CN117203222A - 靶向t细胞的aav载体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了变体AAV衣壳蛋白以及包含所述变体AAV衣壳蛋白的AAV衣壳和病毒载体。本文所述的病毒载体可具有与原生AAV衣壳序列相比增加的在感兴趣的靶细胞诸如T细胞中的转导。本公开还提供了将本公开的病毒载体和病毒衣壳施用于有此需要的细胞或患者的方法。

Description

靶向T细胞的AAV载体
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月14日提交的美国临时申请号63/137,497的优先权权益，该美国临时申请的内容特此以引用方式整体并入用于所有目的。
技术领域
本公开涉及来自腺相关病毒(AAV)的变体衣壳蛋白以及包含所述变体衣壳蛋白的病毒衣壳和病毒载体。具体地，本公开涉及变体AAV衣壳蛋白和包含所述变体AAV衣壳蛋白的AAV衣壳，它们可以被掺入到病毒载体中以赋予增强的体内和/或离体T细胞的细胞转导的表型。
以电子方式提交的文本文件的描述
以下随本文以电子方式提交的文本文件的内容以引用方式整体并入：序列表的计算机可读格式副本(文件名：STRD_022_01WO_Sequence_Listing.txt，记录日期：2022年1月13日，文件大小：约163.4千字节)。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是属于细小病毒(Parvoviridae)科的依赖病毒(Dependovirus)属的小型单链DNA病毒。AAV是用于基因疗法的有前景的病毒载体，因为它们能够感染多种细胞和组织类型、缺乏致病性、免疫原性低并且能够有效转导非分裂细胞。已知的AAV血清型中的每种均具有不同的感染特定细胞类型的能力。
人们对使用AAV靶向T细胞感兴趣。例如，靶向T细胞的AAV可被用在用于预防、限制和/或逆转T细胞耗竭的基因疗法方法中。T细胞耗竭是在许多慢性感染和癌症期间出现的一种T细胞功能障碍状态，并且还被证明会降低CAR-T疗法的有效性。然而，AAV通常不会以高水平转导T细胞。
因此，本领域需要可以以增强的转导效率靶向T细胞的改进的AAV载体。
发明内容
本公开涉及包含一种或多种转导相关肽的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，以及包含所述衣壳蛋白的AAV衣壳和病毒载体。所公开的转导相关肽可以增强AAV载体向所需细胞类型(诸如T细胞)中的细胞转导。
本公开提供了包含衣壳蛋白的重组腺相关病毒(AAV)载体，其中该衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:17至23中任一者的序列的转导相关肽。在一些实施方案中，该衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，转导相关肽替代对应于SEQ ID NO:1的氨基酸454-460的氨基酸。在一些实施方案中，该衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14组成的组的氨基酸序列，或与该氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。
本公开提供了包含衣壳蛋白的重组AAV载体，其中该衣壳蛋白包含SEQ ID NO:1的序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸454-460被包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:24)的转导相关肽替代。在一些实施方案中，X1不是G，X2不是S，X3不是A，X4不是Q，X5不是N，X6不是K，并且/或者X7不是D。在一些实施方案中，X1是H、M、A、Q、V或S。在一些实施方案中，X2是A或T。在一些实施方案中，X3是P或T。在一些实施方案中，X4是R或D。在一些实施方案中，X5是V、Q、C、S或D。在一些实施方案中，X6是E、A或P。在一些实施方案中，X7是E、G、N、T或A。在一些实施方案中，X1是H，X2是A，X3是P，X4是R，X5是V，X6是E，并且X7是E。在一些实施方案中，X1是M，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。在一些实施方案中，X1是H，X2是T，X3是T，X4是D，X5是C，X6是A，并且X7是N。在一些实施方案中，X1是A，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X6是E，并且X7是T。在一些实施方案中，X1是Q，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。在一些实施方案中，X1是V，X2是A，X3是P，X4是R，X5是D，X6是P，并且X7是A。在一些实施方案中，X1是S，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X46是E，并且X7是N。
在一些实施方案中，该衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1具有约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14组成的组的氨基酸序列。
本公开提供了包含衣壳蛋白的重组AAV载体，其中该衣壳蛋白包含具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的转导相关肽，其中该转导相关肽替代相对于SEQ ID NO:1的氨基酸454-460。在一些实施方案中，该转导相关肽具有SEQ ID NO:17-23中任一者的氨基酸序列。
本公开提供了编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14中任一者的序列的重组AAV衣壳蛋白的核酸。在一些实施方案中，该核酸包含选自由SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13和15组成的组的序列。在一些实施方案中，该核酸是DNA序列。在一些实施方案中，该核酸是RNA序列。本公开提供了包含本文所公开的核酸中的任一种核酸的表达载体。本公开进一步提供了包含本文所公开的核酸中的任一种核酸或本文所公开的表达载体中的任一种表达载体的细胞。
在一些实施方案中，本文所公开的重组AAV载体中的任一种重组AAV载体进一步包含被衣壳蛋白包裹的货物核酸。在一些实施方案中，该货物核酸编码治疗性蛋白质或治疗性RNA。在一些实施方案中，该AAV载体表现出与不包含转导相关肽的AAV载体相比增加的向细胞中的转导。在一些实施方案中，该细胞是T细胞。在一些实施方案中，该AAV载体表现出与不包含转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的细胞核中的转导。在一些实施方案中，该AAV载体表现出与不包含转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的胞质溶胶中的转导。
本公开提供了组合物，该组合物包含本文所公开的重组AAV载体中的任一种重组AAV载体、本文所公开的核酸中的任一种核酸、本文所公开的表达载体中的任一种表达载体，或本文所公开的细胞中的任一种细胞。本公开进一步提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所公开的细胞中的任一种细胞或本文所公开的重组AAV载体中的任一种重组AAV载体；以及药学上可接受的载剂。
本公开提供了将AAV载体递送到细胞中的方法，该方法包括使细胞与本文所公开的AAV载体中的任一种AAV载体接触。在一些实施方案中，细胞的接触在体外、离体或在体内进行。在一些实施方案中，该细胞是T细胞。本公开提供了治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的AAV载体中的任一种AAV载体。本公开提供了治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用已经与本文所公开的AAV载体中的任一种AAV载体离体接触的细胞。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。本公开提供了用作药物的本文所公开的AAV载体的任一种AAV载体。本公开还提供了用于治疗有需要的受试者的方法中的本文所公开的AAV载体中的任一种AAV载体。
这些和其他实施方案更详细地论述在下面阐述的具体实施方式中。
附图说明
图1示出了与野生型AAV6相比，使用实施例2中针对包含变体衣壳的各种AAV载体所述的制造过程获得的总载体基因组(vg)体积产量(volumetric yield)。
图2示出了来自用野生型AAV6或包含所指示的AAV6衣壳变体的AAV载体转导的T细胞的显微分析的图像。每个AAV载体都包装了GFP转基因。在使用如所指示的不同的感染复数(MOI)用AAV载体转导细胞后获得图像。
图3A-3C示出了来自用野生型AAV6或所指示的包含变体衣壳的AAV(每一者均包装了GFP转基因)转导的T细胞的流式细胞术分析的结果。图3A示出了感兴趣的细胞群体(在图中圈出)所鉴定自的所测试细胞样本的大小和粒度(即前向散射和侧向散射)。图3B示出了仅选择用于分析的细胞群体的大小和粒度。图3C示出了针对感兴趣的细胞群体测量的荧光(FITC)信号。用包含STRD-207衣壳的AAV载体转导的细胞中的荧光与用野生型AAV6转导的细胞相比增加。
图4示出了从用野生型AAV6或如所指示的包含衣壳变体的AAV中的每一种执行的流式细胞术实验中获得的GFP阳性T细胞百分比图。该T细胞衍生自两种不同的人供体(供体11和供体12)。如所指示(对于供体12T细胞为10,000、5,000和2,500，并且对于供体11T细胞为15,000、7,500和3,750)使用不同的MOI。
图5A和图5B是描绘在如实施例1所述对T细胞转导进行三轮进化和选择后从经活化的T细胞的细胞核级分(图5A)和胞质级分(图5B)获得的包含变体衣壳的单个AAV的分离物的气泡图。每个气泡表示不同的衣壳蛋白氨基酸序列，其中气泡的半径与相应文库中该变体的读段的数目成比例。y轴表示读段的绝对数目。数据沿x轴分布，以便于可视化。选择优势分离物以进行测序分析。
图6示出了在T细胞的细胞核级分或胞质级分中富集的AAV载体中鉴定的转导相关肽的序列。这些转导相关肽位于衣壳蛋白的氨基酸464-456处，其中氨基酸编号对应于野生型AAV6(SEQ ID NO:1)。图6所示的序列按从上到下的顺序对应于SEQ ID NO:17-23。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文的具体实施方式中所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的而非旨在进行限制。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、文章、GenBank或其他登录号和其他参考文献以引用方式整体并入。
本公开和所附权利要求中的AAV衣壳蛋白中所有氨基酸位置的指定都是相对于VP1衣壳亚基编号而言的。本领域技术人员将理解，如果将本文所述的修饰插入到AAV cap基因中，则该修饰可导致VP1、VP2和/或VP3衣壳亚基的修饰。可替代地，衣壳亚基可以独立地被表达成在衣壳亚基(VP1、VP2、VP3、VP1+VP2、VP1+VP3或VP2+VP3)中的仅一者或两者中达成修饰。
定义
在本文的描述和所附权利要求书中使用了以下术语：
单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。
此外，如本文所用的术语“约”在提及可测量值诸如多核苷酸或多肽序列的量或长度、剂量、时间、温度等时意在涵盖具体指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
而且，如本文所用，“和/或”是指并涵盖相关的所列项目中的一个或多个项目的任何和所有可能组合，以及当以替代方式(“或”)解释时是指缺乏组合。
除非上下文另外指出，否则特别意图本文所述的各种特征可以以任何组合使用。
此外，本公开还设想了在一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。为了进一步说明，例如，如果专利说明书指示特定氨基酸可以选自A、G、I、L和/或V，则此语言还指示该氨基酸可以选自这些氨基酸的任何子集，例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；仅L等等，如同每个这样的子组合在本文中被明确阐述一样。此外，此种语言还指示可以放弃具体指定的氨基酸中的一种或多种氨基酸。例如，在一些实施方案中，氨基酸不是A、G或I；不是A；不是G或V等等，如同每个这样的可能放弃在本文中被明确阐述一样。
如本文所用，术语“减少(reduce/reduces/reduction)”和类似术语意指降低至少约10％、约15％、约20％、约25％、约35％、约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或更多。
如本文所用，术语“增强(enhance/enhances/enhancement)”和类似术语指示增加至少约10％、约15％、约20％、约25％、约35％、约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或更多。
如本文所用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科，包括自主复制细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括原细小病毒属(Protoparvovirus)、红细小病毒属(Erythroparvovirus)、博卡细病毒属(Bocaparvirus)和浓核病毒(Densovirus)亚科的成员。示例性自主细小病毒包括但不限于小鼠微小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、疣鼻栖鸭细小病毒、B19病毒以及现在已知或后来发现的任何其他自主细小病毒。其他自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见例如BERNARD N.FIELDS等人,VIROLOGY,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers；Cotmore等人,Archives of Virology DOI 10.1007/s00705-013-1914-I)。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换地用于指脊椎动物，诸如哺乳动物。哺乳动物可以是例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、马、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、黑猩猩)或人。还涵盖体内获得或体外培养的受试者的组织、细胞或它们的衍生物。人受试者可以是成人、青少年、儿童(2岁至14岁)、婴儿(1个月至24个月)或新生儿(至多1个月)。在一些实施方案中，成人是约65岁或更大或约60岁或更大的年长者。在一些实施方案中，受试者是孕妇或打算怀孕的妇女。在一些实施方案中，受试者“需要”本文所述的方法。
如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV rh32.33型、AAV rh8型、AAV rh10型、AAV rh74型、AAVhu.68型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、蛇AAV、鬃狮蜥AAV、AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B以及现在已知或后来发现的任何其他AAV。参见例如BERNARD N.FIELDS等人,VIROLOGY,第2卷,第69章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)。已经鉴定了许多AAV血清型和进化枝(参见例如Gao等人,(2004)J.Virology78:6381-6388；Moris等人,(2004)Virology 33-:375-383；以及表2)。
如本文所用，术语“嵌合AAV”是指包含衣壳蛋白的AAV，该衣壳蛋白具有衍生自两种或更多种不同AAV血清型的区域、结构域和/或单个氨基酸。在一些实施方案中，嵌合AAV包含有包含衍生自第一AAV血清型的第一区域和衍生自第二AAV血清型的第二区域的衣壳蛋白。在一些实施方案中，嵌合AAV包含有包含衍生自第一AAV血清型的第一区域、衍生自第二AAV血清型的第二区域和衍生自第三AAV血清型的第三区域的衣壳蛋白。在一些实施方案中，嵌合AAV可包含衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和/或AAV12中的两者或更多者的区域、结构域、单个氨基酸。例如，嵌合AAV可包括来自如下(表1)所示的第一和第二AAV血清型的区域、结构域和/或单个氨基酸，其中AAVX+Y表示包括衍生自AAVX和AAVY的序列的嵌合AAV。
表1：嵌合AAV
通过在一个衣壳蛋白中包括来自多种AAV血清型的单个氨基酸或区域，可获得具有单独衍生自多种AAV血清型的多种所需性质的衣壳蛋白。
各种AAV血清型和自主细小病毒的基因组序列以及原生末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可在文献或公共数据库诸如GenBank中找到。参见例如GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001 862、AAB95450.1、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；它们的公开内容以引用方式并入本文用于教导细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。还可参见例如Srivistava等人,(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人,(1998)JVirology 71:6823；Chiorini等人,(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人,(1999)JVirology 73:939；Xiao等人,(1999)J Virology 73:3994；Muramatsu等人,(1996)Virology 221:208；Shade等人,(1986)J.Virol.58:921；Gao等人,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人,(2004)Virology 33:375-383；国际专利公布WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；以及美国专利号6,156,303；它们的公开内容以引用方式并入本文用于教导细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。还可参见表2。BERNARDN.FIELDS等人,VIROLOGY,第2卷,第69&70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)中更详细地描述了自主细小病毒和AAV的衣壳结构。还可参见对以下的晶体结构的描述：AAV2(Xie等人,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405-10)、AAV9(DiMattia等人,(2012)J.Virol.86:6947-6958)、AAV8(Nam等人,(2007)J.Virol.81:12260-12271)、AAV6(Ng等人,(2010)J.Virol.84:12945-12957)、AAV5(Govindasamy等人,(2013)J.Virol.87,11187-11199)、AAV4(Govindasamy等人,(2006)J.Virol.80:11556-11570)、AAV3B(Lerch等人,(2010)Virology 403:26-36)、BPV(Kailasan等人,(2015)J.Virol.89:2603-2614)和CPV(Xie等人,(1996)J.Mol.Biol.6:497-520以及Tsao等人,(1991)Science 251:1456-64)。
表2：
可以使用病毒产生细胞系在培养物中产生重组AAV(rAAV)载体。术语“病毒产生细胞”、“病毒产生细胞系”或“病毒产生者细胞”是指用于产生病毒载体的细胞。HEK293和239T细胞是常见的病毒产生细胞系。下表8列出了各种病毒载体的示例性病毒产生细胞系。rAAV的产生通常需要细胞中存在三种元件：1)两侧为AAV反向末端重复(ITR)序列的转基因，2)AAV rep和cap基因，以及3)辅助病毒蛋白序列。这三种元件可在一种或多种质粒上提供并且被转染或转导到细胞中。
表8：示例性病毒产生细胞系
如本文所用，术语“感染复数”或“MOI”是指与细胞接触的病毒粒子的数目。例如，经培养的细胞可以每个细胞约1x 102至约1x 105个病毒粒子范围内的MOI与AAV接触。
如本文所用的术语“转导”是指通过病毒载体将核酸(例如，转基因)引入到细胞中的过程。本文描述了经修饰的AAV衣壳蛋白(例如，变体衣壳蛋白)和包含该衣壳蛋白的衣壳，它们可以被掺入到病毒载体中以赋予增强的体内或离体的细胞转导的表型。如本文所用，“增强的转导”、“增强的细胞转导”和类似术语可指转导增加约1.5倍至约100倍或更多倍。例如，转导可增加了至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多倍。经修饰的AAV(例如，包含衣壳变体的AAV)的转导可相对于野生型或原生AAV载体增强。在一些实施方案中，包含转导相关肽的AAV载体的转导可相对于其他方面同一但缺乏转导相关肽的AAV载体增强。
术语“转基因”是指用于细胞转导的任何核酸序列，该细胞可以是离体维持的细胞或处于生物体中的细胞。转基因可以是编码序列、非编码序列、cDNA、基因或其片段或部分、基因组序列、调节元件等。“转基因”生物体(诸如转基因植物或转基因动物)是这样的生物体，转基因已经被递送或引入到该生物体中并且该转基因可以在该转基因生物体中表达从而产生产物，该产物的存在可以在生物体中赋予效果(例如，治疗或有益效果)和/或表型(例如，期望或改变的表型)。
如本文所用的术语“向性”是指病毒优先进入某些细胞或组织中，任选地随后在该细胞中表达(例如，转录和任选地翻译)病毒基因组所携带的序列，例如对于重组病毒，表达感兴趣的异源核酸。
本领域技术人员将理解，在不存在反式作用因子的情况下，例如对于诱导型启动子或以其他方式被调节的核酸序列而言，来自病毒基因组的异源核酸序列的转录可能无法启动。在rAAV基因组的情况下，来自病毒基因组的基因表达可来自稳定整合的前病毒、来自非整合的附加体以及病毒在细胞内可采取的任何其他形式。
如本文所用，“全身向性”和“全身转导”(和等同术语)表示本公开的病毒衣壳或病毒载体分别表现出对全身的组织(例如，脑、肺、骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏和/或胰腺)的向性或者转导全身的组织(例如，脑、肺、骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏和/或胰腺)。在一些实施方案中，观察到肌肉组织(例如，骨骼肌、隔膜肌和心肌)的全身转导。在一些实施方案中，实现骨骼肌组织的全身转导。例如，在一些实施方案中，基本上全身的所有骨骼肌都被转导(尽管转导的效率可因肌肉类型而异)。在一些实施方案中，实现肢体肌肉、心肌和隔膜肌的全身转导。任选地，病毒衣壳或病毒载体经由全身途径(例如，全身途径诸如静脉内、关节内或淋巴内)施用。
可替代地，在一些实施方案中，衣壳或病毒载体局部(locally)递送(例如，肌内、皮内、皮下、外用(topically)递送到足垫)。
除非另外指出，否则“有效转导”或“有效向性”或类似术语可以通过参考合适的对照来确定(例如，分别为对照的转导或向性的至少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或更多)。在一些实施方案中，病毒载体有效地转导T细胞、骨骼肌、心肌、隔膜肌、胰腺(包括β胰岛细胞)、脾、胃肠道(例如，上皮和/或平滑肌)、中枢神经系统的细胞、肺、关节细胞和/或肾脏，或者对T细胞、骨骼肌、心肌、隔膜肌、胰腺(包括β胰岛细胞)、脾、胃肠道(例如，上皮和/或平滑肌)、中枢神经系统的细胞、肺、关节细胞和/或肾脏具有有效向性。合适的对照将取决于多种因素，包括期望的向性谱(tropism profile)。在一些实施方案中，合适的对照是野生型或原生病毒。
类似地，可以通过参考合适的对照来确定病毒是否“不能有效地转导靶组织”或者“对靶组织不具有有效向性”或类似术语。在一些实施方案中，病毒载体不能有效地转导肝脏、肾脏、性腺和/或生殖细胞(即，对肝脏、肾脏、性腺和/或生殖细胞不具有有效向性)。在一些实施方案中，组织(例如，肝脏)的不期望的转导是期望的靶组织(例如，骨骼肌、隔膜肌、心肌和/或中枢神经系统的细胞)的转导水平的20％或更少、10％或更少、5％或更少、1％或更少、0.1％或更少。
