CN103911393B

CN103911393B - 一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用

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Publication number: CN103911393B
Application number: CN201210594330.9A
Authority: CN
Inventors: 曾凡; 曾凡一; 颜景斌; 曾溢滔
Original assignee: Shanghai City Children Hospital; SHANGHAI TAOTAO TRANSGENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Shanghai City Children Hospital; SHANGHAI TAOTAO TRANSGENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103911393A

Abstract

本发明公开了一种利用转基因动物的乳腺生产人转铁蛋白的方法及其表达载体。本发明的方法包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人转铁蛋白，其中，该表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和牛生长激素基因终止子，所述启动子是山羊β‑酪蛋白基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，所述人转铁蛋白基因是序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的载体是真核表达载体pcDNA3.1，所述的哺乳动物不包括人。本发明的方法，在动物的乳汁中人转铁蛋白的浓度至少可达到5g/L，比现有的方法提高了160倍以上，具有巨大的商业利用价值。

Description

一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用。

背景技术

人转铁蛋白（Human transferrin,hTF）是一种非血红素的铁结合糖蛋白，能使得铁离子与之紧密结合，并将其有选择地释放到特定部位与靶细胞上的特异受体结合以行使生理功能^[1]，是先天性无转铁蛋白血症等多种疾病治疗必备的药物，同时它还参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节^[2]。最近几年的研究发现转铁蛋白还是胚胎干细胞和神经干细胞生长非常重要的一种调节因子。

目前人转铁蛋白主要从血浆中提取并纯化，不仅步骤繁琐、效率低下，而且原料容易受HIV、HBV等病毒的感染，给制备和使用带来潜在的风险。转基因动物乳腺生物反应器是近些年发展起来的一项生物制药新方法，具有广泛的应用前景。2006年，美国GTC生物制药公司通过转基因动物乳汁生产的重组药物人抗凝血酶III已率先上市，另外尚有多种重组药物蛋白正处于各期临床试验中。因此采用转基因动物乳腺生物反应器来生产诸如人转铁蛋白这样重要的生物蛋白具有很好市场价值。

经过二十余年的研究，人们已经在转基因动物乳腺生物反应器研制方面积累了一定的经验。研究发现乳蛋白（即可在乳汁中表达的蛋白）在转基因动物乳汁中的表达水平明显高于非乳蛋白，而这些蛋白由于用量较大，只有当其表达水平超过1g/L时，该转基因动物才有商业利用价值。

但是，到目前为止，根据已有文献报道尚无可在哺乳动物乳汁中高效表达人转铁蛋白的载体，有文献通过兔转铁蛋白基因启动子和增强子指导人转铁蛋白，获得的转基因小鼠乳汁中hTF表达水平亦不超过0.7g/L，尚无法满足乳腺生物反应器的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的利用转基因动物的乳腺生产人转铁蛋白的方法中人转铁蛋白的表达水平低下的不足，提供一种人转铁蛋白的表达水平达5g/L以上的动物乳腺生产人转铁蛋白的方法以及其中所用到的表达载体。

为此，本发明解决上述问题的技术方案之一是：一种利用转基因动物的乳腺组织生产人转铁蛋白的方法，包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人转铁蛋白，其中，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和终止子，其中所述的启动子是山羊β-酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQ IDNO.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子。

本发明中，所述的人转铁蛋白基因如常规，较佳的是人转铁蛋白的编码序列，更佳的是序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明中，所述的终止子是本领域常规。本发明中较佳的是牛生长激素基因的终止子，更佳的其序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中，所述的含有人转铁蛋白基因表达盒的载体可以是本领域的各种能够转染哺乳动物细胞的表达载体，比如慢病毒载体、腺病毒载体等，较佳的是常规的真核表达载体，优选质粒pcDNA3.1。

本发明中，所述将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物的方法是常规，较佳的包括将真核表达载体原核显微注射入哺乳动物的受精卵中，然后移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物；或者是慢病毒载体显微注射哺乳动物受精卵的卵周隙，将感染的受精卵移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物。

本发明中所述的哺乳动物是常规，较佳的是小鼠或奶牛，不包括人。

本发明的技术方案之二是：一种用于制备转基因哺乳动物使其乳腺组织高表达人转铁蛋白的载体，其含有人转铁蛋白基因表达盒，其中，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和终止子，其中所述的启动子是山羊β-酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQID NO.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子。

