CN114761084A - 具有铰链结构域的Notch受体 - Google Patents

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Abstract

本公开文本总体上尤其涉及一种新类别的被工程化为以配体依赖性方式调节转录调控的受体。特别地，所述新受体，虽然衍生自Notch，但不需要先前认为对于所述受体的功能是必需的Notch负调节区。此外，本文所述的新受体并入胞外寡聚化结构域以促进所述嵌合受体的寡聚体形成。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、经所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康状况如癌症的方法。

Description

具有铰链结构域的Notch受体
关于联邦政府资助研发的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的授权号OD025751下在美国政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求均于2019年9月24日提交的美国临时专利申请号62/905,251和62/905,263的优先权，将其披露内容通过引用以其整体(包含所有附图在内)并入本文。
序列表的并入
本申请含有序列表，所述序列表通过引用以其整体特此并入。所附的名称为“048536_654001WO_Sequence_Listing_ST25.txt”的序列表文本文件创建于2020年9月23日，并且为144KB。
技术领域
本公开文本总体上涉及结合细胞表面配体并且具有可选择的特异性和活性的新合成细胞受体。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、经所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康状况或疾病如癌症的方法。
背景技术
限制人类中工程化细胞疗法的发展的重要问题是调节治疗性基因表达以减少或消除对施用嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)引起显著副作用的相互作用，所述副作用例如脱靶活性、中靶、脱瘤(off-tumor)活性(即，其中还在肿瘤外的正常细胞上发现CAR-T靶)、和在需要时不能调节或关闭CAR-T活性。这些问题的一种可能的解决方案是使用能够修饰基因表达和/或细胞行为的合成受体。
Notch受体是跨膜蛋白，其介导细胞间接触信号传导并且在发育和细胞间通讯(例如在两个接触细胞之间的通讯，其中一个接触细胞是“接收”细胞并且另一个接触细胞是“发送”细胞)的其他方面中发挥核心作用。在接收细胞中表达的Notch受体识别它们的在发送细胞上表达的配体(例如，delta/serrate/lag或“DSL”蛋白家族)。notch和delta在这些接触细胞上的接合导致notch受体的两步蛋白水解，其最终导致受体的胞内部分从膜释放到细胞质中。Notch具有金属蛋白酶切割位点(称为“S2”)，其通常被Notch负调节区(NRR)保护免于切割，所述Notch负调节区是由Notch胞外亚基(NEC)的三个LIN-12-Notch重复(LNR)模块和一个异二聚化结构域(HD)组成的结构域。认为这种蛋白水解由通过发送细胞施加的力调节：DSL配体拉动Notch受体并改变负调节区的构象，从而暴露金属蛋白酶位点。然后该位点被组成型活性蛋白酶切割，从而释放受体的胞外结合部分和负调节区(NRR)。受体的胞外结合部分的释放又暴露了另外一个或多个膜内切割位点(表示为“S3”)，所述另外一个或多个膜内切割位点被细胞膜内的γ分泌酶切割以从细胞膜释放核归巢胞内结构域。W.R.Gordon等人,Dev Cell(2015)33:729-36。这种释放的结构域通过作为转录调节因子发挥作用而改变接收细胞行为。Notch受体参与发育期间的多种细胞功能并且为其所需，并且对于跨物种的大量细胞类型的功能是重要的。
Notch受体的现有第一代合成衍生物(通常称为“SynNotch受体”)的例子通过以下方式利用这种直接的信号传导行为：用抗体衍生物替代在野生型Notch中含有多个EGF样重复的胞外配体结合结构域，并且用选择的转录激活物替代胞质结构域，同时仍然依赖于Notch NRR的功能(LMorsutt等人,Cell(2016)164:780-91)。通常，SynNotch信号传导与配体结合相关，但是难以调节受体的敏感性和反应。另外，NRR跨越大约160个氨基酸，使得仅此结构域就具有一些成熟蛋白质如胰岛素或表皮生长因子(EGF)的大小。这使得嵌合受体的表达效率较低，并且由于载体容量相关的大小约束，所得嵌合受体可能超出一些克隆载体和转染载体的容量。
发明内容
本公开文本总体上涉及用于调节细胞活性或治疗各种健康状况或疾病的免疫治疗剂，如嵌合多肽。特别地，本文提供了可寡聚的嵌合受体，其出人意料地保留了响应于配体结合而转导信号的能力，但完全不存在包含负调节区(NRR)在内的Notch胞外亚基(NEC)。更特别地，这些受体并入胞外寡聚化结构域以促进嵌合受体的寡聚形式(例如二聚体或三聚体形式)的形成。不受任何特定理论的约束，此设计有助于胞外结构域(ECD)的寡聚化或簇聚，并且随后将胞内结构域(ICD)集合在一起以激活细胞信号传导，例如T细胞信号传导。此外，这些受体提供了一系列的敏感性。另外，通过完全省略天然Notch NEC，可以使编码本公开文本的受体的多核苷酸小于编码SynNotch的多核苷酸，这使得能够使用具有更有限容量的载体或有助于包含另外的元件，所述另外的元件原本会由于载体容量相关的大小约束而被排除。
在一个方面，本文提供了嵌合多核苷酸，所述嵌合多核苷酸从N末端到C末端包含：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；(b)能够促进经由分子间二硫键合实现所述嵌合多肽的寡聚体形成的铰链结构域；(c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及(d)包含转录调节因子的胞内结构域，其中所述选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导设置在所述转录调节因子与所述铰链结构域之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包含Notch受体的LIN-12-Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。
根据本公开文本的嵌合多肽的非限制性示例性实施方案包含以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述跨膜结构域还包含终止转移序列。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述细胞是病原体。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是终末分化细胞。在一些实施方案中，所述配体包括蛋白质或碳水化合物。在一些实施方案中，所述配体是分化簇(CD)标记物。在一些实施方案中，所述CD标记物选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC-1、MAGE、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及信号调节蛋白α(SIRPα)。
在另一方面，本文提供了核酸，其包含编码如本文公开的嵌合多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达盒或表达载体中。
在一些实施方案中，本文提供了重组细胞，其包含：(a)如本文公开的嵌合多肽；和/或(b)如本文公开的重组核酸。在相关方面，还公开了细胞培养物，其包含至少一种如本文公开的重组细胞和培养基。
