분석하였다. 모든 데이터는 평균±표준오차(S.E.M)으로 표시하였으며 유의성은 p<0.05 수준에서 수행하였다.
그 결과, 야생형 마우스(WT) (C57BL/6N)의 내측 고삐핵(medial habenula, MHb) 및 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN)에서 Gng8 단백질의 높은 발현량이 확인된 반면, Gng8 KO 마우스의 내측 고삐핵 및 경간핵에서는 Gng8 단백질 발현량이 거의 없는 정도로 현저히 적게 나타났다 (***P<0.001) (도 1).
2-2. MHb에서 Gng8 발현 세포 확인
항-Gng8 항체 및 항-ChAT 항체를 1차 항체로 이용하여 9주령 수컷 재조합 마우스 (Gng8 KO mice)의 뇌를 상기 실시예 2-1에서와 같이 적출하여 조직면역염색하고, 공초점현미경으로 내측 고삐핵의 복측 아핵(MHb의 ventrolateral subnuclei, MHbV1) 및 앞쪽 아핵(Rostral subnucleus, IPR)의 형광이미지를 촬영한 뒤, ImageJ 프로그램으로 형광의 세기를 정량화하였다. 또한 두 이미지의 Colocalization을 비률을 측정하는 Mander의 계수를 Fiji image 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 내측 고삐핵의 복측 아핵 및 앞쪽 아핵의 다수의 지역에서 Gng8의 발현 세포와 콜린아세틸전달효소(ChAT) 양성 콜린성 신경세포가 공통적으로 위치하였으며 (도 2), Gng8가 주로 내측 고삐핵에서 발현되고, 특히, 내측 고삐핵의 복측 아핵 및 앞쪽 아핵에서 많이 발현되는 것으로 나타났다.
2-3. MHb에서 아세틸콜린 및 콜린아세틸전달효소 정량 분석
Gng8의 인지기능 저하의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 효소결합면역흡착분석(ELISA)를 이용하여 아세틸콜린의 양을 Gng8 KO 마우스 및 야생형 마우스(WT)의 내측중격(medial septum, MS), 내측 고삐핵(medial habenula, MHb) 및 해마(hippocompus, HC)에서 각각 측정하였으며 아세틸콜린의 양은 총 아세틸콜린에서 유리 아세틸콜린의 양을 빼서 도출하였다. 구체적으로, 9주령 Gng8 KO 마우스 및 야생형 마우스를 각각 펜토바비탈(80mg/kg, i.p.)로 마취한 후 뇌를 바로 적출하여 1mm 두께로 자른 뒤 차가운 매트릭스에 보관하였다. 그 후, 내측중격(medial septum, MS), 고삐핵(habenula) 및 해마(hippocampus)를 분리하여 액체질소로 급속냉각후 -80℃에서 보관하였다. ACh 시험 완충용액 (1mg의 얼린 조직/100μl의 메탄올)을 얼음에서 30분간 인큐베이션한 후 4℃에서 1000g로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 콜린/아세틸콜린 ELISA 키트 (Abcam, 캠브리지, 영국)를 이용하여 제조업체의 사용법에 따라서 분석하고 데이터는 독립표본 t검정으로 처리하였다. 그 결과, WT 마우스에 비해 Gng8 KO 마우스에서 아세틸콜린이 내측 고삐핵(medial habenula, MHb)에서 유의성(**P<0.01)있게 감소하는 것으로 나타났다 (도 3A).
또한, 항-Gng8 항체 및 항-ChAT 항체를 1차 항체로 이용하여 9주령 수컷 재조합 마우스 (Gng8 KO mice) 및 야생형 마우스(WT)의 뇌를 상기 실시예 2-1에서와 같이 적출하여 조직면역염색하고, 공초점현미경으로 내측 고삐핵, 경간핵, 앞쪽 아핵(Rostral subnucleus, IPR) 및 중앙 아핵(Central subnucleus, IPC)의 형광이미지를 촬영한 뒤, ImageJ 프로그램으로 형광의 세기를 정량화하였다. 아울러, 두 이미지의 Colocalization을 비률을 측정하는 Mander의 계수를 Fiji image 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 그 결과, Gng8 KO 마우스의 내측 고삐핵(medial habenula, MHb), IPR 및 IPN에서 콜린아세틸전달효소(choline acetyltransferase, ChAT)의 양이 Gng8 KO 마우스에서 WT 마우스에 비해 현저하게 감소하는 것으로 나타났다 (MHb: *P<0.05, IPR 및 IPC: ***P<0.001) (도 3B).
