CN111304244A

CN111304244A - 携带基因元件组合的载体组件、受体细胞文库、制备和筛选方法及用途

Info

Publication number: CN111304244A
Application number: CN201911107306.6A
Authority: CN
Inventors: 傅文燕; 胡适
Original assignee: Fengchao Medical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Fengchao Medical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2020-06-19
Also published as: WO2021093482A1

Abstract

本发明提供了携带基因元件组合的载体组件、受体细胞文库、制备和筛选方法及用途，该受体细胞文库由细胞和载体组件融合而成，载体组件至少携带三个基因元件，分别为编码一个或多种独特型synNotch受体的多种第一基因元件；载有一种或多种基因回路的第二基因元件；编码一种或多种独特型嵌合抗原受体的第三基因元件。其中，当第一基因元件编码一种独特型synNotch受体时，第三基因元件必须编码至少三种独特型嵌合抗原受体，当第三基因元件编码一种独特型嵌合抗原受体时，第一基因元件必须编码三种独特型synNotch受体。基因回路是预编程性的，将调节性顺势作用因子与转录因子组合，在第一基因元件编码的synNotch受体活化时，对第三基因元件编码的嵌合抗原受体进行控制性表达。

Description

携带基因元件组合的载体组件、受体细胞文库、制备和筛选方法及用途

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术和合成生物学领域，具体涉及一种基因元件组合和携带该组合的synNotch受体及人工受体细胞文库，并对该基因元件组合、细胞文库的制备构建方法、针对体内抗原和/或体外抗原的筛选方法、细胞文库的用途进行了详细说明。

背景技术

对于以恶性肿瘤为代表的人类重大疾病，其特点在于恶性肿瘤具有高度的变异性、个体差异、异质性、进化性。特异性的肿瘤抗原鉴定困难、多样性广、个体化差异极大，且恶性肿瘤组织可以随着病情发展和治疗手段压力进行生物进化，具有较大的变异度。

噬菌体展示技术等文库技术可以利用分子生物学和基因工程方法在体外构建肽文库，然后进行筛选。在筛选方式上，一般采用体外筛选或体内筛选的方法。体外筛选最为常用，如将特定抗原偶联到固相支持物(磁珠或酶联板)上，加入噬菌体肽库或其他抗体文库进行洗脱、富集筛选的步骤。但事实上，一旦离体，无论使用何种抗原(如细胞、组织等)，都因为脱离体内环境而造成抗原变化和丢失。在体内筛选方式上也有一些公开报道，如为了得到能特异结合活体组织、器官并在体内具有稳定性好、特异性高的小肽，以Ruoslahti、Pasqualini和Arap为主的研究小组于1996年创新性的首次将噬菌体肽库直接注射到小鼠体内进行筛选，得到了与小鼠肾、脑血管结合的小肽等[Pasqualini等.Nature，1996，380(6572)：364—366]。但是噬菌体等在体内容易被巨噬细胞、上皮细胞等抗原递呈细胞吞噬，造成噬菌体的损失。

专利文献CN 109576292 A公开了利用合成Notch受体(synNotch受体)细胞作为载体的抗体文库及针对体外固相抗原的筛选方法。与噬菌体展示等传统技术相比，synNotch受体文库结合已知或未知抗原后，在细胞内发生激活反应，使细胞可以产生荧光蛋白或分子标签、自杀蛋白等人工标志物，进而可以根据人工标志物的表达分离携带活化synNotch受体的细胞。通过该过程可以得到结合某种已知或未知抗原的synNotch受体，并可进一步利用synNotch受体获得抗体。但通过这样的筛选方法获得的抗体能否用于疾病治疗未知，如并不知道该抗体能否产生如杀伤肿瘤细胞、改善疾病症状等药效学作用，仍需进一步验证。而噬菌体展示等抗体库技术通过淘选也可以获得已知或未知抗原具有结合能力的抗体，但无法确定这些有结合能力的抗体是否用于疾病治疗。因此，该系统和噬菌体展示等传统系统对比，在功能上并无提高，其并不能提高现有技术对抗体等功能分子用于产品制备的效益。

由此可知，利用该专利公开的方法中仅能筛选出人工受体或抗体，这些人工受体或抗体能结合特定的抗原或者特定的疾病组织，但能否应用于治疗产品的价值并不清楚，后续需要大量的药效学工作和验证性工作，难以实现作为制备治疗药物、试剂、试剂盒的用途。另一方面更难以实现针对变化性的、进化性的抗原进行捕捉，本质上和噬菌体抗体展示等展示方法并无质的区别。

专利文献WO2015/123642是本发明的一个背景技术，该专利公开了嵌合抗原受体文库的构建制备方法，提出了制备大量CAR形成文库、以及进一步携带CAR文库的细胞文库的方法。而该专利文献虽然描述了利用通用技术进行CAR文库进一步筛选方法，如使用iQue^TM筛选器(Intellicyt,Albuquerque,NM)(一种高通量流式细胞仪)进行个别CAR分子的高通量测试，但该文献仅仅公开了多个CAR的制备方案，CAR细胞文库的筛选方向不能跟随抗原的变化而变化，在筛选潜能上没有提高缺乏效率。另一方面，虽然同为人工受体，CAR受体本身的激活精度上远远低于synNotch受体，不利于基因回路的设计。

综上可知，本领域迫切需要建立一种克服上述缺陷的全新技术。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明依托上述研究背景，提供了一种含有新的基因元件的synNotch受体及嵌合抗原受体组合式细胞文库，并对该基因元件组合、细胞文库的制备构建方法、针对体内抗原和/或体外抗原的筛选方法、细胞文库的用途进行了详细说明。

本发明的第一方面，提供了一种载体组件。其携带三种基因元件，分别为：(1)编码一种或多种独特型synNotch受体的多种第一基因元件(即synNotch受体文库)；

(2)载有一种或多种独特型基因回路的第二基因元件；(3)编码一种或多种独特型嵌合抗原受体的第三基因元件。

其中，当第一基因元件编码一种独特型synNotch受体时，第三基因元件必须编码至少三种独特型嵌合抗原受体，当第三基因元件编码一种独特型嵌合抗原受体时，第一基因元件必须编码三种独特型synNotch受体，以实现筛选。

基因回路是预编程性的，为调节性顺势作用因子与转录因子的组合，在第一基因元件编码的synNotch受体活化时，对第三基因元件所编码的嵌合抗原受体进行控制性表达。

synNotch受体包含细胞间信号传导受体Notch的核心调节结构域、合成性的胞外识别结构域和合成性的胞内转录结构域，所述嵌合抗原受体包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外识别结构域。

两种受体的细胞外识别结构域均包括完整的抗体、组成抗体的重链、轻链或抗体片段。

本发明中，所述的“独特型”synNotch受体和嵌合抗原受体均是就它们的胞外识别结构域而言的。当然，发明并不限制于胞外识别结构域。

本发明中的基因元件组合可以实现如下功能：当第一基因元件编码的synNotch受体活化时，可以通过第二基因元件预编程的基因回路实现同时对第三基因元件的控制性表达。所述控制性表达包括激活转录表达、增强转录表达、终止转录表达、抑制转录表达中的任意一种或至少两种的组合。

进一步，本发明中的基因元件组合还包括：(4)编码一种或多种独特型筛选标记蛋白的第四基因元件。此时，基因元件组合可以实现的功能为：当第一基因元件编码的synNotch受体活化时，可以通过第二基因元件预编程的基因回路实现同时对第三基因元件和第四基因元件的控制性表达。其中，该第四基因元件中的筛选标记蛋白包括药物抗性蛋白、自杀蛋白、荧光蛋白基因或分子标签蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

第一基因元件中，术语“synNotch受体”是合成生物学概念。synNotch受体包含了天然的细胞间信号传导受体Notch的核心调节结构域，同时含有合成性的胞外识别结构域和合成性的胞内转录结构域。合成性的胞外识别结构域可以构建为如单链抗体，当单链抗体识别并结合抗原时，synNotch系统发生诱导性跨膜区域剪切，从而释放胞内转录结构域进入细胞核，结合上游顺式激活子来激活受调控目标基因的表达。

由于Notch基因的保守性，可以利用多种物种的Notch进行构建，如专利CN109180805 A所述了人，鼠，斑马鱼，果蝇等Notch基因来源的Notch受体。专利CN 109576292A公开了胞外识别结构域为随机化而产生synNotch受体文库的方法。

在本发明中，如提到蛋白质结构域和多肽，如抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、和膜内结构域(endodomain)使用，术语“独特型”意味着具有不同的多肽(氨基酸)序列、包含不同的多肽(氨基酸)序列或由不同的多肽(氨基酸)序列组成的结构域。例如，两个“独特型”抗原结合结构域可以结合相同抗原(实际上，甚至所述抗原上的相同表位)；然而，抗原结合结构域在它们的连续氨基酸组成彼此不同的情况下是“独特型”。同样地，在连续的氨基酸组成方面不同的两种“独特型”抗原结合结构域也可以特异性结合不同抗原和表位。

关于胞外识别结构域文库，其结构包括但不限于完整的抗体、组成抗体的链(重链或轻链)、抗体的片段(抗体可变区、单链抗体、单域抗体、Fab段)所构成的文库，优选单链抗体(ScFv)文库。文库的来源包括但不限于来自动物、来自免疫动物制备、来自疾病人群、来自健康人群、接种过疫苗的人群、人工合成、基因工程制备中的任意一种或至少两种的组合；还包括上述来源的文库经过现有技术预处理后的亚文库，如非专利文献[尹长城,等.中国生物工程杂志,2008,28(12):82-88.]中记载的去除背景克隆后形成的亚文库。

本发明中的胞外识别结构域文库包括健康人来源的单链抗体文库、人工合成来源的单链抗体文库、羊驼来源的单域抗体文库、健康人来源的单链抗体文库扣除受试者外周单核细胞表达抗原后形成的亚文库、健康人来源的单链抗体文库扣除受试者外周单核细胞表达抗原或癌旁抗原后形成的亚文库。