如本文所用，术语“多肽”涵盖肽和蛋白质两者，除非另外指出。
“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，并且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂合序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸两者)，但在代表性实施方案中是单链或双链DNA序列。
如本文所用，“经分离的”多核苷酸(例如，“经分离的DNA”或“经分离的RNA”)意指至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或者通常被发现与多核苷酸相关的其他多肽或核酸)分离的多核苷酸。在代表性实施方案中，“经分离的”核苷酸与起始材料相比被富集了至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多倍。
同样，“经分离的”多肽意指至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或者通常被发现与多肽相关的其他多肽或核酸)分离的多肽。在一些实施方案中，“经分离的”多肽与起始材料相比被富集了至少约10倍、约100倍、约1000倍、约10,000倍或更多倍。
如本文所用，所谓“分离”或“纯化”(或语法等同物)病毒载体，意指该病毒载体至少部分与起始材料中的至少一些其他组分分离。在一些实施方案中，“经分离的”或“经纯化的”病毒载体与起始材料相比被富集了至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多倍。
如本文所用，术语“转导相关肽”是指可被掺入到AAV载体中以改变AAV载体向任何细胞中的转导的短氨基酸序列。转导相关肽可能对AAV载体的转导具有任何影响。例如，在一些实施方案中，转导相关肽增加了AAV载体向感兴趣的靶细胞中的转导。在一些实施方案中，转导相关肽降低了AAV载体向未被靶向的细胞中的转导。转导相关肽可被插入到现有的AAV衣壳序列中(即，以在该序列中产生氨基酸的净添加)，或者它可替代AAV衣壳序列的现有部分(即，以不在该序列中产生氨基酸数目的净变化或减少)。
“治疗性多肽”或“治疗性蛋白质”是可以缓和、减少、预防、延迟和/或稳定由细胞或受试者中的蛋白质缺乏或缺陷引起的症状的多肽，并且/或者是以其他方式赋予受试者益处(例如，抗癌作用或移植物生存能力的改善)的多肽。
所谓术语“治疗(treat/treating/treatment of)”(及其语法变体)意指降低、至少部分地改善或稳定受试者的疾患的严重程度，以及/或者实现至少一种临床症状的一些缓和、缓解、减少或稳定，以及/或者疾病或病症的进展存在延迟。术语“受试者”和术语“患者”在本文中可互换使用。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”(及其语法变体)是指受试者中疾病、病症和/或临床症状的发作的预防和/或延迟，以及/或者疾病、病症和/或临床症状的发作的严重程度相对于在不存在本公开的方法时将发生的情况的降低。预防可以是完全的，例如完全不存在疾病、病症和/或临床症状。预防也可以是部分的，使得受试者中疾病、病症和/或临床症状的发生和/或发作的严重程度小于在不存在本公开时将发生的情况。
如本文所用的“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病或疾病的临床症状中的至少一种临床症状时足以影响对该疾病或其症状的此种治疗的量。“治疗有效量”可根据例如疾病和/或疾病的症状，疾病以及/或者疾病或病症的症状的严重程度，待治疗的患者的年龄、体重和/或健康以及处方医师的判断而变化。在任何给定情况下的适当量可由本领域技术人员确定或能够通过常规实验确定。
如本文所用，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”是指起核酸递送媒介物作用并且包含病毒粒子内所包装的载体基因组(例如，病毒DNA[vDNA])的病毒(例如，AAV)颗粒。可替代地，在一些上下文中，术语“载体”可用于指单独载体基因组/vDNA。
“腺相关病毒载体”或“AAV载体”通常包含AAV衣壳和被AAV衣壳包裹的核酸(例如，包含转基因的核酸)。“AAV衣壳”是包含约60个以T＝1二十面体对称性缔合和排列的“AAV衣壳蛋白”(在本文中可互换地称为“AAV衣壳蛋白亚基”或“衣壳蛋白”)的近球形蛋白壳。本文所述的AAV载体的AAV衣壳包含多种AAV衣壳蛋白。当AAV载体被描述为包含AAV衣壳蛋白时，应当理解，AAV载体包含AAV衣壳，其中该AAV衣壳包含一种或多种AAV衣壳蛋白。术语“病毒样颗粒(viral-like particle/virus-like particle)”是指不包含任何载体基因组或者包含转移盒或转基因的核酸的蛋白衣壳。术语“AAV载体”、“AAV衣壳”和“AAV衣壳蛋白”在本文中有时可互换使用。基于上下文，本领域普通技术人员将能够容易地推导出所用的特定术语的含义。
在一些实施方案中，AAV载体可包含有包含“转移盒”的核酸，即包含可以通过AAV载体递送到细胞的一个或多个序列的核酸。在一些实施方案中，该核酸是自身互补的(即，双链的)。在一些实施方案中，该核酸不是自身互补的(即，单链的)。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的AAV基因组(即，vDNA)。rAAV载体一般仅需要顺式末端重复序列(TR)来产生病毒。所有其他病毒序列都是可有可无的并且可以反式提供(Muzyczka,(1992)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.158:97)。通常，rAAV载体基因组将仅保留一个或多个TR序列，以便使可以被载体有效地包装的转基因的大小最大化。结构和非结构蛋白编码序列可以反式提供(例如，从载体(诸如质粒)提供，或通过将序列稳定整合到包装细胞中来提供)。在实施方案中，rAAV载体基因组包含至少一个TR序列(例如，AAV TR序列)，任选的两个TR(例如，两个AAV TR)，这两个TR通常将位于载体基因组的5'和3'端并且侧接异源核酸，但不必与异源核酸邻接。该TR可以彼此相同或不同。
术语“末端重复序列”或“TR”包括形成发夹结构并且起反向末端重复序列作用(即，介导期望的功能，诸如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等)的任何病毒末端重复序列或合成序列。该TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，非AAV TR序列诸如其他细小病毒(例如，犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)的那些非AAV TR序列，或任何其他合适的病毒序列(例如，充当SV40复制的起点的SV40发夹)可以用作TR，该TR可以通过截短、取代、缺失、插入和/或添加来进一步修饰。进一步地，该TR可以是部分或完全合成的，诸如授予Samulski等人的美国专利号5,478,745中所描述的“双D序列”。
“AAV末端重复序列”或“AAV TR”可来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或者现在已知或后来发现的任何其他AAV(参见例如表2)。AAV末端重复序列不需要具有原生末端重复序列(例如，原生AAV TR序列可通过插入、缺失、截短和/或错义突变来改变)，只要该末端重复序列介导期望的功能(例如，复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等)即可。
本公开的病毒载体可以进一步是如国际专利公布WO00/28004和Chao等人,(2000)Molecular Therapy 2:619中所描述的“靶向性”病毒载体(例如，具有定向向性)和/或“杂合”细小病毒(即，其中病毒TR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)。
本公开的病毒载体可以进一步是如国际专利公布WO 01/92551(其公开内容以引用方式整体并入本文)中所述的双链体化细小病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，可以将双链(双链体)基因组包装到本公开的病毒衣壳中。
进一步地，病毒衣壳或基因组元件可以含有其他修饰，包括插入、缺失和/或取代。
如本文所用，术语“氨基酸”涵盖任何天然存在的氨基酸、它们的经修饰形式和合成氨基酸。
天然存在的左旋(L-)氨基酸在表3中示出。
表3：氨基酸残基和缩写。
可替代地，该氨基酸可以是经修饰的氨基酸残基(非限制性实例在表4中示出)和/或可以是通过翻译后修饰(例如，乙酰化、酰胺化、甲酰化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸化)修饰的氨基酸。
表4：经修饰的氨基酸残基
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进一步地，非天然存在的氨基酸可以是“非天然”氨基酸(如Wang等人,Annu RevBiophys Biomol Struct.35:225-49(2006)所述)。这些非天然氨基酸可以有利地用于将感兴趣的分子化学连接到AAV衣壳蛋白。
“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“宿主组织和细胞在遇到免疫原后参与”。它涉及具有免疫能力的细胞在淋巴网状组织中的分化和增殖，这导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发展，或两者”。Herbert B.Herscowitz,Immunophysiology:CellFunction and Cellular Interactions in Antibody Formation,in IMMUNOLOGY:BASICPROCESSES1 17(Joseph A.Bellanti编辑,1985)。可替代地说，宿主在通过感染或通过疫苗接种暴露于免疫原后发起主动免疫应答。主动免疫可以与被动免疫相反，被动免疫是通过将预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)从经主动免疫的宿主转移到非免疫宿主而获得的。
如本文所用的“保护性”免疫应答或“保护性”免疫表示免疫应答赋予受试者一些益处，因为它预防或减少疾病的发生。可替代地，保护性免疫应答或保护性免疫可用于治疗和/或预防疾病，特别是癌症或肿瘤(例如，通过预防癌症或肿瘤形成、通过引起癌症或肿瘤的消退和/或通过预防转移和/或通过预防转移结节的生长)。保护作用可以是完全的或部分的，只要治疗的益处超过其任何缺点即可。
如本文所用，术语“癌症”涵盖肿瘤形成性癌症。同样，术语“癌组织”涵盖肿瘤。“癌细胞抗原”涵盖肿瘤抗原。
术语“癌症”在本领域中具有它的被充分理解的含义，例如，具有扩散到身体的远端部位(即，转移)的潜力的不受控制的组织生长。示例性癌症包括但不限于黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌以及现在已知或后来鉴定的任何其他癌症或恶性疾患。在代表性实施方案中，本公开提供了一种治疗和/或预防肿瘤形成性癌症(tumor-forming cancer)的方法。
术语“肿瘤”在本领域中也被理解为例如多细胞生物体内的未分化细胞的异常团块。肿瘤可以是恶性的或良性的。在代表性实施方案中，本文所公开的方法被用于预防和治疗恶性肿瘤。
所谓术语“治疗癌症”、“癌症的治疗”和等同术语，是指降低或至少部分地消除癌症的严重性，以及/或者减缓和/或控制该疾病的进展，以及/或者稳定该疾病。在一些实施方案中，这些术语指示预防或降低或至少部分地消除癌症的转移，以及/或者预防或降低或至少部分地消除转移性结节的生长。
所谓术语“癌症的预防”或“预防癌症”和等同术语，是指该方法至少部分地消除或降低和/或延迟癌症发作的发生率和/或严重性。可替代地说，可降低受试者中癌症发作的可能性或概率以及/或者延迟受试者中癌症发作。
经修饰的AAV衣壳蛋白和包含该衣壳蛋白的衣壳
本公开提供了AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)变体以及包含该变体的病毒衣壳和病毒载体。每种衣壳变体均包含一种或多种转导相关肽。该转导相关肽不存在于天然存在的AAV衣壳蛋白中，并且在一些实施方案中可赋予增强的包含衣壳蛋白的AAV载体向感兴趣的靶细胞(例如，T细胞)中的转导。本文所公开的AAV衣壳蛋白变体可以是相对于现在已知或后来发现的任何AAV血清型的衣壳蛋白的变体。在一些实施方案中，该AAV衣壳蛋白变体是来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV和禽AAV的AAV血清型的衣壳蛋白的变体。
a.AAV衣壳蛋白的修饰
在一些实施方案中，本文所述的转导相关肽可以赋予包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒载体一种或多种期望的特性，包括但不限于增强的在体外、体内或离体在各种细胞类型(例如，T细胞)中的细胞转导。在一些实施方案中，本公开的衣壳蛋白可被掺入到AAV载体中。在一些实施方案中，包含衣壳蛋白的AAV载体具有与野生型AAV或包含不含转导相关肽的AAV衣壳蛋白的AAV病毒颗粒或AAV病毒载体相比增强的细胞转导(例如，增强的T细胞转导)。在一些实施方案中，本公开的AAV病毒颗粒或载体还可以逃避中和抗体。
本公开的转导相关肽可替代野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列，从而导致AAV衣壳蛋白序列中氨基酸的数目没有净增加或减少。在一些实施方案中，用本公开的转导相关肽替代野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列可导致与野生型AAV衣壳蛋白序列相比氨基酸的净损失(例如，缺失)。例如，转导相关肽可替代来自以下血清型中的任一种血清型的AAV衣壳蛋白中的一个或多个氨基酸：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV和禽AAV。在一些实施方案中，本公开的转导相关肽可被插入到野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中，从而导致AAV衣壳蛋白序列中氨基酸的数目增加。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白的修饰导致原生AAV衣壳蛋白的一个或多个氨基酸残基被原生衣壳序列中不存在的氨基酸替代。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白的修饰导致以下氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被原生衣壳蛋白序列中不存在的氨基酸替代：454、455、456、457、458、459和460，其中氨基酸编号是相对于野生型AAV6衣壳蛋白的VP1序列或任何其他AAV血清型的衣壳蛋白中的对应残基而言的。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白的修饰导致缺失以下氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基：454、455、456、457、458、459和460，其中氨基酸编号是相对于野生型AAV6衣壳蛋白的VP1序列或任何其他AAV血清型的衣壳蛋白中的对应残基而言的。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白的修饰导致相对于原生AAV6衣壳蛋白序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列对氨基酸454、455、456、457、458、459和/或460中的一个或多个氨基酸的替代。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:24)的转导相关肽。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQID NO:24)的转导相关肽，其中该衣壳蛋白是以下血清型中的任一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或禽AAV。在一些实施方案中，包含选自SEQ IDNO:1或25-34中的任一者的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:24)的转导相关肽。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含原生AAV6衣壳蛋白序列(例如，SEQ ID NO:1)的序列，并且进一步包含SEQ ID NO:24的转导相关肽。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含与野生型AAV衣壳蛋白序列(诸如例如SEQ ID NO:1或25-34)的氨基酸序列具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或约100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所公开的AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1具有约99％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24的转导相关肽可被用于替代所公开的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中任何地方的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的转导相关肽可被用于替代衣壳蛋白中的序列，其中该衣壳蛋白具有选自SEQ ID NO:1和25-34中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，序列SEQ ID NO:24的转导相关肽可被插入到本文所公开的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中。在一些实施方案中，用序列SEQ ID NO:24的转导相关肽替代本文所述的一种或多种AAV衣壳蛋白的原生序列可导致一个或多个氨基酸从AAV衣壳蛋白的序列中缺失。在一些实施方案中，衣壳蛋白可包含SEQ ID NO:1的序列，不同之处在于SEQ ID NO:1的氨基酸454-460被包含序列SEQ ID NO:24的转导相关肽替代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24被用于替代野生型AAV衣壳蛋白的序列，使得所得序列包含至少一个、两个、三个等不存在于野生型序列中的单个氨基酸。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:24包含这样的序列：其中X1不是G，X2不是S，X3不是A，X4不是Q，X5不是N，X6不是K，并且/或者X7不是D。在一些实施方案中，X1是H、M、A、Q、V或S。在一些实施方案中，X2是A或T。在一些实施方案中，X3是P或T。在一些实施方案中，X4是R或D。在一些实施方案中，X5是V、Q、C、S或D。在一些实施方案中，X6是E、A或P。在一些实施方案中，X7是E、G、N、T或A。在一些实施方案中，X1是H，X2是A，X3是P，X4是R，X5是V，X6是E，并且X7是E。在一些实施方案中，X1是M，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。在一些实施方案中，X1是H，X2是T，X3是T，X4是D，X5是C，X6是A，并且X7是N。在一些实施方案中，X1是A，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X6是E，并且X7是T。在一些实施方案中，X1是Q，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。在一些实施方案中，X1是V，X2是A，X3是P，X4是R，X5是D，X6是P，并且X7是A。在一些实施方案中，X1是S，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X46是E，并且X7是N。
在一些实施方案中，转导相关肽具有X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7的氨基酸序列，其中X1＝H、M、Q、V或S；X2＝A或T；X3＝P或T；X4＝R或D；X5＝V、Q、C、S或D，X6＝E、A或P；并且X7＝E、G、N、T或A(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，转导相关肽具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列的转导相关肽。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列的转导相关肽替代AAV衣壳蛋白的一个或多个氨基酸。本公开提供了以下血清型中的任一种血清型的AAV衣壳蛋白的变体：AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,AAVrh.8,AAVrh.10,AAVrh32.33,AAVrh74、牛AAV和禽AAV，其中该AAV衣壳蛋白变体包含有包含具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列的转导相关肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含选自SEQ ID NO:1和25-34中的任一者的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸被具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列的转导相关肽替代。
在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列的转导相关肽替代以下血清型中的任一种血清型的AAV衣壳蛋白的一个或多个氨基酸：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV和禽AAV。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列的转导相关肽替代包含选自SEQ ID NO:1和25-34中的任一者的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白的一个或多个氨基酸。
在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被包含SEQ ID NO:17-23中的任一者的序列的转导相关肽替代。在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被序列SEQ ID NO:17的转导相关肽替代。在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被序列SEQID NO:18的转导相关肽替代。在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被序列SEQ ID NO:19的转导相关肽替代。在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被序列SEQ ID NO:20的转导相关肽替代。在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被序列SEQ IDNO:21的转导相关肽替代。在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被序列SEQ ID NO:22的转导相关肽替代。在一些实施方案中，原生AAV6衣壳蛋白(例如，SEQ ID NO:1)的氨基酸454-460被序列SEQ ID NO:23的转导相关肽替代。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14组成的组的氨基酸序列，或与该氨基酸序列至少约80％同一的序列。例如，在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14中的任一者至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性、至少约99.5％或约100％的同一的氨基酸序列。
b.AAV衣壳蛋白的其他修饰
