CN114621929A

CN114621929A - 一种抗肿瘤树突状细胞及其制备方法、表达载体及应用

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Publication number: CN114621929A
Application number: CN202210295417.XA
Authority: CN
Inventors: 李冬贝; 魏旭东; 李海军; 范瑞华; 米瑞华; 陈琳; 程诚
Original assignee: Henan Cancer Hospital
Current assignee: Henan Cancer Hospital
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN114621929B

Abstract

本发明属于免疫细胞的改造领域，具体涉及一种抗肿瘤树突状细胞及其制备方法、表达载体及应用。该抗肿瘤树突状细胞为经synNotch受体改造的树突状细胞，synNotch受体包括PD‑1胞外域，Notch跨膜域和转录调节模块Gal4‑VP64；所述抗肿瘤树突状细胞内引入转录调控模块GAL4‑UAS‑TRAF6。本发明的抗肿瘤树突状细胞，胞外表达PD‑1受体胞外域，胞内表达应答系统Gal4‑UAS‑TRAF6；该种细胞通过PD‑1来与PD‑L1阳性的肿瘤细胞精准结合，结合之后方启动胞内应答系统，使TRAF6过表达，促进肿瘤微环境中树突状细胞成熟，解除对其抑制作用。

Description

一种抗肿瘤树突状细胞及其制备方法、表达载体及应用

技术领域

本发明属于免疫细胞的改造领域，具体涉及一种抗肿瘤树突状细胞及其制备方法、表达载体及应用。

背景技术

肿瘤一直是人类生命的重大威胁，传统的放、化疗等方法疗效有限。免疫治疗的兴起打破了肿瘤治疗的僵局，如嵌合抗原受体T胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)，程序性死亡受体1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)免疫检查点抑制剂。2017年CAR-T治疗产品CTL019获FDA批准应用于淋巴瘤的临床治疗，2018年PD-1免疫抑制受体的发现者共享了诺贝尔生理学或医学奖。但是对于实体瘤和复发难治性肿瘤，目前的技术方法的作用受限于以下几点：(1)肿瘤相关抗原的多样性；(2)肿瘤微环境的免疫抑制作用；(3)脱靶效应。

树突状细胞(dendritic cell,DC)是最有效的抗原提呈细胞(antigenpresenting cells，APC)，它的主要功能是诱导初始型T细胞活化和增殖，进而启动适应性免疫应答，介导免疫应答，进而在肿瘤等过程中扮演重要角色。目前，基于DC的免疫疗法在肿瘤的治疗中取得一定的疗效，主要是装载有肿瘤抗原的DC疫苗疗法和基因修饰DC疫苗。美国FDA在2010年5月批准了首个前列腺癌症治疗性疫苗Provenge(DC疫苗)上市销售，采用Provenge治疗后3年总体生存期比对照组延长37％，被认为是肿瘤个体化免疫治疗取得的重大突破。2014年2月我国CFDA正式批准了曹雪涛院士团队的APDC(抗原致敏的人树突状细胞)生产上市，用于晚期大肠癌的治疗。对DC进行基因修饰也是常用的技术方法。将促进DC细胞成熟和迁移的细胞因子等基因转染DC，可增强其介导抗肿瘤功能(姚冰清,张俊萍.基于树突状细胞的抗肿瘤策略与思考[J].中国癌症防治杂志,2016,8(01):55-58.)。

肿瘤细胞通过释放和表达免疫抑制性分子，如PD-L1等促进细胞凋亡和抑制肿瘤效应细胞。随着肿瘤的进展，受多种抑制分化、成熟及功能的肿瘤源性因子的影响，DC会由免疫激活作用转向免疫抑制作用。肿瘤浸润树突状细胞(TIDC)表现出低共刺激分子表达的表型，抗原提呈能力减弱[3]。TIDC不仅发育成熟障碍，细胞数量也减少。循环肿瘤、肿瘤床、引流淋巴结等多种肿瘤模型均证明，恶性肿瘤患者体内成熟DC的数量减少(Ma Y,ShurinGV,Peiyuan Z,Shurin MR.Dendritic Cells in the Cancer Microenvironment.Cancer，2013,4(3):36-44.)。

总之，由于缺乏明确的特异性肿瘤相关抗原，肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)中免疫抑制因素的存在和对正常细胞的脱靶效应等原因，目前基于DC的免疫治疗尚未取得显著、广泛的临床疗效，如何克服这些难点将是未来新的DC免疫疗法发展的方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肿瘤树突状细胞，既能够精准识别肿瘤细胞，而非正常细胞，同时又能够减轻肿瘤微环境对其免疫抑制作用，促使抗肿瘤免疫应答正常化。

本发明的第二个目的是提供上述抗肿瘤树突状细胞的制备方法。

本发明的第三个目的是一种用于改造树突状细胞的表达载体。

本发明的第四个目的是提供上述抗肿瘤树突状细胞、表达载体在制备抗肿瘤药物方面的应用。

为了实现以上目的，本发明的抗肿瘤树突状细胞的技术方案是：

一种抗肿瘤树突状细胞，所述抗肿瘤树突状细胞为经synNotch受体改造的树突状细胞，synNotch受体包括PD-1胞外域，Notch跨膜域和转录调节模块Gal4-VP64，所述synNotch受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述抗肿瘤树突状细胞内引入转录调控模块GAL4-UAS-TRAF6，所述转录调控模块的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

Notch蛋白是最机械的直接跨膜受体之一，胞内域包含一个转录调节因子，当同源细胞外配体的参与引发了内膜蛋白水解时，它就从膜中释放出来(Artavanis-Tsakonas S,Rand MD,Lake RJ.Notch signaling:cell fate control and signal integration indevelopment.Science.1999；284:770–776.)。利用Notch蛋白的这一灵活性特点，本发明将Notch受体胞外传感器模块和胞内转录模块都用其他外源功能蛋白域所取代，合成新的感受-效应体系——合成的Notch(synNotch)受体。

本发明的抗肿瘤树突状细胞，胞外表达PD-1受体胞外域，胞内表达应答系统Gal4-UAS-TRAF6；该种细胞通过PD-1来与PD-L1阳性的肿瘤细胞精准结合，结合之后方启动胞内应答系统，使TRAF6过表达，促进肿瘤微环境中树突状细胞成熟，解除对其抑制作用。

优选地，被改造的所述树突状细胞为DC2.4。

本发明的抗肿瘤树突状细胞的制备方法的技术方案是：

一种上述抗肿瘤树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别合成synNotch受体编码基因以及转录调控模块编码基因；

(2)将synNotch受体编码基因克隆到慢病毒载体上，获得synNotch受体重组慢病毒载体；将转录调控模块编码基因克隆到慢病毒载体上，获得转录调控重组慢病毒载体；

(3)将synNotch受体重组慢病毒载体、转录调控重组慢病毒载体进行慢病毒包装，获得慢病毒；

(4)将所述慢病毒感染树突状细胞。

本发明的抗肿瘤树突状细胞的制备方法，通过慢病毒侵染DC的方式，将synNotch受体编码基因及转录调节模块(应答模块)导入细胞内，得到胞外表达PD-1受体胞外域，胞内表达应答系统Gal4-UAS-TRAF6的树突状细胞。采用慢病毒载体进行转染，具有转染效率高，容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，并能实现目的基因稳定的长期表达。

