CN109777828A - 一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法 - Google Patents

一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109777828A
CN109777828A CN201811618371.0A CN201811618371A CN109777828A CN 109777828 A CN109777828 A CN 109777828A CN 201811618371 A CN201811618371 A CN 201811618371A CN 109777828 A CN109777828 A CN 109777828A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
ovum
genetic modification
carrier
ware
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811618371.0A
Other languages
English (en)
Inventor
琚存祥
赵静
杨笑柳
贾冬景
张明坤
侯欢欢
高翔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Collection Pharmacy Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Collection Pharmacy Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Collection Pharmacy Biotechnology Co Ltd filed Critical Jiangsu Collection Pharmacy Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811618371.0A priority Critical patent/CN109777828A/zh
Publication of CN109777828A publication Critical patent/CN109777828A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明为一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法，提供了一种制备基因改造动物模型的方法，该方法联合IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术来制备基因改造动物模型。该方式大大减少雄性动物的存放，节约空间的使用。也可确保大多数卵子受精时间保持一致，保证受精卵发育的同步性，提高可用受精卵数量，减少雌性动物的使用，大大降低了成本。

Description

一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模 型制备方法
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法。
背景技术
基因改造动物就是对基因组进行修饰的动物，包括基因的插入、删除、突变或替换。它是按照预期的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术进行修饰，使其在生物体内稳定遗传。基因改造动物对于人类疾病的研究，基因功能的发现以及新型药物的开发有重要推动作用。
基因改造动物的方法很多，如：原核显微注射法、精子载体、胚胎干细胞介导法等。原核显微注射法可直接将重组的DNA注入受精卵原核中，能直接获得所需的转基因动物，且产生转基因动物的方式可稳定遗传。2013年CRISPR技术问世后，大幅度提高基因编辑效率。CRISPR技术与显微注射法的叠加使用大大提高基因改造动物制备效率，缩短基因改造动物获得时间。
但DNA显微注射前需要得到大量的注射使用受精卵，现有方法中受精卵是从雌性动物体内直接获取。首先将雌性动物注射促排卵激素，然后将超排的雌性动物与雄性动物交配，从交配后的雌性动物体内收集受精卵。活体交配方式产生的受精卵，因不同动物卵子受精时间不一致，所获得的受精卵发育一致性较差。DNA注射的最好时期在雌雄原核融合之前，融合时间一般在几小时之内，因此胚胎的注射时间需要严密的摸索和尝试，除此之外对于受精卵发育的一致性要求较高。为保证受精卵发育的同步性及单次试验注射所需量，该方式需要同时准备大量的雄性动物与雌性动物，同时需要饲养较多适配雄性动物，以便用于配繁。大量动物的使用需要使用较大的空间来进行动物的饲养和存放。从经济角度和动物福利角度考虑，该方法存在实验动物的浪费与实验动物使用的不合理。