本公开设想了待被修饰的AAV衣壳蛋白可以是天然存在的AAV衣壳蛋白(例如，AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白或表2中所示的任何AAV)，但不限于此。本领域技术人员将理解，对AAV衣壳蛋白的多种操作是本领域已知的，并且本公开不限于天然存在的AAV衣壳蛋白的修饰。例如，待被修饰的衣壳蛋白可能已经具有与天然存在的AAV相比的改变(例如，衍生自天然存在的AAV衣壳蛋白，例如AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或者现在已知或后来发现的任何其他AAV)。在一些实施方案中，该衣壳蛋白可以是工程化AAV，诸如AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B。此类AAV衣壳蛋白也在本公开的范围内。
在一些实施方案中，该AAV衣壳蛋白是嵌合的。例如，该嵌合AAV衣壳蛋白可包含衍生自两种或更多种AAV血清型或者三种或更多种AAV血清型的序列。该嵌合AAV衣壳蛋白可包含衍生自以下AAV血清型中的两种或更多种AAV血清型的序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV和禽AAV。
因此，在一些实施方案中，待被修饰的AAV衣壳蛋白可衍生自天然存在的AAV，但进一步包含被插入和/或取代到衣壳蛋白中并且/或者已通过缺失一个或多个氨基酸而被改变的一个或多个外来序列(例如，对于原生病毒是外源的)。因此，当在本文中提及特定AAV衣壳蛋白(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白或来自表2中所示的任何AAV的衣壳蛋白等)时，旨在涵盖原生衣壳蛋白以及具有除本公开的修饰以外的改变的衣壳蛋白。此类改变包括取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，该衣壳蛋白包含与原生AAV衣壳蛋白序列相比的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个插入其中的氨基酸(除本公开的氨基酸序列取代以外)。在实施方案中，该衣壳蛋白包含与原生AAV衣壳蛋白序列相比的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个氨基酸取代(除根据本公开的转导相关肽以外)。在一些实施方案中，该衣壳蛋白包含与原生AAV衣壳蛋白序列相比的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个或少于70个氨基酸的缺失(除本公开的转导相关肽以外)。
对根据本公开的AAV衣壳蛋白的修饰是“选择性”修饰。此方法与先前在AAV血清型之间进行整个亚基或大结构域交换的工作(参见例如国际专利公布WO 00/28004以及Hauck等人,(2003)J.Virology 77:2768-2774)形成对比。在一些实施方案中，“选择性”修饰导致小于或等于约20、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4或3个连续氨基酸的插入和/或取代和/或缺失。本公开的经修饰的衣壳蛋白和衣壳可以进一步包含现在已知或后来鉴定的任何其他修饰。在本文所述的其中氨基酸残基被野生型或原生氨基酸序列中存在的氨基酸残基以外的任何氨基酸残基取代的实施方案中，所述任何其他氨基酸残基可以是本领域已知的任何天然或非天然氨基酸残基(参见例如表3和4)。在一些实施方案中，该取代可以是保守取代，并且在一些实施方案中，该取代可以是非保守取代。
如本文所述，来自许多AAV的衣壳蛋白的氨基酸序列和核酸序列是本领域已知的。因此，对于任何其他AAV，可以容易地确定(例如，通过使用序列比对)与原生AAV衣壳蛋白的氨基酸位置“对应”的氨基酸。确定两个或更多个氨基酸序列之间的序列相似性或同一性的方法是本领域已知的。序列相似性或同一性可使用本领域已知的标准技术，该标准技术包括但不限于Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2,482(1981)的局部序列同一性算法；通过Needleman&Wunsch,JMol.Biol.48,443(1970)的序列同一性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444(1988)的相似性检索方法；通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics软件包(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；通过Devereux等人,Nucl.Acid Res.12,387-395(1984)描述的最佳拟合序列程序，或通过检查来确定。
另一种合适的算法是描述于Altschul等人,J Mol.Biol.215,403-410,(1990)以及Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5787(1993)的BLAST算法。特别有用的BLAST程序是从Altschul等人,Methods in Enzymology,266,460-480(1996)(blast.wustl/edu/blast/README.html)获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用任选地被设置为默认值的若干搜索参数。该参数是动态值并且由程序本身根据特定序列的组成和正在搜索感兴趣的序列的特定数据库的组成来建立；然而，可调整这些值以提高灵敏度。
进一步地，另一种有用的算法是如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402报道的缺口BLAST。
除非另外指出，否则在本公开中使用可在万维网：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得的BLAST算法来执行同一性百分比的计算。
c.经修饰的病毒衣壳
本公开还提供了包含本文所公开的变体衣壳蛋白中的至少一种变体衣壳蛋白的病毒衣壳。在一些实施方案中，该病毒衣壳是细小病毒衣壳，该细小病毒衣壳可以进一步是自主细小病毒衣壳或依赖病毒衣壳。任选地，该病毒衣壳是AAV衣壳。在一些实施方案中，该AAV衣壳是AAV1、AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV衣壳、禽AAV衣壳或者现在已知或后来鉴定的任何其他AAV。AAV血清型的非限制性清单在表2中示出。本公开的AAV衣壳可以是表2中所列的任何AAV血清型或者通过一个或多个插入、取代和/或缺失而衍生自前述中的任一种。经修饰的病毒衣壳可以用作如例如已在美国专利号5,863,541中被描述的“衣壳媒介物”。根据本公开的病毒衣壳可以使用本领域已知的任何方法，例如通过从杆状病毒表达(Brown等人,(1994)Virology 198:477-488)来产生。在一些实施方案中，AAV衣壳包含约60种本文所述的变体衣壳蛋白。
在一些实施方案中，该病毒衣壳可以是包含靶向序列(例如，被取代或插入在病毒衣壳中)的靶向性病毒衣壳，该靶向序列指导病毒衣壳与存在于期望的靶组织上的细胞表面分子相互作用(参见例如国际专利公布WO 00/28004以及Hauck等人,(2003)J.Virology77:2768-2774；Shi等人,Human Gene Therapy 17:353-361(2006)[描述了在AAV衣壳亚基的位置520和/或584处插入整联蛋白受体结合基序RGD]；以及美国专利号7,314,912[描述了在AAV2衣壳亚基的氨基酸位置447、534、573和587后插入含有RGD基序的PI肽])。该AAV衣壳亚基内耐受插入的其他位置是本领域已知的(例如，Grifman等人,Molecular Therapy 3:964-975(2001)描述的位置449和588)。
例如，本公开的病毒衣壳可能对某些感兴趣的靶组织(例如，肝、骨骼肌、心脏、隔膜肌、肾、脑、胃、肠、皮肤、内皮细胞和/或肺)具有相对低效的向性。可以将靶向序列有利地掺入到这些低转导载体中，以赋予病毒衣壳期望的向性以及任选的对特定组织或细胞(诸如T细胞)的选择性向性。包含靶向序列的AAV衣壳蛋白、衣壳和载体描述于例如国际专利公布WO 00/28004中。作为另一实例，作为将低转导载体重新定向到期望的靶组织的手段，可以将如Wang等人,Annu Rev Biophys Biomol Struct.35:225-49(2006)所描述的一种或多种非天然存在的氨基酸在正交位点处掺入到本公开的AAV衣壳亚基中。这些非天然氨基酸可以有利地被用于将感兴趣的分子化学连接到AAV衣壳蛋白，包括但不限于：聚糖(甘露糖-靶向树突细胞)；用于靶向性地递送到特定癌细胞类型的RGD、铃蟾肽或神经肽；选自靶向于特定细胞表面受体(诸如生长因子受体、整联蛋白等)的噬菌体展示的RNA适体或肽。化学修饰氨基酸的方法是本领域已知的(参见例如Greg T.Hermanson,BioconjugateTechniques,第1版,Academic Press,1996)。在一些实施方案中，靶向序列可以是指导对特定细胞类型的感染的病毒衣壳序列(例如，自主细小病毒衣壳序列、AAV衣壳序列或任何其他病毒衣壳序列)。
作为另一非限制性实例，可将肝素或硫酸乙酰肝素(HS)结合结构域(例如，呼吸道合胞病毒肝素结合结构域)插入或取代到通常不结合HS受体(例如，AAV4、AAV5)的衣壳亚基中，以赋予肝素和/或硫酸乙酰肝素与所得变体的结合。本领域已知的是，HS/肝素结合由富含精氨酸和/或赖氨酸的“碱性贴剂(basic patch)”介导。在示例性实施方案中，可以使用在基序BXXB(SEQ ID NO:105)之后的序列，其中“B”是碱性残基，并且X是中性的和/或疏水性的。作为非限制性实例，BXXB可以是RGNR(SEQ ID NO:106)。作为另一非限制性实例，将BXXB取代原生AAV2衣壳蛋白中的氨基酸位置262至265或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的对应位置。
细小病毒B19使用红细胞糖苷脂作为其受体来感染原代红系祖细胞(Brown等人,(1993)Science 262:114)。B19的结构的分辨率已被确定为(Agbandje-McKenna等人,(1994)Virology 203:106)。B19衣壳中与红细胞糖苷酯结合的区域已被映射在氨基酸399-406之间(Chapman等人,(1993)Virology 194:419)，这是β-桶结构E与F之间的一个环出区域(Chipman等人,(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93:7502)。因此，可将B19衣壳的红细胞糖苷脂受体结合结构域取代到本公开的AAV衣壳蛋白中，以使病毒衣壳或包含病毒衣壳的病毒载体靶向于红系细胞。
在一些实施方案中，外源靶向序列可以是编码改变包含经修饰的AAV衣壳蛋白的病毒衣壳或病毒载体的向性的肽的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，靶向肽或蛋白质可以是天然存在的或者可替代地完全或部分合成的。示例性靶向序列包括与细胞表面受体和糖蛋白结合的配体和其他肽，诸如ROD肽序列、缓激肽、激素、肽生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子I和II等)、细胞因子、黑素细胞刺激激素(例如，α、β或γ)、神经肽和内啡肽等以及它们的保留了使细胞靶向于其同源受体的能力的片段。其他例示性肽和蛋白质包括P物质、角质形成细胞生长因子、神经肽Y、胃泌素释放肽、白介素2、鸡蛋清溶菌酶、促红细胞生成素、促性腺素释放素、皮质抑素、β-内啡肽、亮氨酸脑啡肽、强啡肽、α-新脑啡肽、血管紧张素、pneumadin、血管活性肠肽、神经降压素、胃动素以及它们的如上所述的片段。作为又一进一步替代方案，可以将来自毒素(例如，破伤风毒素或蛇毒素，诸如α-银环蛇毒素等)的结合结构域取代到衣壳蛋白中作为靶向序列。在又一进一步代表性实施方案中，可以通过如Cleves(CurrentBiology 7:R318(1997))所描述将“非经典”输入/输出信号肽(例如，成纤维细胞生长因子-1和-2、白介素1、HIV-1Tat蛋白、疱疹病毒VP22蛋白等)取代到AAV衣壳蛋白中来修饰AAV衣壳蛋白。还涵盖指导特定细胞对肽基序的摄取，例如FVFLP(SEQ ID NO:104)肽基序触发肝细胞摄取。
噬菌体展示技术以及本领域已知的其他技术可被用于鉴定识别任何感兴趣的细胞类型的肽。靶向序列可编码靶向于细胞表面结合位点的任何肽，包括受体(例如，蛋白质、碳水化合物、糖蛋白或蛋白聚糖)。细胞表面结合位点的实例包括但不限于硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和其他糖胺聚糖；在粘蛋白、糖蛋白和神经节苷脂上发现的唾液酸部分；MHC 1糖蛋白；在膜糖蛋白上发现的碳水化合物组分，包括甘露糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、岩藻糖、半乳糖等。表7示出了合适的靶向序列的其他非限制性实例。
表7：例示性靶向序列
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Y*是磷酸Tyr
在一些实施方案中，靶向序列可以是可用于化学偶联到靶向进入细胞中的另一分子(例如，可包含可通过R基团化学偶联到靶向进入细胞中的另一分子的精氨酸和/或赖氨酸残基)的肽。在一些实施方案中，本公开的AAV衣壳蛋白或病毒衣壳可以包含如WO 2006/066066中所描述的突变。例如，该衣壳蛋白可以包含位于原生AAV2衣壳蛋白的氨基酸位置263、705、708和/或716处的选择性氨基酸取代或位于来自另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的对应变化。
另外或可替代地，在一些实施方案中，该衣壳蛋白、病毒衣壳或载体包含紧跟在AAV2衣壳蛋白的氨基酸位置264之后的选择性氨基酸插入或来自其他AAV的衣壳蛋白中的对应变化。所谓“紧跟在氨基酸位置X之后”，意指插入紧接在所指示的氨基酸位置之后(例如，“在氨基酸位置264之后”指示位于位置265处的点插入或更大插入，例如从位置265到268，等)。此外，在一些实施方案中，本公开的衣壳蛋白、病毒衣壳或载体可以包含诸如PCT公布号WO 2010/093784(例如，2i8)和/或PCT公布号WO 2014/144229(例如，双聚糖)中所描述的氨基酸修饰。
异源分子被定义为并非在AAV感染中天然发现的那些，例如不由野生型AAV基因组编码的那些。进一步地，治疗上有用的分子可以与嵌合病毒衣壳的外部缔合以用于将该分子转移到宿主靶细胞中。此类缔合分子可以包括DNA、RNA、有机小分子、金属、碳水化合物、脂质和/或多肽。在本公开的一个实施方案中，治疗上有用的分子共价连接(即，缀合或化学偶联)到衣壳蛋白。共价连接分子的方法是本领域技术人员已知的。
d.经修饰的病毒载体
本公开提供了包含本公开的衣壳蛋白变体和衣壳的病毒载体。在一些实施方案中，该病毒载体是细小病毒载体(例如，包含细小病毒衣壳和/或载体基因组)，例如AAV载体(例如，包含AAV衣壳和/或载体基因组)。在一些实施方案中，该病毒载体包含有包含本公开的经修饰的衣壳蛋白的经修饰的AAV衣壳以及载体基因组。
例如，在一些实施方案中，该病毒载体包含：(a)包含本公开的衣壳蛋白变体的病毒衣壳(例如，AAV衣壳)；以及(b)包含末端重复序列的核酸(例如，AAV TR)，其中包含末端重复序列的核酸被病毒衣壳包裹。该核酸可以任选地包含两个末端重复序列(例如，两个AAV TR)。在代表性实施方案中，该病毒载体是包含编码感兴趣的多肽或功能性RNA的异源核酸的重组病毒载体。
AAV通常不会以高水平转导T细胞。相比之下，在一些实施方案中，本公开的病毒载体表现出与野生型病毒载体或不含衣壳蛋白变体的病毒载体的转导水平相比增强的对一种或多种类型细胞(例如，T细胞)和/或组织的转导。在一些实施方案中，AAV病毒载体具有与野生型或原生AAV病毒载体相比增加的细胞转导。在一些实施方案中，该AAV病毒载体具有与野生型或原生AAV病毒载体或不包含本文所公开的衣壳蛋白变体中的任一种衣壳蛋白变体的AAV病毒载体相比增加的在一种或多种细胞类型(例如，T细胞)中的转导。在一些实施方案中，该AAV病毒载体可具有增加的向造血干细胞中的转导。在一些实施方案中，该AAV病毒载体可具有增加的在单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞和/或天然杀伤细胞中的转导。在一些实施方案中，该AAV病毒载体可具有增加的在卫星细胞、间充质干细胞和/或基底细胞中的转导。在一些实施方案中，该AAV病毒载体可具有增加的在肺上皮细胞、肝细胞和/或骨骼肌细胞中的转导。
AAV的已知受体和共受体包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、整联蛋白、O-连接的唾液酸、N-连接的唾液酸、AAV受体(AAVR、KIAA0319L)、肝细胞生长因子受体(c-Met)、CD9、FGFR-1、37/67-kDa层粘连蛋白受体和血小板衍生生长因子受体。在实施方案中，本公开的AAV病毒载体对这些受体和/或共受体中的一种或多种具有增加的亲和力。例如，在一些实施方案中，该AAV病毒载体具有与野生型或原生AAV病毒载体相比增加的肝素和/或硫酸乙酰肝素结合。在一些实施方案中，该AAV病毒载体具有与野生型或原生AAV病毒载体相比增加的唾液酸结合。在一些实施方案中，该AAV病毒载体具有与野生型或原生AAV病毒载体相比增加的整联蛋白结合。在一些实施方案中，该AAV病毒载体具有与野生型或原生AAV病毒载体相比增加的与包含α亚基和β亚基的整联蛋白的结合。该整联蛋白可以是例如α4β7、α4β1、α1β1、α2β1、αEβ7、αLβ2、α5β1、α5β6、α5β5、α5β8、α5β8、α3β1、α5β1、α11β1、α5β3、α11β3、αVβ3、αVβ5、αVβ6、αVβ8。
本公开还提供了一种编码本公开的衣壳蛋白变体(例如，AAV衣壳蛋白变体)中的一种或多种或者包含衣壳蛋白变体的一种或多种衣壳(例如，AAV衣壳)的核苷酸序列或包含该核苷酸序列的表达载体。在一些实施方案中，该核酸编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14中的任一者的序列的重组AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，该核酸包含选自由SEQID NO:3、5、7、9、11、13和15组成的组的序列。该核苷酸序列可以是DNA序列或RNA序列。该表达载体不受限制并且可以是病毒载体(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、牛痘、痘病毒、杆状病毒等)或非病毒载体(诸如质粒、噬菌体、YAC、BAC等)。本公开还提供了一种包含本公开的一种或多种核苷酸序列或表达载体的细胞。该细胞可以是体外的、离体的或体内的。
用于产生病毒载体的方法
本公开进一步提供了产生本文所公开的病毒载体的方法。因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种产生具有增加的细胞转导(例如，增加的向T细胞中的转导)的AAV载体的方法，该方法包括：a)鉴定AAV衣壳蛋白上的表面暴露的残基；b)产生包含在(a)中鉴定的表面暴露的氨基酸残基的氨基酸取代的AAV衣壳蛋白的文库；c)从(b)的AAV衣壳蛋白的文库产生包含衣壳蛋白的AAV颗粒；d)在可以发生感染和复制的条件下使(c)的AAV颗粒与细胞接触；e)选择可以完成至少一个感染周期并复制到类似于或高于对照AAV颗粒的滴度的AAV颗粒。在一些实施方案中，重复步骤(d)和(e)多于一次，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次。用于鉴定表面暴露的残基的方法的非限制性实例包括冷冻电子显微术。还可参见以下的晶体结构的描述：AAV2(Xie等人,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.99:10405-10)、AAV9(DiMattia等人,(2012)J.Virol.86:6947-6958)、AAV8(Nam等人,(2007)J.Virol.81:12260-12271)、AAV6(Ng等人,(2010)J.Virol.84:12945-12957)、AAV5(Govindasamy等人,(2013)J.Virol.87,11187-11199)、AAV4(Govindasamy等人,(2006)J.Virol.80:11556-11570)、AAV3B(Lerch等人,(2010)Virology403:26-36)、BPV(Kailasan等人,(2015)J.Virol.89:2603-2614)和CPV(Xie等人,(1996)J.Mol.Biol.6:497-520以及Tsao等人,(1991)Science251:1456-64)。
表面暴露的残基的解析(resolution)和鉴定允许随后通过随机、合理和/或简并诱变对它们进行修饰，以产生可以通过进一步选择和/或筛选来鉴定的AAV衣壳。因此，在进一步的实施方案中，本公开提供了一种产生具有增加的细胞转导(例如，增加的向T细胞中的转导)的AAV载体的方法，该方法包括：a)鉴定AAV衣壳蛋白上的表面暴露的氨基酸残基；b)通过随机、合理和/或简并诱变产生包含在(a)中鉴定的表面暴露的氨基酸残基的氨基酸取代的AAV衣壳蛋白；c)从(b)的AAV衣壳蛋白产生包含衣壳蛋白的AAV颗粒；d)在可以发生感染和复制的条件下使(c)的AAV颗粒与细胞接触；以及e)选择可以完成至少一个感染周期并复制到类似于或高于对照AAV颗粒的滴度的AAV颗粒。
通过随机、合理和/或简并诱变产生包含表面暴露的氨基酸残基的氨基酸取代的AAV衣壳蛋白的方法是本领域已知的。这种综合方法呈现了一种可以应用于修饰任何AAV衣壳的平台技术。应用这种平台技术产生衍生自原始AAV衣壳模板的具有增强的转导效率的AAV变体。作为一个优点和益处，该技术的应用将扩大有资格接受利用AAV载体的基因疗法的患者队列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种产生病毒载体的方法，该方法包括向细胞提供：(a)包含至少一个TR序列(例如，AAV TR序列)的核酸模板，以及(b)足以使该核酸模板复制并包裹到AAV衣壳中的AAV序列(例如，编码本公开的AAV衣壳的AAV rep序列和AAV cap序列)。任选地，该核酸模板进一步包含至少一种异源核酸序列。在一些实施方案中，该核酸模板包含两个AAV ITR序列，这两个AAV ITR序列位于异源核酸序列(如果存在)的5'和3'，但是它们不必与该异源核酸序列直接邻接。
在使得包含包装在AAV衣壳内的核酸模板的病毒载体在细胞中得以产生的条件下提供核酸模板以及AAV rep和cap序列。该方法可以进一步包括从细胞收集病毒载体的步骤。可以从培养基和/或通过裂解细胞收集病毒载体。该细胞可以是允许AAV病毒复制的细胞。可使用本领域已知的任何合适的细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是提供从复制缺陷型辅助病毒中删除的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其他E1a反式互补细胞。
AAV复制和衣壳序列可通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案通常使AAVrep/cap基因在单个质粒上表达。AAV复制和包装序列不必一起提供，尽管这样做可能很方便。AAV rep和/或cap序列可由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可由杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，被插入到缺失的腺病毒载体的E1a或E3区域中)。EBV载体也可被用于表达AAV cap和rep基因。该方法的一个优点是EBV载体是附加型的，但在整个连续细胞分裂过程中仍将保持高拷贝数(即，作为称为“基于EBV的核附加体”的染色体外元件被稳定地整合到细胞中，参见Margolski,(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67)。作为进一步的替代方案，可将rep/cap序列稳定地掺入到细胞中。通常AAV rep/cap序列的两侧将不为TR，以防止这些序列的拯救和/或包装。
可以使用本领域已知的任何方法向细胞提供核酸模板。例如，该模板可以由非病毒(例如，质粒)或病毒载体提供。在一些实施方案中，该核酸模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如，被插入到缺失的腺病毒的E1a或E3区域中)。作为另一个例证，Palombo等人,(1998)J.Virology 72:5025描述了携带两侧为AAV TR的报告基因的杆状病毒载体。EBV载体也可用于递送模板，如上文针对rep/cap基因所描述。