在另一方面，本文提供了药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及以下中的一种或多种：(a)如本文公开的重组核酸；以及(b)如本文公开的重组细胞。在一些实施方案中，所公开的药物组合物包含如本文公开的重组核酸和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。
在另一方面，本文提供了用于调节细胞的活性的方法，所述方法包括：(a)提供本公开文本的重组细胞，以及(b)使其与选定的配体接触，其中所述选定的配体与所述嵌合多肽的胞外配体结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并释放转录调节因子，其中所述释放的转录调节因子调节所述重组细胞的活性。另一方面涉及用于调节个体中靶细胞的活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效数量的本公开文本的重组细胞，其中所述重组细胞抑制所述个体中所述靶细胞的活性。
另一方面涉及用于治疗个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效数量的本公开文本的重组细胞，其中所述重组细胞治疗所述个体的健康状况。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的系统，其中所述系统包括以下中的一种或多种：本公开文本的嵌合多肽；本公开文本的多核苷酸；本公开文本的重组细胞；或本公开文本的药物组合物。
本公开文本的另一方面涉及用于制备本公开文本的重组细胞的方法，所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的细胞以及(b)使所提供的细胞与本公开文本的重组核酸接触。在一些实施方案中，通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞，并且离体接触所述细胞。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。
本公开文本的又另一方面是以下中的一种或多种用于治疗健康状况的用途：本公开文本的嵌合多肽、本公开文本的多核苷酸；本公开文本的重组细胞；或本公开文本的药物组合物。在一些实施方案中，所述健康状况是疾病，如癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤、软组织瘤或转移病灶。
本公开文本的另一方面是以下中的一种或多种用于制造治疗健康状况例如疾病的药物的用途：本公开文本的嵌合多肽、本公开文本的多核苷酸、本公开文本的重组细胞；或本公开文本的药物组合物。
前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。
附图说明
图1A-图1B示意性地展示了在SynNotch受体与本公开文本的嵌合多肽之间的差异。图1A描绘了现有合成Notch受体(SynNotch)的示意性结构，所述现有合成Notch受体具有配体识别结构域(例如，抗CD19 scFv)、包含Notch负调节区(NRR)的近膜结构域(JMD)、单次跨膜结构域(TMD)、终止转移序列(STS)以及转录调节因子(例如，Gal4VP64)。图1B描绘了如本文公开的示例性第二代合成Notch受体(铰链-Notch受体)的示意性结构，其中野生型Notch多肽的包含NRR在内的整个NEC已经缺失。将衍生自CD8铰链结构域的铰链多肽序列插入TMD的N末端。所述CD8铰链序列含有促进经由分子间二硫键合实现嵌合多肽的二聚体形成的多肽基序。
图2A-图2C示意性地汇总了铰链-Notch受体的设计、其在原代T CD4+T细胞中的表达和激活。在图2A中，示意性示出了示例性SynNotch1受体(左小图)，所述SynNotch1受体基于人Notch1蛋白设计。中间小图示意性地示出了示例性CD8铰链-Notch1受体。与左小图中的SynNotch1受体相比，CD8铰链-Notch1受体用CD8A铰链结构域替代整个JMD，所述CD8A铰链结构域含有已知形成二硫键的半胱氨酸残基。右小图示意性地示出了示例性截短的CD8铰链-Notch1受体(truncCD8铰链-Notch1)。与CD8铰链-Notch1受体相比，truncCD8铰链-Notch1受体含有CD8A铰链序列的C末端缺失，留下单个半胱氨酸残基和较短的胞外区。图2B是受体表达的流式细胞术数据的汇总。在这些实验中，将原代人T细胞用表达受体或转录报告质粒的两种慢病毒构建体转导，并且用抗CD3/抗CD28Dynabeads(Gibco)激活。使用AlexaFluor647标记的抗myc抗体(Cell Signaling)测量受体信号传导。通过在报告质粒上发现的组成型mCitrine基因测量报告物表达。在初始T细胞刺激后第5天分选双阳性细胞，并且进一步扩增用于激活测试。图2C汇总了受体激活测试的结果，其中使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
图3示意性地汇总了为了展现受体激活与并行的T细胞激活而进行的实验的结果。在这些实验中，为了模拟T细胞激活，使用抗MCAM、抗CD3双特异性T细胞接合器(MCAM
Figure BDA0003648112840000041
)，所述双特异性T细胞接合器在K562细胞的存在下激活T细胞受体。将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下共培养24小时：MCAM
Figure BDA0003648112840000043
(上部迹线)、1x105个K562细胞+MCAM
Figure BDA0003648112840000042
(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞+MCAM
Figure BDA0003648112840000044
(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活，并且展现出与图2中由未激活的T细胞获得的信号相比，报告物信号增加。
图4A-图4D汇总了为了在嵌合Notch受体的背景下优化铰链结构域而进行的实验的结果。图4A示意性地展示了各种CD8铰链-Notch截短变体，所述截短变体包含表示为“a”、“b”、“c”和“d”的一个或多个铰链组分。组分“a”表示第一半胱氨酸残基的N末端区域。组分“b”表示第一半胱氨酸残基。组分“c”表示在第一半胱氨酸残基与第二半胱氨酸残基之间的区域。组分“d”表示第二半胱氨酸残基和从第二半胱氨酸残基到受体跨膜结构域的区域。列出了四种测试变体的铰链组分。图4B汇总了在Jurkat T细胞中受体激活测试的结果。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。图4C示出了来自图4B中的数据的BFP阳性细胞％的量化。图4D是来自图4B中的数据的信噪比的图。
图5示意性地汇总了来自为了测试truncCD8铰链2受体激活与并行的PKC(蛋白激酶C)信号传导而进行的实验的结果。在这些实验中，为了模拟PKC信号传导，添加了佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)。将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下在有和没有PMA的情况下共培养24小时：没有另外的细胞(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
图6A-图6B示意性地汇总了来自含有衍生自其他来源的替代性铰链结构域的铰链-Notch受体的结果。如图6A中展现的，除了CD8A之外，还发现CD28、OX40和IgG4具有可用的铰链结构域。在这些实验中，四种示例性铰链-Notch受体：pIZ343(截短的CD8铰链-Notch)、pIZ358(CD28铰链-Notch)、pIZ360(OX40铰链-Notch)、pIZ359(IgG4铰链-Notch)。铰链-Notch受体中每一种的简要描述提供在表2中。图6B描绘了来自图6A中的测试的BFP阳性细胞％的量化。