此外，胞外识别结构域文库还可以利用抗体工程方法进一步优化，该抗体工程方法包括抗体亲和力成熟技术、抗体人源化技术、抗体动物源化技术、多功能抗体技术、多特异性抗体技术中的任意一种或至少两种的组合。在本发明的一些具体的实施方案中，所述亲和力成熟技术包括热点定点突变、热点随机突变、CDR突变、链交换、依据三维结构的抗体突变中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明的一些具体的实施例中，胞外识别结构域文库的来源包括来自单克隆抗体ABAGOVOMAB、ABCIXIMAB、ABELACIMAB、ABITUZUMAB、ABREZEKIMAB、ABRILUMAB、ACTOXUMAB、ADALIMUMAB、ADECATUMUMAB、ADUCANUMAB、AFASEVIKUMAB、AFELIMOMAB、ALACIZUMAB、ALEMTUZUMAB、ALIROCUMAB、AMATUXIMAB、ANATUMOMAB、ANDECALIXIMAB、ANETUMAB、ANIFROLUMAB、ANRUKINZUMAB、APRUTUMAB、ASCRINVACUMAB、ASELIZUMAB、ATIDORTOXUMAB、ATINUMAB、ATOLTIVIMAB、ATOROLIMUMAB、AVELUMAB、AZINTUXIZUMAB、BALSTILIMAB、BAPINEUZUMAB、BASILIXIMAB、BAVITUXIMAB、BECTUMOMAB、BEDINVETMAB、BEGELOMAB、BELANTAMAB、BELIMUMAB、BEMARITUZUMAB、BERLIMATOXUMAB、BERSANLIMAB、BERTILIMUMAB、BESILESOMAB、BEVACIZUMAB、BIMAGRUMAB、BIMEKIZUMAB、BIRTAMIMAB、BIVATUZUMAB、BLESELUMAB、BLINATUMOMAB、BLONTUVETMAB、BLOSOZUMAB、BOCOCIZUMAB、BRAZIKUMAB、BRIAKINUMAB、BROLUCIZUMAB、BRONTICTUZUMAB、BUDIGALIMAB、BUROSUMAB、CABIRALIZUMAB、CAMIDANLUMAB、CAMRELIZUMAB、CANAKINUMAB、CANTUZUMAB、CAPLACIZUMAB、CAPROMAB、CARLUMAB、CAROTUXIMAB、CATUMAXOMAB、CEDELIZUMAB、CEMIPLIMAB、CENDAKIMAB、CERGUTUZUMAB、CERTOLIZUMAB、CETRELIMAB、CETUXIMAB、CIBISATAMAB、CINPANEMAB、CITATUZUMAB、CIXUTUMUMAB、CLAZAKIZUMAB、CLENOLIXIMAB、CLIVATUZUMAB、COBOLIMAB、CODRITUZUMAB、COFETUZUMAB、COLTUXIMAB、CONATUMUMAB、CONCIZUMAB、COSFROVIXIMAB、CRENEZUMAB、CRIZANLIZUMAB、CROTEDUMAB、CROVALIMAB、CUSATUZUMAB、DACETUZUMAB、DACLIZUMAB、DALOTUZUMAB、DAPIROLIZUMAB、DECTREKUMAB、DEMCIZUMAB、DENINTUZUMAB、DENOSUMAB、DEPATUXIZUMAB、DETUMOMAB、DEZAMIZUMAB、DILPACIMAB、DINUTUXIMAB、DIRIDAVUMAB、DISITAMAB、DOMAGROZUMAB、DONANEMAB、DORLIMOMAB、DOSTARLIMAB、DROZITUMAB、DULIGOTUZUMAB、DUPILUMAB、DUSIGITUMAB、DUVORTUXIZUMAB、ECROMEXIMAB、EDOBACOMAB、EDRECOLOMAB、EFALIZUMAB、EFUNGUMAB、ELDELUMAB、ELEZANUMAB、ELGEMTUMAB、ELIPOVIMAB、ELSILIMOMAB、EMACTUZUMAB、EMIBETUZUMAB、EMICIZUMAB、ENAPOTAMAB、ENAVATUZUMAB、ENFORTUMAB、ENLIMOMAB、ENOBLITUZUMAB、ENOKIZUMAB、ENOTICUMAB、ENSITUXIMAB、ENVAFOLIMAB、EPITUMOMAB、EPTINEZUMAB、ERLIZUMAB、ERTUMAXOMAB、ETIGILIMAB、ETOKIMAB、ETROLIZUMAB、EVINACUMAB、EXBIVIRUMAB、FARALIMOMAB、FARICIMAB、FARLETUZUMAB、FASINUMAB、FELVIZUMAB、FEZAKINUMAB、FICLATUZUMAB、FIGITUMUMAB、FIRIVUMAB、FLANVOTUMAB、FLETIKUMAB、FLOTETUZUMAB、FONTOLIZUMAB、FORALUMAB、FORAVIRUMAB、FRESOLIMUMAB、FROVOCIMAB、FRUNEVETMAB、FULRANUMAB、FUTUXIMAB、GALIXIMAB、GANCOTAMAB、GANITUMAB、GANTENERUMAB、GARADACIMAB、GARETOSMAB、GAVILIMOMAB、GEDIVUMAB、GEMTUZUMAB、GEVOKIZUMAB、GILVETMAB、GIMSILUMAB、GIRENTUXIMAB、GLEMBATUMUMAB、GLENZOCIMAB、GOLIMUMAB、GOSURANEMAB、IANALUMAB、IBRITUMOMAB、ICRUCUMAB、IDARUCIZUMAB、IERAMILIMAB、IFABOTUZUMAB、IGOVOMAB、ILADATUZUMAB、IMALUMAB、IMAPRELIMAB、IMCIROMAB、IMGATUZUMAB、INCLACUMAB、INDATUXIMAB、INDUSATUMAB、INEBILIZUMAB、INFLIXIMAB、INOLIMOMAB、INOTUZUMAB、INTETUMUMAB、APAMISTAMAB、DERLOTUXIMAB、IPILIMUMAB、IRATUMUMAB、ISATUXIMAB、ISCALIMAB、ISTIRATUMAB、IXEKIZUMAB、KELIXIMAB、LABETUZUMAB、LACNOTUZUMAB、LACUTAMAB、LADIRATUZUMAB、LAMPALIZUMAB、LANADELUMAB、LANDOGROZUMAB、LAPRITUXIMAB、LARCAVIXIMAB、LEBRIKIZUMAB、LEMALESOMAB、LENVERVIMAB、LENZILUMAB、LERDELIMUMAB、LERONLIMAB、LESOFAVUMAB、LETOLIZUMAB、LEVILIMAB、LEXATUMUMAB、LIBIVIRUMAB、LIFASTUZUMAB、LIGELIZUMAB、LILOTOMAB、LINTUZUMAB、LIRILUMAB、LODELCIZUMAB、LONCASTUXIMAB、LORVOTUZUMAB、LOSATUXIZUMAB、LUCATUMUMAB、LULIZUMAB、LUMILIXIMAB、LUMRETUZUMAB、LUPARTUMAB、LUTIKIZUMAB、MAFTIVIMAB、MAGROLIMAB、MAPATUMUMAB、MARGETUXIMAB、MARSTACIMAB、MASLIMOMAB、MATUZUMAB、MAVRILIMUMAB、MEPOLIZUMAB、METELIMUMAB、MILATUZUMAB、MINRETUMOMAB、MIRIKIZUMAB、MIRVETUXIMAB、MITAZALIMAB、MITUMOMAB、MODOTUXIMAB、MOGAMULIZUMAB、MONALIZUMAB、MOROLIMUMAB、MOSUNETUZUMAB、MOTAVIZUMAB、MURLENTAMAB、NACOLOMAB、NAMILUMAB、NAPTUMOMAB、NARATUXIMAB、NARNATUMAB、NATALIZUMAB、NAVICIXIZUMAB、NAVIVUMAB、NAXITAMAB、NEBACUMAB、NEMOLIZUMAB、NERELIMOMAB、NESVACUMAB、NETAKIMAB、NIDANILIMAB、NIMACIMAB、NIMOTUZUMAB、NIRSEVIMAB、NIVOLUMAB、OBEXELIMAB、OBILTOXAXIMAB、OBINUTUZUMAB、OCARATUZUMAB、ODULIMOMAB、OFATUMUMAB、OLECLUMAB、OLENDALIZUMAB、OLINVACIMAB、OLOKIZUMAB、OMALIZUMAB、OMBURTAMAB、ONARTUZUMAB、ONTAMALIMAB、ONTUXIZUMAB、ONVATILIMAB、OPICINUMAB、OREGOVOMAB、ORILANOLIMAB、ORTICUMAB、OSOCIMAB、OTELIXIZUMAB、OTILIMAB、OTLERTUZUMAB、OXELUMAB、OZANEZUMAB、OZORALIZUMAB、PAGIBAXIMAB、PALIVIZUMAB、PAMREVLUMAB、PANITUMUMAB、PANOBACUMAB、PARSATUZUMAB、PASCOLIZUMAB、PASOTUXIZUMAB、PATECLIZUMAB、PATRITUMAB、PEMBROLIZUMAB、PEPINEMAB、PERAKIZUMAB、PERTUZUMAB、PEXELIZUMAB、PIDILIZUMAB、PINATUZUMAB、PLACULUMAB、PLAMOTAMAB、PLOZALIZUMAB、POLATUZUMAB、PONEZUMAB、PORGAVIXIMAB、POZELIMAB、PRASINEZUMAB、PREZALUMAB、PRILIXIMAB、PRITOXAXIMAB、PRITUMUMAB、PROLGOLIMAB、QUETMOLIMAB、QUILIZUMAB、RACOTUMOMAB、RADRETUMAB、RAFIVIRUMAB、RALPANCIZUMAB、RANEVETMAB、RANIBIZUMAB、RAVAGALIMAB、RAXIBACUMAB、REFANEZUMAB、REGAVIRUMAB、RELATLIMAB、RELFOVETMAB、REMTOLUMAB、RESLIZUMAB、RILOTUMUMAB、RINUCUMAB、RITUXIMAB、RIVABAZUMAB、ROBATUMUMAB、ROLINSATAMAB、ROMILKIMAB、RONTALIZUMAB、ROSMANTUZUMAB、ROVALPITUZUMAB、ROZANOLIXIZUMAB、SACITUZUMAB、SAMALIZUMAB、SAMROTAMAB、SARILUMAB、SATRALIZUMAB、SATUMOMAB、SECUKINUMAB、SELICRELUMAB、SEMORINEMAB、SERCLUTAMAB、SERIBANTUMAB、SETOXAXIMAB、SETRUSUMAB、SIBROTUZUMAB、SIFALIMUMAB、SIMTUZUMAB、SINTILIMAB、SIRTRATUMAB、SIRUKUMAB、SOFITUZUMAB、SOLANEZUMAB、SOLITOMAB、SONTUZUMAB、SPARTALIZUMAB、SPESOLIMAB、STAMULUMAB、SULESOMAB、SUPTAVUMAB、SUTIMLIMAB、SUVIZUMAB、SUVRATOXUMAB、TABALUMAB、TABITUXIMAB、TADOCIZUMAB、TAFASITAMAB、TALACOTUZUMAB、TALIZUMAB、TAMRINTAMAB、TAMTUVETMAB、TANEZUMAB、TAPLITUMOMAB、TAREXTUMAB、TAVOLIMAB、FANOLESOMAB、NOFETUMOMAB、PINTUMOMAB、TECLISTAMAB、TEFIBAZUMAB、TELIMOMAB、TELISOTUZUMAB、TEMELIMAB、TENATUMOMAB、TENELIXIMAB、TEPLIZUMAB、TEPODITAMAB、TEPROTUMUMAB、TESIDOLUMAB、TEZEPELUMAB、TIBULIZUMAB、TIDUTAMAB、TIGATUZUMAB、TILAVONEMAB、TILDRAKIZUMAB、TIMOLUMAB、TIRAGOLUMAB、TISLELIZUMAB、TISOTUMAB、TOCILIZUMAB、TOMARALIMAB、TORALIZUMAB、TORIPALIMAB、TOSATOXUMAB、TOSITUMOMAB、TOVETUMAB、TRALOKINUMAB、TRASTUZUMAB、TREGALIZUMAB、TREMELIMUMAB、TREVOGRUMAB、TUCOTUZUMAB、TUVIRUMAB、UBLITUXIMAB、ULOCUPLUMAB、URELUMAB、URTOXAZUMAB、USTEKINUMAB、UTOMILUMAB、VADASTUXIMAB、VANDORTUZUMAB、VANTICTUMAB、VANUCIZUMAB、VAPALIXIMAB、VARISACUMAB、VARLILUMAB、VATELIZUMAB、VELTUZUMAB、VEPALIMOMAB、VESENCUMAB、VIBECOTAMAB、VISILIZUMAB、VOBARILIZUMAB、VOFATAMAB、VOLAGIDEMAB、VOLOCIXIMAB、VONLEROLIZUMAB、VOPRATELIMAB、VORSETUZUMAB、VOTUMUMAB、VUNAKIZUMAB、XENTUZUMAB、ZALIFRELIMAB、ZAMPILIMAB、ZANOLIMUMAB、ZENOCUTUZUMAB、ZIRALIMUMAB、ZOLBETUXIMAB、ZOLIMOMAB构建而成的小规模抗体库。

在本发明中，术语“独特型”是抗体工程学专业概念。抗体作为机体分子识别的最重要效应分子，具有不均一性的特点。不均一性包括同种型、同种异型和独特型。其中，独特型(idiotype)的概念是指每一个抗体形成细胞克隆所产生的抗体分子上所有的抗原特异性，是由轻链或重链可变区氨基酸序列的不同所决定的，因此与抗体结合抗原的特异性密切相关。独特型强调的是抗体结合抗原的特性区别。由于synNotch受体、嵌合抗原受体识别抗原的特性基础即为其内部的抗体结构，所以这些人工受体也具有“独特型”。

关于Notch核心调节结构域文库，其来源包括但不限于来自人Notch基因(UniProtKB:P46531；Q04721；Q04721；Q99466)、小鼠Notch基因(UniProtKB:Q01705；P31695；O35516；Q61982)；大鼠Notch基因(UniProtKB:Q07008；Q9QW30；Q9R172)、斑马鱼Notch基因(UniProtKB:P46530)、果蝇Notch基因(UniProtKB:P07207)。

关于合成性的胞内转录结构域文库，其来源包括但不限于TetR-VP64(tTA)、Gal4-VP64、PIP-VP64、ZF21-16-VP64、ZF-42-10-VP64、ZF43-8-VP64、ZF54-8-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB、TetR-KRAB、PIP-KRAB、ZF21-16-KRAB、ZF-42-10-KRAB、ZF43-8-KRAB、ZF54-8-KRAB、ZFHD1-KRAB中的任意一种或至少两种的组合。

第二基因元件中，术语“基因回路”是合成生物学概念。广义上讲，基因回路内包含由调节性的顺式作用因子和被调节基因组成。调节性的顺式作用因子包括启动子等，如T7启动子、CMV启动子、UPS启动子、Tet启动子等。被调节基因多为编码蛋白质的基因。可以根据研究目的灵活的进一步设计多个顺式作用因子，多个调节基因(此时调节基因可以进一步设计为反式作用因子，如转录因子等)的复杂调控网络，如同电路网络一般，故称为“基因回路”或“基因电路”。

在本发明中，如提到基因回路是“独特型”意味着包含不同的设计编程方案方案组成的基因回路。例如，两个“独特型”基因回路可以实现完全一样的生物学效应(如控制某个下游基因表达上调，或控制某个下游基因表达下调)，然而，基因回路的多个内部顺式作用因子、多个调节基因(可以为转录因子)设计构建的形式彼此不同的情况下是“独特型”。相反，如本文中使用，相同基因回路内部顺式作用因子、多个调节基因(可以为转录因子)设计构建方案相同，仅仅在同源序列的范畴的突变并不影响顺式作用因子和调节基因的功能的变化不是“独特型”基因回路。基因回路的构建方法可以这些公开发表的文献：Kulemzin SV,et al.BMC Medical Genomics,2019,12(S2).；Uchibori R,et al.MolecularTherapy—Oncolytics,2019,12:16-25；Morsut L,et al.Cell,2016,164(4):780-791.；Deuschle U,Meyer W K,Thiesen H J.Molecular and Cellular Biology,1995,15(4):1907-1914.；杨子杰,等.生物工程学报,2018,34(12):1886–1894.；Fussenegger M,etal..Nature Biotechnology,2000,18(11):1203-1208；Pomerantz J,Sharp P,PaboC.Science,1995,267(5194):93-96.；朱凯川,等.中国生物工程杂志,2011,31(1):81-85.Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.S.C.Makrides ELSEVIER2003，不再赘述。