本发明的表达载体的技术方案是：

一种用于改造树突状细胞的表达载体，包括synNotch受体表达载体和转录调控表达载体，所述synNotch受体表达载体上携带有synNotch受体编码基因，所述synNotch受体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述转录调控表达载体上携带有转录调控元件编码基因，所述转录调控元件编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

利用上述表达载体可方便进行树突状细胞的改造，从而能够肿瘤微环境中树突状细胞成熟，解除对其抑制作用，增强抗肿瘤免疫应答。

优选地，synNotch受体表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步优选地，所述转录调控表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

基于上述树突状细胞的改造说明，上述树突状细胞、表达载体，能够用于制备抗肿瘤药物，改善肿瘤的免疫治疗效果。

附图说明

图1为本发明synNotch受体改造的树突状细胞作用机理图；

图2为本发明实施例中载体pHR_PGK的结构示意图；

图3为本发明实施例中载体pHR_5x Gal4 UAS的结构示意图；

图4为本发明实施例中编码PD-1胞外域-Notch Core-Gal4-VP64载体的测序比对结果；

图5为本发明实施例中编码Gal4-UAS-TRAF6载体的测序比对结果；

图6为本发明实施例中目的基因重组质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；

图7为本发明实施例中质粒转染293T细胞包装pWPXLd-GFP慢病毒的荧光观察图；

图8为本发明实施例中pWPXLd-GFP慢病毒感染DC2.4细胞的72h流式检测图；

图9为本发明实施例中pWPXLd-GFP慢病毒感染DC2.4细胞后的荧光观察图；

图10为不同处理转染后DC2.4细胞中PD-1表达免疫荧光图；

图11为不同处理转染后DC2.4细胞中PD-1表达免疫印迹图；

图12为不同处理转染后DC2.4细胞中TRAF6表达图；

图13为不同处理组4T1细胞数对比图；

图14为不同治疗对4T1乳腺癌小鼠肿瘤体积的影响；

图15为不同治疗的小鼠瘤体拍照图。

具体实施方式

本发明主要提供一种胞外表达PD-1受体胞外域，胞内表达应答系统Gal4-UAS-TRAF6的树突状细胞，其结构如图1所示。作用机理为：将Notch受体胞外域替换成PD-1胞外域，作为肿瘤信号感受器，胞内替换成转录调控模块GAL4-UAS-TRAF6，作为效应器。改造后的DC一旦通过胞外PD-1与肿瘤细胞上PD-L1结合，胞内转录激活蛋白GAL4就会解离释放，并特异性结合UAS，激活下游基因TRAF6的转录，促进DC成熟。

下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。以下实施例中所用主要材料说明如下：

1、实验细胞：小鼠树突状细胞系DC2.4购自上海细胞库，人胚胎肾细胞293T系实验室保存细胞株。

2、质粒：pHR_PGK由Wendell Lim实验室馈赠(Addgene plasmid#79120；http://n2t.net/addgene:79120；RRID:Addgene_79120)。

pHR_5x Gal4 UAS由Wendell Lim实验室馈赠(Addgene plasmid#79119；http://n2t.net/addgene:79119；RRID:Addgene_79119)。

3、主要试剂配制

(1)LB液体培养基：胰蛋白胨10g+酵母提取物5g+NaCl 10g，加入适量dH2O，磁力搅拌器使充分溶解，再加入ddH2O定容至1L，高压灭菌后室温密闭保存。

(2)LB固体培养基：胰蛋白胨10g+酵母提取物5g+NaCl 10g+琼脂粉15g，加入ddH2O1L，用过滤透气封口膜及牛皮纸双层封闭锥形瓶口，高压灭菌，待培养基温度降至60℃，于超净工作台中将还是液体状的培养基分装到培养皿中，待凝固后密封保存至4℃冰箱。

(3)Western blot相关溶液：

Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5×)：Tris-base15.1g、甘氨酸94g、10％SDS 50ml，在ddH₂O中完全溶解后定容至1000ml，室温保存，使用时稀释成1×。

转膜缓冲液(1×)：Tris-base 2.4g+甘氨酸11.52g，加ddH₂O400ml，搅拌至完全溶解后量筒定容至640ml，加入甲醇160ml，现用现配，并置于冰上预冷。

TBS(1×)：50ml 20×TBS，加入ddH2O 950ml，即为1×工作液。

TBST：1ml Tween-20+1000ml 1×TBS，混匀。

封闭液：5％脱脂奶粉：200ml 1×TBST+10g脱脂奶粉，溶解后4℃保存。3％BSA：BSA6g+200ml TBST，溶解后4℃保存。

发光液：A液和B液等体积混匀，显影前避光配制，现用现配。

4、细胞免疫荧光相关溶液：

10X TBS的配制：称取24.2g Tris(Tris碱),80g NaCl；用盐酸调节pH值至7.6，定容至一升。

TBS配制：把10X TBS按照1:9的比例用水稀释至1X即为TBS。

TBST的配制：在TBS中加Tween-20使最终浓度为0.1％，混匀，即为TBST。

实施例1抗肿瘤树突状细胞的具体实施例

本实施例的抗肿瘤树突状细胞，为经synNotch受体改造的树突状细胞，synNotch受体包括PD-1胞外域，Notch跨膜域和转录调节模块Gal4-VP64；树突状细胞内引入转录调控模块GAL4-UAS-TRAF6。synNotch受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。转录调控模块的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例2抗肿瘤树突状细胞的制备方法的具体实施例

本实施例的抗肿瘤树突状细胞的制备方法，对实施例1的抗肿瘤树突状细胞的构建过程进行详细说明，包括以下步骤：

(1)synNotch受体表达质粒构建

自主合成synNotch受体基因：将小鼠PD-1胞外域基因序列与鼠Notch1(NM_008714)调节区域(Ile1427 to Arg1752)和Gal4-VP64融合。受体包含一个N-末端的CD8α信号肽(MALPVTA LLLPLALLLH AARP)用于膜定位，一个PGK启动子。

synNotch受体基因序列如SEQ ID NO.1所示。其中，小鼠PD-1胞外域基因序列如SEQ ID NO：6所示。鼠Notch1(NM_008714)调节区域基因序列如SEQ ID NO：7所示。Gal4-VP64基因序列如SEQ ID NO：8所示。

synNotch受体表达质粒构建时，具体是将synNotch受体胞外域基因重组到载体pHR_PGK(质粒图谱如图2所示，详见http://www.addgene.org/79120/)。主要步骤说明如下：

1)用EcoRI/NotI限制性内切酶将载体切开，与带有相同粘性末端的目的基因DNA片段连接，形成新的环状DNA。酶切，琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。

2)转化。详细操作步骤如下：

(a)取Top10感受态细胞，融化后取50μl加入1.5mlEP管中，加入已制备好的连接产物4μl，轻轻旋转EP管，均匀混合感受态细胞和连接产物，冰浴30分钟。

(b)将冰浴后的混合物放到预热至42℃的水浴锅中，热激90秒。

(c)热激后迅速转移EP管到冰浴中冷却2min。

(d)向热激和迅速冷却后的混合物中加入400μl LB液体培养基，将EP管放入空的离心管中，置于恒温培养摇床上，220rpm/min、37℃恒温摇50分钟，使感受态细胞恢复正常生长状态。