该人转铁蛋白基因表达盒的其它优选方式如上所述。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明中采用的山羊β-酪蛋白基因启动子序列同时保留了启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子。这些区域含有GRE、STAT等结合位点，这类结合位点是决定乳蛋白表达水平的重要因子。本发明通过调整β-酪蛋白基因启动子中的不同元件，使人转铁蛋白基因（hTF基因）在转基因小鼠中获得了理想的表达水平，平均表达水平达到了5g/L以上，所述基因的蛋白表达水平提高了至少160倍。

乳腺生物反应器产业的特点是成本固定化，即在原料一致的情况下其成本是不变的。所以当提高了乳汁中的蛋白表达量时，提高量获得的将会是药品的净利润。所以业界一般认为只要有50%的蛋白提高，利润就能翻倍。本发明使乳汁中人转铁蛋白的表达水平提高了160倍以上，则利润提高至少160倍。这是极其高的利润，具有广阔的商业前景。

附图说明

图1为pcDNA3.1-P1A3-TFN表达载体构建线路图。

图2为4种不同人转铁蛋白（hTF）表达载体示意图。

图3为不同载体在乳腺细胞中表达人转铁蛋白的比较。

图4为不同转基因小鼠乳汁中人转铁蛋白的表达水平比较。

图5为不同类型人血小板生成素转基因小鼠乳汁中外源蛋白表达水平对比图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

1、载体构建

pcDNA3.1-TFN（pcDNA3.1为购自invitrogen公司的商业化真核表达载体，货号为V795-20）。TFN为克隆的人TF小基因，包括了hTFcDNA和内含子I，全长约4.1Kb，序列见后）。

pcDNA3.1-TFN的构建过程如下：

采用长片段PCR扩增山羊基因组DNA，PCR引物序列分别为：5’-AAGCAGGAATCACAGCATCTAC-3’；5’-AGGATCCTTCATGGCTCTC GAT-3’。采用Apa I+Xho I双酶切通过PCR方法克隆得到的人TF小基因TFN，而pcDNA3.1载体同样采用Apa I+Xho I进行酶切。随后采用连接酶进行连接反应，即得到pcDNA3.1-TFN载体。

pcDNA3.1-P1A3（P1A3为克隆的山羊β酪蛋白基因启动子，参考文献可见“山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ”，序列见后）。

pcDNA3.1-P1A3的构建过程如下：

采用长片段PCR扩增山羊基因组DNA，PCR引物序列分别为：5’-AAGCAGGAATCACAGCATCTAC-3’；5’-AGGATCCTTCATGGCTCTCGAT-3’，得到的山羊β-酪蛋白基因启动子（命名为P1A3），用Apa I和BamH I进行酶切，而pcDNA3.1载体同样采用这两种酶进行酶切。随后采用连接酶进行连接反应，并将连接产物进行感受态细胞转化、挑取阳性克隆，即得到pcDNA3.1-P1A3载体。

限制性内切酶、T4DNA聚合酶和碱性磷酸酶的反应体系均为：

均为37℃处理2h。

将pcDNA3.1-P1A3采用Apa I+Bam HI双酶切，切出P1A3启动子，并采用T4DNA聚合酶进行补平。pcDNA3.1-TFN载体采用Xho I酶切，并补平，随后用碱性磷酸酶（CIP）去磷酸化。最后用连接酶进行连接，获得表达载体pcDNA3.1-P1A3-TFN。

获得的乳腺特异表达载体pcDNA3.1-P1A3-TFN，即T3载体，也称pcDNA3.1-P1A3-TF-intronI。载体构建线路图见图1。

2、转基因小鼠的制备及鉴定

（1）转基因小鼠的制备：

1）载体纯化及片段回收

将构建获得的乳腺特异表达载体pcDNA3.1-P1A3-TFN采用QIAGEN公司的质粒大量纯化试剂盒进行纯化，纯化过程参照试剂盒的说明书进行。

纯化获得的表达载体质粒用Sal I酶切，酶切获得的12.8Kb长的片段（包括山羊β酪蛋白启动子和人转铁蛋白小基因）用QIAGEN公司的片段回收试剂盒进行回收和纯化，纯化过程参照试剂盒的说明书进行。

2）受精卵供体鼠准备

选择动情期间的雌鼠（7周龄）于第一日采用腹腔注射方法对雌鼠分别注射10U孕马血清促性腺激素（PMS），于第三日对已注射PMS的雌鼠腹腔注射10U人促绒毛膜性激素（HCG），然后与雄鼠以1:1合笼。第四日早晨检查雌鼠阴栓，有阴栓说明已经交配，将有阴栓的雌鼠可作为受精卵供体鼠。