调节性的顺式作用因子包括单个顺势作用因子或融合式顺势作用因子，被调节基因包括单个转录因子或组合式转录因子。

单个顺势作用因子包括一个或多个NFAT反应启动子元件(NFAT-responsivepromoter element，NFAT)、一个或多个NFκB反应启动子元件(NFκB-responsive promoterelement，NFκB)、一个或多个四环素反应元件(tetracycline responsive element,TRE)、一个或多个半乳糖代谢酶系(GAL)基因启动子的UAS(upstream activating sequence，UAS)、一个或多个PIP反应元件(PIP responsive element，PIR)、一个或多个ZFHD1反应元件(ZFHD1 responsive element，ZFHD1RE)、一个或多个ZF21-16反应元件(ZF21-16responsive element，ZF21-16RE)、一个或多个ZF42-10反应元件(responsive element，ZF42-10RE)、一个或多个ZF43-8反应元件(responsive element，ZF43-8RE)、一个或多个ZF54-8反应元件(responsive element，ZF54-8RE)、一个或多个最小化CMV启动子(minimalCMV promoter,P_CMV-min)、一个或多个CMV启动子(CMV promoter，P_CMV)、一个或多个SV40启动子(SV40 promoter，P_SV40)、一个或多个最小化IL-2启动子(minimal IL-2promoter，P_IL-2min)、一个或多个最小化昆虫热休克蛋白70启动子(minimal insect heat shock 70promoter，P_hsp70min)、一个或多个最小化HIVtata启动子(minimal HIVtata promoter，P_HIVtatamin)中的任意一种或至少两种的组合。

融合式顺势作用因子包括4个NFAT反应元件和最小化IL-2启动子融合而成(4×NFAT)、6个NFAT反应元件和最小化IL-2启动子融合而成(6×NFAT)、其包括5个NFκB结合原件和最小化HIVtata启动子融合而成(5×NFκB)、10个NFκB结合原件和最小化HIVtata启动子融合而成(10×NFκB)、7个TRE和最小化CMV启动子融合而成(7×TRE-P_CMV-min)、5个UAS和最小化CMV启动子融合而成(5×UAS-P_CMV-min)、4个PIR和最小化CMV启动子融合而成(4×PIR-P_CMV-min)、8个PIR和最小化CMV启动子融合而成(8×PIR-P_CMV-min)、8个PIR和昆虫热休克蛋白70启动子融合而成(8×PIR-P_hsp70min)、4个ZFHD1RE和最小化CMV启动子融合而成(4×ZFHD1RE-P_CMV-min)、8个ZF21-16RE和最小化CMV启动子融合而成(8×ZF21-16RE-P_CMV-min)、8个ZF42-10RE和最小化CMV启动子融合而成(8×ZF42-10RE-P_CMV-min)、8个ZF43-8RE和最小化CMV启动子融合而成(8×ZZF43-8R-P_CMV-min)、8个ZF54-8RE和最小化CMV启动子融合而成(8×ZF54-8RE-P_CMV-min)、7个TRE和SV40启动子融合而成(7×TRE-P_SV40)、7个TRE和CMV启动子融合而成(7×TRE-P_cmv)、5个UAS和SV40启动子融合而成(5×UAS-P_SV40)、4个PIR和SV40启动子融合而成(4×PIR-P_SV40)、8个PIR和SV40启动子融合而成(8×PIR-P_SV40)、4个ZFHD1RE和SV40启动子融合而成(4×ZFHD1RE-P_SV40)、8个ZF21-16RE和SV40启动子融合而成(8×ZF21-16RE-P_SV40)、8个ZF42-10RE和SV40启动子融合而成(8×ZF42-10RE-P_SV40)、8个ZF43-8RE和SV40启动子融合而成(8×ZZF43-8RE-P_SV40)、8个ZF54-8RE和SV40启动子融合而成(8×ZF54-8RE-P_SV40)中的任意一种或至少两种的组合。

组合式转录因子包括TetR-VP64(tTA)、Gal4-VP64、PIP-VP64、ZF21-16-VP64、ZF-42-10-VP64、ZF43-8-VP64、ZF54-8-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB、TetR-KRAB、PIP-KRAB、ZF21-16-KRAB、ZF-42-10-KRAB、ZF43-8-KRAB、ZF54-8-KRAB、ZFHD1-KRAB中的任意一种或至少两种的组合。优选包括TetR-VP64(tTA)、Gal4-VP64、Gal4-KRAB、TetR-KRAB中的任意一种或至少两种的组合。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因回路优选包括(i)Gal4-KRAB和5×UAS-P_SV40的组合、TetR-KRAB和7×TRE-P_SV40的组合或TetR-KRAB和7×TRE-P_cmv的组合中的任意一种和(ii)4×NFAT、6×NFAT、5×NFκB、10×NFκB中的任意一种组合而成。

第三基因元件中的术语“嵌合抗原受体”是免疫治疗学概念，是模仿免疫细胞激活过程构建的人工受体。嵌合抗原受体包含多个免疫受体的部分，目的是设计一种无需任何帮助就能识别抗原(如BCR)，然后直接杀死被识别的细胞(如TCR)的受体。

本发明第三基因元件的嵌合抗原受体针对的靶点包括CD19、BCMA、Mesothelin、GD2、EGFR、HER2、CD22、CD123、Glypican 3、CD30、MUC1、CD33、CD20、CD38、EpCAM、CD56、CD138、CD7、CD133、CEA、CD34、CD117、Claudin18.2、PSCA、cMET、Lewis Y、EphA2、NKG2Dligands、ErbB、NY-ESO-1、CLL-1、CD10、LI13Rα2、CD171、ROR2、AXL、Kappa、CS1、FAP、IL-1RAP、MG7、PSMA、CD5、ROR1、CD70、HER3、Gp75、磷脂酰丝氨酸、cMyc、CD4、CD44v6、CD45、CD28、CD3、CD3e、CD52、CD74、CD30、CD166、CD24、EGFR/HER3融合物、碳水化合物、曲霉、Dectin、埃博拉、真菌、GP、HERV-K、VEGF-R2、TGF-b2R、IgG4、生物素、O-AcGD2、Cadherin 2、OB-cadherin、α5β1 integrin、αVβ6 integrin、Syndecan-1、Cadherin 1、Claudin 12、Claudin7、Claudin 3、ZO-1中的任意一种或至少两种的组合。

嵌合抗原受体的结构是本领域的通用技术，包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外识别结构域(细胞外识别结构域文库)。跨膜结构域还包含位于细胞外识别结构域和跨膜结构域之间的铰链区，以及位于跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间的一种或多种另外的共刺激分子。

细胞内信号传导结构域包含CD3ζ；跨膜结构域包括：CD28跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域中的任意一种；共刺激分子包括：CD28、CD27、OX40、4-1BB中的任意一种或至少两种的组合；细胞外识别结构域的结构包括但不限于完整的抗体、组成抗体的链(重链或轻链)、抗体的片段(抗体可变区、单链抗体、单域抗体、Fab段)所构成的文库，优选单链抗体(ScFv)文库，其来源与synNotch受体中的胞外识别结构域文库的来源相同。

胞外识别结构域文库包括健康人来源的单链抗体文库、人工合成来源的单链抗体文库、羊驼来源的单域抗体文库或健康人来源的单链抗体文库扣除受试者外周单核细胞表达抗原后形成的亚文库。在本发明的一些具体的实施例中，胞外抗体文库还包括健康人来源的单链抗体文库扣除受试者外周单核细胞表达抗原、癌旁抗原后形成的亚文库。

相应的，嵌合抗原受体文库的来源包括但不限于来自动物、来自免疫动物制备、来自疾病人群、来自健康人群、接种过疫苗的人群、人工合成、基因工程制备中的任意一种或至少两种的组合，还包括上述来源的文库经过现有技术预处理后的亚文库，如非专利文献[尹长城,等.中国生物工程杂志,2008,28(12):82-88.]中所述的去除背景克隆后形成的亚文库。

胞外识别结构域文库可以利用抗体工程方法进一步优化，该抗体工程方法包括抗体亲和力成熟技术、抗体人源化技术、抗体动物源化技术、多功能抗体技术、多特异性抗体技术中的任意一种或至少两种的组合。其中，亲和力成熟技术包括热点定点突变、热点随机突变、CDR突变、链交换、依据三维结构的抗体突变中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中嵌合抗原受体的结构以及嵌合抗原受体文库的构建方法可以有多种构建组合，并可以均构建在本发明的元件内，以实现随机化，参见专利文献WO2015/123642。

第四基因元件种的筛选标记蛋白包括药物抗性蛋白、自杀蛋白、荧光蛋白或分子标签蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，药物抗性蛋白包括嘌呤霉素抗性蛋白、新霉素抗性蛋白、杀稻瘟素抗性蛋白或潮霉素B抗性蛋白中的任意一种或至少两种的组合；自杀蛋白包括单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因或iCasp9自杀系统基因中的任意一种或至少两种的组合；荧光蛋白包括EGFP、YFP、mCherry、DsRed或BFP中的任意一种或至少两种的组合；分子标签蛋白包括His-tag、Flag-tag、HA-tag、Myc-tag、Sun-tag或Strep-tag中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中的一些实施例中，多个第一基因元件编码多个独特的synNotch受体，多个第二基因元件构建为多种独特的基因回路，多个第三元件编码多个独特的嵌合抗原受体，并且多个第四元件编码多个筛选标记蛋白。在一些实施方案中，多个第一基因元件编码一个独特的synNotch受体，多个第二基因元件构建为多种独特的基因回路，多个第三元件编码多个独特的嵌合抗原受体，并且多个第四元件编码多个独特的筛选标记蛋白。在一些实施方案中，在一些实施方案中，多个第一基因元件编码多个独特的synNotch受体，多个第二基因元件构建为一种独特的基因回路，多个第三元件编码多个独特的嵌合抗原受体，并且多个第四元件编码多个独特的筛选标记蛋白。在一些实施方案中，多个第一基因元件编码多个独特的synNotch受体，多个第二基因元件构建为多种独特的基因回路，多个第三元件编码一个独特的嵌合抗原受体，并且多个第四元件编码多个独特的筛选标记蛋白。在一些实施方案中，多个第一基因元件编码多个独特的synNotch受体，多个第二基因元件构建为多种独特的基因回路，多个第三元件编码多个独特的嵌合抗原受体，并且多个第四元件编码一个独特的筛选标记蛋白。

因此，本发明所述基因元件组合包含编码不同synNotch受体基因元件(根据现有技术，所述的synNotch受体就独特的胞外识别结构域、Notch核心调节结构域和/或合成性的胞内转录结构域而言也可以是随机化的，如专利文献CN109180805A、CN109576292A和非专利文献Morsut,et al.2016等)、载有不同基因回路的元件、编码不同的嵌合抗原受体、和/或编码不同筛选标记蛋白的元件的集合，所述元件集合编码多个独特的synNotch受体、载有多个独特的基因回路、编码多个独特的嵌合抗原受体、和/或编码多个独特的筛选标记蛋白。所述集合就所述基因元件而言是随机化的。

进一步的，本发明的涉及基因元件组合文库，所述基因元件组合文库是包含不同基因元件组合的文库，所述文库就独特的synNotch受体(根据现有技术，所述的synNotch受体就独特的胞外识别结构域、Notch核心调节结构域和/或合成性的胞内转录结构域而言也可以是随机化的，如专利文献CN109180805A、CN109576292A和非专利文献Morsut,etal.2016等)、基因回路、嵌合抗原受体、筛选标记蛋白而言是随机化的。在一些实施方案中，所述文库就独特的synNotch受体、基因回路、嵌合抗原受体和筛选标记蛋白中的任意一种或至少两种的组合而言随机化。

本发明的第二方面，提供了载有上述基因元件组合的人工细胞文库的制备方法。

简言之，将第一基因元件、第二基因元件、第三基因元件、第四基因元件插入同一载体或不同载体，转染至细胞内，得到细胞文库，即得所述人工细胞文库。

载体是本领域技术人员所熟悉的技术，如参考非专利文献中的病毒载体[MorsutL,et al.Cell,2016,164(4):780-791.]和非病毒载体[Athanasopoulos T,etal..Hematology/Oncology Clinics of North America,2017,31(5):753-770.]，还可以将基因元件插入特定位点如AAVS1位点的载体(Parthiban K,et al.mAbs.Taylor&Francis,2019.)。

转染的方法包括病毒转染、化学转染试剂转染或电击转染中的任意一种或至少两种的组合。

细胞是哺乳动物细胞，优选为免疫细胞，包括免疫细胞和/或基因工程化的免疫细胞。免疫细胞的来源包括自体免疫细胞、供体免疫细胞、健康志愿者的免疫细胞的任意一种或至少两种的组合。更优选为T淋巴细胞，特别优选NK细胞，如NK-92细胞。

具体的构建步骤举例如下：

A、抗体库制备及背景扣除

利用健康志愿者来源、全合成方法、基因工程方法建立抗体基因文库。基因工程方法举例如下：利用健康志愿者来源、全合成方法等建立抗体基因文库，选择噬菌体、酵母或哺乳动物细胞进一步建立抗体展示库，并选取对照组织，经过多轮淘选扣除背景，获取抗体展示亚库，然后以PCR方法获取扣除背景的抗体基因文库；

B、基因元件构建

构建第一基因元件，其结构包含抗体库-synNotch，构建第二基因元件，包含一种或多种调节性顺势作用因子、和/或一种或多种转录因子；构建第三基因元件，其结构包含抗体库-CAR，所述抗体库或抗体亚库被构建为synNotch受体、CAR受体的胞外识别结构域；构建第四基因元件，包含筛选标记蛋白基因，而后将上述四个基因元件构建到一种或多种基因控制表达盒中；