在一些实施方案中，核酸模板由复制性rAAV病毒提供。在一些实施方案中，包含核酸模板的AAV前病毒被稳定地整合到细胞的染色体中。为了增强病毒滴度，可以向细胞提供促进生产性(productive)AAV感染的辅助病毒功能(例如，腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。可替代地，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒或病毒载体提供，例如作为携带促进有效AAV产生的所有辅助基因的非感染性腺病毒极微质粒(miniplasmid)，如Ferrari等人,(1997)Nature Med.3:1295以及美国专利号6,040,183和6,093,570所描述的。
进一步地，辅助病毒功能可以由具有嵌入在染色体或者作为稳定的染色体外元件被维持的辅助序列的包装细胞提供。一般来讲，该辅助病毒序列不能包装到AAV病毒粒子中，例如两侧不为TR。本领域技术人员将理解，可能有利的是在
单个辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如，腺病毒序列)。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性例证，辅助构建体可以是包含AAV rep/cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。在一些实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。此载体进一步可以进一步包含核酸模板。该AAV rep/cap序列和/或rAAV模板可以被插入到腺病毒的缺失的区域(例如，E1a或E3区域)中。
在一些实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。该rAAV模板可以例如作为质粒模板提供。在一些实施方案中，该AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且该rAAV模板作为前病毒被整合到细胞中。可替代地，该rAAV模板由作为染色体外元件(例如，作为基于EBV的核附加体)被维持在细胞内的EBV载体提供。
在一些实施方案中，该AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助序列提供。该rAAV模板可以作为单独的复制性病毒载体提供。例如，该rAAV模板可以由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。根据前述方法，杂合腺病毒载体通常包含足以进行腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即，腺病毒末端重复序列和PAC序列)。该AAV rep/cap序列和(如果存在)rAAV模板嵌入在腺病毒主链中，并且两侧为5'和3'顺式序列，使得这些序列可被包装到腺病毒衣壳中。如上所述，腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列的两侧一般不为TR，使得这些序列不被包装到AAV病毒粒子中。Zhang等人,((2001)Gene Ther.18:704-12)描述了一种包含腺病毒以及AAV rep和cap基因两者的嵌合辅助子。
疱疹病毒也可用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码AAV Rep蛋白的杂合疱疹病毒可有利地促进可扩展的AAV载体产生方案。表达AAV-2rep和cap基因的杂合I型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体已经被描述(Conway等人,(1999)Gene Therapy 6:986以及WO 00/17377)。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以在昆虫细胞中使用杆状病毒载体来产生以递送rep/cap基因和rAAV模板，如例如Urabe等人,(2002)Human Gene Therapy 13:1935-43所描述。
不含污染性辅助病毒的AAV载体原种可通过本领域已知的任何方法获得。例如，AAV和辅助病毒可容易地基于大小来区分。AAV也可基于对乙酰肝素底物的亲和力从辅助病毒中被分离出来(Zolotukhin等人(1999)Gene Therapy 6:973)。可以使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染性辅助病毒都不具有复制能力。在一些实施方案中，可使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助细胞，因为仅需要腺病毒早期基因表达就能介导AAV病毒的包装。对晚期基因表达有缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100K和ts149腺病毒突变体)。
重组病毒载体
本公开提供了包含本文所公开的衣壳蛋白(例如，AAV衣壳蛋白)中的至少一种或衣壳(例如，AAV衣壳)中的至少一种的重组病毒载体(例如，重组AAV载体)，其中该衣壳蛋白包含一种或多种本文所公开的转导相关肽。在一些实施方案中，该AAV载体表现出与野生型AAV载体或不包含转导相关肽的AAV载体相比增加的向细胞诸如T细胞中的转导。在一些实施方案中，AAV载体表现出与野生型AAV载体或不包含转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的细胞核中的转导。在一些实施方案中，AAV载体表现出与野生型AAV载体或不包含转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的胞质溶胶中的转导。
本公开的重组病毒载体可用于在体外、离体和体内将核酸递送到细胞。可以被经修饰的病毒衣壳包装并转移到细胞中的分子包括异源DNA、RNA、多肽、有机小分子、金属或它们的组合。具体地，病毒载体可以有利地被用于将核酸递送或转移到包括哺乳动物细胞在内的动物细胞。因此，在一些实施方案中，核酸(“货物核酸”)可被本公开的衣壳蛋白包裹。在本公开的病毒载体中递送的货物核酸序列可以是任何感兴趣的异源核酸序列。
在一些实施方案中，本文所公开的AAV载体递送的异源核酸的表达与野生型AAV载体(例如，AAV6载体)或不包含本文所公开的转导相关肽的AAV载体递送的异源核酸的表达相比增加。在一些实施方案中，本文所公开的AAV载体递送的异源核酸的表达与野生型AAV载体(诸如AAV6载体)或不包含本文所公开的转导相关肽的AAV载体递送的异源核酸的表达相比增加至少约1.5倍，例如约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍(包括位于其间的所有值和子范围)。在一些实施方案中，本文所公开的AAV载体递送的异源核酸的表达与野生型AAV载体(诸如AAV6载体)或不包含本文所公开的转导相关肽的AAV载体递送的异源核酸的表达相比增加至少约10％，例如约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％(包括位于其间的所有值和子范围)。
感兴趣的核酸包括编码多肽的核酸，包括治疗性(例如，用于医疗或兽医用途)或免疫原性(例如，用于疫苗)多肽或RNA。在一些实施方案中，该货物核酸编码治疗性蛋白质或治疗性RNA。
治疗性多肽可包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)、ABCD1、β珠蛋白(HBB)、血红蛋白A、血红蛋白F、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌营养不良蛋白(包括小型和微型肌营养不良蛋白，参见例如Vincent等人,(1993)Nature Genetics 5:130；美国专利公布号2003/017131；国际公布WO/2008/088895；Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:1 3714-13719(2000)；以及Gregorevic等人,Mol.Ther.16:657-64(2008))、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、活化素11型可溶性受体、IGF-1、抗炎多肽诸如Ikappa B显性突变体、肌长蛋白(sarcospan)、肌凝蛋白(Tinsley等人,(1996)Nature 384:349)、小型肌凝蛋白、凝血因子(例如，因子VIII、因子IX、因子X等)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-珠蛋白、a-珠蛋白、血影蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶A、支链酮酸脱氢酶、RP65蛋白、细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白介素-2、白介素-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子、神经营养因子和激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑衍生神经营养因子、骨形态发生蛋白[包括RANKL和VEGF]、胶质衍生生长因子、转化生长因子-α和-β等)、溶酶体酸性α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、受体(例如，肿瘤坏死生长因子可溶性受体)、S100A1、小清蛋白、腺苷酰环化酶6型、调节钙处理的分子(例如，SERCA2A、PP1的抑制剂1及其片段[例如，WO 2006/029319和WO 2007/100465])、影响G蛋白偶联受体激酶2型敲除的分子诸如截短的组成型活性bARKct、抗炎因子诸如IRAP、抗肌肉生长抑素蛋白、天冬氨酸酰化酶、单克隆抗体(包括单链单克隆抗体；示例性Mab是Mab)、神经肽及其片段(例如，甘丙肽、神经肽Y(参见U.S.7,071,172)、血管生成抑制剂诸如Vasohibin和其他VEGF抑制剂(例如，Vasohibin 2[参见WO JP2006/073052])。其他例示性异源核酸序列编码自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子)、增强或抑制宿主因子转录的蛋白质(例如，与转录增强子或抑制子元件连接的核酸酶失活的Cas9(nuclease-dead Cas9)、与转录增强子或抑制子元件连接的锌指蛋白、与转录增强子或抑制子元件连接的转录激活子样(TAL)效应物)、赋予对癌症疗法中使用的药物的抗性的蛋白质、肿瘤抑制基因产物(例如，p53、Rb、Wt-1)、TRAIL、FAS配体以及在有需要的受试者中具有治疗效果的任何其他多肽。AAV载体也可以被用于递送单克隆抗体和抗体片段，例如针对肌肉生长抑制素的抗体或抗体片段(参见例如Fang等人,NatureBiotechnology 23:584-590(2005))。编码多肽的异源核酸序列包括编码报告多肽(例如，酶)的那些。报告多肽是本领域已知的并且包括但不限于绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。任选地，异源核酸编码分泌型多肽(例如作为处于其原生状态下的分泌型多肽，或例如通过与如本领域已知的分泌信号序列可操作地缔合已被工程化为分泌型多肽的多肽)。
可替代地，在本公开的一些实施方案中，异源核酸可以编码反义核酸、核酶(例如，如美国专利号5,877,022中所述)、实现剪接体介导的/ram剪接的RNA(参见Puttaraju等人,(1999)Nature Biotech.17:246；美国专利号6,013,487；美国专利号6,083,702)、干扰RNA(RNAi)(包括介导基因沉默的siRNA、shRNA或miRNA)(参见Sharp等人,(2000)Science 287:2431)以及其他非翻译RNA，诸如“引导”RNA(Gorman等人,(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:4929；授予Yuan等人的美国专利号5,869,248)等。示例性非翻译RNA包括针对多重抗药性(MDR)基因产物的RNAi(例如，以治疗和/或预防肿瘤和/或用于施用于心脏以预防由化疗引起的损伤)、针对肌肉生长抑制素的RNAi(例如，用于杜兴氏肌营养不良症)、针对VEGF的RNAi(例如，以治疗和/或预防肿瘤)、针对受磷蛋白的RNAi(例如，以治疗心血管疾病，参见例如Andino等人,J.Gene Med.10:132-142(2008)以及Li等人,Acta Pharmacol Sin.26:51-55(2005))、受磷蛋白抑制或显性失活分子(诸如受磷蛋白S16E(例如，以治疗心血管疾病，参见例如Hoshijima等人,Nat.Med.8:864-871(2002)))、针对腺苷激酶的RNAi(例如，用于癫痫)以及针对病原生物体和病毒(例如，乙型和/或丙型肝炎病毒、人免疫缺乏病毒、CMV、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等)的RNAi。
进一步地，可以递送指导交替性剪接(alternative splicing)的核酸序列。为了说明与肌营养不良蛋白外显子51的5'和/或3'剪接位点互补的反义序列(或其他抑制性序列)，可以与U1或U7小核(sn)RNA启动子结合递送，以诱导此外显子的跳跃。例如，可以将包含位于反义/抑制性序列5'的U1或U7 snRNA启动子的DNA序列包装在本公开的经修饰的衣壳中并且以该经修饰的衣壳递送。
在一些实施方案中，可以递送指导基因编辑的核酸序列。例如，该核酸可编码基因编辑分子，诸如引导RNA或核酸酶。在一些实施方案中，该核酸可编码锌指核酸酶、归巢核酸内切酶、TALEN(转录激活子样效应物核酸酶)、NgAgo(agronaute核酸内切酶)、SGN(结构引导的核酸内切酶)或RGN(RNA引导的核酸酶)，诸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。
该病毒载体还可包含与宿主染色体上的基因座共享同源性并且与之重组的异源核酸。该方法可以被用于例如纠正宿主细胞中的遗传缺陷。
本公开还提供了表达免疫原性多肽(例如，用于疫苗接种)的病毒载体。该核酸可编码本领域已知的任何感兴趣的免疫原，包括但不限于来自人类免疫缺乏病毒(HIV)、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)、流感病毒、HIV或SIV gag蛋白、肿瘤抗原、癌抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。
使用细小病毒作为疫苗载体是本领域已知的(参见例如Miyamura等人,(1994)Proc.Nat.Acad.Sci USA 91:8507；授予Young等人的美国专利号5,916,563、授予Mazzara等人的美国专利号5,905,040、授予Samulski等人的美国专利号5,882,652、美国专利号5,863,541)。抗原可存在于细小病毒衣壳中。可替代地，抗原可由引入到重组载体基因组中的异源核酸表达。如本文所述和/或如本领域已知的任何感兴趣的免疫原可以由本公开的病毒载体提供。
免疫原性多肽可以是适于引发免疫应答和/或保护受试者不受感染和/或疾病(包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和/或病毒感染和疾病)的任何多肽。例如，免疫原性多肽可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，诸如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白，或马流感病毒免疫原)或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)免疫原或人免疫缺乏病毒(HIV)免疫原，诸如HIV或SIV包膜GP 160蛋白、HIV或SIV基质/衣壳蛋白和HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。免疫原性多肽还可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒免疫原，诸如拉沙热病毒核衣壳蛋白和拉沙热包膜糖蛋白)、痘病毒免疫原(例如，牛痘病毒免疫原，诸如牛痘LI或L8基因产物)、黄病毒免疫原(例如，黄热病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、线状病毒免疫原(例如，埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，诸如NP和GP基因产物)、布尼亚病毒免疫原(例如，RVFV、CCHF和/或SFS病毒免疫原)或冠状病毒免疫原(例如，传染性人冠状病毒免疫原，诸如人冠状病毒包膜糖蛋白，或猪传染性胃肠炎病毒免疫原，或禽传染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽可以进一步是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如，CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等)免疫原以及/或者本领域现在已知或后来鉴定为免疫原的任何其他疫苗免疫原。
可替代地，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌抗原在癌细胞的表面上表达。
示例性癌症和肿瘤细胞抗原描述于S.A.Rosenberg(Immunity10:281(1991))。其他例示性癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、Caspase-8、KΙΑA0205、HPVE、SART-1、FRAME、p15、黑素瘤肿瘤抗原(Kawakami等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3515；Kawakami等人,(1994)J.Exp.Med.,180:347；Kawakami等人,(1994)Cancer Res.54:3124)、MART-1、gp100、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪氨酸酶(Brichard等人,(1993)J Exp.Med.178:489)；HER-2/neu基因产物(美国专利号4.968.603)、CA 125、LK26、FB5(内皮唾酸蛋白)、TAG 72、AFP、CA 19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN(唾液酸基Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤抑制蛋白(Levine,(1993)Ann.Rev.Biochem.62:623)；粘蛋白抗原(国际专利公布号WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸磷酸酶；乳头瘤病毒抗原；以及/或者现在已知或后来发现与以下癌症相关的抗原：黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌以及现在已知或后来鉴定的任何其他癌症或它们的恶性疾患或转移(参见例如Rosenberg,(1996)Ann.Rev.Med.47:481-91)。
本领域技术人员将理解，感兴趣的异源核酸可以与适当的控制序列可操作地缔合。例如，异源核酸可以与表达控制元件(诸如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等)可操作地缔合。
进一步地，感兴趣的异源核酸的受调节表达可以以转录后水平实现，例如通过根据特异性位点处选择性阻断剪接活性的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物的存在或不存在调节不同内含子的选择性剪接(例如，如WO 2006/119137中所述)。
本领域技术人员将理解，可以根据期望的水平和组织特异性表达来使用多种启动子/增强子元件。启动子/增强子可以是组成型的或诱导型的，这取决于期望的表达模式。启动子/增强子可以是原生的或外来的，并且可以是天然的或合成的序列。所谓外来，意指转录起始区域在引入了转录起始区域的野生型宿主中未被发现。
在一些实施方案中，启动子/增强子元件可以原生于待治疗的靶细胞或受试者。在代表性实施方案中，启动子/增强子元件可以原生于异源核酸序列。启动子/增强子元件一般被选择成使得它在感兴趣的靶细胞中起作用。进一步地，在一些实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型的或诱导型的。
诱导型表达控制元件通常在期望提供对异源核酸序列的表达的调节的那些应用中是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌特异性或优选的)、神经组织特异性或优选的(包括脑特异性或优选的)、眼特异性或优选的(包括视网膜特异性和角膜特异性)、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾特异性或优选的以及肺特异性或优选的启动子/增强子元件。在一些实施方案中，诱导型表达控制元件诸如启动子和/或增强子促进T细胞中的选择性表达。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在其中异源核酸序列被转录并且然后在靶细胞中被翻译的实施方案中，一般包括特异性起始信号以有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些外源翻译控制序列可包括ATG起始密码子和相邻序列，可以具有多种天然和合成的来源。
药物组合物和使用方法
本公开还提供了包含本文所公开的AAV衣壳蛋白、AAV衣壳、病毒载体、核酸、表达载体和/或细胞中的至少一者的组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的本公开的病毒载体和/或衣壳和/或衣壳蛋白和/或病毒颗粒，以及任选的其他药用剂、药物剂、稳定剂、缓冲剂、载剂、佐剂、稀释剂等。对于注射，载剂通常将是液体。对于其他施用模式，载剂可以是固体或液体。对于吸入施用，载剂将是可吸入的，并且任选地可以呈固体或液体颗粒形式。所谓“药学上可接受的”，意指不是有毒的或在其他方面不期望的材料，即，该材料可施用于受试者而不引起任何不期望的生物效应。
根据本公开的病毒载体提供了一种用于将异源核酸递送到广泛范围的细胞(包括分裂和非分裂细胞)中的手段。在一些实施方案中，该细胞是T细胞。该病毒载体可以用于将感兴趣的核酸体外递送到细胞，例如以在体外产生多肽或用于离体基因疗法。该病毒载体另外可用于将核酸递送到有需要的受试者的方法中，例如以表达免疫原性或治疗性多肽或功能性RNA。以这种方式，可以在受试者体内产生多肽或功能性RNA。受试者可能需要多肽，因为受试者缺乏多肽。进一步地，可以实施该方法，因为受试者中多肽或功能性RNA的产生可赋予一些有益效果。在一些实施方案中，该方法包括在体外、离体或在体内在细胞中表达多肽或RNA，以及任选地从细胞中分离多肽或RNA。该病毒载体还可以被用于在经培养的细胞中或在受试者中产生感兴趣的多肽或功能性RNA(例如，使用受试者作为生物反应器以产生多肽或者以例如与筛选方法相结合观察功能性RNA对受试者的影响)。
本公开提供了将本公开的病毒载体、病毒颗粒和/或组合物中的任一者施用于受试者的方法。因此，本公开提供了治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的病毒载体(例如，AAV载体)中的任一种、病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中的任一种，和/或组合物中的任一种。因此，本公开提供了本文所公开的病毒载体(例如，AAV载体)中的任一种、病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中的任一种，和/或组合物中的任一种，其用作药物并且/或者用于治疗有需要的受试者的方法中。