3）假孕受体鼠准备

在供体母鼠注射HCG当日，选择动情期的雌鼠和结扎输精管的雄鼠以1:1或2:1比例合笼。第二日同供体鼠一起检查阴栓，将有阴栓的雌鼠即作为假孕受体鼠。

4）受精卵的采集和显微注射

实验前，所用的物品应高压灭菌，实验房间消毒。

培养液准备：用移液枪吸取M2培养液（不含透明质酸）于一次性塑料培养皿中，在不同位置上滴约80μL的数个液滴（培养皿背面相应位置编号），这些液滴用于洗涤受精卵。在另一个培养皿中的不同位置滴上约80μL的数个M16培养液滴，再加入轻质石蜡油将M16液滴全部覆盖，洗涤后的受精卵放置在此M16培养液中，然后将二个培养皿置于37℃5%CO₂的培养箱平衡其湿度和pH值。

在培养皿中滴加M2培养液、含透明质酸酶液滴，将剪取的输卵管放入其中。

颈椎脱臼法处死受精卵供体小鼠，背侧朝上置于一培养皿盖上，70%乙醇消毒待切口处的皮毛，刮去鼠毛，在小鼠背侧近中部脊椎两侧纵向剪开一小口，用眼科剪将皮肤与腹壁分离，再将腹壁同样剪开一小口，用眼科镊将卵巢、输卵管及子宫提出，再用眼科剪将输卵管完整地剪下来，放在盛有透明质酸酶培养液的培养皿中，同样取对侧及另外供体雌鼠的输卵管。

体视镜下用眼科镊撕开输卵管壶腹部，用洗卵管（Flushing pipet）依次将受精卵收集转移到M2培养液中。在M2液滴中逐个将受精卵吸起，移入下一个液滴中，如此将每个受精卵清洗数次，这样在选择合适的卵细胞的同时也将尽量去除透明质酸酶（注意：载物台上有热光源或放置恒温微热板，使细胞处于合适的温度环境中）。

从CO₂培养箱中取出含有培养液滴和石蜡油的培养皿，用移卵管将洗涤过的受精卵转移到M12液滴中，若受精卵原核发育仍未达到理想状态，可放入CO₂培养箱培养一定时间。

此过程供体鼠两侧输卵管可得到超排受精卵20-80枚不等。理想的受精卵细胞形态饱满正常，透明带完整，雄原核和雌原核清晰。

将先制备好的固定受精卵的持卵管（holding pipette）安置在显微注射仪的左侧。将预制好的注射针（Microinjection needle）尾端插入注射用DNA溶液中，使DNA自动地吸入注射针中部即可。或将DNA溶液从尾部加入，在体视镜下检查DNA溶液中无气泡产生（注射前，质粒DNA稀释成4ng/μL，同时离心10min，将DNA溶液上层的80-90%转移入新的EP管）。然后将注射针安置在显微注射仪的右侧，并使注射针内处于正压状态。

I.在凹孔载玻片中央滴20-30μL M2，覆盖石蜡油，用移卵管移入待注射的受精卵。将载玻片移入显微操作仪的载物台上。

II.在低倍镜下调节焦距，用持卵管将受精卵置于视野的适当位置，再将持卵管和注射针调节至合适位置（与玻片底部平面呈15°角），通过微调左右臂使持卵管、注射针和受精卵在一条直线并清晰可见。

III.在高倍镜下将注射针的尖端在持卵管上轻轻碰撞，以碰断注射针的少许尖端，以让DNA溶液溢出。

IV.用持卵管反复吹吸受精卵将其调至合适位置，通过负压将欲注射的受精卵固定在左侧持卵管的顶端。受精卵的最佳位置是极体位于正上方，其雄原核的位置对应于持卵管的中央且近右侧。

V.将注射针快速刺入雄原核，勿插入核仁，适当加压，使DNA注入，待核膨大为原来体积的一倍后迅速将注射针拔出，将受精卵转移。如此反复，对其它受精卵逐个进行注射，尽可能在较短时间内完成。

VI.将注射完毕的受精卵可置于37℃的5%CO₂培养箱中培养一段时间，选出完整的受精卵直接用于移植。

VII.腹腔注射方法，用戊巴比妥钠溶液（10mg/mL）按0.8mg/10g体重的剂量将假孕母鼠麻醉。

VIII.将已经麻醉的小鼠背部向上置于培养皿盖中，在最后一根肋骨将凹陷处去毛，70%乙醇消毒。按常规外科手术在小鼠消毒处行一与脊椎平行的纵切口，手术镊伸入腹腔，将脂肪垂及包裹在膜囊中的卵巢、输卵管和子宫一并提出，在体视镜下将卵巢和输卵管置于适当的操作部位。