为解决如上问题，我们采用体外受精的方式来获取受精卵，该方式大大减少雄性动物的存放，节约空间的使用。同时体外受精的方式也可确保大多数卵子受精时间保持一致，保证受精卵发育的同步性，提高可用受精卵数量，减少雌性动物的使用。
发明内容
本发明提供了一种制备基因改造动物模型的方法，其特征在于，所述方法联合IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术来制备基因改造动物模型，包括如下步骤：
(1)构建表达针对靶基因的sgRNA的质粒；
(2)构建打靶载体；
(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母体动物生产基因改造动物模型；
其中所述受精卵是采用体外受精的方式获取的受精卵。
优选地，其中受精卵通过以下步骤获得：
(a)采集精子；
(b)采集卵子；
(c)精卵混合；
(d)收集胚胎。
优选地，受精卵的具体制备步骤如下：
1)采集精子
脱颈椎法处死雄鼠后，打开腹腔迅速分离出两侧的附睾尾和输精管，将附睾尾放于滤纸上尽可能去除脂肪和血管，用一次性注射器在附睾尾上开口轻轻扎数下，挤出精液用显微镊轻轻捏起，让精液进入精子获能皿微滴中，将含有雄鼠精液的的精子获能皿放置于培养箱中获能1h；
2)采集卵子
将注射过HCG后的雌鼠处死，从背部脊椎两侧的白色脂肪垫上方皮肤开口，取出两侧的输卵管，将输卵管放于盛有DPBS的皿盖内清洗血液与毛发，再移到滤纸上尽量去除周围水分，最后将输卵管放入受精皿的矿物油中，用一侧显微镊将输卵管的膨大部附近固定，同时用另一个显微镊撕破膨大部，并将卵团撕出放置在受精滴中；
3)精卵混合
从培养箱中取出获能结束的精子皿，从精子滴边缘吸取精子，加到卵子滴中，根据卵团大小，每滴加5-8uL精子，把培养皿置于培养箱中培养；
4)收集胚胎
先将所有的细胞从受精皿中吸出，使用HTF做3个微滴，清洗3 遍，然后在最后一个微滴中挑选形态良好的含有2个原核的一细胞。
优选地，其中步骤(2)中使用单链DNA打靶，具体过程如下：
1)dsDNA载体制备
设计并构建包含敲入位点同源臂、目的插入片段的打靶载体，将上述片段与PMD18T通用载体连接，获得dsDNA载体；
2)dsDNA转录
取dsDNA载体进行酶切，获得线性化片段，使用酚/氯仿纯化体系纯化，后获得加帽的转录产物，再与加尾反应液置于37℃温育30 –45min，获得加尾产物，最后对转录成功的RNA纯化；
3)RNA反转获得单链DNA
将上步转录的RNA反转录成单链DNA；采用单链DNA打靶。
优选地，其中步骤(2)中使用双链载体打靶，具体过程如下：设计并构建包含敲入位点同源臂、目的插入片段的打靶载体，将上述片段与PMD18T通用载体连接，获得dsDNA载体，使用该dsDNA载体作为打靶载体。
进一步地，所述方法还包括后续的鉴定阳性的基因改造动物的步骤。
本发明具有以下积极效果：
1.IVF方法制备注射用胚，可以使用较少的雌鼠供应注射，节约了小鼠成本，同时符合动物福利，尽量用少量的动物；
2.使用IVF方法制备基因改造小鼠，不影响小鼠的生仔，胚胎质量与自然胚胎无显著差异，该种方式节约了雄鼠的使用和笼位占比。
3.在同一染色体进行多基因改造小鼠制备时，无法通过两种小鼠分别改造后配繁的方法获得。因此需要多次打靶，在已有阳性小鼠背景进行其他基因改造，而采用IVF的方法可以减少提供阳性鼠所需的时间，降低成本。
附图说明
图1是IVF与自然胚胎注射可用胚胎对比图。A为可用胚胎数目， B为可用胚胎比率。
图2是IVF与自然胚胎注射的小鼠生仔率。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例基因改造动物模型的制备
(一)注射胚胎准备
1C57BL/6小鼠激素超排
选取雌鼠，3.5-4周龄，12-15克(背景鼠)。雄鼠，3-6个月，使用前适配且至少单放一周。第一天下午18：30供卵鼠注射PMSG 5IU/ 只，第三天下午19：00注射HCG 5IU/只。每只鼠的注射体积保持在 100-200ul之间。
2体外受精
1)培养皿准备
准备受精液：用配置的HTF液体在35mm无菌皿中做2个200ul 微滴，2个50ul微滴，上覆盖矿物油，使用前置于37℃，5％CO2培养箱中平衡6h以上。
精子获能皿：用配置的HTF液体在35mm无菌皿中做1个200ul 微滴，上覆盖矿物油，使用前置于37℃，5％CO2培养箱中平衡6h以上。
2)采集精子
早上9：00-9：30之间采集精子(根据雌鼠数量，先采精子，再采卵)。脱颈椎法处死雄鼠后，打开腹腔迅速分离出两侧的附睾尾和输精管，将附睾尾放于滤纸上尽可能去除脂肪和血管，用一次性 1mL注射器在附睾尾上开口(轻轻扎4-6下)，挤出精液用显微镊轻轻捏起，让精液进入精子获能皿微滴中。将含有雄鼠精液的的精子获能皿放置于培养箱中获能1h。
3)采集卵子