图7A-图7B示意性地汇总了来自为了测试含有其他配体识别结构域的铰链-Notch受体而进行的实验的结果。如图7A中展现的，除了抗CD19 scFv之外，抗ALPPL2scFv和eGFP也可以用作配体识别结构域。如图7B中所示，用受体构建体转导先前产生的报告物阳性Jurkat T细胞系。使用AlexaFluor647标记的抗myc抗体(Cell Signaling)测量受体表达。对于受体激活测试，将1x105个表达抗CD19受体的Jurkat T细胞与以下共培养24小时：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个ALPPL2+K562细胞/1x105个在细胞表面上表达抗GFP纳米抗体的K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BDBiosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
图8A-图8B示意性地汇总了来自为了测试具有其他终止转移序列(STS)的铰链-Notch受体而进行的实验的结果。如图8A中所展示，除了Notch1 STS之外，还可以使用另一STS(例如，Notch2 STS、Notch4 STS、DAG1 STS、PTPRF STS和KL STS)来影响受体行为。在这些实验中，将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用表达受体或转录报告物构建体的两种慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天分选受体/报告物阳性细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下共培养24小时：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。图8B描绘了图8A中的激活数据的量化。
图9A-图9C示意性地汇总了来自为了评价如由铰链-Notch1构建体举例说明的各种铰链-Notch截短变体的功能性以优化铰链-Notch受体而进行的实验的结果。图9A展示了变体的构建体设计，所述变体包含构建体pIZ341的全长或截短N-JMD结构域形式。黑色棒指示构成每种变体的氨基酸。“全长”是指全长变体，包含SEQ ID NO:12。“Trunc 1”是指1号截短变体，包含SEQ ID NO:39。“Trunc 2”是指2号截短变体，包含SEQ ID NO:13。“Trunc 3”是指3号截短变体，包含SEQ ID NO:40。“Trunc 4”是指4号截短变体，包含SEQ ID NO:41。这些CD8铰链变体的表达的比较示于图9B中。具体地，将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达铰链截短变体受体，而另一种慢病毒构建体表达BFP转录报告物加抗胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)CAR。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。图9B的左侧五个小图示出了通过抗myc标签染色测量的每种受体的相对表达水平(y轴)与通过GFP测量的报告物构建体表达水平(x轴)的关系。图9B的最右侧小图示出了在双阳性细胞中CD8铰链变体的受体表达的MFI量化。图9C示出了从左到右代表全长变体和截短变体1至4的5个小图。对于每种变体，将表达抗CD19受体的T细胞与以下共培养：从顶到底为，无添加(顶部迹线)、ALPPL2+K562细胞(从顶部起第二个迹线)、CD19+K562细胞(从顶部起第三个迹线)、或ALPPL2+CD19+(底部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
图10示意性地汇总了来自为了测试具有不同结合结构域的铰链-Notch变体及其对蛋白水解活性的依赖性而进行的实验的结果。将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有指示的结合头截短变体受体的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养：1x105个K562细胞(顶部迹线)、1x105个配体+K562细胞(从顶部起第二个迹线)、1x105个配体+K562细胞及ADAM10抑制剂(从顶部起第三个迹线)、或1x105个配体+K562细胞及γ分泌酶抑制剂DAPT(底部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BDBiosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
图11A-图11C示意性地汇总了来自为了测试具有不同结合结构域和Notch2STS结构域的铰链-Notch变体而进行的实验的结果。将原代CD4+人T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有指示的结合头铰链Notch受体的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养两天：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个BCMA+K562细胞(下部迹线)(图11A)。在图11A中，左小图是指具有抗BCMAscFv结合头的构建体，中间小图是指具有抗BCMA完全人源化VH结合头的构建体，并且右小图是指具有具备针对结合结构域优化的铰链结构域(铰链5)的抗BCMA完全人源化VH结合头的构建体。类似地测试SIRPα结合头。将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养两天：无添加(上部迹线)或1x105个K562细胞(下部迹线)(图11B)。在图11C中，使用类似方法测试并比较了针对HER2抗原的不同scFv。将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养两天：无添加(顶部迹线)、贴壁HEK 293T细胞(从顶部起第二个迹线)、贴壁MBMDA-468细胞(从顶部起第三个迹线)、贴壁MCF7细胞(从顶部起第四个迹线)、或贴壁SKBR3细胞(底部迹线)(图11C)。左小图代表抗HER2 4D5-7 scFv结合头，而右小图代表抗HER2 4D5-8 scFv结合头。对于图11A-图11C，随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
图12示意性地汇总了来自为了比较具有不同启动子和STS结构域的铰链-Notch变体的激活而进行的实验的结果。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下共培养：无添加(顶部迹线)、1x105个ALPPL2+K562细胞(从顶部起第二个迹线)、1x105个CD19+K562细胞(从顶部起第三个迹线)、或1x105个ALPPL2+CD19+K562细胞(底部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。包括使用鼠原始SynNotch构建体和人原始SynNotch构建体的激活用于比较。
图13A-图13B示意性地汇总了来自用于铰链-Notch构建体中Notch1跨膜结构域(TMD)的突变分析的实验的结果。制备在铰链-Notch构建体的TMD结构域中具有不同丙氨酸突变的变体。在铰链-Notch的TMD中从301位(F)至322位(S)的每个氨基酸残基单独突变为丙氨酸。将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达TMD突变体变体，而另一种慢病毒构建体含有BFP转录报告物。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。在图13A中，左小图示出了通过抗myc标签染色测量的不同受体的相对表达(y轴)与报告物构建体标记物表达(x轴)的关系，而右小图代表了在双阳性细胞中TMD突变体变体的受体表达的MFI量化。在图13B中，将表达抗CD19受体的T细胞与对照CD19(-)K562细胞或对照CD19(+)K562细胞以1:1的比率共培养。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。左小图示出了激活概况的流式图。右小图代表绘制为线图的BFP％。