(e)涂布平板筛选阳性菌落

将恢复正常生长状态的感受态细胞涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，倒置过夜培养，挑出平板上克隆进行摇菌测序。

(f)制备LB固体培养基平板：用微波炉将已制备好的LB固体培养基加热至融化，冷却片刻后，在生物安全柜中向融化的LB固体培养基中加入浓度为100μg/ml的氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)，摇晃均匀后迅速倒入10cm培养皿中，每个皿约10ml，室温凝固后，用封口膜封边，倒置放入4℃保存。

(g)将上一步制备好的含转化后感受态细胞的LB液体培养基均匀涂布在已制备好的LB固体培养基平板上，将平板倒置于恒温培养箱中，37℃过夜。注意培养箱中要放置高压过的dH2O，保持培养箱湿润，避免LB固体培养基平板干燥。

(h)第二天下午收取平板，挑选一个单克隆菌落加入含2-3ml液体LB培养基(含氨苄青霉素)的离心管中过夜培养，220rpm摇床37℃摇10-12h，将所得产物送测序，测序结果如图4所示。序列比对正确，说明synNotch受体载体构建成功。

(i)通过核对测序峰图，证实插入的片段为目的片段，且无碱基突变，说明synNotch载体构建成功。

3)质粒提取

配制含氨苄霉素的LB液体培养基，高压灭菌，将含有经过测序验证构建成功质粒的菌液2ml加到已高压灭菌过的150ml的含有氨苄霉素的LB培养基中，220rpm摇床37℃摇16-24h，提取质粒。详细操作步骤如下：

①菌液移到离心管，8000rpm离心3min，尽量弃除上清液，沉淀为菌体。

②10ml P1溶液加入到菌体沉淀中，移液器轻轻吹打使沉淀重悬。

③P1溶液中迅速加入等体积即10ml P2溶液，立即温和上下翻转离心管混匀P1、P2溶液，混合液室温放置5min，使细菌菌体充分裂解，溶液清亮粘稠即为裂解彻底。

④加入10ml P4溶液，立即温和上下翻转6-8次，P4溶液为中和液，使其与裂解液充分混匀，直到溶液中出现白色絮状沉淀，离心管室温放置10min，室温、8000rpm离心10min。

⑤上清加入已经用平衡液处理过的柱子中，过滤，滤液收集在干净的离心管中。

⑥滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，转移到吸附柱中。室温8000rpm，离心2分钟，得到的滤液倒回柱子，再重复一次。

⑦倒掉废液，吸附柱中加入10ml的PW洗液，室温8000rpm离心2min，重复一次。

⑧倒掉废液，柱子中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液，8000rp空转5min。

⑨将吸附柱置于一个洁净的新50ml离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加2ml洗脱缓冲液TB，室温静置5min，室温8000rpm离心2min，将洗脱液倒回吸附柱，重复一次。最后，将洗脱液移至EP管中，-20℃可长期保存。

⑩检测质粒浓度。

(2)下游应答元件表达质粒构建：合成小鼠TRAF6基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。

将该目的基因重组到载体pHR_5x Gal4 UAS(质粒图谱如图3所示，详见https://www.addgene.org/79119/)。用限制性内切酶SalI对载体进行酶切，反应体系如下：

20μL体系：3μL 10×T Buffer，1μL SalI，1μg DNA，补水至20μL；37度，1.5h。

连接，酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳(图6)。参考以上第(1)部分实施方法进行转化，提取质粒，测序，结果见图5，基因序列比对正确，说明应答元件载体构建成功。

(3)细胞复苏、培养及冻存操作条件

3.1对树突状细胞进行复苏、培养。

(a)从液氮中取出存放细胞的冻存管，在已经调好的37℃恒温水浴锅中快速解冻。

(b)细胞完全融化后，快速将其加入已准备好的5-10ml培养液中重悬，室温、800rpm/min，离心5分钟，弃上清。

(c)用完全培养基重悬细胞，将其移入培养皿，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中静置培养。

(d)细胞复苏后24h更换新鲜培养液，室温、800rpm/min，离心5分钟，弃上清，用含10％FBS的新鲜RPMI1640培养液重悬细胞，重新接种至培养皿中，放回细胞培养箱中。

3.2细胞冻存

1)冻存细胞之前12h换液，细胞处于对数生长期。

2)将细胞悬液转移至离心管中，室温、800rpm/min，离心5分钟，弃上清。

3)用细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度为5-10×10⁶/ml，细胞悬液每管1ml分装至冻存管。

4)置于程序降温盒，负80℃冰箱存放过夜后转移至液氮储存罐长期保存。

(4)慢病毒包装

a)将synNotch受体表达质粒、下游应答元件表达质粒pHR_5x Gal4 UAS-TRAF6、pHR_PGK空载质粒、pWPXLd-GFP质粒(Addgene plasmid#12258，用于检测转染效率)分别与两种辅助包装质粒(Addgene plasmid#12260,Addgene plasmid#12259)共转染至293T细胞，分别于培养48h、72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。如图7所示，pWPXLd-GFP质粒转染293T细胞包装慢病毒，48h荧光显微镜观察转染效率大于90％。

b)使用带滤膜的离心柱，3500g，30min，4℃离心对病毒液进行浓缩。

c)倍比稀释浓缩病毒液，感染293T细胞，检测浓缩病毒液的滴度。

d)浓缩好的病毒液立即使用或放-80℃保存。

(5)慢病毒感染树突状细胞

具体过程为：

1)树突状细胞铺至24孔板，2.5x10⁵ cells/well，贴壁，过夜；

2)更换新鲜培养基，将synNotch慢病毒液和pHR_5x Gal4 UAS-TRAF6慢病毒液滴加至一个孔内，pHR_PGK空载、pWPXLd-GFP慢病毒液分别滴加至不同的孔内，MOI值＝100；

3)24h后换液，二氧化碳孵箱培养。

5.1、采用流式细胞术检测转染效率，操作如下：

1)收集转染后的细胞于离心管中，加入预冷的PBS离心，300g，5min，弃上清。

2)向管内加入PBS缓冲液洗涤细胞，离心两遍300g，5min，弃去上清。

3)管加入3-4滴PBS，上机检测GFP阳性细胞比例，观察转染效率。

如图8所示，流式检测结果表明，转染效率大于70％。采用荧光显微镜观察转染后的DC2.4细胞，如图9所示。

5.2、采用免疫荧光实验检测转染后DC2.4中PD-1的表达情况，步骤如下：

①取普通洁净盖玻片于70％乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9％NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50％-80％满。

②按照特定的实验目的处理细胞后，吸尽培养液，加入1ml固定液，固定10分钟或更长时间(可4℃固定过夜)。

③去固定液，用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

④用封闭液封闭60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。

⑤去封闭液，用稀释的特定一抗作用60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4℃作用过夜。

⑥去除一抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

⑦除洗涤液，加入1毫升稀释好的荧光标记的二抗避光孵育60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。

⑧回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟，期间适当注意避光操作。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

⑨滴一滴本试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

转染后DC2.4中PD-1的表达结果如图10所示。

图10中，DC-NC为pHR_PGK空载组。转染目的基因组细胞(两个镜下视野c,d)中PD-1(红色荧光)表达明显高于空载组(两个镜下视野a,b)。

5.3、采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测转染后DC2.4中PD-1的表达情况，步骤如下：