IX.将注射后受精卵吸入同一移卵管内（Transfer pipet），管中吸入气泡作为标志。

X.在血管稀疏处用眼科镊轻轻分离卵巢和输卵管之间的囊膜，将镊子伸入囊膜内，轻轻地将卵巢和输卵管分开，夹住输卵管伞部，提到裂口处，找到游离端中央有一小口。将充有受精卵的移卵管从输卵管伞部轻轻插入到漏斗部，用口慢慢地将受精卵吹入输卵管，可见输卵管明显地膨胀及移卵管中气泡移至伞口内。

XI.将移卵管轻轻从输卵管中拔出，将卵巢和输卵管放回腹腔，缝合伤口后放回洁净鼠笼中，注意保暖，待其苏醒后按常规饲养。植入后18-21天，受精卵可发育成小鼠而分娩。

（2）整合鉴定

通过显微注射获得的小鼠生长至3周时剪尾，抽提DNA。

鼠尾组织DNA提取

1）小鼠生长至21天时剪取1cm尾组织置于1.5mL EP管中。在EP管中加400μL消化缓冲液，5μL（20mg/mL）蛋白酶K，56℃消化16h。

2）加等体积酚，振荡，混匀后13000rpm离心12min。

3）取上清液加等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）振荡混匀后13000rpm离心8min。

4）取上清液加等体积氯仿/异戊醇（24:1）振荡混匀后13000rpm离心4min。

5）取上清液加1/10体积3mol/L NaAC及2倍体积无水乙醇混匀室温放置10min后13000rpm离心10min。

6）80%乙醇洗二次，真空抽干后溶解于pH8.0TE中。

PCR鉴定

PCR反应体系同前。混匀,瞬间离心。引物序列为

hTF-1:5’-tggatgccaagatgtacctg-3’

hTF-2:5’-cgcctgtgtagccgtagtat-3’

反应条件：94℃5min；(94℃1min,55℃45sec,72℃1min)×32个循环；72℃10min。取8μL PCR产物，2%Agarose凝胶电泳检测。

抽提得到的DNA采用PCR和定量PCR进行整合鉴定。经鉴定共获得转基因小鼠8只，命名为P1A3-TFN。其中公鼠4只，母鼠4只。

（3）表达水平检测

将成年的转基因母鼠与正常公鼠进行交配，带母鼠分娩后第9天采集乳汁100L，采用ELISA法测定乳汁中hTF的表达水平，平均表达水平达到了5g/L以上，比公开文献报道中最高的表达水平提高160倍以上（见图4）。

抗体：鼠抗hTF单克隆抗体（DAKO，USA）；生物素标记的鼠抗hTF单克隆抗体（Sigma，USA）；HRP酶联羊抗生物素抗体（华美公司）。

ELISA过程：

1）包被：将鼠抗人hTF抗体用0.2M碳酸盐缓冲液（pH 9.6）1:1000稀释，酶标板中每孔加入120μL上述稀释的抗体，37℃2h。

2）倾去包被抗体，用含有0.5%Tween20的PBS室温洗涤5次。

3）每孔中加入150μL含2%BSA的PBS 4℃封闭过夜。

4）倾去封闭液，洗涤4次。

5）酶标板上每孔依次加入100μL PBS（空白对照）、hTF浓度为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.3ng/mL、15.6ng/mL的标准品，以及待测的细胞上清液。

6）37℃温育2h，倾去样品，洗涤5次。

7）每孔中均加入100μL用含2%BSA的PBS 1:1000稀释的生物素标记的鼠抗人hTF抗体，37℃2h。

8）倾去一抗，洗脱5次。

9）每孔加入100μL用含2%BSA的PBS 1:1000稀释的羊抗生物素抗体（HRP），37℃2h。

10）倾去二抗，洗涤5次。

11）每孔加入100μL TMB显色，待标准品显色梯度明显后加入100μL 1MH₂SO₄终止反应。

12）用酶标仪读取数据。

实施例2

1、四种载体的构建

T1载体即：pcDNA3.1-P1A3-TF，命名为pcDNA3.1-P1A3-TF；

T2载体即：pcDNA3.1-增强子-P1A3-TF，命名为pcDNA3.1-P1A3-ETF；

T3载体即：pcDNA3.1-P1A3-TF-intronI，命名为pcDNA3.1-P1A3-TFN；

T4载体即：pcDNA3.1-增强子-P1A3-TF-intronI，命名为pcDNA3.1-P1A3-ETFN。

4种载体的结构示意图见图2。

T1载体构建过程如下：

从人胎肝文库中扩增获得人转铁蛋白cDNA（称为TF），将该cDNA和pcDNA3.1-P1A3载体均用Xho I酶切，连接后获得表达载体pcDNA3.1-P1A3-TF。