이를 통해, Gng8 KO 마우스의 내측 고삐핵(medial habenula, MHb)의 아세틸콜린 감소는 내측 고삐핵의 콜린아세틸전달효소의 감소로 인한 것임을 알 수 있었다.
상기 결과들을 통해, 뇌신경발달장애의 유전 요인을 모사한 본 발명의 동물 모델에서 기억결핍을 유발한 신규 중추신경 발달 병리 기전을 확인할 수 있었으며, 뇌 부위별 아세틸콜린 농도 분석을 통해, IPN에서 MHb로 투사하는 아세틸콜린 효소가 현저히 감소함을 확인함으로써, 신규회로인 IPN-MHb의 콜린성 농도 감소로 인하여 기억력감소를 유발함을 유추할 수 있다.
실시예 3. 인지기능 저하 마우스 모델의 행동학적 분석
3-1. 단기 기억력 확인
Gng8 단백질 낙아웃된 본 발명의 재조합 마우스의 단기 기억력 변화를 확인하기 위해 Y자 미로 실험(Y maze test)을 수행하였다. 구체적으로, 9-11 주령의 수컷 재조합 Gng8 KO 마우스 (n=7) 및 WT 마우스 (n=10)를 Y 미로에 각각 배치한 후 5분간 자유롭게 탐색하게 둔 뒤 minor modifications60 으로 움직임을 녹화하고 녹화된 비디오를 분석하였다. 데이터 처리는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 수행하였다. 이 후의 모든 데이터는 평균±표준오차(S.E.M)으로 표시하였으며 유의성은 p<0.05 수준에서 수행하였으며, 모든 실험은 경희대학교 동물실험 관련위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 지침으로 실시하였다.
그 결과, Gng8 KO 마우스는 WT 마우스와 비교하여 단기 기억력 차이가 거의 없는 것으로 나타났다 (도 4a).
3-2. 장기 기억력 확인
본 발명의 재조합 Gng8 KO 마우스의 장기 기억력 변화를 확인하기 위해 수동회피실험(passive avoidance test)을 수행하였다. 구체적으로, 각각의 마우스를 빛이 없는 행동실험 공간에 2시간 동안 적응시키고, 실험하는 셔틀 챔버(shuttle chamber, SD instruments, 캘리포니아, 미국)의 한쪽 구역에 배치해 빛이 없이 1분간 동안 자유롭게 이동시켰다. 적응 뒤 각 마우스가 있는 구역에 조명을 키고 어두운 구역으로 4족 모두 넘어가는 순간 문을 닫았다. 적응 30분 후 마우스를 조명이 있는 구역에 두고 마우스가 어두운 구역으로 넘어가면 문을 닫고 지연시간을 측정하였다. 또한 문이 닫히고 3초 뒤 바닥에 전기충격 (0.5mA, 3초 동안)을 주었다. 전기충격 후 10초 뒤에 마우스는 케이지로 옮겨졌고 24시간 및 28시간 뒤 다시 조명이 있는 구역에 마우스를 옮겨 어두운 구역으로 넘어가는 시간을 측정하고 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 재조합 Gng8 KO 마우스가 WT 마우스에 비해 48시간 뒤의 지연시간이 유의성이 있게 감소하는 것으로 나타나 (**P<0.01) (도 4b), 장기 기억이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
3-3. 인지기능 저하 확인 및 원인 확인
본 발명의 재조합 Gng8 KO 마우스의 공간 기억 및 인지기능 저하를 확인하고, 이의 원인이 콜린성 신경전달물질 감소로 인한 것인지 확인하기 위해, 재조합 마우스(Gng8 KO mice)에 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR) α4β2의 효능제(agonist)로 A85380 디하이드로클로라이드(dihydrochloride) (Tocris Bioscience, cat.no. 5017)를 생리식염수에 녹여 복강주사로 0.01, 0.05 및 0.1 mg/kg을 14일간 투약하였으며, 투약기간 중 모리스 수중 미로 검사(Morris water maze test)를 실시하여 재조합 마우스(Gng8 KO mice)의 콜린성자극의 향상을 통한 공간기억을 측정하였다. 구체적으로, 지름 90cm의 원형 풀에 깊이 21cm가 되도록 22℃의 무독성 하얀색 물을 채우고, 수면 1cm 밑에 플랫폼을 고정하여 숨겨두었다. 재조합 Gng8 KO 마우스 및 WT 마우스를 풀에 넣고 1분간 플랫폼을 찾을 기회를 주는 실험을 4일 동안 하루에 3회 (50분 간격) 수행하였다. 5일째에 플랫폼을 제거하고 1분간 플랫폼을 찾을 수 있게 수영시켰다. 실험 수행 중 탈출 시간 및 경로를 인식프로그램 (S-MART, Pan Lab, 바르셀로나, 스페인)을 통하여 기록하고 플랫폼을 찾아 올라갈 때까지의 잠재기(escape latency) 및 표적 지점에 머문 시간 (time spent in target)을 분석하였다. 프로브 테스트(Probe test)시에는 일원 분산 분석 후 Post hoc 시험을 진행하였고, 표적 지점에 머문 시간 (time spent in target)에 따른 데이터는 독립표본 t-검정으로 수행하였다.