提取细胞总蛋白，步骤如下：

(1)收集DC2.4，DC-NC，DC-PD-1-TRAF6细胞，600×g离心10分钟，弃上清收集细胞，用冷PBS重悬细胞，600×g离心5分钟，弃上清，收集细胞。

(2)配制细胞裂解液：Lysis Buffer 1ml，加10μl 100×的磷酸酶抑制剂，加入5μlPMSF(100mmol/L)，加入1μl 1000×蛋白酶抑制剂，用移液器吹打混匀后置于冰上预冷备用。按照5×10⁶个细胞加200uL～500ul的比例，加入Lysis Buffer，吹打混匀。

(3)将离心管置于涡旋混合器，剧烈振荡30s，置于冰上4min，重复5次。

(4)4℃，14000rpm/min，离心15分钟，用移液器将上清小心移至另一洁净EP管中，即为全蛋白提取物。

(5)BCA法测蛋白浓度，4×蛋白上样缓冲液：蛋白体积＝1:3，混合均匀，金属浴锅提前调至100℃，将蛋白与上样缓冲液混合物煮沸5分钟，蛋白分装后置于负80℃超低温冰箱中可长期保存。

Western blot分析，步骤如下：

(1)制胶。

(2)取出蛋白样品，完全融化后上样，调节电压至80V，蛋白进入分离胶时调电压为120V，继续电泳。

(3)电泳结束后从玻璃板上移除凝胶，置于预冷的1×甘氨酸转膜缓冲液中，剪一张略大于凝胶的PVDF膜，在甲醇溶液中浸润15s，使用厚滤纸、凝胶、PVDF膜组装成转膜“三明治结构”，加入转膜缓冲液，100V恒压转膜90min-120min。

(4)转膜完毕后将PVDF膜放入5％脱脂奶粉的封闭液中，室温下在摇床上封闭1h。

(5)封闭液稀释一抗，将PVDF膜放入，室温孵育1-2h或4℃震荡孵育过夜。

(6)孵育完毕后将PVDF膜放入1×TBST溶液中轻轻振摇5min，洗涤3次。

(7)封闭液稀释二抗，将PVDF膜放入，室温孵育1h。

(8)二抗孵育完毕后将膜放入1×TBST溶液中轻轻振摇5min，洗涤3次。

(9)ECL发光液A液B液等体积混匀，滴加于PVDF膜上。

(10)Amersham lmager 600超灵敏多功能成像仪显影。

转染后DC2.4中PD-1的表达蛋白免疫印迹结果如图11所示，表明相对于DC2.4、DC-NC组，DC-PD-1-TRAF6组中有PD-1的表达。

用重组小鼠PD-1蛋白包被96孔板，37度，3-6h，孔内进行黏附处理。将转染后的DC2.4细胞接种于孔板内，24h后进行免疫荧光染色，检测DC细胞中TRAF6表达情况，结果如图12所示。

图12中，转染目的基因组TRAF6荧光强度高于对照组，说明synNotch-DC细胞模型构建成功。

实施例3用于改造树突状细胞的表达载体的具体实施例

本实施例的用于改造树突状细胞的表达载体，由synNotch受体表达载体与其应答元件表达载体，synNotch受体表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。应答元件表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

实施例4synNotch-DC介导的抗肿瘤免疫效应增强

4T1细胞计数，铺至6孔板，2.5×10⁵cells/well，培养过夜。第二天DC2.4细胞计数，2.5×10⁵cells/well加入4T1培养孔内；分离获取6-8周C57BL/6小鼠脾细胞，2.5×10⁶cells/well加入4T1培养孔内。4T1，DC2.4/DC-NC/DC-PD-1-TRAF6，脾细胞共培养48h后，吸弃上清，显微镜下观察各组4T1细胞数量。

如图13所示，转染目的基因PD-1/TRAF6 DC组4T1细胞数较对照组明显减少，初步表明改造后DC对4T1的抗肿瘤免疫效应增强。

实施例5动物实验

利用免疫缺陷鼠NOD/SCI/IL-2Rg(NSG)建立乳腺癌肿瘤模型，在体内观察synNotch受体改造的树突状细胞对乳腺癌的抗肿瘤作用。将小鼠随机分为4组：阴性对照组，DC-NC+spleen细胞组，synNotch-DC+spleen细胞组，Spleen细胞组，6只/组，经皮下注射小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞，5×10⁵cells/只。接种后第7天瘤体长出，建模成功。在接种后第2，9，13天皮下注射DC细胞和脾细胞进行治疗，每只小鼠给予DC细胞2×10⁶个，脾细胞2×10⁷个。接种后第7，9，11，13，15天监测肿瘤体积变化，如图14所示，synNotch-DC组小鼠肿瘤体积始终显著小于DC-NC组和脾细胞组。接种后第17天，每组取3只小鼠瘤体拍照，结果如图15所示。体内实验表明synNotch受体改造的树突状细胞在体内有明显的抗肿瘤作用。

<110> 河南省肿瘤医院

<120> 一种抗肿瘤树突状细胞及其制备方法、表达载体及应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> synNotch受体

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser

20 25 30

Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe

35 40 45

Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr

50 55 60

Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg

65 70 75 80

Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly

85 90 95

Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro

100 105 110

Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp

115 120 125

Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys

130 135 140

Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu

145 150 155 160

Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg

165 170 175

Phe Gln Ile Leu Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile

180 185 190

Pro Pro Pro Gln Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Val

195 200 205

Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys

210 215 220

Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys

225 230 235 240

Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly His

245 250 255

Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe Asp

260 265 270

Cys Gln Leu Thr Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys

275 280 285

Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala

290 295 300

Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg

305 310 315 320

Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Leu Val Val Leu Leu Pro Pro Asp Gln

325 330 335

Leu Arg Asn Asn Ser Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser His Val Leu

340 345 350

His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala Gln Gly Gln Gln Met Ile

355 360 365

Phe Pro Tyr Tyr Gly His Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys

370 375 380

Arg Ser Thr Val Gly Trp Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Gly Thr Ser

385 390 395 400

Gly Gly Arg Gln Arg Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile Arg Gly Ser