T2载体构建过程如下：

采用PCR扩增人基因组DNA，引物序列分别为：5’-CCAGCCTCGGAGTCTTCCTC-3’；5’-TCGCTCGGTGCCAGGAGCGG-3’。扩增获得2.2Kb长的人转铁蛋白增强子，用Sal I和Xho I进行双酶切，并补平。pcDNA3.1-P1A3-TF用Apa I酶切，并补平，去磷酸化。连接后获得表达载体pcDNA3.1-P1A3-ETF。

T3载体构建前面已述。

T4载体构建过程如下：

PCR扩增获得的人转铁蛋白增强子片段用Sal I和Xho I进行双酶切，并补平。pcDNA3.1-P1A3-TFN用Apa I酶切，并补平，去磷酸化。连接后获得表达载体pcDNA3.1-P1A3-ETFN。

2、细胞转染

1）转染液的制备：

取青霉素小瓶（玻璃离心管）稀释A液和B液

A液：T1-T4四种人转铁蛋白表达载体各取1.6μg质粒DNA，用Opti-MEM培养液分别定容稀释到100μL，轻摇。室温放置5min。

B液：3μL LipofectamineTM 2000用Opti-MEM培养液定容稀释到100μL，轻摇。室温放置5min。

将100μL B液分别加入到A液中，轻轻摇匀，室温静置20min。

2）转染：

倾去细胞悬液用1mL不含血清1640培养液漂洗细胞二次，倾去培养液。每孔中加入200μL转染液，前后摇几次。使培养液完全覆盖细胞。37℃，5%CO₂下培养6h。每种质粒均平行转染3个孔，同时以转染空质粒的孔作为阴性对照。

3）吸除转染液，加0.5mL完全培养液。

4）37℃，5%CO₂及饱和湿度下培养66h。

5）收集细胞上清液，稍离心，去除细胞悬液中的残留细胞，供ELISA测定。

四种不同载体的细胞表达结果如图3，从结果可见hTF增强子（Enhancer）不仅无法提高人转铁蛋白在乳腺细胞中的表达水平，而且明显降低了表达。而Htf的内含子1对人转铁蛋白在乳腺细胞中的表达有一定的提高作用。

实施例3

1、不同启动子的表达水平比较

采用不同启动子进行人转铁蛋白的表达。

RTF：兔转铁蛋白基因启动子；

EP：兔转铁蛋白基因启动子+兔转铁蛋白增强子；

2EP：兔转铁蛋白基因启动子+2个串联的兔转铁蛋白增强子；

BLG：山羊β乳球蛋白基因启动子。

而转基因小鼠的制备、鉴定及表达水平的检测同实施例1。

pcDNA3.1-RTF-TFN载体的构建过程如下：

采用PCR从兔基因组DNA中扩增兔转铁蛋白启动子，PCR引物序列分别为5’-CACGCTCCGGTCCAGCAG-3’;5’-GAGCCTCATCTTGTAGCTCA-3’，将扩增的0.25Kb的兔TF启动子装入购自Promega公司的pGEM-T载体，而后将该载体和购自invitrogen公司的pSL301载体分别用Sac II和Xho I双酶切，将启动子装入pSL301载体，构成301-RTF载体。然后将301-RTF载体和pcDNA3.1载体分别用Xho I进行酶切，随后连接获得pcDNA3.1-RTF-TFN载体。

pcDNA3.1-2EP-TFN载体的构建过程如下：

采用PCR从兔基因组DNA中扩增兔转铁蛋白增强子，PCR引物序列分别为5’-GGCACCAACTGCAGCAGACA-3’;5’-TTCAGTTCCAGACCAACACAAGCAT-3’，将扩增的0.25Kb长的兔TF增强子装入pGEM-T载体（Promega公司购买），构成T-RTFE载体。然后将301-RTF载体用ApaI/SacII双酶切，将两个T-RTFE载体分别用Apa I/Not I双酶切和Sac II/Not I双酶切，进行3片段连接，形成pSL301-2EP载体。接着将pSL301-2EP载体和pcDNA3.1分别用Apa I/XhoI双酶切，连接后形成3.1-2EP载体。最后将3.1-2EP载体和pcDNA3.1-TFN载体均用Xho I/Afl II双酶切，连接后形成pcDNA3.1-2EP-TFN载体。