C、基因元件导入细胞

采用慢病毒载体系统将上述基因控制表达盒导入哺乳动物免疫细胞内，得到受体细胞文库；

又如，A、噬菌体单链抗体库制备及筛选

利用健康志愿者来源的或全合成方法建立噬菌体单链抗体库，以正常组织作为对照，经过多轮淘选扣除背景，获取噬菌体抗体亚库，然后以PCR方法获取抗体基因文库。

B、基因元件构建

构建第一基因元件，其结构包含单链抗体库-synNotch，所述单链抗体库被构建为synNotch的胞外识别结构域；构建第二基因元件，包含第一个调节性顺势作用因子、以及受该调节性顺势作用因子调控的转录因子、受转录因子调控的第二个顺势作用因子；构建第三基因元件，其结构包含单链抗体库-CAR，所述单链抗体库被构建为CAR的胞外识别结构域；构建第四基因元件，包含筛选标记蛋白基因，而后将上述四个基因元件构建到一个或多个基因控制表达盒中。

C、基因元件导入细胞

采用慢病毒载体系统将上述基因控制表达盒导入哺乳动物免疫细胞内，得到人工受体细胞文库。

本发明的第三方面，提供一种人工细胞文库

该细胞文库携带第一方面所述的基因元件组合并通过第二方面的制备方法获取。

本发明的第四方面，提供一种筛选针对体外抗原的人工细胞的方法，包括如下步骤：

(1)将人工受体细胞文库与抗原接触；(2)根据自杀蛋白表达的情况，实施筛选；(3)回收表达目的人工受体细胞。

优选的，还包括以下步骤：

(4)从步骤(3)中筛选获得的人工受体细胞中，利用抗体工程方法重新构建次级人工受体细胞文库；(5)重复步骤(1)-(3)，筛选目标人工受体细胞，必要时一次或多次重复步骤(4)-(5)。

其中，人工受体细胞包括单克隆的人工受体细胞和多克隆的人工受体细胞群。

所述的“单克隆”和“多克隆”也包括就第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体，第四元件编码筛选标记蛋白而言的，即包括单克隆的第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体和多克隆的第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体，以及第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体的合集。

抗原包括野生型细胞、转染特定抗原基因的细胞、结合特定抗原的细胞、溶解在培养基中的抗原、包被在培养器皿上的抗原、包被在微珠上的抗原或包被在培养支架上的抗原中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，筛选人工细胞的方法是将人工细胞文库与体外抗原接触，只有能识别抗原的人工细胞，才会根据细胞内预编程的基因回路调控嵌合抗原受体、和/或筛选标记蛋白的表达，包括激活表达、增强表达、终止表达、抑制表达中的任意一种或至少两种的组合。根据嵌合抗原受体和/或筛选标记蛋白的表达情况，选择合适的筛选方法，然后筛选出目标人工细胞。可以根据基因回路、嵌合抗原受体、和/或筛选标记蛋白灵活进行设计，达到筛选目的。

在本发明的一些具体的实施例中，还包括以下筛选方法：

筛选标记蛋白的筛选方法包括药物筛选、流式细胞仪检测并分选、磁珠分选、beads分选中的任意一种或至少两种的组合；药物抗性蛋白的筛选药物包括嘌呤霉素、G418、杀稻瘟素或潮霉素B中的任意一种；自杀蛋白的筛选药物包括更昔洛韦或FIAU、5-氟胞嘧啶、AP1903或AP20187中的任意一种或至少两种的组合。

本发明的第五方面，提供了一种筛选针对体内抗原的人工受体细胞的方法，包括如下步骤：(1)给实验目的受试者施用有效量人工受体细胞文库，使之与体内抗原接触；(2)根据自杀蛋白表达的情况，实施筛选方法；(3)从受试者体内利用通用方法回收富集获得目的人工受体细胞。

优选的，还包括以下步骤：(4)从步骤(3)中筛选获得的人工受体细胞中，利用抗体工程和/或基因工程方法重新构建次级人工受体细胞文库；(5)重复步骤(1)～(3)，筛选目标人工受体细胞，必要时一次或多次重复步骤(4)-(5)。

其中，所述人工细胞包括单克隆的合成细胞和多克隆的合成细胞群。

所述的“单克隆”和“多克隆”也包括就第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体，第四元件编码筛选标记蛋白而言的，即包括单克隆的第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体和多克隆的第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体，以及所述第一基因元件编码的synNotch受体、第二基因元件构建的基因回路，第三元件编码的嵌合抗原受体的合集。

体内抗原指存在于人及动物活体内的抗原，包括在体细胞、在体病灶细胞、转染特定抗原基因的在体细胞、感染特定病原体的在体细胞、结合特定抗原的在体细胞、移植在动物模型上的在体细胞中的任意一种或至少两种的组合。

将人工细胞文库与体内抗原接触的方法一般包括向体内施用所述的人工细胞文库。施用的方法包括静脉输入、经胃肠道输入、肌肉注射、组织局部注射、皮下注射、腹腔注射、吸入中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，筛选合成体细胞的方法是将合成体细胞文库施用于目的受试者，使得合成体细胞文库与体内抗原接触，只有能识别抗原的人工细胞，才会根据细胞内预编程的基因回路调控嵌合抗原受体、和/或筛选标记蛋白的表达，包括激活表达、增强表达、终止表达、抑制表达中的任意一种或至少两种的组合。根据嵌合抗原受体和/或筛选标记蛋白的表达情况，选择合适的筛选方法，然后筛选出目标人工细胞。可以根据基因回路、嵌合抗原受体、和/或筛选标记蛋白灵活进行设计，达到筛选目的。

在本发明的一些具体的实施例中，采取以下筛选技术手段：

本发明的第六方面，提供了一种人工受体细胞。该人工受体细胞由第四方面以及第五方面所述的方法筛选得到，该人工受体细胞包括单克隆的人工受体细胞和多克隆的人工受体细胞。

本发明的第七方面，提供一种人工合成受体。该人工合成受体是通过第六方面所述的人工受体细胞利用通用基因工程技术提取相关基因获得的。

本发明的第八方面，提供了一种抗体。所述抗体是通过第七方面所述的人工合成受体通用的抗体工程技术获得的。

本发明的第九方面，提供了靶点抗原。该靶点抗原是通过上述第六方面所述的人工受体细胞、第七方面所述、第八方面所述的抗体通过通用基因工程技术获得的对应抗原。

本发明的第十方面，提供了一种药物组合物。该组合物包含上述的第一方面所述人工受体细胞文库、第二方面构建获得的抗原受体细胞文库、第六方面所述人工受体细胞、第七方面所述人工合成受体、第八方面所述的抗体中的任意一种或至少两种的组合，和至少一种医学/药学上可接受的载体。此外，该药物组合物还包括医学或药学用途的稀释剂或赋形剂。

本发明的第十一方面，提供了上述药物组合物在包括预防、诊断和治疗需要去除疾病介质相关疾病药物、试剂、试剂盒用途中的任意一种或至少两种的组合。

在一些方面，所述疾病介质指病灶细胞。需要去除病灶细胞相关疾病如良恶性肿瘤、组织增生、急慢性炎症等疾病。疾病可以是例如肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢及附件、子宫、皮肤、肾、窦、结肠、直肠、食道、血液、大脑和其覆盖物、脊髓和其覆盖物、肌肉、结缔组织、肾上腺、副甲状腺、甲状腺、子宫、睾丸、垂体、生殖器、肝脏、胆囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴结和淋巴系统及其它器官的恶性肿瘤。在某些实施方式中，还包括这些器官的良性肿瘤。

在本发明中，术语“恶性肿瘤”包括人类癌、肉瘤和黑色素瘤的所有形式，它们以低度分化、适度分化、高度分化的形式出现。

所述疾病还包括组织增生、肥大、异位或过度增长，组织包括肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢及附件、子宫、皮肤、肾、窦、结肠、直肠、食道、血液、大脑和其覆盖物、脊髓和其覆盖物、肌肉、结缔组织、肾上腺、副甲状腺、甲状腺、子宫、睾丸、垂体、生殖器、肝脏、胆囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴结和淋巴系统及其它器官。

所述疾病还包括病毒、细菌或寄生虫改变的组织，组织包括肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢及附件、子宫、皮肤、肾、窦、结肠、直肠、食道、血液、大脑和其覆盖物、脊髓和其覆盖物、肌肉、结缔组织、肾上腺、副甲状腺、甲状腺、子宫、睾丸、垂体、生殖器、肝脏、胆囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴结和淋巴系统及其它器官。

所述疾病包括急慢性炎症引起的组织纤维化改变，组织包括肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢及附件、子宫、皮肤、肾、窦、结肠、直肠、食道、血液、大脑和其覆盖物、脊髓和其覆盖物、肌肉、结缔组织、肾上腺、副甲状腺、甲状腺、子宫、睾丸、垂体、生殖器、肝脏、胆囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴结和淋巴系统及其它器官。

所述疾病还包括子宫内膜异位症、扁桃体肥大、前列腺增生、银屑病、湿疹、皮肤病、痔、血管病如动脉粥样硬化或动脉硬化。或者是血管病如静脉曲张、动脉或支架的狭窄或重狭窄。

所述疾病还包括组织的整容修复，如皮肤、眼、耳、鼻、喉、口、肌肉、结缔组织、毛发或乳房组织的整容修复。

所述疾病还包括神经性衰退疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症等。

在一些方面，所述疾病介质指炎性介质。

在一些方法中，所述炎性介质包括：病毒、细菌或寄生虫等病原体、酶、细胞因子、前列腺素(prostaglandins)、类花生酸(eicosanoids)、自三烯类(Leukotrienes)、激肽类(kinins)、补体、凝血因子、毒素、内毒素、肠毒素、脂多糖、诱导细胞凋亡的物质、腐蚀性物质、胆汁盐、脂肪酸、磷脂、氧化副产物、活性氧簇、氧自由基、表面活性剂、离子、刺激性物质、细胞碎片、干扰素、以及免疫调节性抗体、生物制品(biologics)、药物中的任一种或至少两种的组合。在一些方面，所述炎性介质存在于受试者的生理性流体或载体流体中，所述生理性流体包括以下的流体：鼻咽、口腔、食道、胃、胰腺、肝、胸膜、心包、腹膜、肠、前列腺、精液、阴道分泌物、眼泪、唾液、粘液、胆汁、血液、淋巴、血浆、血清、滑液、脑脊液、尿，以及间隙、细胞内和细胞外的流体。

所述炎性介质相关性疾病包括：全身性炎性应答综合征(SIRS)或脓毒症(例如源自病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)、自身免疫病、外科手术、细胞毒性化疗、骨髓操作、大的组织损伤或外伤、肠系膜灌注不足、肠粘膜损伤、疟疾、胃肠道炎性疾病、肠道感染、宫腔感染、流行性感冒、急性肺炎如急性呼吸窘迫综合症或急性肺损伤、肺栓塞、胰腺炎、自身免疫和胶原血管病、输血相关疾病、烧伤、烟或吸入肺损伤、移植物抗宿主病、缺血或梗死、再灌注损伤、出血、过敏反应、药物过量、辐射损伤或化学损伤。在一些实施方案中，炎性介质由生物战的病原体、毒素或制剂导致的疾病产生，例如病毒性出血热、水母毒素等海洋毒素、登革热、埃博拉、汉坦病毒心肺综合征(汉坦病毒)、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、草麻毒素、Q热[博纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)]、斑痊伤寒症(Rickettsia prowaszekii)或鹦鹉热[鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)]。

所述炎性介质相关性疾病还包括：接受移植，免疫不孕等需要去除目的免疫因素的疾病。

相比现有技术，本发明的技术效果如下：

本发明中的人工细胞文库装载有四个基因元件，当第一基因元件编码的synNotch受体活化时，可以通过第二基因元件预编程的基因回路实现同时对第三基因元件的控制性表达，成功利用基因回路实现了synNotch文库和嵌合抗原受体文库的信息耦合。与单独的synNotch受体细胞文库和单独的嵌合抗原受体细胞文库对比，本发明中的人工细胞文库结合了SynNotch受体细胞文库高精度结合结合到细胞或组织上，实现抗体的筛选，甚至未知抗原的筛选、利于基因回路编程可以实现跟随抗原变化的优势，以及嵌合抗原受体文库能够制备大量可激活免疫细胞CAR进行异常细胞杀伤的优势，尤其适合制备个体化用途的药物、试剂、试剂盒，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为举例说明本发明所述人工细胞文库的结构、制备方法、体内筛选示意图，其中A为利用现有技术构建抗体库；B为对抗体库扣除背景；C为人工细胞文库的构建；D为施用于受试者，进行体内筛选；E为未能识别目的抗原的人工细胞清除；F为识别目的抗原的人工细胞存活。

图2为基因控制表达盒示意图：

A为UAS-αEpCAM.CAR-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒，5×UAS-PCMV-min启动子控制的CAR-2A-TerR-KRAB融合蛋白的表达，和7×TRE-PCMV启动子控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因。B为CMV-scFvlab-synNotch控制表达盒，其包含CMV启动子控制的synNotch受体，抗体库构建在synNotch胞外识别结构域，synNotch受体的胞内转录结构域为Gal4-VP64。C为抗CD19 synNotch受体。

图3为各组肿瘤组织抑制率。

图4为各组肿瘤组织抑制率。

图5为UAS-αEpCAM.CAR-IL-12-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒。其包含5×UAS-PCMV-min启动子控制的αEpCAM.CAR-IL12FLAG-2A-TerR-KRAB融合蛋白的表达，和7×TRE-PCMV启动子控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因。