图14示意性地汇总了来自对于针对铰链-Notch构建体中跨膜结构域(TMD)和STS结构域的突变分析的实验的结果。在此实施例中使用四种类型的示例性铰链Notch受体，所有这些都包含抗CD19 scFv结构域、截短的CD8铰链结构域和Gal4VP64结构域，加上不同的TMD结构域(CLSTN1 TMD或CLSTN2 TMD)和不同的STS结构域(CLSTN1STS、CLSTN2 STS或Notch1 STS)。将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有所指示的TMD/STS组合的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物及组成型表达的抗ALPPL2 CAR。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养：1x105个K562细胞(“-CAR”小图，蓝色)、或1x105个CD19+K562细胞(“-CAR”小图，红色)。类似地，在存在CAR活性的情况下，通过与1x105个ALPPL2+K562细胞(“+CAR”小图，蓝色)或1x105个ALPPL2+CD19+K562细胞(“+CAR”小图，红色)共培养，测试1x105个表达受体的双阳性T细胞。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
图15A-图15B示意性地汇总了来自关于以下的实验的结果：使用工程化细胞因子的由铰链-Notch控制的表达，T细胞的可调配体依赖性扩增。图15A示出了如下的图：用铰链-Notch STS变体工程化T细胞，以提供工程化细胞因子的由配体触发的分泌以用于T细胞的自分泌和旁分泌扩增。具有指示的STS修饰的抗CD19铰链-Notch受体的表达概况示于图15B中。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达针对MCAM抗原的CAR，而一种慢病毒构建体表达铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(super-IL2)(在Gal4-UAS控制下)。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。通过抗myc标签染色确定受体表达(y轴)。
图16示意性地汇总了来自为了展现超级IL2的由配体触发的表达改善CAR-T细胞的细胞活力而进行的实验的结果。将1x105个表达抗CD19铰链Notch Notch1 STS受体的双阳性T细胞在不含IL-2的培养基中与以下共培养：无K562细胞(左上)、CD19+K562细胞(以触发铰链-Notch)(右上)、MCAM+K562细胞(以触发CAR激活)(左下)或MCAM+和CD19+K562细胞(以触发两种受体的激活)(右下)。9天后，通过使用Fortessa X-50的前向散射测量和侧向散射测量来评估活T细胞的比例。
图17示意性地汇总了来自为了展现在用铰链-Notch的STS变体的情况下T细胞的可调增殖而进行的实验的结果。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达针对MCAM抗原的CAR，而一种慢病毒构建体表达铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(在Gal4-UAS控制下)(右侧四个小图)。针对无铰链-Notch对照测试含有3种不同STS变体(NRG1、Notch1、Notch2)的铰链-Notch受体。类似地，在没有CAR表达的情况下产生原代人T细胞(左小图)。根据制造商的方案，将T细胞用CellTrace Violet染色，与CD19+K562靶细胞一起在不含IL-2的培养基中共孵育，并且在指示的时间点使用Fortessa X-50测量以通过CTV信号衰减评估增殖。
图18A-图18B示意性地汇总了来自为了展现在用铰链-Notch的STS变体的情况下超级IL2的可调分泌而进行的实验的结果。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads激活，并且用慢病毒构建体(铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(在Gal4-UAS控制下))转导(图18A)。针对无铰链Notch对照测试含有3种不同STS变体(NRG1、Notch1、Notch2)的铰链-Notch受体。将T细胞与MCAM+CD19+K562细胞一起在缺乏IL-2的培养基中共孵育，并且在指示的时间点，使用Instant ELISA试剂盒根据制造商的方案用酶标仪测量上清液IL-2。红色虚线指示用于培养T细胞的IL-2的标准浓度。通过STS调节的铰链-Notch受体的激活实现了超级IL2的分级分泌。对于图18B，用表达针对MCAM的CAR的另外的慢病毒载体产生原代人T细胞。
图19示意性地汇总了来自为了展现在用铰链-Notch的STS变体的情况下超级IL2的可调分泌增强旁邻T细胞的增殖而进行的实验的结果。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads激活，并且用包含铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(在Gal4-UAS控制下)的慢病毒构建体转导(右小图)。针对无铰链Notch对照测试含有3种不同STS变体(NRG1、Notch1、Notch2)的铰链Notch受体。将铰链Notch T细胞与用CellTrace Far Red染色的“旁邻”T细胞共孵育，所述“旁邻”T细胞表达针对MCAM的CAR(左小图)或不表达CAR(右小图)。将T细胞与MCAM+CD19+K562细胞在缺乏IL-2的培养基中共孵育，并且通过在Fortessa X-50上测量信号衰减来评估旁邻T细胞的增殖。
图20示意性地汇总了来自为了测试含有铰链-Notch受体CAR回路的单一慢病毒载体构建体而进行的实验的结果。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads激活，并且用含有组成型表达的铰链-Notch受体及诱导型抗MCAM CAR盒(在Gal4-UAS控制下)的单一慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天，经由myc标签针对铰链-Notch受体表达分选细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如所指示测试了三种STS变体，其中组成型表达的CAR用作对照。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的T细胞与以下共培养：无添加(上部迹线)、5x105个K562细胞(中间迹线)、或5x104个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50通过GFP标签测量诱导型CAR的转录激活。
图21示意性地汇总了来自为了展现通过用含有铰链Notch CAR回路的单一慢病毒载体工程化的T细胞实现的特异性双重抗原靶细胞杀伤而进行的实验的结果。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads激活，并且用含有组成型表达的铰链Notch-受体及诱导型抗MCAM CAR盒(在Gal4-UAS控制下)的单一慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天，经由myc标签针对铰链-Notch受体表达分选细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如所指示测试了三种STS变体，其中组成型表达的CAR用作对照。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的T细胞与5x105个MCAM+K562细胞或5x104个MCAM+CD19+K562细胞共培养。使用Fortessa X-50通过K562群体的前向/侧向散射评估靶细胞杀伤。