405 410 415

Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ser Ser Ser

420 425 430

Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu

435 440 445

Ala Ser Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys

450 455 460

Ser Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr

465 470 475 480

Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val

485 490 495

Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu

500 505 510

Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu

515 520 525

Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr

530 535 540

Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu

545 550 555 560

Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe

565 570 575

Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp

580 585 590

Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys

595 600 605

Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu

610 615 620

Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser

625 630 635 640

Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly

645 650 655

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp

660 665 670

Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly

675 680 685

Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala

690 695 700

Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser

705 710 715

<210> 2

<211> 2148

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> synNotch受体

<400> 2

atggcgctcc ctgtcaccgc actgcttctt ccgctggcac tgctgctgca cgctgcacgg 60

cctgagcaaa aacttatctc tgaagaggac ctctcagggt ggcttctaga ggtccccaat 120

gggccctgga ggtccctcac cttctaccca gcctggctca cagtgtcaga gggagcaaat 180

gccaccttca cctgcagctt gtccaactgg tcggaggatc ttatgctgaa ctggaaccgc 240

ctgagtccca gcaaccagac tgaaaaacag gccgccttct gtaatggttt gagccaaccc 300

gtccaggatg cccgcttcca gatcatacag ctgcccaaca ggcatgactt ccacatgaac 360

atccttgaca cacggcgcaa tgacagtggc atctacctct gtggggccat ctccctgcac 420

cccaaggcaa aaatcgagga gagccctgga gcagagctcg tggtaacaga gagaatcctg 480

gagacctcaa caagatatcc cagcccctcg cccaaaccag aaggccggtt tcaaatcctg 540

gactacagct tcacaggtgg cgctgggcgc gacattcccc caccgcagat tgaggaggcc 600

tgtgagctgc ctgagtgcca ggtggatgca ggcaataagg tctgcaacct gcagtgtaat 660

aatcacgcat gtggctggga tggtggcgac tgctccctca acttcaatga cccctggaag 720

aactgcacgc agtctctaca gtgctggaag tattttagcg acggccactg tgacagccag 780

tgcaactcgg ccggctgcct ctttgatggc ttcgactgcc agctcaccga gggacagtgc 840

aaccccctgt atgaccagta ctgcaaggac cacttcagtg atggccactg cgaccagggc 900

tgtaacagtg ccgaatgtga gtgggatggc ctagactgtg ctgagcatgt acccgagcgg 960

ctggcagccg gcaccctggt gctggtggtg ctgcttccac ccgaccagct acggaacaac 1020

tccttccact ttctgcggga gctcagccac gtgctgcaca ccaacgtggt cttcaagcgt 1080

gatgcgcaag gccagcagat gatcttcccg tactatggcc acgaggaaga gctgcgcaag 1140

cacccaatca agcgctctac agtgggttgg gccacctctt cactgcttcc tggtaccagt 1200

ggtgggcgcc agcgcaggga gctggacccc atggacatcc gtggctccat tgtctacctg 1260

gagatcgaca accggcaatg tgtgcagtca tcctcgcagt gcttccagag tgccaccgat 1320

gtggctgcct tcctaggtgc tcttgcgtca cttggcagcc tcaatattcc ttacaagatt 1380

gaggccgtga agagtgagcc ggtggagcct ccgctgccct cgcagctgca cctcatgtac 1440

gtggcagcgg ccgccttcgt gctcctgttc tttgtgggct gtggggtgct gctgtcccgc 1500

aagcgccggc ggatgaagct gctgagcagc atcgagcagg cctgtgacat ctgccggctg 1560

aagaaactga agtgcagcaa agaaaagccc aagtgcgcca agtgcctgaa gaacaactgg 1620

gagtgccggt acagccccaa gaccaagaga agccccctga ccagagccca cctgaccgag 1680

gtggaaagcc ggctggaaag actggaacag ctgtttctgc tgatcttccc acgcgaggac 1740

ctggacatga tcctgaagat ggacagcctg caggacatca aggccctgct gaccggcctg 1800

ttcgtgcagg acaacgtgaa caaggacgcc gtgaccgaca gactggccag cgtggaaacc 1860

gacatgcccc tgaccctgcg gcagcacaga atcagcgcca ccagcagcag cgaggaaagc 1920

agcaacaagg gccagcggca gctgacagtg tctgctgctg caggcggaag cggaggctct 1980

ggcggatctg atgccctgga cgacttcgac ctggatatgc tgggcagcga cgccctggat 2040

gattttgatc tggacatgct gggatctgac gctctggacg atttcgatct cgacatgttg 2100

ggatcagatg cactggatga ctttgacctg gacatgctcg gatcatga 2148

<210> 3

<211> 1863

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 转录调控模块Gal4-UAS-TRAF6

<400> 3

ggagcactgt cctccgaacg tcggagcact gtcctccgaa cgtcggagca ctgtcctccg 60

aacgtcggag cactgtcctc cgaacggagc atgtcctccg aacgtcggag cactgtcctc 120

cgaacgacta gttaggcgtg tacggtggga ggcctatata agcagagctc gtttagtgaa 180

ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 240

ccgatccagc ctctcgacat tcgttggatc atgagtctct taaactgtga gaacagctgc 300

gggtccagcc agtcgtccag tgactgctgc gctgccatgg ccgcctcctg cagcgctgca 360

gtgaaagatg acagcgtgag tggctctgcc agcaccggga acctctccag ctccttcatg 420

gaggagatcc agggctacga tgtggagttt gacccacctc tggagagcaa gtatgagtgt 480

cccatctgct tgatggcttt acgggaagca gtgcaaacac catgtggcca caggttctgc 540

aaagcctgca tcatcaaatc cataagggat gcagggcaca agtgcccagt tgacaatgaa 600

atactgctgg aaaatcaact gtttcccgac aattttgcaa agcgagagat tctttccctg 660

acggtaaagt gcccaaataa aggctgtttg caaaagatgg aactgagaca tctcgaggat 720

catcaagtac attgtgaatt tgctctagtg aattgtcccc agtgccaacg tcctttccag 780

aagtgccagg ttaatacaca cattattgag gattgtccca ggaggcaggt ttcttgtgta 840

aactgtgctg tgtccatggc atatgaagag aaagagatcc atgatcaaag ctgtcctctg 900

gcaaatatca tctgtgaata ctgtggtaca atcctcatca gagaacagat gcctaatcat 960

tatgatctgg actgcccaac agctccaatc ccttgcacat tcagtgtttt tggctgtcat 1020

caaaagatgc agaggaatca cttggcacga cacttgcaag agaataccca gttgcacatg 1080

agactgttgg cccaggctgt tcataatgtt aaccttgctt tgcgtccgtg cgatgccgcc 1140

tctccatccc ggggatgtcg tccagaggac ccaaattatg aggaaactat caaacagttg 1200

gagagtcgcc tagtaagaca ggaccatcag atccgggagc tgactgccaa aatggaaact 1260

cagagtatgt acgtgggcga gctcaaacgg accattcgga ccctggagga caaggttgcc 1320

gaaatggaag cacagcagtg taacgggatc tacatttgga agattggcaa gtttgggatg 1380

cacttgaaat cccaagaaga ggaaagacct gttgtcatcc atagccctgg attctacaca 1440

ggcagacctg ggtacaagct gtgcatgcgc ctgcatcttc agttaccgac agctcagcgc 1500

tgtgcaaact atatatccct ttttgtccac acaatgcaag gagaatatga cagccacctc 1560

ccctggccct tccagggtac aatacgcctt acaattctcg accagtctga agcacttata 1620

aggcaaaacc acgaagaggt catggacgcc aaaccagaac tgcttgcctt tcagcgaccc 1680

acaatcccac ggaaccccaa aggttttggc tatgtaacat ttatgcacct ggaagcctta 1740

agacagggaa ccttcattaa ggatgataca ttactagtgc gctgtgaagt ctctacccgc 1800

tttgacatgg gtggccttcg gaaggagggt ttccagccac gaagtactga tgcgggggtg 1860

tag 1863

<210> 4

<211> 11112

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> synNotch受体表达载体

<400> 4

cgataccgtc gaccaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac 60

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 120

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 180

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 240

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagcatct 300

agaattaatt ccgtgtattc tatagtgtca cctaaatcgt atgtgtatga tacataaggt 360

tatgtattaa ttgtagccgc gttctaacga caatatgtac aagcctaatt gtgtagcatc 420

tggcttactg aagcagaccc tatcatctct ctcgtaaact gccgtcagag tcggtttggt 480

tggacgaacc ttctgagttt ctggtaacgc cgtcccgcac ccggaaatgg tcagcgaacc 540

aatcagcagg gtcatcgcta gccagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac 600

cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg 660

ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt 720

ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct 780

caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg 840

tcgaatggtg cactctcagt acaatctagc tctgatgccg catagttaag ccagccccga 900

cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 960

agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 1020

aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 1080

ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 1140

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 1200

atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 1260

attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 1320

gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 1380

agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 1440

aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 1500

cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 1560

cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 1620

actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 1680

cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 1740

ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 1800

ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 1860

gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 1920

gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 1980

ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 2040

cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 2100

caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 2160

taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 2220

cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 2280

cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 2340

gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 2400

aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 2460

cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 2520

tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 2580

acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 2640

ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 2700

ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 2760

tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 2820

tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 2880

ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 2940

gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 3000

cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 3060

gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt 3120

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 3180

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 3240

agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 3300

ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 3360

cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 3420

gcaaaaagct tggacacaag acaggcttgc gagatatgtt tgagaatacc actttatccc 3480

gcgtcaggga gaggcagtgc gtaaaaagac gcggactcat gtgaaatact ggtttttagt 3540

gcgccagatc tctataatct cgcgcaacct attttcccct cgaacacttt ttaagccgta 3600

gataaacagg ctgggacact tcacatgagc gaaaaataca tcgtcacctg ggacatgttg 3660

cagatccatg cacgtaaact cgcaagccga ctgatgcctt ctgaacaatg gaaaggcatt 3720

attgccgtaa gccgtggcgg tctgtaccgg gtgcgttact ggcgcgtgaa ctgggtattc 3780

gtcatgtcga taccgtttgt atttccagct acgatcacga caaccagcgc gagcttaaag 3840

tgctgaaacg cgcagaaggc gatggcgaag gcttcatcgt tattgatgac ctggtggata 3900

ccggtggtac tgcggttgcg attcgtgaaa tgtatccaaa agcgcacttt gtcaccatct 3960

tcgcaaaacc ggctggtcgt ccgctggttg atgactatgt tgttgatatc ccgcaagata 4020

cctggattga acagccgtgg gatatgggcg tcgtattcgt cccgccaatc tccggtcgct 4080

aatcttttca acgcctggca ctgccgggcg ttgttctttt taacttcagg cgggttacaa 4140

tagtttccag taagtattct ggaggctgca tccatgacac aggcaaacct gagcgaaacc 4200

ctgttcaaac cccgctttaa acatcctgaa acctcgacgc tagtccgccg ctttaatcac 4260

ggcgcacaac cgcctgtgca gtcggccctt gatggtaaaa ccatccctca ctggtatcgc 4320

atgattaacc gtctgatgtg gatctggcgc ggcattgacc cacgcgaaat cctcgacgtc 4380

caggcacgta ttgtgatgag cgatgccgaa cgtaccgacg atgatttata cgatacggtg 4440

attggctacc gtggcggcaa ctggatttat gagtgggccc cggatctttg tgaaggaacc 4500

ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt 4560

aaatataaaa tttttaagtg tataatgtgt taaactactg attctaattg tttgtgtatt 4620

ttagattcca acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg tggaatgcct ttaatgagga 4680

aaacctgttt tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat gaggctactg ctgactctca 4740

acattctact cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac cccaaggact ttccttcaga 4800

attgctaagt tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga actcttgctt gctttgctat 4860

ttacaccaca aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa attatggaaa aatattctgt 4920

aacctttata agtaggcata acagttataa tcataacata ctgttttttc ttactccaca 4980

caggcataga gtgtctgcta ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt 5040

aatttgtaaa ggggttaata aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa 5100

tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 5160

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 5220

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 5280

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcaactgga 5340

taactcaagc taaccaaaat catcccaaac ttcccacccc ataccctatt accactgcca 5400

attacctagt ggtttcattt actctaaacc tgtgattcct ctgaattatt ttcattttaa 5460

agaaattgta tttgttaaat atgtactaca aacttagtag ttggaagggc taattcactc 5520

ccaaagaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga 5580

ttagcagaac tacacaccag ggccaggggt cagatatcca ctgacctttg gatggtgcta 5640

caagctagta ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc aataaaggag agaacaccag 5700

cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tgttagagtg 5760

gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga gagctgcatc cggagtactt 5820

caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc gctggggact ttccagggag 5880

gcgtggcctg ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga tcctgcatat aagcagctgc 5940

tttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 6000

aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 6060

gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 6120

ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga 6180

gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg 6240

actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga 6300

gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc 6360

agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg 6420

attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca 6480

gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc 6540

aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa 6600

gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag caagcggccg gtgatcttca 6660

gacctggacg atatatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt 6720

aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga 6780

aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac 6840

tatgggcgca gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt 6900

gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac 6960

agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga 7020

tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc 7080

ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat 7140

ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc 7200

gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt 7260

gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt 7320

aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag 7380

gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag 7440

gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt 7500

gaacggatct cgacggtcgc caaatggcag tattcatcca caattttaaa agaaaagggg 7560

ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa 7620

ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca 7680

gcagagatcc agtttggatc gataagcttg atatcgaatt gggtagggga ggcgcttttc 7740

ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt 7800

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ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg 7920

cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag 7980

atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag 8040

ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc 8100

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acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg 8220

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ccgcactgct tcttccgctg gcactgctgc tgcacgctgc acggcctgag caaaaactta 8340

tctctgaaga ggacctctca gggtggcttc tagaggtccc caatgggccc tggaggtccc 8400

tcaccttcta cccagcctgg ctcacagtgt cagagggagc aaatgccacc ttcacctgca 8460

gcttgtccaa ctggtcggag gatcttatgc tgaactggaa ccgcctgagt cccagcaacc 8520

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tccagatcat acagctgccc aacaggcatg acttccacat gaacatcctt gacacacggc 8640

gcaatgacag tggcatctac ctctgtgggg ccatctccct gcaccccaag gcaaaaatcg 8700

aggagagccc tggagcagag ctcgtggtaa cagagagaat cctggagacc tcaacaagat 8760

atcccagccc ctcgcccaaa ccagaaggcc ggtttcaaat cctggactac agcttcacag 8820

gtggcgctgg gcgcgacatt cccccaccgc agattgagga ggcctgtgag ctgcctgagt 8880

gccaggtgga tgcaggcaat aaggtctgca acctgcagtg taataatcac gcatgtggct 8940

gggatggtgg cgactgctcc ctcaacttca atgacccctg gaagaactgc acgcagtctc 9000

tacagtgctg gaagtatttt agcgacggcc actgtgacag ccagtgcaac tcggccggct 9060

gcctctttga tggcttcgac tgccagctca ccgagggaca gtgcaacccc ctgtatgacc 9120

agtactgcaa ggaccacttc agtgatggcc actgcgacca gggctgtaac agtgccgaat 9180

gtgagtggga tggcctagac tgtgctgagc atgtacccga gcggctggca gccggcaccc 9240

tggtgctggt ggtgctgctt ccacccgacc agctacggaa caactccttc cactttctgc 9300

gggagctcag ccacgtgctg cacaccaacg tggtcttcaa gcgtgatgcg caaggccagc 9360

agatgatctt cccgtactat ggccacgagg aagagctgcg caagcaccca atcaagcgct 9420

ctacagtggg ttgggccacc tcttcactgc ttcctggtac cagtggtggg cgccagcgca 9480

gggagctgga ccccatggac atccgtggct ccattgtcta cctggagatc gacaaccggc 9540

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gtgctcttgc gtcacttggc agcctcaata ttccttacaa gattgaggcc gtgaagagtg 9660