图6为各组不同时间IL-2FLAG的表达水平。

图7为各组病理检测组织内的转移灶数量情况。

图8为基因控制表达盒示意图。A为UAS-CARlab-iCasp9-2A-GFP控制表达盒。其包含5×UAS-Psv40启动子控制的CAR文库基因和一个反向的NFAT反应元件启动子控制的抑制性转录因子。B为CMV-scFvlab-synNotch-VP64控制表达盒。其包含CMV启动子控制的synNotch受体，链抗体库构建在synNotch胞外识别区。反向的7×TRE-PCMV启动子控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因synNotch受体的胞内转录结构域为Gal4-VP64。C为抗CD19 synNotch受体。synNotch受体的胞内转录结构域为Gal4-KRAB。

图9为各组肿瘤组织抑制率。

图10为UAS-ctxCAR-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒。其包含ctxCAR-抑制性转录因子-TerR-KRAB融合蛋白的表达，嵌合抗原受体的scFv区域构建自单抗cetuximab,和7×TRE-PCMV启动子控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因。

图11为炎症性肠病各组病理评分。

图12为基因元件构建示意图，A-F为第一基因元件构建示意图，G-K为第二基因元件构建示意图。

图13为第三基因元件构建示意图

图14为载体组合示意图。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.合成细胞、装置、基因回路的构建方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold spring HarborLaboratory Press；Phage Display:A laboratory Manual,Cold spring HarborLaboratory Press。

实施例1.全合成鼠源synNotch受体细胞文库

文库的构建及筛选流程见图1：

(A)噬菌体抗体库构建：首先利用全合成方法建立全合成鼠源噬菌体单链抗体库。抗体库制备的方法是本领域普通技术的人员众所周知的，建立全合成鼠源噬菌体单链抗体库的方法同文献[Geuijen C et al..European Journal of Cancer,2005,41(1):178-187；Noronha E J,et al.Journal of Immunology,1998,161(6):2968-2976.]。经过库容量评估，所建立的全合成鼠源噬菌体单链抗体库库容量为1×10⁹。库容量评估的方法同文献[Ridgway J B B,et al.Cancer Research,2013,59(11):2718-2723]。

(B)背景剔除：将全合成鼠源噬菌体单链抗体库(1×10¹¹PFU)从尾静脉注射BALB/c小鼠，经过4轮筛选，去除能与小鼠组织结合的所有噬菌体。方法同文献[Wada,Akinori,etal.Molecular Therapy-Oncolytics 12(2019):138-146.]。新获取的噬菌体抗体库扩增检测库容无明显变化。然后以PCR方法获取抗体基因文库。

(C)人工受体细胞文库的构建

按照文献报道的方法[Srivastava S,et al..Cancer cell,2019,35(3):489-503.e8.]获取小鼠T淋巴细胞，依据synNotch受体结构设计方案构建基因回路(图2A，2B)。该基因回路包含两个基因控制表达盒：①如图2A所示的基因控制表达盒，命名为UAS-αEpCAM.CAR-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒。其包含5×UAS-P_CMV-min启动子控制的αEpCAM.CAR-2A-TerR-KRAB融合蛋白[Deuschle U,Meyer W K,Thiesen H J..Molecularand Cellular Biology,1995,15(4):1907-1914.]的表达，和7×TRE-P_CMV启动子[DeuschleU,Meyer W K,Thiesen H J.Molecular and Cellular Biology,1995,15(4):1907-1914.]控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因。iCasp9基因、自切割肽2A的构建方法同文献[Liu E,et al.Leukemia,2018,32(2):520.]。Anti-EpCAM scFv参考文献[ShivaniSrivastava,et al.2019 Mar 18；35(3):489-503.e8]利用慢病毒系统将UAS-αEpCAM.CAR-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒整合小鼠T淋巴细胞。利用流式细胞术分选成功整合的小鼠T淋巴细胞。②如图2B所示的基因控制表达盒，命名为CMV-scFvlab-synNotch。将上述鼠源噬菌体单链抗体库构建在synNotch胞外识别区。利用哺乳动物细胞基因组特定位点整合转染技术[Parthiban K,et al.mAbs.Taylor&Francis,2019.]，将CMV-scFvlab-synNotch基因控制表达盒插入T细胞的AVVS1位点。

该基因回路的预编程是：当synNotch受体结合抗原时，该基因回路编程表达αEpCAM.CAR，同时抑制iCasp9基因的表达，此时该细胞不受iCasp9诱导剂的诱导凋亡调控。αEpCAM.CAR识别抗原，发挥抗肿瘤作用。

获得的合成细胞文库命名为KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库，库容量为1×10⁶单克隆数。

(D)若要进行体内筛选，将适量以及适当浓度的细胞文库溶液施用于受试者；

(E)给予自杀基因iCasp9诱导剂，依据预编程基因回路，检测iCasp9基因的抑制表达情况，筛选出受iCasp9诱导剂的诱导凋亡调控的细胞，并将其作为未能识别目的抗原的人工受体细胞予以清除。

(F)根据体内iCasp9基因的抑制表达情况，筛选出不受iCasp9诱导剂的诱导凋亡调控的细胞，并进行回收。

实施例2.全合成鼠源synNotch受体细胞文库治疗乳腺癌

建立4T1小鼠原位乳腺癌模型。模型的建方法同文献[Paschall A V,Liu K.JoVE2016(114):e54040.]。当小鼠肿瘤体积平均达100mm³时将小鼠分为对照组，无关synNotch-T细胞组，KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组。synNotch-T细胞的受体阳性率标准化为40％。其中对照组给予PBS治疗，无关synNotch-T细胞组给予CD19-synNotch-T细胞治疗(基因控制表达盒如图2C)剂量为5×10⁶个细胞静脉注射，每2天注射一次，注射3次。KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组，剂量为5×10⁶个细胞静脉注射，细胞治疗均使用无血清的1640培养基稀释细胞。于治疗第2周各组均给予iCasp9诱导剂。5周治疗后测量肿瘤生长抑制比率。计算方法为：比值＝1-治疗组肿瘤平均体积/对照组肿瘤平均体积。结果如图3。结果显示KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组具有较强的肿瘤抑制效果。

实施例3.体内筛选靶向4T1乳腺癌的全合成鼠源synNotch受体细胞文库

将实施例2中的所有实验组在实验结束后处死小鼠，分离小鼠血液、肿瘤组织并用流式细胞术分离培养iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组的CAR阳性细胞。即完成体内筛选。

实施例4.靶向4T1乳腺癌细胞synNotch受体、抗体的发现制备

利用实施例3获得的synNotch受体T细胞(即人工细胞)，利用试剂盒提取T细胞基因组。设计引物利用PCR等基因工程通用技术获取其中的synNotch受体基因，即获取靶向4T1乳腺癌细胞的synNotch受体。进一步利用PCR获取单链抗体。通过基因工程抗体技术，将获取的单链抗体构建成鼠IgG2a，然后进行表达纯化。即获得靶向4T1乳腺癌细胞的抗体。

实施例5.4T1乳腺癌细胞靶点抗原鉴定

将实施例4中获取得抗体交联在琼脂糖beads上。将4T1乳腺癌细胞裂解物与交联抗体的beads孵育过夜。经过漂洗后此时抗体对应的集合抗原富集在beads上。将beads进行肽指纹鉴定，即获得靶点抗原。

实施例6.靶向4T1乳腺癌的全合成鼠源synNotch受体细胞治疗应用

将实施例3中各组获取的synNotch受体T细胞再次进行4T1小鼠原位乳腺癌治疗，各组治疗方式同实施例2。

当小鼠肿瘤体积平均达100mm³时将小鼠分为对照组，无关synNotch-T细胞组，iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组。synNotch-T细胞的受体阳性率标准化为40％。其中对照组给予PBS治疗，无关synNotch-T细胞组给予CD19-synNotch-T细胞治疗(基因控制表达盒如图2C)剂量为5×10⁶个细胞静脉注射，每2天注射一次，注射3次。iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组，剂量为5×10⁶个细胞静脉注射，细胞治疗均使用无血清的1640培养基稀释细胞。于治疗第2周各组均给予iCasp9诱导剂。5周治疗后测量肿瘤生长抑制比率。计算方法为：比值＝1-治疗组肿瘤平均体积/对照组肿瘤平均体积。结果如图4。结果显示靶向4T1的iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组具有较强的肿瘤抑制效果。

实施例7.全合成鼠源synNotch受体细胞文库检测小鼠乳腺癌转移

将实施例1中的如图2A所示的基因控制表达盒重新改造，如图5所示。然后按照如实施例1的方法构建合成细胞文库，简要如下：

首先利用全合成方法建立全合成鼠源噬菌体单链抗体库。建立全合成鼠源噬菌体单链抗体库的方法同文献。经过库容量评估，所建立的全合成鼠源噬菌体单链抗体库库容量为1×10⁹。将全合成鼠源噬菌体单链抗体库(1×10¹¹PFU)从尾静脉注射BALB/c小鼠，经过4轮筛选，去除能与小鼠组织结合的所有噬菌体，重新获取的噬菌体抗体库扩增检测库容无明显变化。然后以PCR方法获取抗体基因文库。获取小鼠T淋巴细胞。选择小鼠T淋巴细胞进一步制备细胞文库。依据synNotch受体结构设计方案构建基因回路(图2A，2B)。

该基因回路包含两个基因控制表达盒：①如图5所示的基因控制表达盒，命名为UAS-αEpCAM.CAR-IL-12-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒。其包含5×UAS-P_CMV-min启动子控制的αEpCAM.CAR-IL12FLAG-2A-TerR-KRAB融合蛋白(Deuschle U,Meyer W K,Thiesen H J.Molecular and Cellular Biology,1995,15(4):1907-1914.]的表达，和7×TRE-P_CMV启动子控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因。利用慢病毒系统将UAS-αEpCAM.CAR-IL-12-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒整合小鼠T淋巴细胞。利用流式细胞术分选成功整合的小鼠T淋巴细胞。②如图2B所示的基因控制表达盒，命名为CMV-scFvlab-synNotch。将上述鼠源噬菌体单链抗体库构建在synNotch胞外识别区。将CMV-scFvlab-synNotch基因控制表达盒插入T细胞的AVVS1位点。该基因回路的预编程是：当synNotch受体结合抗原时，该基因回路编程表达anti-EpCAMCAR并分泌IL-12FLAG，同时抑制iCasp9基因的表达，此时该细胞不受iCasp9诱导剂的诱导凋亡调控。IL-12本身可以激活巨噬细胞，增强细胞文库的抗肿瘤作用。IL-2融合FLAG标签，可以从血液中检测。

获得的细胞文库命名为为iCasp9-αEpCAM.CAR-IL12-synNotch-T文库。按照实施例2和实施例3的小鼠肿瘤治疗和体内筛选方法，获取针对4T1肿瘤的细胞文库，命名为4T1.KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-IL12-synNotch-T文库。

按照实施例1的方法建立4T1原位肿瘤模型，在50天后手术切除原位肿瘤，然后将小鼠分为对照组、无关synNotch-T细胞组、4T1.KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-IL12-synNotch-T文库1组、4T1.KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-IL12-synNotch-T文库2组。剂量为5×10⁶个细胞静脉注射，每2天注射一次，注射3次。每周检测小鼠血液IL-2-FLAG水平(图6)。4T1.KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-IL12-synNotch-T文库2组于第2周IL-2-FLAG检测后处死检测肺转移情况，其他组治疗四周后处死小鼠，检测肺转移情况(图7)。结果显示全合成鼠源synNotch受体细胞文库可以通过IL-2FLAG水平诊断和检测肺癌转移情况。

实施例8.天然全人synNotch受体NK-92细胞文库

首先制备利用300名健康志愿者外周单核细胞制备天然人来源的噬菌体单链抗体库。抗体库制备的方法是本领域普通技术的人员是众所周知，建立噬菌体单链抗体库的方法同文献[Ridgway J B B,et al.Cancer Research,2013,59(11):2718-2723)。经过库容量评估，所建立的噬菌体天然人单链抗体库库容量为1×10¹⁰。库容量评估的方法同文献[Ridgway J B B,et al.Cancer Research,2013,59(11):2718-2723)。

将噬菌体天然人单链抗体库(1×10¹²PFU)从尾静脉注射NSG小鼠，经过4轮筛选，去除能与小鼠组织结合的所有噬菌体，方法同文献[Wada,Akinori,et al.MolecularTherapy-Oncolytics 12(2019):138-146.]。重新获取的噬菌体抗体库扩增检测库容无明显变化。然后以PCR方法获取抗体基因文库。

选择NK-92细胞(

K,et al.Mol ecular therapy,2015,23(2):330-338.]进一步制备细胞文库。依据synNotch受体结构设计方案构建基因回路(图8A，8B)。