在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以被用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸以治疗和/或预防递送治疗性多肽或功能性RNA对其有益的任何疾病状态。在一些实施方案中，该疾病状态与T细胞的功能障碍或增加相关、与T细胞的功能障碍或增加有关系，或者由T细胞的功能障碍或增加引起。在一些实施方案中，疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和肺的其他疾病、血友病A(因子VIII)、血友病B(因子IX)、地中海贫血(β-珠蛋白)、贫血(红细胞生成素)和其他血液病症。阿尔茨海默病(GDF；脑啡肽酶)、多发性硬化(β-干扰素)、帕金森病(胶质细胞系衍生的神经营养因子[GDNF])、亨廷顿病(RNAi去除重复)、肌萎缩侧索硬化、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其他神经病症、癌症(内皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配体、细胞因子(包括干扰素)；RNAi(包括针对VEGF或多重抗药性基因产物的RNAi)、mir-26a[例如，针对肝细胞癌])、糖尿病(胰岛素)、肌营养不良症(包括杜兴氏)(肌营养不良蛋白、小型肌营养不良蛋白、胰岛素样生长因子I、肌聚糖[例如，α、β、γ]、针对肌肉生长抑制素前肽的RNAi、卵泡抑素、活化素II型可溶性受体抗炎多肽诸如Ikappa B显性突变体、肌长蛋白、肌凝蛋白、小型肌凝蛋白、针对肌营养不良蛋白基因中的剪接连接以诱导外显子跳跃的反义或RNAi[参见例如WO/2003/095647]、针对U7snRNA以诱导外显子跳跃的反义RNAi[参见例如WO/2006/021724]以及针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段)，以及贝克氏病(Becker)、高雪氏病(Gaucherdisease)(葡糖脑苷脂酶)、胡尔勒病(Hurler's disease)(α-L-艾杜糖醛酸酶)、腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)、糖原贮积病(例如，法布里病[α-半乳糖苷酶]和庞贝病(Pompedisease)[溶酶体酸性α-葡糖苷酶])和其他代谢病症、先天性肺气肿(α-1-抗胰蛋白酶)、莱施-尼汉综合征(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)、尼曼-匹克病(鞘磷脂酶)、泰-萨克斯病(溶酶体己糖胺酶A)、枫糖尿病(支链酮酸脱氢酶)、视网膜退行性疾病(以及眼睛和视网膜的其他疾病；例如，用于黄斑变性的PDGF和/或vasohibin或VEGF的其他抑制剂或用于治疗/预防视网膜病症的其他血管生成抑制剂，例如在I型糖尿病中)、实体器官诸如脑的疾病(包括帕金森病[GDNF]、星形细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi]、胶质母细胞瘤[内皮抑素、血管抑素和/或针对VEGF的RNAi])、肝脏、肾脏、心脏(包括充血性心力衰竭)或外周动脉疾病(PAD)(例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I(I-1)及其片段(例如，IlC)、serca2a、调节受磷蛋白基因的锌指蛋白、Barkct、[32-肾上腺素受体、2-肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小清蛋白、腺苷酰环化酶6型、影响G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子诸如截短的组成型活性bARKct；calsarcin、针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制或显性失活分子诸如受磷蛋白S16E等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、关节病症(胰岛素样生长因子1和/或2)、内膜增生(例如，通过递送enos、inos)、提高心脏移植的存活率(超氧化物歧化酶)、AIDS(可溶性CD4)、肌肉虚耗(胰岛素样生长因子I)、肾虚(促红细胞生成素)、贫血(促红细胞生成素)、关节炎(抗炎因子，诸如I RAP和TNFa可溶性受体)、肝炎(α-干扰素)、LDL受体缺乏症(LDL受体)、高血氨症(鸟氨酸转氨甲酰酶)、克拉伯病(半乳糖脑苷酯酶)、巴藤病、脊髓性脑共济失调(包括SCA1、SCA2和SCA3)、苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)、自身免疫性疾病等。本公开可以进一步在器官移植后使用，以增加移植的成功率以及/或者减少器官移植或辅助疗法的负面副作用(例如，通过施用免疫抑制剂或抑制性核酸以阻断细胞因子产生)。作为另一实例，可以例如在癌症患者骨折或手术切除之后将骨形态发生蛋白(包括BNP 2、7等，RANKL和/或VEGF)与骨同种异体移植物一起施用。
在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以被用于递送编码多肽或功能性RNA的异源核酸以治疗和/或预防肝脏疾病或病症。肝脏疾病或病症可以是例如原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、自身免疫性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、纤维化、黄疸、原发性硬化性胆管炎(PSC)、布加氏综合征、血色沉着病、威尔逊氏病、酒精性纤维化、非酒精性纤维化、肝脂肪变性、吉尔伯特氏综合征、胆道闭锁、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、阿拉吉欧综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积症、血友病B、遗传性血管性水肿(HAE)、纯合型家族性高胆固醇血症(HoFH)、杂合型家族性高胆固醇血症(HeFH)、冯基尔克氏病(GSD I)、血友病A、甲基丙二酸血症、丙酸血症、高胱氨酸尿症、苯丙酮尿症(PKU)、酪氨酸血症1型、精氨酸酶1缺乏症、精氨琥珀酸裂解酶缺乏症、氨基甲酰磷酸合成酶1缺乏症、瓜氨酸血症1型、希特林蛋白(Citrin)缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征1型、胱氨酸病、法布里病、糖原累积病1b、LPL缺乏症、N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、鸟氨酸转位酶缺乏症、原发性高草酸尿症1型或ADA SCID。
本文所述的病毒载体还可以被用于产生诱导型多能干细胞(iPS)。例如，本公开的病毒载体可以被用于将干细胞相关核酸递送到非多能细胞(诸如成人成纤维细胞、皮肤细胞、肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、心脏细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等)中。
编码与干细胞相关的因子的核酸是本领域已知的。与干细胞和多能性相关的此类因子的非限制性实例包括Oct-3/4、SOX家族(例如，SOX 1、SOX2、SOX3和/或SOX 15)、Klf家族(例如，Klfl、KHZ Klf4和/或Klf5)、Myc家族(例如，C-myc、L-myc和/或N-myc)、NANOG和/或LIN28。
在一些实施方案中，本文所公开的经修饰的载体可以被用于治疗如本文所述的溶酶体贮积病症，诸如粘多糖贮积病症(例如，Sly综合征[β-葡萄糖醛酸酶]、胡尔勒综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、施艾综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、胡尔勒-施艾综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏综合征[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、圣菲利波综合征A[乙酰肝素磺酰胺酶]、B[N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶]、C[乙酰辅酶A:α-氨基葡萄糖苷乙酰转移酶]、D[N-乙酰基葡萄糖胺6-硫酸酯酶]、莫基奥综合征A[半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶]、B[β-半乳糖苷酶]、马罗托-拉米综合征[N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法布里病(α-半乳糖苷酶)、高雪氏症(葡糖脑苷脂酶)或糖原贮积病症(例如，庞贝病；溶酶体酸性α-葡糖苷酶)。在一些实施方案中，还可以实施本公开以治疗和/或预防代谢病病症，诸如糖尿病(例如，胰岛素)、血友病(例如，因子IX或因子VIII)、溶酶体贮积病病症诸如粘多糖贮积病症(例如，Sly综合征[β-葡萄糖醛酸酶]、胡尔勒综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、施艾综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、胡尔勒-施艾综合征[α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏综合征[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、圣菲利波综合征A[乙酰肝素磺酰胺酶]、B[N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶]、C[乙酰辅酶A:α-氨基葡萄糖苷乙酰转移酶]、D[N-乙酰基葡萄糖胺6-硫酸酯酶]、莫基奥综合征A[半乳糖-硫酸硫酸酯酶]、B[β-半乳糖苷酶]、马罗托-拉米综合征[N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法布里病(α-半乳糖苷酶)、高雪氏症(葡糖脑苷脂酶)或糖原贮积病症(例如，庞贝病；溶酶体酸性α-葡糖苷酶)。
基因转移在了解疾病状态以及提供针对疾病状态的疗法方面具有重要用途。有许多遗传性疾病的缺陷基因是已知的并且已被克隆。一般来讲，以上疾病状态分为两类：通常是酶的缺乏状态，其一般以隐性方式遗传；以及不平衡状态，其可能涉及调节性蛋白或结构蛋白，并且通常以显性方式遗传。对于缺乏状态疾病，基因转移可以被用于将正常基因带入到受累组织中以进行替代疗法，以及使用反义突变来创建该疾病的动物模型。对于不平衡疾病状态，基因转移可以被用于在模型系统中创建疾病状态，该模型系统然后可以被用于努力对抗疾病状态。因此，根据本公开的病毒载体允许治疗和/或预防遗传疾病。
根据本公开的病毒载体还可被用于在体外或体内向细胞提供功能性RNA。该功能性RNA可以是例如非编码RNA。在一些实施方案中，细胞中功能性RNA的表达可以减弱细胞对特定靶蛋白的表达。因此，可以施用功能性RNA以降低有需要的受试者中特定蛋白质的表达。在一些实施方案中，细胞中功能性RNA的表达可以增加细胞对特定靶蛋白的表达。因此，可以施用功能性RNA以增加有需要的受试者中特定蛋白质的表达。在一些实施方案中，功能性RNA的表达可以调节细胞中特定靶RNA的剪接。因此，可以施用功能性RNA以调节有需要的受试者中特定RNA的剪接。在一些实施方案中，细胞中功能性RNA的表达可以调节细胞对特定靶蛋白的功能。因此，可以施用功能性RNA以调节有需要的受试者中特定蛋白质的功能。功能性RNA也可以在体外施用于细胞以调节基因表达和/或细胞生理学，例如以优化细胞或组织培养系统或在筛选方法中进行优化。
在一些实施方案中，可使本文所公开的病毒载体与细胞离体接触。在一些实施方案中，该细胞是T细胞，诸如经活化的T细胞。在一些实施方案中，该细胞(例如，经活化的T细胞)是从受试者诸如人类患者获得。在一些实施方案中，将与该病毒载体接触后的细胞施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，该病毒载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)的异源核酸。因此，在一些实施方案中，使该病毒载体与T细胞接触导致嵌合抗原受体(CAR)表达从而产生CART细胞。因此，在一些实施方案中，本公开提供了制备CAR T细胞的方法，该方法包括使本文所公开的病毒载体中的任一种病毒载体与T细胞离体接触。本公开进一步提供了使用本文所公开的方法中的任一种方法产生的CAR T细胞，以及治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的CAR T细胞。在一些实施方案中，该CAR T细胞是使用从同一受试者获得的T细胞(自体T细胞)产生的，而在其他实施方案中，该CAR T细胞是使用从健康供体受试者获得的T细胞(同种异体T细胞)产生的。需要施用CAR T细胞的受试者可由医生或熟练的医学从业者鉴定，并且可患有任何疾病，诸如癌症，例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤。
T细胞耗竭是在许多慢性感染和癌症期间出现的一种T细胞功能障碍状态，并且还被证明会降低CAR-T疗法的有效性。在一些实施方案中，本文所公开的重组病毒载体在基因疗法方法(例如，CAR-T疗法方法)中用于预防、限制和/或逆转T细胞耗竭。因此，本公开提供了缓和、预防、限制和/或逆转受试者中的T细胞耗竭的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的病毒载体(例如，AAV载体)中的任一种、病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中的任一种和/或组合物中的任一种。
在一些实施方案中，该病毒载体包含编码免疫原(诸如免疫原性多肽)的异源核酸。因此，在一些实施方案中，使该病毒载体与细胞接触导致免疫原的表达。在一些实施方案中，该细胞可被施用于受试者，并且因此导致在受试者中诱导针对免疫原的免疫应答。在一些实施方案中，引发保护性免疫应答。在一些实施方案中，该细胞是抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。在一些实施方案中，已从受试者中取出细胞，将病毒载体引入到该细胞中，并然后将该细胞施用回受试者。从受试者中取出细胞以进行离体操作、随后引入回受试者的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346)。可替代地，可以将重组病毒载体引入到来自供体受试者的细胞中、引入到经培养的细胞中或者引入到来自任何其他合适来源的细胞中，并将细胞施用于有需要的受试者(即，“接受者”受试者)。
在一些实施方案中，可从患有癌症的受试者中取出细胞并使其与根据本公开的表达癌细胞抗原的病毒载体接触。然后将经修饰的细胞施用于受试者，由此引发针对癌细胞抗原的免疫应答。此方法可以有利地用于不能在体内发起足够的免疫应答(即，不能产生足够量的增强抗体)的免疫受损受试者。可替代地，癌抗原可以作为病毒衣壳的一部分表达或以其他方式与病毒衣壳缔合(例如，如上所述)。作为另一替代方案，可以施用本领域已知的任何其他治疗性核酸(例如，RNAi)或多肽(例如，细胞因子)以治疗和/或预防癌症。
本领域已知的是免疫应答可被免疫调节细胞因子(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白介素-1-α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞化学引诱物蛋白-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素)增强。因此，免疫调节细胞因子(优选地，CTL诱导型细胞因子)可与病毒载体结合施用于受试者。细胞因子可通过本领域已知的任何方法施用。外源细胞因子可被施用于受试者，或可替代地，编码细胞因子的核酸可使用合适的载体递送到受试者，并且细胞因子在体内产生。
另外，根据本公开的病毒载体可用于诊断和筛选方法中，由此感兴趣的核酸在细胞培养系统，或可替代地，转基因动物模型中瞬时或稳定表达。
本公开的病毒载体也可以用于各种非治疗性目的，包括但不限于用于评估基因靶向、清除、转录、翻译等的方案中，如对本领域技术人员显而易见的。病毒载体也可以用于评价安全性(传播性、毒性、免疫原性等)的目的。例如，美国食品和药物管理局将此类数据视为评价临床功效之前的监管审批流程的一部分。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的病毒衣壳可用于产生针对新衣壳结构的抗体。在一些实施方案中，可将外源氨基酸序列插入到经修饰的病毒衣壳中以将抗原呈递给细胞，例如以用于施用于受试者以产生对外源氨基酸序列的免疫应答。
在一些实施方案中，可以在施用递送编码感兴趣的多肽或功能性RNA的核酸的病毒载体之前和/或与之同时(例如，在彼此的几分钟或几小时内)施用病毒衣壳以阻断某些细胞位点。例如，可以递送本发明的衣壳以阻断肝细胞上的细胞受体，并且可以随后或同时施用递送载体，这可减少肝细胞的转导，并增强其他靶标(例如，骨骼肌、心肌和/或隔膜肌)的转导。
施用的剂量和模式
可根据适合于特定靶细胞的标准转导方法以适当的感染复数将病毒载体引入到细胞中。要施用的病毒载体的滴度可以根据靶细胞类型和数目以及特定病毒载体而变化，并且可以由本领域技术人员在不进行过度的实验的情况下确定。在代表性实施方案中，将至少约103个感染单位、任选至少约105个感染单位引入到细胞中。
引入病毒载体的细胞可以是任何类型，包括但不限于T细胞、神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，具体是脑细胞，诸如神经元和少突胶质细胞)、肺细胞、眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮细胞和角膜细胞)、上皮细胞(例如，肠和呼吸上皮细胞)、肌细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或膈膜肌细胞)、树突细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如，骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等。在代表性实施方案中，该细胞可以是任何祖细胞。作为进一步的可能性，该细胞可以是干细胞(例如，神经干细胞、肝干细胞)。作为进一步的替代方案，该细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，该细胞可以来自如上文所指示的起源的任何物种。
用于离体核酸递送的合适细胞如上所描述。要施用于受试者的细胞的剂量将根据受试者的年龄、状况和物种、细胞的类型、细胞表达的核酸、施用的模式等而变化。通常，每剂将施用在药学上可接受的载剂中的至少约102至约108个细胞或至少约103至约106个细胞。在一些实施方案中，将用病毒载体转导的细胞以治疗有效量与药物载剂组合施用于受试者。
在一些实施方案中，将病毒载体引入到细胞中，并且可以将该细胞施用于受试者以引发针对所递送的多肽(例如，作为转基因表达或在衣壳中表达)的免疫原性应答。通常，施用与药学上可接受的载剂组合的一定量的表达免疫原性有效量的多肽的细胞。“免疫原性有效量”是所表达的多肽的量，该量足以在施用药物制剂的受试者中引起针对该多肽的主动免疫应答。在一些实施方案中，剂量足以产生保护性免疫应答。所赋予的保护程度不必是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处胜过其任何缺点即可。因此，本公开提供了一种向细胞施用核酸的方法，该方法包括使细胞与本公开的病毒载体、病毒颗粒和/或组合物接触。
待施用于受试者的病毒载体和/或衣壳的剂量取决于施用的模式、待治疗和/或预防的疾病或疾患、个体受试者的状况、特定的病毒载体或衣壳以及待递送的核酸等，并且可以以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量是至少约105、约106、约107、约108、约109、约1010、约1011、约1012、约1013、约1014、约1015个转导单位、任选地约108-1013个转导单位的滴度。在一些实施方案中，可采用多于一次施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)以在各种间隔(例如，每天、每周、每月、每年等)的时间段内实现期望的基因表达水平。
可以通过本领域已知的任何手段将根据本公开的病毒载体、病毒颗粒和/或衣壳施用于有需要的人类受试者或动物。任选地，病毒载体、病毒颗粒和/或组合物在药学上可接受的载剂中以治疗有效剂量递送。在一些实施方案中，递送治疗有效量的病毒载体、病毒颗粒和/或衣壳。
示例性施用模式包括经口、直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，经由气雾剂)、经颊(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内[包括施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、外用(例如，施用到皮肤和粘膜表面(包括气道表面)以及透皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如，到肝脏、骨骼肌、心肌、隔膜肌或脑)。还可以向肿瘤(例如，在肿瘤或淋巴结中或附近)施用。在任何给定情况下最合适的途径将取决于所治疗和/或预防的疾患的性质和严重性以及所使用的特定载体的性质。还可以实施本公开以产生非编码RNA(诸如反义RNA、RNAi或其他功能性RNA(例如，核酶))进行全身递送。
注射剂可以被制备为作为液体溶液或悬浮液的常规形式、适合于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或者乳剂。可替代地，可以以局部而非全身方式(例如，以储库或持续释放制剂)施用本公开的病毒载体和/或病毒衣壳。进一步地，病毒载体和/或病毒衣壳可以粘附于可手术植入的基质上递送(例如，如美国专利公布号US-2004-0013645-A1中所述)。
实施例
以下实施例仅出于说明目的而包括在本文中，并不旨在进行限制。如本文所用，术语STRD.201、STRD.202、STRD.203、STRD.204、STRD.205、STRD.206和STRD.207被用于描述衣壳蛋白序列，并且术语AAV-STRD.201、AAV-STRD.202、AAV-STRD.203、AAV-STRD.204、AAV-STRD.205、AAV-STRD.206和AAV-STRD.207被用于描述包含衣壳蛋白的AAV载体。然而，术语STRD.201、STRD.202、STRD.203、STRD.204、STRD.205、STRD.206和STRD.207在一些上下文中可被用于描述包含所提及的衣壳的AAV载体，如对本领域技术人员将显而易见的。
实施例1：包含转导相关肽的AAV衣壳蛋白变体的进化
使用体外进化过程来制备AAV衣壳蛋白变体，该AAV衣壳蛋白变体在被掺入到AAV载体中时提供增强的该载体向T细胞中的转导。此过程的第一步涉及使用冷冻电子显微术来鉴定在AAV衣壳表面上的表面暴露区域。然后使用其中每个密码子均被核苷酸NNK取代的简并引物和通过Gibson装配和/或多步PCR组合在一起的基因片段对AAV衣壳的表面暴露区域内的所选残基进行诱变。此处，对SEQ ID NO:1的氨基酸残基454-460进行随机诱变以产生重组衣壳基因序列文库。将此简并文库中的每个基因克隆到野生型AAV基因组中以替代原始的Cap编码DNA序列，从而产生质粒文库。然后用腺病毒辅助质粒将质粒文库转染到293产生者细胞系中以产生AAV衣壳文库。经由DNA测序证实AAV文库的成功产生。
为了鉴定可以靶向并有效转导T细胞的AAV载体，对上述AAV文库进行多轮体外选择。具体而言，执行第一轮向混合细胞群体中的转导，随后执行两轮向经活化的供体T细胞中的转导。在每个阶段，病毒DNA都被纯化、PCR扩增并且被回克隆到AAV载体中，并且被用于下一轮选择。用于AAV载体的组合工程化和选择的一般方法的进一步细节提供在WO 2019/195449、WO 2019/195423和WO 2019/195444中，这些中每一者的内容以引用方式整体并入本文。三轮感染后，从经培养的T细胞中分离AAV颗粒。具体而言，裂解细胞，并且如上所述从T细胞的细胞核和胞质级分中纯化病毒DNA、对其进行PCR扩增并将其回克隆到AAV载体中。
对在实施例1中所述的三轮选择和进化后在T细胞的细胞核和胞质级分中富集的AAV变体测序以鉴定单个AAV分离物。在图5所示的气泡图中，气泡尺寸与读段的数目成比例。对在细胞核级分(AAV.STRD-203、205)、胞质级分(AAV.STRD-206、207)，或细胞核和胞质级分(AAV.STRD-201、202和204)中富集最多的AAV变体测序以鉴定存在于氨基酸位置454-460处的氨基酸残基。参见图6和表5。这些结果证明，包含有包含表5的转导相关肽的变体衣壳蛋白的重组AAV病毒粒子能够有效地转导T细胞。
表5：使用体外进化过程鉴定的转导相关肽
实施例2：包含转导相关肽的AAV载体的可制造性
为了确定在实施例1中鉴定的各种AAV载体是否可在大规模系统中制造，根据标准方法产生AAV，并将产率与野生型AAV6载体的产率进行比较。
根据标准三重转染方案在HEK293细胞中产生AAV。简言之，用以下转染细胞：(i)包含野生型AAV9衣壳序列或表5中所列的变体衣壳序列的质粒；(ii)包含5'ITR、转基因和3'ITR序列的质粒；以及(iii)包含AAV产生所需的辅助基因的质粒。从细胞培养物的上清液中纯化AAV。随后，使用基于PCR的定量方法测量每种AAV的产率。
如图1和表6所示，包含STRD-201的衣壳序列的重组AAV载体(此处称为“AAV.STRD-201”)的产率高于野生型AAV6的产率。进一步地，AAV.STRD-204、AAV.STRD-205、AAV.STRD-206和AAV.STRD-207的产率与野生型AAV6的产率相当。
这些数据证实，包含衣壳变体蛋白的AAV载体适合于商业制造。
表6：
实施例3：表征T细胞中AAV变体对GFP转基因的表达