pcDNA3.1-EP-TFN载体的构建过程如下：

将pSL301-2EP载体用Not I/Sac II双酶切，补平、去磷酸化后进行自连接，形成pSL301-EP载体。接着将pSL301-EP载体和pcDNA3.1分别用ApaI/Xho I双酶切，连接后形成3.1-EP载体。最后将3.1-EP载体和pcDNA3.1-TFN载体均用Xho I/Afl II双酶切，连接后形成pcDNA3.1-EP-TFN载体。

pcDNA3.1-BLG-TFN载体的构建过程如下：

采用PCR从山羊基因组DNA中扩增山羊β乳球蛋白基因启动子，PCR引物序列分别为5’-GTCAACGGATCTCTGTGTCT-3’;5’-GGCACTTCATGGCTGCAGCTG-3’，将扩增获得的BLG启动子和pcDNA3.1-TFN载体分别用Xho I进行酶切，随后连接获得pcDNA3.1-BLG-TFN载体。

而转基因小鼠的制备、鉴定及表达水平的检测同实施例1。结果见图4。

本实验进行表达水平分析的5种原代转基因小鼠均超过4只。乳汁中人转铁蛋白的检测结果表明整合pcDNA3.1-P1A3-TFN载体的转基因小鼠平均表达水平超过5g/L，而其他几种转基因小鼠的表达最高不超过30mg/L。P1A3指导人转铁蛋白在小鼠乳汁中的表达超过其他载体160倍以上，这种载体构建形式在启动人转铁蛋白乳腺表达方面具有非常显著的优越性。

2、P1A3启动子提高其他目的基因在转基因小鼠乳汁中的表达水平

采用P1A3启动子启动转基因小鼠乳汁中人血小板生成素（TPO）基因的表达，并与使用山羊乳球蛋白（BLG）启动子启动的转基因小鼠乳汁中人TPO的表达进行比较。

pcDNA3.1-P1A3-TPO构建过程如下：

将pcDNA3.1-P1A3载体和pcDNA3.1-TPO载体（参见文献：宁云山等,内含子和5’非翻译区对人血小板生成素基因表达的影响，《第一军医大学学报》2004年09期）分别用BamHI酶切，随后将切下的TPO基因连接入pcDNA3.1-P1A3载体中，得到表达载体pcDNA3.1-P1A3-TPO。

pcDNA3.1-BLG-TPO构建过程如下：

将扩增获得的BLG启动子和pcDNA3.1-TPO载体分别采用Xho I进行酶切和连接，得到表达载体pcDNA3.1-BLG-TPO。

而转基因小鼠的制备、鉴定及表达水平的检测同实施例1。

结果见图5。从实验结果看，P1A3启动的人TPO表达水平仅比BLG启动的表达水平提高2倍左右，P1A3提高其他基因表达水平的程度远远低于对hTF表达的提高程度，因此本发明采用P1A3启动人转铁蛋白的表达具有预料不到的高表达效果。

Claims

1.一种利用转基因动物的乳腺组织生产人转铁蛋白的方法，包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人转铁蛋白，其特征在于，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次由启动子、人转铁蛋白基因和pcDNA3.1载体中携带的牛生长激素基因终止子组成，其中所述的启动子是山羊β-酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQ IDNO.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子，所述的人转铁蛋白基因是序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的终止子的序列为牛生长激素基因终止子，所述的含有人转铁蛋白基因表达盒的载体是真核表达载体pcDNA3.1，所述的哺乳动物不包括人。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物的方法包括将真核表达载体原核显微注射入哺乳动物的受精卵中，然后移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物是小鼠或奶牛。

4.一种用于制备转基因哺乳动物使其乳腺组织高表达人转铁蛋白的载体，其含有人转铁蛋白基因表达盒，其特征在于，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次由启动子、人转铁蛋白基因和终止子组成，其中所述的启动子是山羊β-酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQ ID NO.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子，所述的人转铁蛋白基因是序列表中SEQ ID NO.2，所述的终止子为牛生长激素基因终止子，所述的含有人转铁蛋白基因表达盒的载体是真核表达载体pcDNA3.1。