该基因回路包含两个基因控制表达盒：①如图8A所示的基因控制表达盒，命名为UAS-CARlab-iCasp9-2A-GFP控制表达盒。其包含5×UAS-P_sv40启动子控制的控制下的CAR文库基因，CAR文库的scFv文库为包含结合靶点CD19、BCMA、Mesothelin、GD2、EGFR、HER2、CD22、CD123、Glypican 3、CD30、MUC1、CD33、CD20、CD38、EpCAM、CD56、CD138、CD7、CD133、CEA、CD34、CD117、Claudin18.2、PSCA、cMET、Lewis Y、EphA2、NKG2D ligands、ErbB、NY-ESO-1、CLL-1、CD10、LI13Rα2、CD171、ROR2、AXL、Kappa、CS1、FAP、IL-1RAP、MG7、PSMA、CD5、ROR1、CD70、HER3、Gp75、磷脂酰丝氨酸、cMyc、CD4、CD44v6、CD45、CD28、CD3、CD3e、CD52、CD74、CD30、CD166、CD24、EGFR/HER3融合物、碳水化合物、曲霉、Dectin、埃博拉、真菌、GP、HERV-K、VEGF-R2、TGF-b2R、IgG4、生物素、O-AcGD2、Cadherin 2、OB-cadherin、α5β1 integrin、αVβ6integrin、Syndecan-1、Cadherin 1、Claudin 12、Claudin 7、Claudin 3、ZO-1的小规模文库；该控制表达盒还包含一个反向的NFAT反应元件启动子[Uchibori R,et al.MolecularTherapy-Oncolytics,2019,12:16-25.]控制的TerR-KRAB转录因子，该启动子包含6个NFAT反应原件和最小化白介素2(IL-2)启动子。利用慢病毒系统将UAS-CARlab-iCasp9-2A-GFP控制表达盒整合NK-92细胞。利用流式细胞术分选成功整合的NK-92细胞。②如图8B所示的基因控制表达盒，命名为CMV-scFvlab-synNotch-VP64。将上述天然人单链抗体库构建在synNotch胞外识别区。同时包含反向的7×TRE-P_CMV启动子控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因。利用哺乳动物细胞展示技术，将CMV-scFvlab-synNotch-VP64基因控制表达盒插入NK-92细胞的AVVS1位点。该基因回路的预编程是：当synNotch受体结合抗原时，基因回路激活CAR受体文库，当CAR受体也能同时活化时，则继续抑制下游iCasp9基因的表达，此时该细胞不受iCasp9诱导剂的诱导凋亡调控。

获得的全人synNotch受体NK-92细胞文库命名为CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库，库容量为1×10⁶单克隆数。

实施例9.体内筛选天然全人synNotch受体NK-92细胞文库

利用实施例8所述CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库进行本实施例。

利用病人来源的组织直接建立NSG小鼠荷瘤模型，即PDX。按照文献方法[Fu W,etal.Clinical Cancer Research,2019,25(9):2835-2847.]建立肺癌PDX模型L10，乳腺癌PDX模型B7，卵巢癌PDX模型OV3。当小鼠肿瘤体积平均达400mm³时将小鼠分为对照组，无关synNotch-NK92细胞组(anti-CD19 synNotch-NK92，包含基因控制表达盒如图8C)，CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库组。治疗剂量和方式同实施例1。于治疗第2周各组均给予iCasp9诱导剂。治疗第三周处死小鼠，分离小鼠血液和肿瘤组织并用流式细胞术检测其中的CAR阳性细胞。

分别从肺癌PDX模型L10，乳腺癌PDX模型B7，卵巢癌PDX模型OV3的CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库组分离获取CAR阳性表达细胞。即完成体内筛选。即获得针对肺癌L10、乳腺癌B7、卵巢癌OV3的嵌合抗原受体NK-92细胞文库。此时获得的人嵌合抗原受体NK-92细胞文库分别命名为L10-CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库、B7-CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库，OV3-CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库。库容量为6×10⁴单克隆数。

实施例11.靶向肿瘤组织的嵌合抗原受体NK-92细胞文库治疗小鼠荷瘤模型

利用实施例10所述的L10-CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库、B7-CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库，OV3-CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库进行本实施例。

利用病人来源的组织直接建立NSG小鼠荷瘤模型，即PDX。按照文献方法(Fu W,etal.Clinical Cancer Research,2019,25(9):2835-2847.]建立肺癌PDX模型L10，乳腺癌PDX模型B7，卵巢癌PDX模型OV3。当小鼠肿瘤体积平均达100mm³时将小鼠分为对照组，无关CAR-NK92细胞组(anti-CD19 CAR-NK92，包含基因控制表达盒如图8C)，体NK-92细胞文库组。治疗剂量和方式同实施例1。于治疗第2周各组均给予iCasp9诱导剂。5周治疗后测量肿瘤生长抑制比率。计算方法为：比值＝1-治疗组肿瘤平均体积/对照组肿瘤平均体积。结果如图9。结果显示靶向肿瘤组织的嵌合抗原受体NK-92细胞文库具有非常强的抗肿瘤抑制效果。

实施例12.个体化天然全人synNotch受体T细胞文库构建制备

利用实施例8中所述利用300名健康志愿者外周单核细胞制备天然人来源的噬菌体单链抗体库进行本实施例。经过库容量评估，所建立的噬菌体天然人单链抗体库库容量为1×10¹⁰。

取结肠癌受试者的外周单核细胞及手术获得的结肠癌癌旁组织作为对照细胞/组织，通过三次阴性筛选，去除噬菌体天然人单链抗体库中能与上述对照细胞/组织结合的噬菌体。重新获取的噬菌体抗体库扩增后以PCR方法获取抗体基因文库。此时检测扩容无明显变化。

取结肠癌受试者外周单核细胞进一步分离T淋巴细胞进一步制备细胞文库，据实施例1所述synNotch受体结构设计方案构建基因回路(图2A，2B)。

该基因回路包含两个基因控制表达盒：①如图10所示的基因控制表达盒，命名为UAS-ctxCAR-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒。其包含5×UAS-P_CMV-min启动子控制的ctxCAR-抑制性转录因子-TerR-KRAB融合蛋白的表达，嵌合抗原受体的scFv区域构建自单抗cetuximab(参考文献Fu W,et al.Nat Commun.2019 Sep 25；10(1):4355.)，和7×TRE-P_CMV启动子(Deuschle U,Meyer W K,Thiesen H J.Molecular and CellularBiology,1995,15(4):1907-1914.]控制下的iCasp9-2A-绿色荧光蛋白融合基因。利用慢病毒系统将UAS-ctxCAR-2A-TerR.KRAB-iCasp9-2A-GFP控制表达盒整合该受试者的T淋巴细胞。利用流式细胞术分选成功整合的T淋巴细胞。②如图2B所示的基因控制表达盒，命名为CMV-scFvlab-synNotch。将上述天然人来源单链抗体库构建在synNotch胞外识别区。利用慢病毒系统将CMV-scFvlab-synNotch整合该受试者的T淋巴细胞，利用流式细胞术分选成功整合的T淋巴细胞。

该基因回路的预编程是：当synNotch受体结合抗原时，该基因回路编程表达能结合EGFR的嵌合抗原受体，同时抑制iCasp9基因的表达，此时该细胞不受iCasp9诱导剂的诱导凋亡调控。嵌合抗原受体可以介导T细胞杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用。

获得的synNotch受体细胞文库命名为ctxCAR-iCasp9-synNotch-hT文库，库容量为6×10⁵单克隆数。

实施例13.个体化天然全人synNotch受体T细胞文用于人结肠癌免疫治疗

将上述ctxCAR-iCasp9-synNotch-hT文库静脉施用于实施例12所述的肺癌受试者。给药方式、剂量等按照细胞治疗通用的给药方法[Fry T J,et al.Nature medicine,2018,24(1):20.]

实施例14.全合成鼠源synNotch受体细胞文库治疗炎症性肠病小动物模型

利用实施例1中所述KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T细胞文库进行本实施例。

按照文献方法，利用BALB/c小鼠建立三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulphonicacid，TNBS)诱导结肠炎(即炎症性肠病模型)。模型制备和评估同文献[He C,et al..Gut,2015.]。将模型鼠分为为对照组，模型组，无关synNotch-T细胞组，KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T文库组。其中对照组不给予TNBS对照，其余各组在给予小剂量TNBS的同时给予治疗：给予PBS治疗，无关synNotch-T细胞组给予CD19-synNotch-T细胞治疗(基因控制表达盒如图2C)，剂量为5×10⁶个细胞静脉注射，每2天注射一次，注射3次。四周后进行病例评分，方法同文献。结果如图11，结果显示KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-synNotch-T细胞文库具有良好的治疗效果。

实施例15.靶向异位内膜的天然全人synNotch受体NK-92细胞文库体内筛选

利用实施例8所CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库进行本实施例。

按照文献中的建模方法(Masuda H,et al.N Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2007,104(6):1925-1930.]，将子宫内膜异位症受试者的异位子宫内膜移植至NOG小鼠体内。模型成功后将小鼠分为对照组，无关synNotch-NK92细胞(anti-CD19 synNotch-NK92(n＝30)，包含基因控制表达盒如图2C)，CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库组。治疗剂量和方式同实施例1。于治疗第2周各组均给予iCasp9诱导剂。5周治疗后处死小鼠，获取各组检查内膜。分离小鼠血液和异位内膜组织并用流式细胞术分离获取CARlab-iCasp9-synNotch-NK92文库处理组的CAR阳性表达细胞，即完成体内筛选。

实施例16.靶向异位内膜的天然全人synNotch受体T细胞文库构建制备

如实施例7中所述方法建立天然人来源的噬菌体单链抗体库，方法简述如下：首先制备利用300名健康志愿者外周单核细胞制备天然人来源的噬菌体单链抗体库。经过库容量评估，所建立的噬菌体天然人单链抗体库库容量为1×10¹⁰。

取子宫内膜异位症受试者的外周单核细胞及手术获得的原位子宫内膜组织作为对照细胞/组织，通过三次阴性筛选，去除噬菌体天然人单链抗体库中能与上述对照细胞/组织结合的噬菌体。重新获取的噬菌体抗体库扩增后以PCR方法获取抗体基因文库。此时检测扩容无明显变化。

取子宫内膜异位症受试者外周单核细胞进一步分离T淋巴细胞作进一步制备细胞文库，根据实施例1相同的方法构建synNotch受体和基因回路。基因回路的两个基因控制表达盒如图2所示。获得的靶向异位内膜的天然全人synNotch受体T细胞文库命名为endo-CARlab-iCasp9-synNotch-hT文库，库容量为3×10⁵单克隆数。

实施例17.靶向异位内膜的天然全人synNotch受体T细胞文库用于人子宫内膜异位症治疗

将上述endo-CARlab-iCasp9-synNotch-hT文库静脉施用于子宫内膜异位症受试者。给药方式、剂量等按照细胞治疗通用的给药方法[Fry T J,et al.Nature medicine,2018,24(1):20.]