图22示意性地汇总了来自为了测试含有铰链-Notch受体的单一慢病毒载体构建体控制T细胞激活和耗尽而进行的实验的结果。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads激活，并且用含有组成型表达的铰链-Notch受体及诱导型抗MCAM CAR盒(在Gal4-UAS控制下)的单一慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天，经由myc标签针对铰链-Notch受体表达分选细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如所指示测试了三种STS变体，其中组成型表达的CAR用作对照。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的T细胞与5x104个CD19+K562细胞共培养。随后使用Fortessa X-50通过GFP标签测量诱导型CAR的转录激活(最左侧小图)。T细胞激活和耗尽分别通过CD25的表达(从左侧起的第二个小图)和CD39的表达(从左侧起的第三个小图和第四个小图)来测量。
图23示意性地汇总了来自为了体内测试铰链-Notch-至-CAR回路而进行的实验的结果。对于单侧肿瘤，对NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠在左侧腹皮下植入1x106个K562-BCMA/CD19肿瘤细胞。对于对侧肿瘤，对NSG小鼠在左侧腹植入1x106个K562-BCMA/CD19肿瘤细胞，并且在右侧腹植入1x106个K562-CD19肿瘤细胞。肿瘤植入后四天，通过尾静脉注射静脉内输注2.5x106个工程化的原代人CD4+T细胞和工程化的原代人CD8+T细胞(总共5x106个T细胞)。每周2-3次经由卡尺监测肿瘤大小，并且当测量到肿瘤≥20mm时，确定小鼠已经达到终点。对于免疫表型分析，在T细胞植入后10天收获肿瘤和脾。手工切碎肿瘤并且在37℃下在具有4mg/ml胶原酶IV和0.1mg/ml DNA酶I的RPMI-1640中消化30min，并且手动分离脾脏并进行红细胞裂解。使用以下抗体：抗CD45、抗CD3、抗CD4以及抗CD8。用Draq7排除死细胞。使用FACSymphony X50SORP分析样品，并且使用FlowJo软件分析数据。
具体实施方式
本公开文本总体上尤其涉及一种新类别的被工程化为以配体依赖性方式调节转录调控的可寡聚嵌合多肽受体。特别地，所述新受体(称为“铰链-Notch”)，虽然衍生自Notch，但不需要Notch NEC亚基，特别是先前认为对于受体的功能是必需的NRR。此新类别的受体是合成的和重组的，并且未在自然界中出现。如下所述，本文公开的嵌合多肽可以是合成多肽，或者可以被工程化、设计或修饰以提供期望的和/或改善的特性，例如调节转录。如本文公开的新铰链-Notch受体不仅具有功能而且展现出增强的生物活性的证明是出人意料的并且与本领域的传授完全相反。此外，本文所述的新嵌合受体并入胞外寡聚化结构域以促进形成所述嵌合受体的寡聚形式(例如二聚体或三聚体形式)。认为此设计有助于胞外结构域(ECD)的寡聚化/簇聚，并且随后将胞内结构域(ICD)集合在一起以激活细胞信号传导，例如T细胞信号传导。在一些实施方案中，本文公开的受体结合靶细胞表面配体，所述靶细胞表面配体触发嵌合受体的蛋白水解切割以及调节所述细胞中定制转录程序的转录调节因子的释放。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、经所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康状况如疾病(例如，癌症)的方法。
在以下具体实施方式中，参考形成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则类似的符号通常标识类似的组分。在具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性替换方案不意为是限制性的。在不脱离在此呈现的主题的精神或范围的情况下，可以使用其他替代方案并且可以进行其他改变。将容易理解的是，如在本文总体上描述的以及在附图中展示的方面可以以各种各样的不同配置来布置、取代、组合和设计，所有这些都被明确地考虑并构成本申请的一部分。
定义
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。本文中使用“A和/或B”来包括所有的以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
如本文所用，术语“施用”(“administration”和“administering”)是指通过包括但不限于以下的施用途径来递送如本文公开的组合物或配制品：静脉内、动脉内、颅内、肌肉内、腹膜内、皮下、肌肉内或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。
“癌症”是指具有致癌细胞典型特征(如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速的生长和增殖速率，以及某些特征性的形态特征)的细胞的存在。一些类型的癌细胞可以聚集成块，如肿瘤，但是一些癌细胞可以单独存在于受试者体内。肿瘤可以是实体瘤、软组织肿瘤或转移病灶。如本文所用，术语“癌症”还涵盖其他类型的非肿瘤癌症。非限制性例子包括血癌或血液恶性肿瘤，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。癌症可以包括恶变前癌症以及恶性癌症。
术语“宿主细胞”和“重组细胞”在本文中可互换使用。应理解，此类术语以及“细胞”、“细胞培养物”、“细胞系”不仅指特定的主题细胞或细胞系，而且指这种细胞或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞或细胞系相同的功能即可。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，这允许它们以其预期方式操作。
在两个或更多个核酸或蛋白质的上下文中，如本文所用的术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用采用如下所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量。参见例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。则将此类序列称为“基本上相同”。此定义也指或可以应用于序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。可以在长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域上，或在长度为10-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在给定序列的整个长度上计算序列同一性。可以使用已公布的技术和广泛可用的计算机程序来计算序列同一性，所述计算机程序如GCS程序包(Devereux等人,Nucleic Acids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J Mol Biol 215:403,1990)。可以使用序列分析软件以所述软件的默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如University of Wisconsin Biotechnology Center(威斯康星州麦迪逊，大学大道1710号，53705)的Genetics Computer Group的序列分析软件包