早上9：05开始采集卵子。将注射过HCG13-14h后处死雌鼠，从背部脊椎两侧的白色脂肪垫上方皮肤开口，取出两侧的输卵管，将输卵管放于盛有DPBS(提前放入培养箱预热)的皿盖内清洗血液与毛发，再移到滤纸上尽量去除周围水分，最后将输卵管放入受精皿的矿物油中，用一侧显微镊将输卵管的膨大部附近固定，同时用另一个显微镊撕破膨大部，并将卵团撕出放置在受精滴中。
4)精卵混合
9：30-10：00(根据采精时间)，从培养箱中取出获能结束的精子皿，从精子滴边缘吸取精子，加到卵子滴中，根据卵团大小，每滴加5-8uL左右的精子，把培养皿置于培养箱中培养。
5)收集胚胎
先将所有的细胞从受精皿中吸出，使用HTF做3个微滴，清洗 3遍，然后在最后一个微滴中挑选形态良好的含有2个原核的一细胞，然后将剩余的无法用于注射的细胞做统计，数据统计见表一。
表一IVF注射可用胚胎统计
3自然胚胎获取
1)按照步骤1进行HCG注射完成后立即与单放雄合笼，合笼 16-18h后，观察合笼的母鼠的阴道口是否有白色的阴栓，发现有阴栓供使用。
2)脱颈处死供体雌鼠，从背部脊椎两侧的白色脂肪垫上方皮肤开口，取出两侧的输卵管，将输卵管放于盛有DPBS(提前放入培养箱预热)的皿盖内清洗血液与毛发，再移到滤纸上尽量去除周围水分，将输卵管放置在空置的皿盖上，用吸有M2的1ml注射器配钝口的4#针头，插入输卵管伞部冲洗输卵管，将胚胎冲出。
3)全部输卵管取出后，将卵子转移到200ul的M2液滴中，加入50ul的500IU/mL透明质酸酶消化颗粒细胞，消化完全后用移卵针将胚胎吸出，清洗挑选。将可用胚胎放置在待注射皿中，将不可用于注射的胚胎统计数量并记录，数据统计见表二。
表二自然胚注射可用胚胎统计
将IVF可用胚与自然交配产生的可用胚胎对比可知，IVF每只雌鼠可获得的可用胚胎数与整体可用胚胎的总比例显著高于自然交配产生的可用胚胎(P<0.01)，见图1。结果显示采用自然胚胎用于注射打靶从雌鼠的使用角度考虑，是可以大幅度减少C57BL/6雌性小鼠使用。
(二)Cas9样品注射
选取5个基因改造项目，制备打靶样品。
1Cas9蛋白的准备
体外表达纯化制备获得Cas9蛋白，并检测其活性，有核酸酶活性蛋白可用于后续实验。也可购买商品化的Cas9活性蛋白。
2sgRNA准备
根据项目改造特点确定sgRNA大概区域，针对目的片段选取脱靶率最低几组序列进行制备。设计并合成识别靶位点sgRNA，并构建 sgRNA表达载体。
sgRNA转录制备方法：以PrimerStar或PrimerStar Max体系， sgRNA-F、sgRNA-R为引物，测序正确的puc57-sgRNA质粒(1：30 稀释)为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒(AM1354)进行sgRNA的转录。
sgRNA筛选：将靶位点sgRNA与Cas9蛋白进行孵育后，将混合液注射至0.5天的受精卵中，培养至囊胚阶段后，进行小鼠靶基因的 ko阳性率的鉴定，以此筛选切割活性高的sgRNA。
3donor准备
若采用双链donor打靶仅需进行步骤一，若采用单链DNA打靶需进行步骤二和三。
1)dsDNA终载体制备
设计并构建包含敲入位点同源臂、目的插入片段的打靶载体，通过HiFi DNA Assembly Master Mix(E2621S)试剂盒将上述片段与PMD18T通用载体连接，获得dsDNA终载体。
2)dsDNA转录
取约50μg质粒DNA进行酶切，酶切方案根据各项目执行。获得的线性化片段，使用酚/氯仿纯化体系，使用RNA Polymerase Enzyme Mix，将混合体系与DNA底物置于37℃温育1小时获得加帽的转录产物。获得的产物再与加尾反应液mMESSAGET7μLtrareaction置于37℃温育30–45min，获得加尾产物。最后对转录成功的RNA纯化。
3)RNA反转获得单链DNA
用TaKaRa的PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒(#6210A/B)将上步转录的RNA反转录成单链DNA。
4胚胎注射与移植
1)受体准备
注射前16-18h，将大于8周龄的ICR雌鼠与结扎雄鼠合笼，合笼16h后检栓，见栓鼠用于注射后移植。
2)注射前准备
用拉针仪制备固定针与注射针。使用3.5mm的皿盖在中央做一个宽度约2mm的长条M2液滴，覆盖矿物油作为操作皿。将注射样品 (1-3ng/ul)用微量加样器加入到注射管中以备使用。
3)注射样品准备
根据项目类型准备样品，使用PBS做为介质补足样品注射体积。
4)样品注射
将注射针和固定针装入操作手臂。将在M16中培养的受精卵转移入准备好的M2液滴中，并排成一排。使用显微操作系统调节固定管，使其吸住一个卵子，调整视野至原核清晰将注射管刺入原核，按 Inject键打入DNA，原核明显胀大后迅速退针。
5)胚胎移植
将0.5d见栓受体鼠称重按剂量麻醉，待深入麻醉后，将鼠剃毛延背部剪开。取出卵巢、输卵管、子宫前端，将卵巢旁边的脂肪垫用钝镊子夹住固定在一边。用显微镊固定住输卵管前端，然后使用1ml 注射针将输卵管前端戳破小孔，使用移卵针将注射过的胚胎吹入输卵管。最后将组织塞入皮下，完成缝合。