将携带GFP转基因序列的重组AAV变体AAV.STRD-201、AAV.STRD-202、AAV.STRD-204、AAV.STRD-205、AAV.STRD-206和AAV.STRD-207或野生型AAV6载体转导到经活化的T细胞中。由于T细胞在扩增过程中会聚集，因此在成像前将细胞上下吹吸或混合。通过显微术观察GFP的表达，并且来自实验的图像在图2中示出。GFP表达越高表明病毒载体向T细胞的转导越有效。从图2中的图像可以看出，所有AAV变体都显示出与野生型AAV6病毒载体相比更亮的绿色荧光信号，以及因此在经活化的T细胞中更高的GFP表达。在重组AAV变体中，AAV.STRD-201和AAV.STRD-207显示出特别增强的GFP表达，表明向T细胞中的转导更加增强。为了进一步分析与野生型AAV6病毒载体相比AAV变体的GFP表达水平，使用AAV6载体或AAV.STRD-207变体转导的T细胞经受流式细胞术，其中单独T细胞用作阴性对照。如图3C所示，增加的比例的用AAV.STRD-207变体转导的细胞显示出与由AAV6亲本载体转导的群体相比更高的GFP信号(由蓝色线上方的FITC信号指示)。用AAV变体(AAV.STRD-201、AAV.STRD-202、AAV.STRD-204、AAV.STRD-205、AAV.STRD-206和AAV.STRD-207)转导的细胞中的GFP表达在图4中被进一步定量，该图示出了给定群体中GFP阳性细胞的百分比(由条表示)以及此群体中GFP的平均强度(由线图表示)。结果显示，与野生型AAV6相比，GFP阳性细胞的数目的增加与由AAV变体转导的细胞中GFP信号的平均强度的增加很好地对应，表明AAV变体向T细胞中的转导增强导致T细胞中GFP表达的增加。
前述内容是对本发明的说明，并且不应被解释为对本发明进行限制。本发明由所附权利要求限定，其中权利要求的等同物被包括在其中。
编号实施方案
以下实施方案列表仅出于说明目的而包括在本文中，并且不旨在是全面的或限制性的。所要求保护的主题明确地不限于以下实施方案。
实施方案1.一种包含衣壳蛋白的重组腺相关病毒(AAV)载体，其中所述衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:17至23中任一者的序列的转导相关肽。
实施方案2.如实施方案1所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含与SEQ IDNO:1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
实施方案3.如实施方案1或实施方案2所述的重组AAV载体，其中所述转导相关肽替代对应于SEQ ID NO:1的氨基酸454-460的氨基酸。
实施方案4.如实施方案1所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含选自由SEQID NO:2、4、6、8、10、12和14组成的组的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。
实施方案5.一种包含衣壳蛋白的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含SEQ IDNO:1的序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸454-460被包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQID NO:24)的转导相关肽替代。
实施方案6.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1不是G，X2不是S，X3不是A，X4不是Q，X5不是N，X6不是K，并且/或者X7不是D。
实施方案7.如实施方案5-6中任一项所述的重组AAV载体，其中X1是H、M、A、Q、V或S。
实施方案8.如实施方案5-7中任一项所述的重组AAV载体，其中X2是A或T。
实施方案9.如实施方案5-8中任一项所述的重组AAV载体，其中X3是P或T。
实施方案10.如实施方案5-9中任一项所述的重组AAV载体，其中X4是R或D。
实施方案11.如实施方案5-10中任一项所述的重组AAV载体，其中X5是V、Q、C、S或D。
实施方案12.如实施方案5-11中任一项所述的重组AAV载体，其中X6是E、A或P。
实施方案13.如实施方案5-12中任一项所述的重组AAV载体，其中X7是E、G、N、T或A。
实施方案14.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1是H，X2是A，X3是P，X4是R，X5是V，X6是E，并且X7是E。
实施方案15.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1是M，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。
实施方案16.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1是H，X2是T，X3是T，X4是D，X5是C，X6是A，并且X7是N。
实施方案17.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1是A，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X6是E，并且X7是T。
实施方案18.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1是Q，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。
实施方案19.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1是V，X2是A，X3是P，X4是R，X5是D，X6是P，并且X7是A。
实施方案20.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中X1是S，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X46是E，并且X7是N。
实施方案21.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含与SEQ IDNO:1具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。
实施方案22.如实施方案21所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含与SEQ IDNO:1具有约99％同一性的氨基酸序列。
实施方案23.如实施方案5所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含选自由SEQID NO:2、4、6、8、10、12和14组成的组的氨基酸序列。
实施方案24.一种包含衣壳蛋白的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含具有SEQID NO:16的氨基酸序列的转导相关肽，其中所述转导相关肽替代相对于SEQ ID NO:1的氨基酸454-460。
实施方案25.如实施方案24所述的重组AAV载体，其中所述转导相关肽具有SEQ IDNO:17-23中的任一者的氨基酸序列。
实施方案26.一种核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14中的任一者的序列的重组AAV衣壳蛋白。
实施方案27.如实施方案26所述的核酸，其中所述核酸包含选自由SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13和15组成的组的序列。
实施方案28.如实施方案26或实施方案27所述的核酸，其中所述核酸是DNA序列。
实施方案29.如实施方案26或实施方案27所述的核酸，其中所述核酸是RNA序列。
实施方案30.一种表达载体，所述表达载体包含如实施方案26-29中任一项所述的核酸。
实施方案31.一种细胞，所述细胞包含如实施方案26-29中任一项所述的核酸或如实施方案30所述的表达载体。
实施方案32.如实施方案1-25中任一项所述的重组AAV载体，所述重组AAV载体进一步包含被所述衣壳蛋白包裹的货物核酸。
实施方案33.如实施方案32所述的重组AAV载体，其中所述货物核酸编码治疗性蛋白质或治疗性RNA。
实施方案34.如实施方案32至33中任一项所述的重组AAV载体，其中所述AAV载体表现出与不包含所述转导相关肽的AAV载体相比增加的向细胞中的转导。
实施方案35.如实施方案34所述的AAV载体，其中所述细胞是T细胞。
实施方案36.如实施方案35所述的AAV载体，其中所述AAV载体表现出与不包含所述转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的细胞核中的转导。
实施方案37.如实施方案35所述的AAV载体，其中所述AAV载体表现出与不包含所述转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的胞质溶胶中的转导。
实施方案38.一种组合物，所述组合物包含实施方案1-25或32-37中任一项所述的重组AAV载体、实施方案26-29中任一项所述的核酸、实施方案30所述的表达载体，或实施方案31所述的细胞。
实施方案39.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案31所述的细胞或实施方案1-25或32-37中任一项所述的重组AAV载体；以及药学上可接受的载剂。
实施方案40.一种将AAV载体递送到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与实施方案1-25或32-37中任一项所述的AAV载体接触。
实施方案41.如实施方案40所述的方法，其中所述细胞的所述接触在体外、离体或在体内进行。
实施方案42.如实施方案40或实施方案41所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
实施方案43.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方案1-25或32-37中任一项所述的AAV载体。
实施方案44.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用已经与实施方案1-25或32-37中任一项所述的AAV载体离体接触的细胞。
实施方案45.如实施方案43或实施方案44所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
实施方案46.如实施方案45所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案47.如实施方案1-25或32-37中任一项所述的AAV载体，其用作药物。
实施方案48.如实施方案1-25或32-37中任一项所述的AAV载体，其用于治疗有需要的受试者的方法中。
序列表
<110> 银杏生物制品公司
<120> 靶向T细胞的AAV载体
<130> STRD-022/01WO 331843-2276
<150> US 63/137,497
<151> 2021-01-14
<160> 167
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 736
<212> PRT
<213> 依赖细小病毒属腺相关依赖细小病毒A (Dependoparvovirus Adeno-associated dependoparvovirus A)
<400> 1
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<223> CAM640-01衣壳
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<210> 4
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CAM640-02衣壳
<400> 4
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
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ggctgcctcc ctccgttccc ggcggacgtg ttcatgattc cgcagtacgg ctacctaacg 1140
ctcaacaatg gcagccaggc agtgggacgg tcatcctttt actgcctgga atatttccca 1200
tcgcagatgc tgagaacggg caataacttt accttcagct acaccttcga ggacgtgcct 1260
ttccacagca gctacgcgca cagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc tctcatcgac 1320
cagtacctgt attacctgaa cagaactcag aatcagtcca gcgccccccg gagcgagaac 1380
ttgctgttta gccgggggtc tccagctggc atgtctgttc agcccaaaaa ctggctacct 1440
ggaccctgtt accggcagca gcgcgtttct aaaacaaaaa cagacaacaa caacagcaac 1500
tttacctgga ctggtgcttc aaaatataac cttaatgggc gtgaatctat aatcaaccct 1560
ggcactgcta tggcctcaca caaagacgac aaagacaagt tctttcccat gagcggtgtc 1620
atgatttttg gaaaggagag cgccggagct tcaaacactg cattggacaa tgtcatgatc 1680
acagacgaag aggaaatcaa agccactaac cccgtggcca ccgaaagatt tgggactgtg 1740
gcagtcaatc tccagagcag cagcacagac cctgcgaccg gagatgtgca tgttatggga 1800
gccttacctg gaatggtgtg gcaagacaga gacgtatacc tgcagggtcc tatttgggcc 1860
aaaattcctc acacggatgg acactttcac ccgtctcctc tcatgggcgg ctttggactt 1920
aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacgcctg ttcctgcgaa tcctccggca 1980
gagttttcgg ctacaaagtt tgcttcattc atcacccagt attccacagg acaagtgagc 2040
gtggagattg aatgggagct gcagaaagaa aacagcaaac gctggaatcc cgaagtgcag 2100
tatacatcta actatgcaaa atctgccaac gttgatttca ctgtggacaa caatggactt 2160
tatactgagc ctcgccccat tggcacccgt tacctcaccc gtcccctgta a 2211
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 共有序列
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His、Met、Gln、Val或Ser
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ala或Ser
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Pro或Thr
<220>
<221> 位点
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Arg或Asp
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Val、Gln、Cys、Ser或Asp
<220>
<221> 位点
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Glu、Ala或Pro
<220>
<221> 位点
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Glu、Gly、Asn、Thr或Ala
<400> 16
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CAM640-01的454-460区域
<400> 17
His Ala Pro Arg Val Glu Glu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CAM640-02的454-460区域
<400> 18
Met Ala Pro Arg Gln Glu Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CAM640-03的454-460区域
<400> 19
His Thr Thr Asp Cys Ala Asn
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CAM640-04的454-460区域
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Ala Ala Pro Arg Ser Glu Thr
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Gln Ala Pro Arg Gln Glu Gly
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CAM640-06的454-460区域
<400> 22
Val Ala Pro Arg Asp Pro Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CAM640-07的454-460区域
<400> 23
Ser Ala Pro Arg Ser Glu Asn
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 454-460区域
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(7)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 24
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 25
<211> 736
<212> PRT
<213> 依赖细小病毒属腺相关依赖细小病毒A (Dependoparvovirus Adeno-associated dependoparvovirus A)
<400> 25
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
<210> 26
<211> 735
<212> PRT
<213> 依赖细小病毒属腺相关依赖细小病毒A (Dependoparvovirus Adeno-associated dependoparvovirus A)
<400> 26
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 27
<211> 736
<212> PRT
<213> 依赖细小病毒属腺相关依赖细小病毒A (Dependoparvovirus Adeno-associated dependoparvovirus A)
<400> 27
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435 440 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565 570 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580 585 590
Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 28
<211> 734
<212> PRT
<213> 依赖细小病毒属腺相关依赖细小病毒A (Dependoparvovirus Adeno-associated dependoparvovirus A)
<400> 28
Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu
1 5 10 15
Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35 40 45
Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val
50 55 60
Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln
65 70 75 80
Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85 90 95
Ala Glu Phe Gln Gln Arg Leu Gln Gly Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100 105 110
Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu
115 120 125
Gly Leu Val Glu Gln Ala Gly Glu Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro
130 135 140
Leu Ile Glu Ser Pro Gln Gln Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys
145 150 155 160
Lys Gly Lys Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Val Phe Glu Asp Glu Thr
165 170 175
Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Thr Ser Gly Ala Met Ser
180 185 190
Asp Asp Ser Glu Met Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Val Glu Gly
195 200 205
Gly Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys
210 215 220
Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly His Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr
225 230 235 240
Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Gly Glu
245 250 255
Ser Leu Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Met Arg Pro Lys Ala Met Arg Val
290 295 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu
305 310 315 320
Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp
325 330 335
Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365
Cys Gly Leu Val Thr Gly Asn Thr Ser Gln Gln Gln Thr Asp Arg Asn
370 375 380
Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly
385 390 395 400
Asn Asn Phe Glu Ile Thr Tyr Ser Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser
405 410 415
Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile
420 425 430
Asp Gln Tyr Leu Trp Gly Leu Gln Ser Thr Thr Thr Gly Thr Thr Leu