如本文所用，并且除非另有说明，否则药剂的“治疗有效量”是足以在治疗或管理健康状况如疾病(例如，癌症)方面提供治疗益处或者延迟或最小化与疾病相关的一种或多种症状的量。治疗有效量的化合物意指单独或与其他治疗剂组合的一定量的治疗剂，其在治疗或管理疾病方面提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以涵盖改善疾病的整体疗法、减轻或避免疾病的症状或原因、或增强另一治疗剂的治疗功效的量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,2010)；Lloyd,TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(2016)；Pickar,DosageCalculations(2012)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的疾病(例如，癌症)和/或疾病的一种或多种症状的人患者或个体。所述受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为具有目的病症的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如，啮齿动物，例如小鼠)以及非哺乳动物，如非人灵长类动物，例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
在提供了一系列值时，应理解的是每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文另外明确指出)，所述范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在所述陈述范围内的中间值均被涵盖在本公开文本之内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在本公开文本之内，服从于陈述的范围内的任何确切排除的界限。当陈述的范围包括一个或两个界限时，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开文本中。
本文公开的所有范围还涵盖任何且所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以被认为充分描述和允许将相同的范围分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性例子，本文所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中间三分之一和上三分之一，等等。同样如本领域技术人员将理解的，如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞都包括所列举的数字并且涉及随后可以分解为如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等等。
应了解，为明确起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征还可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。
Notch受体
Notch受体是跨膜蛋白，其通常在结合至在相邻细胞上表达的表面结合配体时转导信号。Notch信号依赖于细胞间接触。脊椎动物和无脊椎动物的进化趋异已经伴随涉及Notch受体的至少两轮基因重复：蝇类具有单个Notch基因，蠕虫具有两个Notch基因(GLP-1和LIN-12)，并且哺乳动物具有四个Notch基因(NOTCH1-4)。Notch信号的转导依赖于三个关键事件：(i)配体识别，(ii)配体依赖性切割位点的构象暴露，以及(iii)核转录激活复合物的组装。
规范的Notch信号通过称为调节的膜内蛋白水解的过程转导。Notch受体通常在细胞表面上维持静止的蛋白水解抗性构象，但配体结合启动蛋白水解级联，所述蛋白水解级联从膜释放受体的胞内部分(也称为胞内notch(ICN)或Notch胞内结构域(NICD))。关键的调节的切割步骤受ADAM金属蛋白酶的影响，并且发生在紧邻质膜外部的称为S2的位点。这种截短的受体(称为NEXT(Notch胞外截短))保持束缚在膜上，直到它在位点S3处被γ分泌酶(多蛋白酶复合物)加工。
在γ分泌酶介导的切割后，ICN最终进入细胞核，在细胞核中组装转录激活复合物，所述转录激活复合物含有称为CSL(哺乳动物中的C-启动子-结合因子；也称为RBP-J)/黑腹果蝇中无毛的抑制物或秀丽隐杆线虫中的Lag1)的DNA结合转录因子，以及Mastermind/Lag-3家族的转录共激活物。然后，此复合物与另外的共激活蛋白如p300接合，以募集基础转录机构并激活下游靶基因的表达。
Notch受体具有模块结构域组织。Notch受体的Notch胞外亚基(NEC)由一系列的负责配体结合的N末端表皮生长因子受体(EGFR)样重复组成。这些EGFR重复的O-连接糖基化(包括由O-岩藻糖、Fringe和Rumi糖基转移酶修饰)还响应于蝇类和哺乳动物中的不同配体亚型调节Notch受体的活性。
EGFR重复之后是三个LIN-12/Notch重复(LNR)模块，其对于Notch受体是独特的，并且被广泛报告参与防止过早的受体激活。Notch1的异二聚化(HD)结构域被弗林蛋白酶切割而分开，因此其N末端部分封端Notch胞外亚基(NEC)，并且其C末端半部构成Notch跨膜(NTM)亚基的起始处。NEC的胞外HD-C区之后是跨膜区段和胞内区(ICN)，所述胞内区包含转录激活物。关于Notch受体和Notch介导的细胞信号传导的另外信息可以在例如以下中见到：W.R.Gordon等人,Dev Cell(2015)33:729-36；以及W.R.Gordon等人,J.Cell Sci.(2008)121:3109-19，两者特此通过引用并入。
本公开文本的组合物
如下文更详细描述的，本公开文本提供了一种新类别的可寡聚的嵌合多肽受体，所述可寡聚的嵌合多肽受体被工程化为以配体依赖性方式调节转录调控，具有优于现有合成Notch受体的各种优点。例如，由于天然Notch受体大(其中NEC亚基含有几十个串联EGFR样重复)，通过省略Notch调节区或甚至整个NEC亚基，可以使编码本公开文本的受体的多核苷酸比天然Notch受体和现有的编码SynNotch的多核苷酸小，这使得能够使用具有更有限容量的载体或包含另外的元件，所述另外的元件原本由于载体容量相关的大小约束而被排除。
本领域技术人员将理解，本文公开的嵌合多肽受体有助于在某些细胞和环境背景下的扩增激活。这种类型的受体活性反馈是新的特征，其可以用于增强和调节由工程化的细胞实现的治疗有效载荷的产生。另外，如以下进一步详细描述的，本文公开的许多受体变体比现有SynNotch受体更易于表达，因为它们可以以更高的效率转导并且在人原代T细胞的细胞表面上以更高的水平表达。
此外，如以下更详细描述的，本文公开的某些嵌合多肽受体具有比现有SynNotch受体更好的活性，如通过例如期望的转录输出的由配体诱导的信号水平所确定的。例如，铰链-Notch和trunc铰链-Notch提供比相应的SynNotch更高的配体诱导信号速率，并且当没有配体诱导时提供更低的信号速率。此外，本文公开的某些嵌合多肽受体提供了用于工程化另外的Notch受体的更模块化的平台。此模块化平台有助于具有不同功能的结构域容易地与来自例如其他物种的对应结构域交换，从而使得能够定制受体激活特征。如实施例中更详细描述的，如本文提供的某些铰链-Notch和截短的铰链-Notch受体除了比现有SynNotch受体更小和良好表达之外，还可以被很大程度地定制，其中受体胞外、跨膜和胞内结构域的所有元件都可供定制。例如，如本文所述的各种CD8铰链Notch受体的测试证明各种胞外结构域是可能的。形成鲜明对比的是，在现有SynNotch1调节结构域上进行的类似过程导致表达丧失或开关样功能丧失。