agccggtgga gcctccgctg ccctcgcagc tgcacctcat gtacgtggca gcggccgcct 9720

tcgtgctcct gttctttgtg ggctgtgggg tgctgctgtc ccgcaagcgc cggcggatga 9780

agctgctgag cagcatcgag caggcctgtg acatctgccg gctgaagaaa ctgaagtgca 9840

gcaaagaaaa gcccaagtgc gccaagtgcc tgaagaacaa ctgggagtgc cggtacagcc 9900

ccaagaccaa gagaagcccc ctgaccagag cccacctgac cgaggtggaa agccggctgg 9960

aaagactgga acagctgttt ctgctgatct tcccacgcga ggacctggac atgatcctga 10020

agatggacag cctgcaggac atcaaggccc tgctgaccgg cctgttcgtg caggacaacg 10080

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ggcagctgac agtgtctgct gctgcaggcg gaagcggagg ctctggcgga tctgatgccc 10260

tggacgactt cgacctggat atgctgggca gcgacgccct ggatgatttt gatctggaca 10320

tgctgggatc tgacgctctg gacgatttcg atctcgacat gttgggatca gatgcactgg 10380

atgactttga cctggacatg ctcggatcat gagatccttg acttgcggcc gcaactccca 10440

cctgcaacat gcgtgactga ctgaggccgc gactctagag tcgacctgca ggcatgcaag 10500

cttgatatca agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact 10560

ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg 10620

tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg 10680

ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg 10740

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tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc 10980

tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct 11040

ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc 11100

gcctccccgc at 11112

<210> 5

<211> 10282

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 转录调控（应答元件）表达载体

<400> 5

cgataccgtc gaccaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac 60

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 120

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 180

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 240

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagcatct 300

agaattaatt ccgtgtattc tatagtgtca cctaaatcgt atgtgtatga tacataaggt 360

tatgtattaa ttgtagccgc gttctaacga caatatgtac aagcctaatt gtgtagcatc 420

tggcttactg aagcagaccc tatcatctct ctcgtaaact gccgtcagag tcggtttggt 480

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aatcagcagg gtcatcgcta gccagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac 600

cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg 660

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ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct 780

caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg 840

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agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 1020

aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 1080

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tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 1200

atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 1260

attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 1320

gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 1380

agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 1440

aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 1500

cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 1560

cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 1620

actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 1680

cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 1740

ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 1800

ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 1860

gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 1920

gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 1980

ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 2040

cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 2100

caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 2160

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tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 2580

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ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 2700

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ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 3240

agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 3300

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cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 3420

gcaaaaagct tggacacaag acaggcttgc gagatatgtt tgagaatacc actttatccc 3480

gcgtcaggga gaggcagtgc gtaaaaagac gcggactcat gtgaaatact ggtttttagt 3540

gcgccagatc tctataatct cgcgcaacct attttcccct cgaacacttt ttaagccgta 3600

gataaacagg ctgggacact tcacatgagc gaaaaataca tcgtcacctg ggacatgttg 3660

cagatccatg cacgtaaact cgcaagccga ctgatgcctt ctgaacaatg gaaaggcatt 3720

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gtcatgtcga taccgtttgt atttccagct acgatcacga caaccagcgc gagcttaaag 3840

tgctgaaacg cgcagaaggc gatggcgaag gcttcatcgt tattgatgac ctggtggata 3900

ccggtggtac tgcggttgcg attcgtgaaa tgtatccaaa agcgcacttt gtcaccatct 3960

tcgcaaaacc ggctggtcgt ccgctggttg atgactatgt tgttgatatc ccgcaagata 4020

cctggattga acagccgtgg gatatgggcg tcgtattcgt cccgccaatc tccggtcgct 4080

aatcttttca acgcctggca ctgccgggcg ttgttctttt taacttcagg cgggttacaa 4140

tagtttccag taagtattct ggaggctgca tccatgacac aggcaaacct gagcgaaacc 4200

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attggctacc gtggcggcaa ctggatttat gagtgggccc cggatctttg tgaaggaacc 4500

ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt 4560

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attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcaactgga 5340

taactcaagc taaccaaaat catcccaaac ttcccacccc ataccctatt accactgcca 5400

attacctagt ggtttcattt actctaaacc tgtgattcct ctgaattatt ttcattttaa 5460

agaaattgta tttgttaaat atgtactaca aacttagtag ttggaagggc taattcactc 5520

ccaaagaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga 5580

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cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tgttagagtg 5760

gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga gagctgcatc cggagtactt 5820

caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc gctggggact ttccagggag 5880

gcgtggcctg ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga tcctgcatat aagcagctgc 5940

tttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 6000

aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 6060

gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 6120

ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga 6180

gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg 6240

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gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc 6360

agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg 6420

attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca 6480

gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc 6540

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gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag caagcggccg gtgatcttca 6660

gacctggacg atatatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt 6720

aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga 6780

aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac 6840

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gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac 6960

agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga 7020

tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc 7080

ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat 7140

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gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt 7260

gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt 7320

aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag 7380

gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag 7440

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ctccgaacgg agcatgtcct ccgaacgtcg gagcactgtc ctccgaacga ctagttaggc 7860

gtgtacggtg ggaggcctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 7920

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctctcga 7980

cattcgttgg atcatgagtc tcttaaactg tgagaacagc tgcgggtcca gccagtcgtc 8040

cagtgactgc tgcgctgcca tggccgcctc ctgcagcgct gcagtgaaag atgacagcgt 8100

gagtggctct gccagcaccg ggaacctctc cagctccttc atggaggaga tccagggcta 8160

cgatgtggag tttgacccac ctctggagag caagtatgag tgtcccatct gcttgatggc 8220

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cctttttgtc cacacaatgc aaggagaata tgacagccac ctcccctggc ccttccaggg 9300

tacaatacgc cttacaattc tcgaccagtc tgaagcactt ataaggcaaa accacgaaga 9360

ggtcatggac gccaaaccag aactgcttgc ctttcagcga cccacaatcc cacggaaccc 9420

caaaggtttt ggctatgtaa catttatgca cctggaagcc ttaagacagg gaaccttcat 9480

taaggatgat acattactag tgcgctgtga agtctctacc cgctttgaca tgggtggcct 9540

tcggaaggag ggtttccagc cacgaagtac tgatgcgggg gtgtagcttg acttgcggcc 9600

gcaactccca cctgcaacat gcgtgactga ctgaggccgc gactctagag tcgacctgca 9660

ggcatgcaag cttgatatca agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga 9720

aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 9780

aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 9840

atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 9900

gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 9960

cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 10020

ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 10080

ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 10140

gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 10200

gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 10260

cctttgggcc gcctccccgc at 10282

<210> 6

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 小鼠PD-1胞外域

<400> 6

tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 60

tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 120

gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 180

gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 240

cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 300

tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 360

gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 420

aaaccagaag gccggtttca a 441

<210> 7

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 鼠Notch1(NM_008714)调节区域

<400> 7

atcctggact acagcttcac aggtggcgct gggcgcgaca ttcccccacc gcagattgag 60

gaggcctgtg agctgcctga gtgccaggtg gatgcaggca ataaggtctg caacctgcag 120

tgtaataatc acgcatgtgg ctgggatggt ggcgactgct ccctcaactt caatgacccc 180

tggaagaact gcacgcagtc tctacagtgc tggaagtatt ttagcgacgg ccactgtgac 240

agccagtgca actcggccgg ctgcctcttt gatggcttcg actgccagct caccgaggga 300

cagtgcaacc ccctgtatga ccagtactgc aaggaccact tcagtgatgg ccactgcgac 360

cagggctgta acagtgccga atgtgagtgg gatggcctag actgtgctga gcatgtaccc 420

gagcggctgg cagccggcac cctggtgctg gtggtgctgc ttccacccga ccagctacgg 480

aacaactcct tccactttct gcgggagctc agccacgtgc tgcacaccaa cgtggtcttc 540

aagcgtgatg cgcaaggcca gcagatgatc ttcccgtact atggccacga ggaagagctg 600

cgcaagcacc caatcaagcg ctctacagtg ggttgggcca cctcttcact gcttcctggt 660

accagtggtg ggcgccagcg cagggagctg gaccccatgg acatccgtgg ctccattgtc 720

tacctggaga tcgacaaccg gcaatgtgtg cagtcatcct cgcagtgctt ccagagtgcc 780

accgatgtgg ctgccttcct aggtgctctt gcgtcacttg gcagcctcaa tattccttac 840

aagattgagg ccgtgaagag tgagccggtg gagcctccgc tgccctcgca gctgcacctc 900

atgtacgtgg cagcggccgc cttcgtgctc ctgttctttg tgggctgtgg ggtgctgctg 960

tcccgcaagc gccggcgg 978

<210> 8

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gal4-VP64

<400> 8

atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggcc tgtgacatct gccggctgaa gaaactgaag 60

tgcagcaaag aaaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgccggtac 120

agccccaaga ccaagagaag ccccctgacc agagcccacc tgaccgaggt ggaaagccgg 180

ctggaaagac tggaacagct gtttctgctg atcttcccac gcgaggacct ggacatgatc 240

ctgaagatgg acagcctgca ggacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300

aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacaga ctggccagcg tggaaaccga catgcccctg 360

accctgcggc agcacagaat cagcgccacc agcagcagcg aggaaagcag caacaagggc 420

cagcggcagc tgacagtgtc tgctgctgca ggcggaagcg gaggctctgg cggatctgat 480

gccctggacg acttcgacct ggatatgctg ggcagcgacg ccctggatga ttttgatctg 540

gacatgctgg gatctgacgc tctggacgat ttcgatctcg acatgttggg atcagatgca 600

ctggatgact ttgacctgga catgctcgga tcatga 636

<210> 9

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> TRAF6

<400> 8

atgagtctct taaactgtga gaacagctgc gggtccagcc agtcgtccag tgactgctgc 60

gctgccatgg ccgcctcctg cagcgctgca gtgaaagatg acagcgtgag tggctctgcc 120

agcaccggga acctctccag ctccttcatg gaggagatcc agggctacga tgtggagttt 180

gacccacctc tggagagcaa gtatgagtgt cccatctgct tgatggcttt acgggaagca 240

gtgcaaacac catgtggcca caggttctgc aaagcctgca tcatcaaatc cataagggat 300

gcagggcaca agtgcccagt tgacaatgaa atactgctgg aaaatcaact gtttcccgac 360

aattttgcaa agcgagagat tctttccctg acggtaaagt gcccaaataa aggctgtttg 420

caaaagatgg aactgagaca tctcgaggat catcaagtac attgtgaatt tgctctagtg 480

aattgtcccc agtgccaacg tcctttccag aagtgccagg ttaatacaca cattattgag 540

gattgtccca ggaggcaggt ttcttgtgta aactgtgctg tgtccatggc atatgaagag 600

aaagagatcc atgatcaaag ctgtcctctg gcaaatatca tctgtgaata ctgtggtaca 660

atcctcatca gagaacagat gcctaatcat tatgatctgg actgcccaac agctccaatc 720

ccttgcacat tcagtgtttt tggctgtcat caaaagatgc agaggaatca cttggcacga 780

cacttgcaag agaataccca gttgcacatg agactgttgg cccaggctgt tcataatgtt 840

aaccttgctt tgcgtccgtg cgatgccgcc tctccatccc ggggatgtcg tccagaggac 900

ccaaattatg aggaaactat caaacagttg gagagtcgcc tagtaagaca ggaccatcag 960

atccgggagc tgactgccaa aatggaaact cagagtatgt acgtgggcga gctcaaacgg 1020

accattcgga ccctggagga caaggttgcc gaaatggaag cacagcagtg taacgggatc 1080

tacatttgga agattggcaa gtttgggatg cacttgaaat cccaagaaga ggaaagacct 1140

gttgtcatcc atagccctgg attctacaca ggcagacctg ggtacaagct gtgcatgcgc 1200

ctgcatcttc agttaccgac agctcagcgc tgtgcaaact atatatccct ttttgtccac 1260

acaatgcaag gagaatatga cagccacctc ccctggccct tccagggtac aatacgcctt 1320

acaattctcg accagtctga agcacttata aggcaaaacc acgaagaggt catggacgcc 1380

aaaccagaac tgcttgcctt tcagcgaccc acaatcccac ggaaccccaa aggttttggc 1440

tatgtaacat ttatgcacct ggaagcctta agacagggaa ccttcattaa ggatgataca 1500

ttactagtgc gctgtgaagt ctctacccgc tttgacatgg gtggccttcg gaaggagggt 1560

ttccagccac gaagtactga tgcgggggtg tag 1593

Claims

1.一种抗肿瘤树突状细胞，其特征在于，所述抗肿瘤树突状细胞为经synNotch受体改造的树突状细胞，synNotch受体包括PD-1胞外域，Notch跨膜域和转录调节模块Gal4-VP64，所述synNotch受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；所述抗肿瘤树突状细胞内引入转录调控模块GAL4-UAS-TRAF6，所述转录调控模块的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤树突状细胞，其特征在于，被改造的所述树突状细胞为DC2.4。

3.一种如权利要求1所述的抗肿瘤树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)将所述慢病毒感染树突状细胞。

4.一种用于改造树突状细胞的表达载体，其特征在于，包括synNotch受体表达载体和转录调控表达载体，所述synNotch受体表达载体上携带有synNotch受体编码基因，所述synNotch受体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述转录调控表达载体上携带有转录调控元件编码基因，所述转录调控元件编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，synNotch受体表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.如权利要求4或5所述的表达载体，其特征在于，所述转录调控表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

7.一种如权利要求1或2所述的抗肿瘤树突状细胞、如权利要求4～6中任一项所述的表达载体在制备抗肿瘤药物方面的应用。