435 440 445
Asn Ala Gly Thr Ala Thr Thr Asn Phe Thr Lys Leu Arg Pro Thr Asn
450 455 460
Phe Ser Asn Phe Lys Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Ser Ile Lys Gln
465 470 475 480
Gln Gly Phe Ser Lys Thr Ala Asn Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Thr
485 490 495
Gly Ser Asp Ser Leu Ile Lys Tyr Glu Thr His Ser Thr Leu Asp Gly
500 505 510
Arg Trp Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro
515 520 525
Ala Asp Ser Lys Phe Ser Asn Ser Gln Leu Ile Phe Ala Gly Pro Lys
530 535 540
Gln Asn Gly Asn Thr Ala Thr Val Pro Gly Thr Leu Ile Phe Thr Ser
545 550 555 560
Glu Glu Glu Leu Ala Ala Thr Asn Ala Thr Asp Thr Asp Met Trp Gly
565 570 575
Asn Leu Pro Gly Gly Asp Gln Ser Asn Ser Asn Leu Pro Thr Val Asp
580 585 590
Arg Leu Thr Ala Leu Gly Ala Val Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg
595 600 605
Asp Ile Tyr Tyr Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp
610 615 620
Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Leu Lys His
625 630 635 640
Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro
645 650 655
Ala Thr Thr Phe Ser Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr
660 665 670
Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Gln Ile Asp Trp Glu Ile Gln Lys Glu
675 680 685
Arg Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Tyr Gly
690 695 700
Gln Gln Asn Ser Leu Leu Trp Ala Pro Asp Ala Ala Gly Lys Tyr Thr
705 710 715 720
Glu Pro Arg Ala Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr His His Leu
725 730
<210> 29
<211> 724
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Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Leu Glu Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys
145 150 155 160
Lys Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Glu Glu Asp Thr
165 170 175
Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Asp Thr Ser Ala Met Ser
180 185 190
Ser Asp Ile Glu Met Arg Ala Ala Pro Gly Gly Asn Ala Val Asp Ala
195 200 205
Gly Gln Gly Ser Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys
210 215 220
Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly Lys Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr
225 230 235 240
Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Leu Arg Leu Gly Thr
245 250 255
Thr Ser Ser Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Leu Arg Pro Lys Ala Met Arg Val
290 295 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu
305 310 315 320
Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp
325 330 335
Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365
Cys Gly Ile Val Thr Gly Glu Asn Gln Asn Gln Thr Asp Arg Asn Ala
370 375 380
Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn
385 390 395 400
Asn Phe Glu Met Ala Tyr Asn Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Met
405 410 415
Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Leu Asp
420 425 430
Gln Tyr Leu Trp His Leu Gln Ser Thr Thr Ser Gly Glu Thr Leu Asn
435 440 445
Gln Gly Asn Ala Ala Thr Thr Phe Gly Lys Ile Arg Ser Gly Asp Phe
450 455 460
Ala Phe Tyr Arg Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Val Lys Gln Gln
465 470 475 480
Arg Phe Ser Lys Thr Ala Ser Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Ser Gly
485 490 495
Gly Asn Ala Leu Leu Lys Tyr Asp Thr His Tyr Thr Leu Asn Asn Arg
500 505 510
Trp Ser Asn Ile Ala Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro Ser
515 520 525
Asp Gly Asp Phe Ser Asn Ala Gln Leu Ile Phe Pro Gly Pro Ser Val
530 535 540
Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ser Ala Asn Asn Leu Leu Phe Thr Ser Glu
545 550 555 560
Glu Glu Ile Ala Ala Thr Asn Pro Arg Asp Thr Asp Met Phe Gly Gln
565 570 575
Ile Ala Asp Asn Asn Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Ile Thr Gly Asn
580 585 590
Val Thr Ala Met Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp
595 600 605
Ile Tyr Tyr Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Ala Asp Gly
610 615 620
His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro
625 630 635 640
Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ala
645 650 655
Thr Thr Phe Thr Ala Ala Arg Val Asp Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser
660 665 670
Thr Gly Gln Val Ala Val Gln Ile Glu Trp Glu Ile Glu Lys Glu Arg
675 680 685
Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Tyr Gly Asn
690 695 700
Gln Ser Ser Met Leu Trp Ala Pro Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Thr Glu
705 710 715 720
Pro Arg Val Ile Gly Ser Arg Tyr Leu Thr Asn His Leu
725 730
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Gly或Ser
<400> 35
Asn Ser Val Arg Asp Leu Xaa
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 36
Pro Arg Ser Val Thr Val Pro
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Ser或Ala
<400> 37
Asn Ser Val Ser Ser Xaa Xaa
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 38
Asn Gly Arg Ala His Ala
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 39
Gln Pro Glu His Ser Ser Thr
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 40
Val Asn Thr Ala Asn Ser Thr
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 41
His Gly Pro Met Gln Ser
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 42
Pro His Lys Pro Pro Leu Ala
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 43
Ile Lys Asn Asn Glu Met Trp
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 44
Arg Asn Leu Asp Thr Pro Met
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 45
Val Asp Ser His Arg Gln Ser
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 46
Tyr Asp Ser Lys Thr Lys Thr
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 47
Ser Gln Leu Pro His Gln Lys
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 48
Ser Thr Met Gln Gln Asn Thr
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 49
Thr Glu Arg Tyr Met Thr Gln
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 50
Gln Pro Glu His Ser Ser Thr
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 51
Asp Ala Ser Leu Ser Thr Ser
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 52
Asp Leu Pro Asn Lys Thr
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 53
Asp Leu Thr Ala Ala Arg Leu
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 54
Glu Pro His Gln Phe Asn Tyr
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 55
Glu Pro Gln Ser Asn His Thr
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 56
Met Ser Ser Trp Pro Ser Gln
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 57
Asn Pro Lys His Asn Ala Thr
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 58
Pro Asp Gly Met Arg Thr Thr
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 59
Pro Asn Asn Asn Lys Thr Thr
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 60
Gln Ser Thr Thr His Asp Ser
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 61
Thr Gly Ser Lys Gln Lys Gln
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 62
Ser Leu Lys His Gln Ala Leu
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 63
Ser Pro Ile Asp Gly Glu Gln
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 64
Trp Ile Phe Pro Trp Ile Gln Leu
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 65
Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1 5
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 66
Cys Asn Gly Arg Cys
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 67
Cys Pro Arg Glu Cys Glu Ser
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 68
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys
1 5 10
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 69
Cys Gly Arg Arg Ala Gly Gly Ser Cys
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 70
Cys Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 71
Cys Val Pro Glu Leu Gly His Glu Cys
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 72
Cys Arg Arg Glu Thr Ala Trp Ala Lys
1 5
<210> 73
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 73
Val Ser Trp Phe Ser His Arg Tyr Ser Pro Phe Ala Val Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 74
Gly Tyr Arg Asp Gly Tyr Ala Gly Pro Ile Leu Tyr Asn
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Y是磷酸酪氨酸
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(7)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 75
Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Y是磷酸酪氨酸
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Glu或Met
<400> 76
Tyr Xaa Asn Trp
1
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 77
Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 78
Ala Pro Pro Leu Pro Pro Arg
1 5
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 79
Asp Val Phe Tyr Pro Tyr Pro Tyr Ala Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 80
Met Tyr Trp Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 81
Asp Ile Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Gly或Leu
<400> 82
Cys Trp Asp Asp Xaa Trp Leu Cys
1 5
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 83
Glu Trp Cys Glu Tyr Leu Gly Gly Tyr Leu Arg Cys Tyr Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (4)..(5)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 84
Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro
1 5 10
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 85
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Tyr、Trp、Phe或His
<400> 86
Leu Trp Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 87
Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Leu Trp
1 5
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 88
Arg Trp Gly Leu Cys Asp
1 5
<210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 89
Met Ser Arg Pro Ala Cys Pro Pro Asn Asp Lys Tyr Glu
1 5 10
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 90
Cys Leu Arg Ser Gly Arg Gly Cys
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 91
Cys His Trp Met Phe Ser Pro Trp Cys
1 5
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 92
Trp Xaa Xaa Phe
1
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 93
Cys Ser Ser Arg Leu Asp Ala Cys
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 94
Cys Leu Pro Val Ala Ser Cys
1 5
<210> 95
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 95
Cys Gly Phe Glu Cys Val Arg Gln Cys Pro Glu Arg Cys
1 5 10
<210> 96
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 96
Cys Val Ala Leu Cys Arg Glu Ala Cys Gly Glu Gly Cys
1 5 10
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 97
Ser Trp Cys Glu Pro Gly Trp Cys Arg
1 5
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 98
Tyr Ser Gly Trp Gly Trp
1 5
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 99
Gly Leu Ser Gly Gly Arg Ser
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 100
Leu Met Leu Pro Arg Ala Asp
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 101
Cys Ser Cys Phe Arg Asp Val Cys Cys
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 102
Cys Arg Asp Val Val Ser Val Ile Cys
1 5
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 103
Cys Asn Gly Arg Cys
1 5
<210> 104
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 104
Met Ala Arg Ser Gly Leu
1 5
<210> 105
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 105
Met Ala Arg Ala Lys Glu
1 5
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 106