그 결과, 수중 미로 실험의 4일차까지는 탈출 지연시간 (잠재기)에서 Gng8 KO 마우스 및 WT 마우스 간의 차이가 유의적이지 않았으나 (도 4c), 5일차에 Gng8 KO 마우스가 표적 지역의 머문 시간이 WT에 비해 현저히 감소하여 (**P<0.01) (도 4d), Gng8이 인지기능에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 수중 미로 실험 5일차에, Gng8 KO 마우스에 A85380 디하이드클로라이드를 0.01 또는 0.05 mg/kg으로 투여한 군에서는 vehicle 투여군에 비해 표적 지역의 머문 시간이 현저히 증가하여, Gng8 유전자가 결핍된 상황에서, 콜린성 자극 향상은 인지기능을 향상시킴을 유추할 수 있다 (도 5).
상기 결과를 통해, gng8 유전자가 인지기능 저하를 동반한 뇌발달장애와 관련이 있음을 유추할 수 있다.
<110> THE INDUSTRY & ACADEMIC COOPERATION IN CHUNGNAM NATIONAL UNIVERSITY
University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University
<120> GNG8 KNOCK-OUT NEURODEVELOPMENT DISORDER ANIMAL MODEL
<130> SKH20P-0154-KR
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 213
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 1
atgtccaaca acatggccaa gattgctgag gcccgcaaga ccgtggagca gctgaagctg 60
gaagtgaaca tcgatcgcat gaaggtgtcg caggcagcag ccgagctttt ggctttctgc 120
gaaacgcacg ctaaggatga cccactggtg actcctgtcc ctgccgccga gaatcccttc 180
cgcgacaagc gactcttttg caccctgctc tga 213
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CRISPR RNA target site
<400> 2
caacatggcc aagattgctg 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligomer for sgRNA synthesis_1
<400> 3
taggcaacat ggccaagatt gctg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligomer for sgRNA synthesis_2
<400> 4
aaaccagcaa tcttggccat gttg 24
Claims (18)
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- a) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 GNG8 유전자를 결손(knock-out)시킨 콜린성 뇌신경발달장애 동물 모델에 후보 물질을 처리하는 단계; 및
b) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 콜린성 뇌신경발달장애의 증상 회복이 나타나는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 콜린성 뇌신경발달장애 치료제의 스크리닝 방법으로서,
상기 동물모델은 내측 고삐핵(medial habenula, MHb) 및 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN)에서 GNG8 유전자가 발현되지 않으며,
내측 고삐핵의 앞쪽 아핵(Rostral subnucleus, IPR) 및 경간핵에서 콜린아세틸전달효소(choline acetyltransferase, ChAT)가 감소되며,
상기 내측 고삐핵에서 아세틸콜린이 감소되며,
상기 경간핵(interpeduncular nucleus, IPN)에서 내측 고삐핵으로 투사하는 콜린아세틸전달효소가 감소된 것인, 콜린성 뇌신경발달장애 치료제의 스크리닝 방법. - 제 14항에 있어서, 상기 콜린성 뇌신경발달장애의 증상 회복은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 콜린성 뇌신경발달장애 치료제의 스크리닝 방법:
ⅰ) 장기 기억력 감소 또는 인지기능 저하가 완화됨;
ⅱ) 내측 고삐핵 및 경간핵에서 GNG8 유전자 발현이 증가됨;
ⅲ) 내측 고삐핵의 앞쪽 아핵 및 경간핵에서 콜린아세틸전달효소가 증가함;
ⅳ) 내측 고삐핵에서 아세틸콜린이 증가함; 및
ⅴ) 경간핵에서 내측 고삐핵으로 투사하는 콜린아세틸전달효소가 증가함. - 삭제
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| KR102331240B1 (ko) * | 2019-03-21 | 2021-11-29 | 재단법인대구경북과학기술원 | Sgk3 유전자를 이용한 뇌신경계 질환의 진단 및 치료 |
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Adriana Basnakova, Circadian regulation of the vertebrate habenula, 박사학위 논문 University of Manchester 2019. |
| J Physiol. vol.591 no.16 pp.3949-62, 2013. |
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