(三)生仔与阳性鼠鉴定
1小鼠生仔数量统计
胚胎移植后将受体鼠每两只放置一笼，21d后统计生仔数目，表格如下。
表三IVF注射生仔统计
表四自然胚注射生仔统计
统计学数据分析显示，生仔平均值无显著差异，但具体数值显示IVF出生较稳定，浮动较少，SEM值较小(参见图2)。结果显示 IVF获得胚胎适合打靶注射使用。
2小鼠生仔鉴定
小鼠出生1周后，剪取小仔尾部，提取DNA进行鉴定。PCR鉴定目的片段两端插入鉴定。根据插入片段，在同源臂两端选取引物进行PCR鉴定，鉴定阳性的鼠尾，进行全长测序，经专业测序公司测序验证通过的用于F0配繁，统计阳性小鼠数据。
PCR体系如下：
试剂 体积(ul) 规格
2XPrimerStarMax 25
ddH<sub>2</sub>O 22
F 1 10uM
R 1 10uM
C57BL/6基因组DNA 1
PCR程序如下：
表五阳性率统计对比
从统计数据比较，每个项目的阳性率中，IVF胚胎阳性率均高于自然胚胎。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种制备基因改造动物模型的方法，其特征在于，所述方法联合IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术来制备基因改造动物模型，包括如下步骤：
(1)构建表达针对靶基因的sgRNA的质粒；
(2)构建打靶载体；
(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母体动物生产基因改造动物模型；
其中所述受精卵是采用体外受精的方式获取的受精卵。
2.如权利要求1所述的方法，其中受精卵通过以下步骤获得：
(a)采集精子；
(b)采集卵子；
(c)精卵混合；
(d)收集胚胎。
3.如权利要求2所述的方法，受精卵的具体制备步骤如下：
1)采集精子
脱颈椎法处死雄鼠后，打开腹腔迅速分离出两侧的附睾尾和输精管，将附睾尾放于滤纸上尽可能去除脂肪和血管，用一次性注射器在附睾尾上开口轻轻扎数下，挤出精液用显微镊轻轻捏起，让精液进入精子获能皿微滴中，将含有雄鼠精液的的精子获能皿放置于培养箱中获能1h；
2)采集卵子
将注射过HCG后的雌鼠处死，从背部脊椎两侧的白色脂肪垫上方皮肤开口，取出两侧的输卵管，将输卵管放于盛有DPBS的皿盖内清洗血液与毛发，再移到滤纸上尽量去除周围水分，最后将输卵管放入受精皿的矿物油中，用一侧显微镊将输卵管的膨大部附近固定，同时用另一个显微镊撕破膨大部，并将卵团撕出放置在受精滴中；
3)精卵混合
从培养箱中取出获能结束的精子皿，从精子滴边缘吸取精子，加到卵子滴中，根据卵团大小，每滴加5-8uL精子，把培养皿置于培养箱中培养；
4)收集胚胎
先将所有的细胞从受精皿中吸出，使用HTF做3个微滴，清洗3遍，然后在最后一个微滴中挑选形态良好的含有2个原核的一细胞。
4.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中步骤(2)中使用单链DNA打靶，具体过程如下：
1)dsDNA载体制备
设计并构建包含敲入位点同源臂、目的插入片段的打靶载体，将上述片段与PMD18T通用载体连接，获得dsDNA载体；
2)dsDNA转录
取dsDNA载体进行酶切，获得线性化片段，使用酚/氯仿纯化体系纯化，后获得加帽的转录产物，再与加尾反应液置于37℃温育30–45min，获得加尾产物，最后对转录成功的RNA纯化；
3)RNA反转获得单链DNA
将上步转录的RNA反转录成单链DNA；采用单链DNA打靶。
5.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中步骤(2)中使用双链载体打靶，具体过程如下：设计并构建包含敲入位点同源臂、目的插入片段的打靶载体，将上述片段与PMD18T通用载体连接，获得dsDNA载体，使用该dsDNA载体作为打靶载体。
6.如权利要求1-2任一项所述的方法，其还包括后续的鉴定阳性的基因改造动物的步骤。
CN201811618371.0A 2018-12-28 2018-12-28 一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法 Pending CN109777828A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811618371.0A CN109777828A (zh) 2018-12-28 2018-12-28 一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811618371.0A CN109777828A (zh) 2018-12-28 2018-12-28 一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109777828A true CN109777828A (zh) 2019-05-21