不受任何特定理论的束缚，认为当与鼠或人型式的SynNotch1相比时，本文所述的铰链Notch受体可以提供更高水平的由配体诱导的信号。还认为，当与鼠型式的SynNotch1相比时，本文所述的铰链Notch受体在不存在配体的情况下可以提供较低水平的信号(例如，较低噪声信号)。例如，现有SynNotch受体可以用配体结合结构域如scFv和纳米抗体进行工程化，但是难以使用来自SynNotch受体上的受体/配体的天然胞外结构域。相比之下，本文提供的第二代Notch受体可以使用其他类型的配体结合结构域，例如，不同于scFv的结合结构域，从而扩大了可靶向疾病和组织的前景。例如，以下实施例部分中呈现的实验展现出使用eGFP作为配体结合结构域的能力，所述eGFP可以结合在靶细胞表面上表达的抗GFP纳米抗体LaG17。相比之下，现有的合成Notch受体如鼠和人SynNotch1与作为配体结合结构域的eGFP不相容。
如实施例中所述，某些嵌合多肽受体已在原代人T细胞中测试和验证。预期这些新受体在小鼠模型中显示类似的性能。本文公开的受体可以被工程化到各种免疫细胞类型中以增强肿瘤的辨别和消除，或工程化到工程化的细胞中以控制自身免疫和组织再生。因此，工程化的细胞如被工程化为表达本文公开的嵌合受体中的一种或多种的免疫细胞也在本公开文本的范围内。
嵌合多肽
如上所概述，本公开文本的一些实施方案涉及新型非天然存在的嵌合多肽，其被工程化为以配体依赖性方式调节转录调控。特别地，所述新受体，虽然衍生自Notch，但不需要先前认为对于受体的功能是必需的Notch调节区(NRR)。另外，本文所述的新的工程化受体并入胞外寡聚化结构域(例如，铰链结构域)以促进寡聚化形成嵌合受体的更高级寡聚(例如，二聚体或三聚体)形式。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含能够促进经由分子间二硫键合实现嵌合多肽的寡聚体形成的多肽基序。所述胞外寡聚化结构域可以替代Notch胞外结构域的一部分或全部。在一些实施方案中，本文公开的受体结合靶细胞表面配体，所述靶细胞表面配体触发受体的蛋白水解切割以及调节所述细胞中定制转录程序的转录调节因子的释放。
在一些实施方案中，本文提供了一种嵌合多肽，其从N末端到C末端包含：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域(ECD)；(b)能够促进经由分子间二硫键合实现所述嵌合多肽的寡聚体形成的铰链结构域；(c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域(TMD)；以及(d)包含转录调节因子的胞内结构域(ICD)，其中所述选定的配体与所述ECD的结合诱导在所述转录调节因子与所述铰链结构域之间的一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包含Notch受体的LIN-12-Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。
胞外结构域(ECD)
在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽受体(例如，铰链-Notch受体)的ECD对于一种或多种靶配体具有结合亲和力。所述靶配体在细胞表面上表达，或以其他方式锚定、固定或限制，从而它可以对所述嵌合受体施加机械力。这样，不受任何特定理论的束缚，本文提供的嵌合受体的ECD与细胞表面配体的结合不一定从靶细胞表面去除靶配体，而是对所述嵌合受体产生机械拉力。例如，如果其他可溶性配体结合至表面或胞外基质中的分子，则所述其他可溶性配体可以被靶向。在一些实施方案中，靶配体是细胞表面配体。合适的配体类型的非限制性例子包括细胞表面受体；粘附蛋白；表面结合的碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白和脂多糖；整合素；粘蛋白；以及凝集素。在一些实施方案中，所述配体是蛋白质。在一些实施方案中，所述配体是碳水化合物。
在一些实施方案中，所述配体是分化簇(CD)标记物。在一些实施方案中，所述CD标记物选自以下：CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC-1和MAGE。
在一些实施方案中，所述胞外结构域包含受体的配体结合部分。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含结合至一种或多种靶抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含抗体或其功能性抗原结合片段的一种或多种抗原结合决定簇。本领域技术人员在阅读本公开文本后将容易理解，术语“其功能片段”或“其功能变体”是指与衍生所述片段或变体的野生型分子具有共同的定量和/或定性生物活性的分子。例如，抗体的功能片段或功能变体是这样的，其保留与衍生所述功能片段或功能变体的抗体基本上相同的结合至相同表位的能力。例如，能够与细胞表面受体的表位结合的抗体可以在N末端和/或C末端处截短，并且使用本领域技术人员已知的测定评估其表位结合活性的保留。在一些实施方案中，所述抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体或微型抗体、F(ab')2片段、F(ab)片段、单链可变片段(scFv)、和单结构域抗体(sdAb)、或其功能片段。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含scFv。
所述抗原结合部分可以包含天然存在的氨基酸序列或者可以被工程化、设计或修饰为提供期望的和/或改善的特性，例如结合亲和力。通常，抗原结合部分(例如，抗体)对靶抗原(例如，CD19抗原)的结合亲和力可以通过Frankel等人,Mol.Immunol,16:101-06,1979描述的斯卡查德(Scatchard)方法计算。在一些实施方案中，通过抗原/抗体解离速率测量结合亲和力。在一些实施方案中，通过竞争放射免疫测定测量结合亲和力。在一些实施方案中，通过ELISA测量结合亲和力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量抗体亲和力。“选择性结合”抗原(如CD19)的抗体是基本上不结合其他抗原但以高亲和力，例如以如下平衡常数(KD)结合所述抗原的抗原结合部分：100nM或更小，如60nM或更小，例如30nM或更小，如15nM或更小、或10nM或更小、或5nM或更小、或1nM或更小、或500pM或更小、或400pM或更小、或300pM或更小、或200pM或更小、或100pM或更小。
熟练技术人员可以基于经遗传修饰为表达本公开文本的嵌合多肽或铰链-Notch受体的细胞的期望定位或功能来选择ECD。例如，具有包含对HER2抗原具有特异性的抗体的ECD的嵌合多肽或miniNotch受体可以将细胞靶向表达HER2的乳腺癌细胞。在一些实施方案中，公开的多肽铰链-Notch受体的ECD能够结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。熟练技术人员将理解，TAA包括存在于肿瘤细胞和正常细胞上或许多正常细胞上但浓度远低于在肿瘤细胞上的浓度的分子，例如蛋白质。相比之下，TSA通常包括存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上的分子，例如蛋白质。
在一些情况下，所述抗原结合部分对存在于由肿瘤细胞表达的抗原(即，肿瘤相关抗原)中的表位具有特异性。所述肿瘤相关抗原可以是与例如以下相关的抗原：乳腺癌细胞、B细胞淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌细胞等。还将理解，肿瘤相关抗原也可以由非癌细胞表达。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域对存在于组织特异性抗原中的表位具有特异性。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域对存在于疾病相关抗原中的表位具有特异性。