实施例18.包含495个人工抗体的synNotch受体NK-92细胞文库

首先利用全合成方法建立单链抗体库。抗体库制备的方法是本领域普通技术的人员是众所周知。抗体库来源于以下495个单克隆抗体：ABAGOVOMAB、ABCIXIMAB、ABELACIMAB、ABITUZUMAB、ABREZEKIMAB、ABRILUMAB、ACTOXUMAB、ADALIMUMAB、ADECATUMUMAB、ADUCANUMAB、AFASEVIKUMAB、AFELIMOMAB、ALACIZUMAB、ALEMTUZUMAB、ALIROCUMAB、AMATUXIMAB、ANATUMOMAB、ANDECALIXIMAB、ANETUMAB、ANIFROLUMAB、ANRUKINZUMAB、APRUTUMAB、ASCRINVACUMAB、ASELIZUMAB、ATIDORTOXUMAB、ATINUMAB、ATOLTIVIMAB、ATOROLIMUMAB、AVELUMAB、AZINTUXIZUMAB、BALSTILIMAB、BAPINEUZUMAB、BASILIXIMAB、BAVITUXIMAB、BECTUMOMAB、BEDINVETMAB、BEGELOMAB、BELANTAMAB、BELIMUMAB、BEMARITUZUMAB、BERLIMATOXUMAB、BERSANLIMAB、BERTILIMUMAB、BESILESOMAB、BEVACIZUMAB、BIMAGRUMAB、BIMEKIZUMAB、BIRTAMIMAB、BIVATUZUMAB、BLESELUMAB、BLINATUMOMAB、BLONTUVETMAB、BLOSOZUMAB、BOCOCIZUMAB、BRAZIKUMAB、BRIAKINUMAB、BROLUCIZUMAB、BRONTICTUZUMAB、BUDIGALIMAB、BUROSUMAB、CABIRALIZUMAB、CAMIDANLUMAB、CAMRELIZUMAB、CANAKINUMAB、CANTUZUMAB、CAPLACIZUMAB、CAPROMAB、CARLUMAB、CAROTUXIMAB、CATUMAXOMAB、CEDELIZUMAB、CEMIPLIMAB、CENDAKIMAB、CERGUTUZUMAB、CERTOLIZUMAB、CETRELIMAB、CETUXIMAB、CIBISATAMAB、CINPANEMAB、CITATUZUMAB、CIXUTUMUMAB、CLAZAKIZUMAB、CLENOLIXIMAB、CLIVATUZUMAB、COBOLIMAB、CODRITUZUMAB、COFETUZUMAB、COLTUXIMAB、CONATUMUMAB、CONCIZUMAB、COSFROVIXIMAB、CRENEZUMAB、CRIZANLIZUMAB、CROTEDUMAB、CROVALIMAB、CUSATUZUMAB、DACETUZUMAB、DACLIZUMAB、DALOTUZUMAB、DAPIROLIZUMAB、DECTREKUMAB、DEMCIZUMAB、DENINTUZUMAB、DENOSUMAB、DEPATUXIZUMAB、DETUMOMAB、DEZAMIZUMAB、DILPACIMAB、DINUTUXIMAB、DIRIDAVUMAB、DISITAMAB、DOMAGROZUMAB、DONANEMAB、DORLIMOMAB、DOSTARLIMAB、DROZITUMAB、DULIGOTUZUMAB、DUPILUMAB、DUSIGITUMAB、DUVORTUXIZUMAB、ECROMEXIMAB、EDOBACOMAB、EDRECOLOMAB、EFALIZUMAB、EFUNGUMAB、ELDELUMAB、ELEZANUMAB、ELGEMTUMAB、ELIPOVIMAB、ELSILIMOMAB、EMACTUZUMAB、EMIBETUZUMAB、EMICIZUMAB、ENAPOTAMAB、ENAVATUZUMAB、ENFORTUMAB、ENLIMOMAB、ENOBLITUZUMAB、ENOKIZUMAB、ENOTICUMAB、ENSITUXIMAB、ENVAFOLIMAB、EPITUMOMAB、EPTINEZUMAB、ERLIZUMAB、ERTUMAXOMAB、ETIGILIMAB、ETOKIMAB、ETROLIZUMAB、EVINACUMAB、EXBIVIRUMAB、FARALIMOMAB、FARICIMAB、FARLETUZUMAB、FASINUMAB、FELVIZUMAB、FEZAKINUMAB、FICLATUZUMAB、FIGITUMUMAB、FIRIVUMAB、FLANVOTUMAB、FLETIKUMAB、FLOTETUZUMAB、FONTOLIZUMAB、FORALUMAB、FORAVIRUMAB、FRESOLIMUMAB、FROVOCIMAB、FRUNEVETMAB、FULRANUMAB、FUTUXIMAB、GALIXIMAB、GANCOTAMAB、GANITUMAB、GANTENERUMAB、GARADACIMAB、GARETOSMAB、GAVILIMOMAB、GEDIVUMAB、GEMTUZUMAB、GEVOKIZUMAB、GILVETMAB、GIMSILUMAB、GIRENTUXIMAB、GLEMBATUMUMAB、GLENZOCIMAB、GOLIMUMAB、GOSURANEMAB、IANALUMAB、IBRITUMOMAB、ICRUCUMAB、IDARUCIZUMAB、IERAMILIMAB、IFABOTUZUMAB、IGOVOMAB、ILADATUZUMAB、IMALUMAB、IMAPRELIMAB、IMCIROMAB、IMGATUZUMAB、INCLACUMAB、INDATUXIMAB、INDUSATUMAB、INEBILIZUMAB、INFLIXIMAB、INOLIMOMAB、INOTUZUMAB、INTETUMUMAB、APAMISTAMAB、DERLOTUXIMAB、IPILIMUMAB、IRATUMUMAB、ISATUXIMAB、ISCALIMAB、ISTIRATUMAB、IXEKIZUMAB、KELIXIMAB、LABETUZUMAB、LACNOTUZUMAB、LACUTAMAB、LADIRATUZUMAB、LAMPALIZUMAB、LANADELUMAB、LANDOGROZUMAB、LAPRITUXIMAB、LARCAVIXIMAB、LEBRIKIZUMAB、LEMALESOMAB、LENVERVIMAB、LENZILUMAB、LERDELIMUMAB、LERONLIMAB、LESOFAVUMAB、LETOLIZUMAB、LEVILIMAB、LEXATUMUMAB、LIBIVIRUMAB、LIFASTUZUMAB、LIGELIZUMAB、LILOTOMAB、LINTUZUMAB、LIRILUMAB、LODELCIZUMAB、LONCASTUXIMAB、LORVOTUZUMAB、LOSATUXIZUMAB、LUCATUMUMAB、LULIZUMAB、LUMILIXIMAB、LUMRETUZUMAB、LUPARTUMAB、LUTIKIZUMAB、MAFTIVIMAB、MAGROLIMAB、MAPATUMUMAB、MARGETUXIMAB、MARSTACIMAB、MASLIMOMAB、MATUZUMAB、MAVRILIMUMAB、MEPOLIZUMAB、METELIMUMAB、MILATUZUMAB、MINRETUMOMAB、MIRIKIZUMAB、MIRVETUXIMAB、MITAZALIMAB、MITUMOMAB、MODOTUXIMAB、MOGAMULIZUMAB、MONALIZUMAB、MOROLIMUMAB、MOSUNETUZUMAB、MOTAVIZUMAB、MURLENTAMAB、NACOLOMAB、NAMILUMAB、NAPTUMOMAB、NARATUXIMAB、NARNATUMAB、NATALIZUMAB、NAVICIXIZUMAB、NAVIVUMAB、NAXITAMAB、NEBACUMAB、NEMOLIZUMAB、NERELIMOMAB、NESVACUMAB、NETAKIMAB、NIDANILIMAB、NIMACIMAB、NIMOTUZUMAB、NIRSEVIMAB、NIVOLUMAB、OBEXELIMAB、OBILTOXAXIMAB、OBINUTUZUMAB、OCARATUZUMAB、ODULIMOMAB、OFATUMUMAB、OLECLUMAB、OLENDALIZUMAB、OLINVACIMAB、OLOKIZUMAB、OMALIZUMAB、OMBURTAMAB、ONARTUZUMAB、ONTAMALIMAB、ONTUXIZUMAB、ONVATILIMAB、OPICINUMAB、OREGOVOMAB、ORILANOLIMAB、ORTICUMAB、OSOCIMAB、OTELIXIZUMAB、OTILIMAB、OTLERTUZUMAB、OXELUMAB、OZANEZUMAB、OZORALIZUMAB、PAGIBAXIMAB、PALIVIZUMAB、PAMREVLUMAB、PANITUMUMAB、PANOBACUMAB、PARSATUZUMAB、PASCOLIZUMAB、PASOTUXIZUMAB、PATECLIZUMAB、PATRITUMAB、PEMBROLIZUMAB、PEPINEMAB、PERAKIZUMAB、PERTUZUMAB、PEXELIZUMAB、PIDILIZUMAB、PINATUZUMAB、PLACULUMAB、PLAMOTAMAB、PLOZALIZUMAB、POLATUZUMAB、PONEZUMAB、PORGAVIXIMAB、POZELIMAB、PRASINEZUMAB、PREZALUMAB、PRILIXIMAB、PRITOXAXIMAB、PRITUMUMAB、PROLGOLIMAB、QUETMOLIMAB、QUILIZUMAB、RACOTUMOMAB、RADRETUMAB、RAFIVIRUMAB、RALPANCIZUMAB、RANEVETMAB、RANIBIZUMAB、RAVAGALIMAB、RAXIBACUMAB、REFANEZUMAB、REGAVIRUMAB、RELATLIMAB、RELFOVETMAB、REMTOLUMAB、RESLIZUMAB、RILOTUMUMAB、RINUCUMAB、RITUXIMAB、RIVABAZUMAB、ROBATUMUMAB、ROLINSATAMAB、ROMILKIMAB、RONTALIZUMAB、ROSMANTUZUMAB、ROVALPITUZUMAB、ROZANOLIXIZUMAB、SACITUZUMAB、SAMALIZUMAB、SAMROTAMAB、SARILUMAB、SATRALIZUMAB、SATUMOMAB、SECUKINUMAB、SELICRELUMAB、SEMORINEMAB、SERCLUTAMAB、SERIBANTUMAB、SETOXAXIMAB、SETRUSUMAB、SIBROTUZUMAB、SIFALIMUMAB、SIMTUZUMAB、SINTILIMAB、SIRTRATUMAB、SIRUKUMAB、SOFITUZUMAB、SOLANEZUMAB、SOLITOMAB、SONTUZUMAB、SPARTALIZUMAB、SPESOLIMAB、STAMULUMAB、SULESOMAB、SUPTAVUMAB、SUTIMLIMAB、SUVIZUMAB、SUVRATOXUMAB、TABALUMAB、TABITUXIMAB、TADOCIZUMAB、TAFASITAMAB、TALACOTUZUMAB、TALIZUMAB、TAMRINTAMAB、TAMTUVETMAB、TANEZUMAB、TAPLITUMOMAB、TAREXTUMAB、TAVOLIMAB、FANOLESOMAB、NOFETUMOMAB、PINTUMOMAB、TECLISTAMAB、TEFIBAZUMAB、TELIMOMAB、TELISOTUZUMAB、TEMELIMAB、TENATUMOMAB、TENELIXIMAB、TEPLIZUMAB、TEPODITAMAB、TEPROTUMUMAB、TESIDOLUMAB、TEZEPELUMAB、TIBULIZUMAB、TIDUTAMAB、TIGATUZUMAB、TILAVONEMAB、TILDRAKIZUMAB、TIMOLUMAB、TIRAGOLUMAB、TISLELIZUMAB、TISOTUMAB、TOCILIZUMAB、TOMARALIMAB、TORALIZUMAB、TORIPALIMAB、TOSATOXUMAB、TOSITUMOMAB、TOVETUMAB、TRALOKINUMAB、TRASTUZUMAB、TREGALIZUMAB、TREMELIMUMAB、TREVOGRUMAB、TUCOTUZUMAB、TUVIRUMAB、UBLITUXIMAB、ULOCUPLUMAB、URELUMAB、URTOXAZUMAB、USTEKINUMAB、UTOMILUMAB、VADASTUXIMAB、VANDORTUZUMAB、VANTICTUMAB、VANUCIZUMAB、VAPALIXIMAB、VARISACUMAB、VARLILUMAB、VATELIZUMAB、VELTUZUMAB、VEPALIMOMAB、VESENCUMAB、VIBECOTAMAB、VISILIZUMAB、VOBARILIZUMAB、VOFATAMAB、VOLAGIDEMAB、VOLOCIXIMAB、VONLEROLIZUMAB、VOPRATELIMAB、VORSETUZUMAB、VOTUMUMAB、VUNAKIZUMAB、XENTUZUMAB、ZALIFRELIMAB、ZAMPILIMAB、ZANOLIMUMAB、ZENOCUTUZUMAB、ZIRALIMUMAB、ZOLBETUXIMAB、ZOLIMOMAB。

选择NK-92细胞(

K,et al.Molecular therapy,2015,23(2):330-338.]进一步制备细胞文库，根据实施例1相同的方法构建synNotch受体和细胞内基因回路，即获得包含495个人工抗体的人工NK-92细胞文库。获得的NK-92细胞文库命名为KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-495synNotch-NK92文库，库容量就synNotch受体而言为495单克隆数。

实施例19.包含495个人工抗体的synNotch受体NK-92细胞文库用于人胰腺癌免疫治疗

将上述KRAB-iCasp9-αEpCAM.CAR-495synNotch-NK92文库静脉施用于胰腺癌受试者。给药方式、剂量等按照细胞治疗通用的给药方法[Fry T J,et al.Nature medicine,2018,24(1):20.]。

实施例20.载体组合构建方法举例概述

(1)第一基因元件的构建举例

第一基因元件即为synNotch受体文库synNotch受体是一种人工受体，其文库的构建可以参见专利文献CN109576292 A。本发明强调利用synNotch胞外识别结构域的随机化文库实现特定synNotch文库的应用，构建方法举例如下。

可以采用如下的方法构建，简述如下：利用DNA合成的方法，根据人基因抗体编码规则，人工合成人类抗体基因文库。进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：人类抗体基因单链抗体文库—小鼠synNotch核心结构域—Gal4-VP64，如图12A；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：利用DNA合成的方法，根据人基因抗体编码规则，人工合成人类抗体基因文库。将基因文库构建在噬菌体载体中，扩增噬菌体即获得噬菌体抗体库。如要在动物模型上的应用筛选方法，则将噬菌体抗体库施用于动物，扣除能够结合动物模型抗原的噬菌体，此时得到噬菌体抗体亚库，利用基因工程方法，获取亚库的抗体基因文库。进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：单链抗体文库—人synNotch核心结构域—Gal4-KRAB如图12B；如要直接用于受试者，则获取受试者的对照组织，如受试者的外周单核细胞、癌旁组织等，扣除能够结合对照组织的噬菌体，此时得到噬菌体抗体亚库，利用基因工程方法，获取亚库的抗体基因文库。进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：Fab抗体文库—斑马鱼synNotch核心—PIP-VP64如图12C；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：从多名健康志愿者外周单核细胞利用基因工程方法获取抗体基因文库，将基因文库构建在酵母载体中，扩增酵母细胞即获得酵母抗体库。进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：人类抗体基因文库—大鼠synNotch核心—ZFHD1-VP64，如图12D；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：利用骆驼外周血单核细胞利用基因工程方法获取骆驼抗体基因文库，进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：骆驼抗体基因文库—小鼠synNotch核心结构域—Gal4-VP64，如图12E；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：从多名健康志愿者外周单核细胞利用基因工程方法获取抗体基因文库，将基因文库构建在酵母载体中，扩增酵母细胞即获得酵母抗体库。将肿瘤细胞系MDA-MB-231接触抗体库，淘选能够结合细胞的酵母。利用基因工程方法获取酵母中的抗体基因文库亚库，再利用CDR突变、亲和力成熟、链交换的基因工程方法重新建立抗体库，进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：基因工程单链抗体文库—基因工程scFv基因文库，如图12F；

(2)第二基因元件的构建举例

第二元件为基因回路。可以采用如下的方法构建，简述如下：6个NFAT反应原件和最小化白介素2(IL-2)启动子(6×NFAT)，如图12G

也可以采用如下的方法构建：构建7个TRE和最小化CMV启动子融合而成(7×TRE-P_CMV-min)，然后构建4个NFAT反应元件和最小化IL-2启动子融合而成(4×NFAT)的启动子，其下游包含Gal4-KRAB；再构建收到Gal4-KRAB调控的5×UAS-PS_V40融合启动子)，如图12H。