Met Ser Arg Thr Met Ser
1 5
<210> 107
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 107
Lys Cys Cys Tyr Ser Leu
1 5
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 108
Met Tyr Trp Gly Asp Ser His Trp Leu Gln Tyr Trp Tyr Glu
1 5 10
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 109
Met Gln Leu Pro Leu Ala Thr
1 5
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 110
Glu Trp Leu Ser
1
<210> 111
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 111
Ser Asn Glu Trp
1
<210> 112
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 112
Thr Asn Tyr Leu
1
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 113
Trp Ile Phe Pro Trp Ile Gln Leu
1 5
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 114
Trp Asp Leu Ala Trp Met Phe Arg Leu Pro Val Gly
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 115
Cys Thr Val Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Val Arg Val Cys
1 5 10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 116
Cys Val Pro Glu Leu Gly His Glu Cys
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 117
Cys Gly Arg Arg Ala Gly Gly Ser Cys
1 5
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 118
Cys Val Ala Tyr Cys Ile Glu His His Cys Trp Thr Cys
1 5 10
<210> 119
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 119
Cys Val Phe Ala His Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Cys
1 5 10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 120
Cys Val Phe Thr Ser Asn Tyr Ala Phe Cys
1 5 10
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 121
Val His Ser Pro Asn Lys Lys
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 122
Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
1 5
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 123
Cys Arg Gly Asp Gly Trp Cys
1 5
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 124
Xaa Arg Gly Cys Asp Xaa
1 5
<210> 125
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Ser或Thr
<400> 125
Pro Xaa Xaa Xaa
1
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 126
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys
1 5 10
<210> 127
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 127
Ser Gly Lys Gly Pro Arg Gln Ile Thr Ala Leu
1 5 10
<210> 128
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ala或Gln
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Asn或Ala
<220>
<221> 位点
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Leu或Tyr
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Thr、Val、Met或Arg
<220>
<221> 位点
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Arg或Lys
<400> 128
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 129
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 129
Val Tyr Met Ser Pro Phe
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 130
Met Gln Leu Pro Leu Ala Thr
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 131
Ala Thr Trp Leu Pro Pro Arg
1 5
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 132
His Thr Met Tyr Tyr His His Tyr Gln His His Leu
1 5 10
<210> 133
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 133
Ser Glu Val Gly Cys Arg Ala Gly Pro Leu Gln Trp Leu Cys Glu Lys
1 5 10 15
Tyr Phe Gly
<210> 134
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 134
Cys Gly Leu Leu Pro Val Gly Arg Pro Asp Arg Asn Val Trp Arg Trp
1 5 10 15
Leu Cys
<210> 135
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 135
Cys Lys Gly Gln Cys Asp Arg Phe Lys Gly Leu Pro Trp Glu Cys
1 5 10 15
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 136
Ser Gly Arg Ser Ala
1 5
<210> 137
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 137
Trp Gly Phe Pro
1
<210> 138
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 138
Leu Trp Xaa Xaa Ala Arg
1 5
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 139
Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Leu Trp
1 5
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 140
Ala Glu Pro Met Pro His Ser Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Tyr
1 5 10 15
Thr
<210> 141
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Trp或Phe
<400> 141
Trp Ala Tyr Xaa Ser Pro
1 5
<210> 142
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 142
Ile Glu Leu Leu Gln Ala Arg
1 5
<210> 143
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 143
Asp Ile Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys
1 5 10
<210> 144
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 144
Ala Tyr Thr Lys Cys Ser Arg Gln Trp Arg Thr Cys Met Thr Thr His
1 5 10 15
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 145
Pro Gln Asn Ser Lys Ile Pro Gly Pro Thr Phe Leu Asp Pro His
1 5 10 15
<210> 146
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 146
Ser Met Glu Pro Ala Leu Pro Asp Trp Trp Trp Lys Met Phe Lys
1 5 10 15
<210> 147
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 147
Ala Asn Thr Pro Cys Gly Pro Tyr Thr His Asp Cys Pro Val Lys Arg
1 5 10 15
<210> 148
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 148
Thr Ala Cys His Gln His Val Arg Met Val Arg Pro
1 5 10
<210> 149
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 149
Val Pro Trp Met Glu Pro Ala Tyr Gln Arg Phe Leu
1 5 10
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 150
Asp Pro Arg Ala Thr Pro Gly Ser
1 5
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 151
Phe Arg Pro Asn Arg Ala Gln Asp Tyr Asn Thr Asn
1 5 10
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 152
Cys Thr Lys Asn Ser Tyr Leu Met Cys
1 5
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<220>
<221> 位点
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Arg或Gln
<220>
<221> 位点
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Leu或Arg
<220>
<221> 位点
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Gly或Asn
<220>
<221> 位点
<222> (6)..(7)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 位点
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Ala或Val
<400> 153
Cys Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly Cys
1 5 10
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 154
Cys Pro Ile Glu Asp Arg Pro Met Cys
1 5
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 155
His Glu Trp Ser Tyr Leu Ala Pro Tyr Pro Trp Phe
1 5 10
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 156
Met Cys Pro Lys His Pro Leu Gly Cys
1 5
<210> 157
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 157
Arg Met Trp Pro Ser Ser Thr Val Asn Leu Ser Ala Gly Arg Arg
1 5 10 15
<210> 158
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 158
Ser Ala Lys Thr Ala Val Ser Gln Arg Val Trp Leu Pro Ser His Arg
1 5 10 15
Gly Gly Glu Pro
20
<210> 159
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 159
Lys Ser Arg Glu His Val Asn Asn Ser Ala Cys Pro Ser Lys Arg Ile
1 5 10 15
Thr Ala Ala Leu
20
<210> 160
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 160
Glu Gly Phe Arg
1
<210> 161
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 161
Ala Gly Leu Gly Val Arg
1 5
<210> 162
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 162
Gly Thr Arg Gln Gly His Thr Met Arg Leu Gly Val Ser Asp Gly
1 5 10 15
<210> 163
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 163
Ile Ala Gly Leu Ala Thr Pro Gly Trp Ser His Trp Leu Ala Leu
1 5 10 15
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 164
Ser Met Ser Ile Ala Arg Leu
1 5
<210> 165
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 165
His Thr Phe Glu Pro Gly Val
1 5
<210> 166
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 166
Asn Thr Ser Leu Lys Arg Ile Ser Asn Lys Arg Arg Arg Lys
1 5 10
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向肽序列
<400> 167
Leu Arg Ile Lys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Thr Arg Lys
1 5 10 15

Claims (48)

1.一种包含衣壳蛋白的重组腺相关病毒(AAV)载体，其中所述衣壳蛋白包含具有SEQID NO:17至23中任一者的序列的转导相关肽。
2.如权利要求1所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的重组AAV载体，其中所述转导相关肽替代对应于SEQ ID NO:1的氨基酸454-460的氨基酸。
4.如权利要求1所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14组成的组的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。
5.一种包含衣壳蛋白的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:1的序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸454-460被包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO:24)的转导相关肽替代。
6.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1不是G，X2不是S，X3不是A，X4不是Q，X5不是N，X6不是K，并且/或者X7不是D。
7.如权利要求5-6中任一项所述的重组AAV载体，其中X1是H、M、A、Q、V或S。
8.如权利要求5-7中任一项所述的重组AAV载体，其中X2是A或T。
9.如权利要求5-8中任一项所述的重组AAV载体，其中X3是P或T。
10.如权利要求5-9中任一项所述的重组AAV载体，其中X4是R或D。
11.如权利要求5-10中任一项所述的重组AAV载体，其中X5是V、Q、C、S或D。
12.如权利要求5-11中任一项所述的重组AAV载体，其中X6是E、A或P。
13.如权利要求5-12中任一项所述的重组AAV载体，其中X7是E、G、N、T或A。
14.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1是H，X2是A，X3是P，X4是R，X5是V，X6是E，并且X7是E。
15.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1是M，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。
16.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1是H，X2是T，X3是T，X4是D，X5是C，X6是A，并且X7是N。
17.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1是A，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X6是E，并且X7是T。
18.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1是Q，X2是A，X3是P，X4是R，X5是Q，X6是E，并且X7是G。
19.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1是V，X2是A，X3是P，X4是R，X5是D，X6是P，并且X7是A。
20.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中X1是S，X2是A，X3是P，X4是R，X5是S，X46是E，并且X7是N。
21.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1具有约99％同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求5所述的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14组成的组的氨基酸序列。
24.一种包含衣壳蛋白的重组AAV载体，其中所述衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的转导相关肽，其中所述转导相关肽替代相对于SEQ ID NO:1的氨基酸454-460。
25.如权利要求24所述的重组AAV载体，其中所述转导相关肽具有SEQ ID NO:17-23中的任一者的氨基酸序列。
26.一种核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14中的任一者的序列的重组AAV衣壳蛋白。
27.如权利要求26所述的核酸，其中所述核酸包含选自由SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13和15组成的组的序列。
28.如权利要求26或27所述的核酸，其中所述核酸是DNA序列。
29.如权利要求26或27所述的核酸，其中所述核酸是RNA序列。
30.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求26-29中任一项所述的核酸。
31.一种细胞，所述细胞包含权利要求26-29中任一项所述的核酸或权利要求30所述的表达载体。
32.如权利要求1-25中任一项所述的重组AAV载体，所述重组AAV载体进一步包含被所述衣壳蛋白包裹的货物核酸。
33.如权利要求32所述的重组AAV载体，其中所述货物核酸编码治疗性蛋白质或治疗性RNA。
34.如权利要求32至33中任一项所述的重组AAV载体，其中所述AAV载体表现出与不包含所述转导相关肽的AAV载体相比增加的向细胞中的转导。
35.如权利要求34所述的AAV载体，其中所述细胞是T细胞。
36.如权利要求35所述的AAV载体，其中所述AAV载体表现出与不包含所述转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的细胞核中的转导。
37.如权利要求35所述的AAV载体，其中所述AAV载体表现出与不包含所述转导相关肽的AAV载体相比增加的向T细胞的胞质溶胶中的转导。
38.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-25或32-37中任一项所述的重组AAV载体、权利要求26-29中任一项所述的核酸、权利要求30所述的表达载体，或权利要求31所述的细胞。
39.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求31所述的细胞或权利要求1-25或32-37中任一项所述的重组AAV载体；以及药学上可接受的载剂。
40.一种将AAV载体递送到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-25或32-37中任一项所述的AAV载体接触。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞的所述接触在体外、离体或在体内进行。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
43.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-25或32-37中任一项所述的AAV载体。
44.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用已经与权利要求1-25或32-37中任一项所述的AAV载体离体接触的细胞。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述受试者是人。
47.如权利要求1-25或32-37中任一项所述的AAV载体，其用作药物。
48.如权利要求1-25或32-37中任一项所述的AAV载体，其用于治疗有需要的受试者的方法中。
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