Family

ID=66497892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811618371.0A Pending CN109777828A (zh) 2018-12-28 2018-12-28 一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109777828A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113881708A (zh) * 2021-01-05 2022-01-04 清华大学 对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293831A (zh) * 2014-09-28 2015-01-21 上海云舜生物技术有限公司 建立高血压小鼠模型的方法及其用途
CN105210981A (zh) * 2015-09-15 2016-01-06 中国科学院生物物理研究所 建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法及其应用
CN107475300A (zh) * 2017-09-18 2017-12-15 上海市同济医院 Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293831A (zh) * 2014-09-28 2015-01-21 上海云舜生物技术有限公司 建立高血压小鼠模型的方法及其用途
CN105210981A (zh) * 2015-09-15 2016-01-06 中国科学院生物物理研究所 建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法及其应用
CN107475300A (zh) * 2017-09-18 2017-12-15 上海市同济医院 Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASAKAZU HASHIMOTO等: "Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse", 《DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 *
曾文滔等: "C57BL/6J小鼠冻融IVF原核胚用于Cas9", 《中国比较医学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113881708A (zh) * 2021-01-05 2022-01-04 清华大学 对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用
WO2022148078A1 (zh) * 2021-01-05 2022-07-14 清华大学 对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107043787B (zh) 一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法和应用
CN105210981A (zh) 建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法及其应用
CN109777837A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法
CN104419719B (zh) 一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法
Bin Ali et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer
CN116769834A (zh) 一种Myf5-Cre构建脂肪组织特异性STAU1敲除小鼠模型的方法
CN103993027B (zh) 一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法
Longenecker et al. Generation of gene knockout mice by ES cell microinjection
CN109777828A (zh) 一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法
Hossein et al. Cloning missy: obtaining multiple offspring of a specific canine genotype by somatic cell nuclear transfer
CN109811009A (zh) 一种利用CRISPR/Cas9系统构建敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法
Feng et al. Generation of transgenic mice
CN1735338A (zh) 利用体细胞核转移胚胎作为细胞供体进行附加核转移的方法和系统
CN103952424B (zh) 生产mstn双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法
CN115369116A (zh) 无毛品系plcd1基因敲除的转基因猪的构建方法
CN109897867B (zh) 基因改造方法
Goel et al. Status and Prospects of Reproductive Biotechnologies of Small Ruminants in India: An Overview
CN110129320A (zh) 一种获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA和Oligo DNA
Briski et al. Comparison of ICSI, IVF, and in vivo derived embryos to produce CRISPR-Cas9 gene-edited pigs for xenotransplantation
JP2966016B2 (ja) トランスジェニックラット及びその作製方法
CN110438155A (zh) 修饰cd163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方法
Conner Transgenic mouse production by zygote injection
CN103710386B (zh) 转基因动物的制备方法
CN118166038B (zh) 免疫缺陷动物模型的构建方法
KR102552211B1 (ko) 생체 외 랫트 난소 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: No.12 Xuefu Road, Pukou high tech Industrial Development Zone, Nanjing, Jiangsu 210032

Applicant after: Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd

Address before: No.12 Xuefu Road, Pukou high tech Industrial Development Zone, Nanjing, Jiangsu 210032

Applicant before: GEMPHARMATECH Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190521

RJ01 Rejection of invention patent application after publication