也可以采用如下的方法构建：构建5个UAS和最小化CMV启动子融合而成(5×UAS-P_CMV-min)，再构建6个NFAT反应原件和最小化白介素2(IL-2)启动子(6×NFAT)，其下游的TetR-KRAB转录因子；再构建受到TetR-KRAB调控的7×TRE-P_SV40融合启动子，如图12I。

也可以采用如下的方法构建：10个NFκB结合原件和最小化HIVtata启动子融合而成的启动子(10×NFκB)，其下游的转录因子TetR-VP64；再构建受到TetR-VP64调控的7个TRE和最小化CMV启动子融合而成(7×TRE-P_CMV-min)启动子，如图12J。

也可以采用如下的方法构建：10个NFκB结合原件、6个NFAT反应原件和最小化白介素2(IL-2)启动子融合(10×NFκB+6×NFAT)而成的启动子，其下游的转录因子ZFHD1-VP64；再构建受到ZFHD1-VP64调控的4×ZFHD1RE-P_CMV-min启动子，如图12K。

(3)第三基因元件的构建举例

第一基因元件即为嵌合抗原受体文库。嵌合抗原受体是一种人工受体，其文库的构建可以参见专利文献WO2015/123642。本发明强调利用嵌合抗原受体胞外识别结构域的随机化文库实现特定嵌合抗原受体的应用，构建方法举例如下。

可以采用如下的方法构建，简述如下：利用DNA合成的方法，根据人基因抗体编码规则，人工合成人类抗体基因文库。进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：人类抗体基因单链抗体文库—CD8 hinge—CD8TM—4-1BB—CD3ζ，如图13A；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：利用DNA合成的方法，根据人基因抗体编码规则，人工合成人类抗体基因文库。将基因文库构建在噬菌体载体中，扩增噬菌体即获得噬菌体抗体库。如要在动物模型上的应用筛选方法，则将噬菌体抗体库施用于动物，扣除能够结合动物模型抗原的噬菌体，此时得到噬菌体抗体亚库，利用基因工程方法，获取亚库的抗体基因文库。进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：单链抗体文库—IgG4-hinge—CD28TM—CD28—4-1BB—CD3ζ如图13B；如要直接用于受试者，则获取受试者的对照组织，如受试者的外周单核细胞、癌旁组织等，扣除能够结合对照组织的噬菌体，此时得到噬菌体抗体亚库，利用基因工程方法，获取亚库的抗体基因文库。进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：Fab抗体文库—CD8-hinge—CD28TM—CD28—CD27—CD3ζ如图13C；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：从多名健康志愿者外周单核细胞利用基因工程方法获取抗体基因文库，将基因文库构建在酵母载体中，扩增酵母细胞即获得酵母抗体库。进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：人类抗体基因文库—2D3—CD137TM—4-1BB—CD3ζ，如图13D；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：利用骆驼外周血单核细胞利用基因工程方法获取骆驼抗体基因文库，进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：骆驼抗体基因文库—CD8-hinge—CD8TM—4-1BB—CD3ζ，如图13E；

也可以采用如下的方法构建，简述如下：从多名健康志愿者外周单核细胞利用基因工程方法获取抗体基因文库，将基因文库构建在酵母载体中，扩增酵母细胞即获得酵母抗体库。将肿瘤细胞系MDA-MB-231接触抗体库，淘选能够结合细胞的酵母。利用基因工程方法获取酵母中的抗体基因文库亚库，再利用CDR突变、亲和力成熟、链交换的基因工程方法重新建立抗体库，进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：基因工程单链抗体文库—CD8 hinge—CD8TM—4-1BB—CD3ζ，如图13F；

(4)第四基因元件的构建举例

第三基因元件为编码蛋白的基因元件，编码包括绿色荧光蛋白GFP、蓝色荧光蛋白BFP、Myc标签、FLAG标签、嘌呤霉素抗性蛋白(PuroR)、新霉素抗性蛋白(NeoR)、杀稻瘟素抗性蛋白(Blasticidin-R)、潮霉素B抗性蛋白(Hygromycin B-R)、单纯疱疹病毒胸苷激酶蛋白(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶蛋白(CD)或iCasp9自杀系统蛋白(iCasp9)的基因。

(4)载体组合举例

包含三种基因元件的载体组合可以采用如下的方法构建，简述如下：(i)DNA合成的方法，根据人基因抗体编码规则，人工合成人类抗体基因文库。进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：人类抗体基因单链抗体文库—小鼠synNotch核心结构域—TetR-VP64；(ii)采用如下的方法构建：构建7个TRE和最小化CMV启动子融合而成(7×TRE-P_CMV-min)，然后构建4个NFAT反应元件和最小化IL-2启动子融合而成(4×NFAT)的启动子，其下游包含Gal4-KRAB；再构建受到Gal4-KRAB调控的5×UAS-P_SV40融合启动子。(III)利用DNA合成的方法，根据人基因抗体编码规则，人工合成人类抗体基因文库。进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：人类抗体基因单链抗体文库—CD8 hinge—CD8TM—4-1BB—CD3ζ，插入7×TRE-P_CMV-min启动子下；(IV)构建编码单纯疱疹病毒胸苷激酶蛋白的第三基因元件(HSV-TK)；整体如图14A所示的两个基因表达控制盒上

还可以按照如下方法构建：

(i)利用骆驼外周血单核细胞利用基因工程方法获取骆驼抗体基因文库，进一步按照synNotch受体方案进行构建，即：骆驼抗体基因文库—小鼠synNotch核心结构域—Gal4-VP64，(ii)构建5个UAS和最小化CMV启动子融合而成(5×UAS-P_CMV-min)，再构建6个NFAT反应原件和最小化白介素2(IL-2)启动子(6×NFAT)，其下游的TetR-KRAB转录因子；再构建受到TetR-KRAB调控的7×TRE-P_SV40融合启动子，(iii)从多名健康志愿者外周单核细胞利用基因工程方法获取抗体基因文库，将基因文库构建在酵母载体中，扩增酵母细胞即获得酵母抗体库。将肿瘤细胞系MDA-MB-231接触抗体库，淘选能够结合细胞的酵母。利用基因工程方法获取酵母中的抗体基因文库亚库，再利用CDR突变、亲和力成熟、链交换的基因工程方法重新建立抗体库，进一步按照嵌合抗原受体方案进行构建，即：基因工程单链抗体文库—CD8 hinge—CD8TM—4-1BB—CD3ζ，(iv)建编码嘌呤霉素抗性蛋白(PuroR)和蓝色荧光蛋白(BFP)，以2A肽融合；整体如图14B所示的一个载体上，载体上可以有其他现有技术描述的调控元件

本发明中涉及的未说明部分与现有技术相同或采用现有技术加以实现。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种载体组件，其特征在于，包括一个或多个载体，以及插入在所述载体上的三种基因元件，该三种基因元件分别为编码一种或多种独特型synNotch受体的多种第一基因元件；载有一种或多种基因回路的第二基因元件；编码一种或多种独特型嵌合抗原受体的第三基因元件，

其中，当所述第一基因元件编码一种独特型synNotch受体时，所述第三基因元件必须编码至少三种独特型嵌合抗原受体，当所述第三基因元件编码一种独特型嵌合抗原受体时，第一基因元件必须编码三种独特型synNotch受体；

所述基因回路是预编程性的，为调节性顺势作用因子与转录因子的组合，在所述第一基因元件编码的synNotch受体活化时，对所述第三基因元件所编码的嵌合抗原受体产生表达调控效应；

synNotch受体包含细胞间信号传导受体Notch的核心调节结构域、合成性的胞外识别结构域和合成性的胞内转录结构域，所述嵌合抗原受体包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外识别结构域，

synNotch受体和嵌合抗原受体的细胞外识别结构域均包括完整的抗体、组成抗体的重链、轻链或抗体片段。

2.根据权利要求1所述的载体组件，其特征在于，还包括编码一种或多种筛选标记蛋白的第四基因元件，

所述筛选标记蛋白包括药物抗性蛋白、自杀蛋白、荧光蛋白基因或分子标签蛋白中的任意一种或至少两种的组合，

当所述第一基因元件编码的synNotch受体活化时，通过第二基因元件预编程的基因回路实现同时对第三基因元件和第四基因元件产生表达调控效应。

3.根据权利要求1或2所述的载体组件，其特征在于：

其中，所述抗体片段包括抗体可变区、单链抗体、单域抗体或Fab段；

Notch核心调节结构域来源于人Notch基因、小鼠Notch基因、大鼠Notch基因、斑马鱼Notch基因或果蝇Notch基因，

合成性的胞内转录结构域包括TetR-VP64、Gal4-VP64、PIP-VP64、ZF21-16-VP64、ZF-42-10-VP64、ZF43-8-VP64、ZF54-8-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB、TetR-KRAB、PIP-KRAB、ZF21-16-KRAB、ZF-42-10-KRAB、ZF43-8-KRAB、ZF54-8-KRAB、ZFHD1-KRAB中的任意一种或至少两种的组合，

所述调节性顺势作用因子包括单个顺势作用因子和融合式顺势作用因子，融合式顺势作用因子包括一种或多种单个顺势作用因子的灵活组合，

所述单个顺势作用因子包括NFAT反应启动子元件、NFκB反应启动子元件、四环素反应元件、半乳糖代谢酶系基因启动子的UAS、PIP反应元件、ZFHD1反应元件、ZF21-16反应元件、ZF42-10反应元件、ZF43-8反应元件、ZF54-8反应元件、最小化CMV启动子、CMV启动子、SV40启动子、最小化IL-2启动子、最小化昆虫热休克蛋白70启动子、最小化HIVtata启动子中的任意一种或至少两种的组合；

所述融合式顺势作用因子包括4×NFAT、6×NFAT、5×NFκB、10×NFκB、7×TRE-P_CMV-min、5×UAS-P_CMV-min、4×PIR-P_CMV-min、8×PIR-P_CMV-min、8×PIR-P_hsp70min、4×ZFHD1RE-P_CMV-min、8×ZF21-16RE-P_CMV-min、8×ZF42-10RE-P_CMV-min、8×ZZF43-8R-P_CMV-min、8×ZF54-8RE-P_CMV-min、7×TRE-P_SV40、7×TRE-Pcmv、5×UAS-P_SV40、4×PIR-P_SV40、8×PIR-P_SV40、4×ZFHD1RE-P_SV40、8×ZF21-16RE-P_SV40、8×ZF42-10RE-P_SV40、8×ZF43-8RE-P_SV40、8×ZF54-8RE-P_SV40中的任意一种或至少两种的组合；

所述转录因子包括TetR-VP64(tTA)、Gal4-VP64、PIP-VP64、ZF21-16-VP64、ZF-42-10-VP64、ZF43-8-VP64、ZF54-8-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB、TetR-KRAB、PIP-KRAB、ZF21-16-KRAB、ZF-42-10-KRAB、ZF43-8-KRAB、ZF54-8-KRAB、ZFHD1-KRAB中的任意一种或至少两种的组合；

所述表达调控效应包括激活转录表达、增强转录表达、终止转录表达、抑制转录表达中的任意一种或至少两种的组合。

4.携带权利要求1～3任一项所述载体组件的受体细胞文库。

5.权利要求4所述的受体细胞文库的制备和筛选方法，其特征在于：

将第一基因元件、第二基因元件、第三基因元件和/或第四元件插入同一载体或不同载体，而后转染至细胞内，即得到细胞文库，然后进行筛选。

其中，转染方法包括病毒转染、化学试剂转染或电击转染中的任意一种或至少两种的组合；所述细胞是哺乳动物的免疫细胞或基因工程化的免疫细胞。

6.权利要求5所述的受体细胞文库的制备和筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、抗体库制备

利用健康志愿者来源、全合成方法、基因工程方法建立抗体基因文库；

B、基因元件构建

C、基因元件导入细胞

D、受体细胞体外筛选

将受体细胞文库体外与抗原接触，根据筛选标记蛋白的表达情况，筛选目标抗原受体表达细胞，并对其进行回收；

E、受体细胞体内筛选

给实验目的受试者施用有效量受体细胞文库，与体内抗原接触，根据筛选标记蛋白的表达情况，筛选目标受体表达细胞，并对其进行回收。

7.根据权利要求6所述的受体细胞文库的制备和筛选方法，其特征在于：

其中，在步骤D和步骤E中，还包括筛选获得的受体细胞后，利用抗体工程方法重新构建次级人工受体细胞文库的步骤。

8.根据权利要求6所述的受体细胞文库的制备和筛选方法，其特征在于：

其中，步骤D中，抗原包括野生型细胞、转染特定抗原基因的细胞、结合特定抗原的细胞、溶解在培养基中的抗原、包被在培养器皿上的抗原、包被在微珠上的抗原或包被在培养支架上的抗原中的任意一种或至少两种的组合；

步骤E中，体内抗原指存在于人及动物活体内的抗原，包括在体细胞、在体病灶细胞、转染特定抗原基因的在体细胞、感染特定病原体的在体细胞、结合特定抗原的在体细胞、移植在动物模型上的在体细胞中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的稀释剂或赋形剂，该活性组分包括权利要求1-2所述的载体组件、权利要求4-6所述的抗原受体细胞文库、权利要求5-8所述筛选方法获得的人工受体细胞、synNotch受体、嵌合抗原受体、人工受体来源的抗体中的任意一种或至少两种的组合，和至少一种医学或药学上可接受的载体。

10.权利要求9所述的药物组合物在制备诊断或治疗需要去除疾病介质相关疾病药物、试剂或试剂盒中的用途。