合适靶抗原的非限制性例子包括CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、信号调节蛋白α(SIRPα)、CD123、CD171、CD179α、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Rα、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet和Axl。
在一些实施方案中，所述靶抗原选自CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、ALPPL2、CD123、CD171、CD179α、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Ra、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet、Axl、GPC2、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7H3)、IL-13Rα1、IL-13Rα2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD123、CD93、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、ALK、DLK1、FAP、NY-ESO、WT1、HMB-45抗原、蛋白黑色素-A(T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CD125、CD147(基础免疫球蛋白)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(异二聚IL-2受体的亚基)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整合素α4、整合素α4β7、LFA-1(CD11α)、肌生成抑制蛋白、OX-40、骨硬化蛋白(scleroscin)、SOST、TGFβ1、TNF-α、VEGF-A、丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD20、CD5、CD7、CD3、TRBC1、TRBC2、BCMA、CD38、CD123、CD93、CD34、CD1α、SLAMF7/CS1、FLT3、CD33、CD123、TALLA-1、CSPG4、DLL3、κ轻链、λ轻链、CD16/FcγRIII、CD64、FITC、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、GD3、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、EGFR及其同种变体、TEM-8、精子蛋白17(Sp17)、间皮素。
合适抗原的另外的非限制性例子包括PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、prostein、NKG2D、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(CD61)、催乳素、K-Ras(V-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因)、Ral-B、GPC2、CD276(B7H3)或IL-13Rα。在一些实施方案中，所述抗原是Her2。在一些实施方案中，所述抗原是ALPPL2。在一些实施方案中，所述抗原是BCMA。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分对报告蛋白如GFP和eGFP具有特异性。这种抗原结合部分的非限制性例子包括LaG17抗GFP纳米抗体。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分包含抗BCMA完全人源化VH结构域(FHVH)。在一些实施方案中，所述抗原是信号调节蛋白α(SIRPα)。
适合于被本文公开的嵌合多肽受体靶向的另外抗原包括但不限于GPC2、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7H3)、IL-13Rα1、IL-13Rα2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)。其他合适的靶抗原包括但不限于酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD123、CD93、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、ALK、DLK1、FAP、NY-ESO、WT1、HMB-45抗原、蛋白质黑色素-A(T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1。
适合于被本文公开的嵌合受体靶向的另外抗原包括但不限于与炎性疾病相关的那些，如AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CD125、CD147(基础免疫球蛋白)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的异聚体的亚单位)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整合素α4、整合素α4β7、LFA-1(CD11α)、肌生成抑制蛋白、OX-40、骨硬化蛋白、SOST、TGFβ1、TNF-α和VEGF-A。
适合于被本文公开的嵌合多肽和铰链-Notch受体靶向的另外抗原包括但不限于丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD20、CD5、CD7、CD3、TRBC1、TRBC2、BCMA、CD38、CD123、CD93、CD34、CD1α、SLAMF7/CS1、FLT3、CD33、CD123、TALLA-1、CSPG4、DLL3、κ轻链、λ轻链、CD16/FcγRIII、CD64、FITC、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、GD3、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、EGFR及其同种变体、TEM-8、精子蛋白17(Sp17)、间皮素。合适抗原的另外的非限制性例子包括PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、prostein、NKG2D、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(CD61)、催乳素、K-Ras(V-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因)和Ral-B。在一些实施方案中，抗原是GPC2、CD19、Her2/neu、CD276(B7H3)、IL-13Rα1或IL-13Rα2。在一些实施方案中，所述抗原是Her2。在一些实施方案中，所述抗原是ALPPL2。在一些实施方案中，所述抗原是BCMA。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分对报告蛋白如GFP和eGFP具有特异性。这种抗原结合部分的非限制性例子包括LaG17抗GFP纳米抗体。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分包含抗BCMA完全人源化VH结构域(FHVH)。
在一些实施方案中，适合于被本文公开的嵌合多肽和铰链-Notch受体靶向的抗原包含衍生自病原体的配体。例如，所述抗原可以是由HER2阳性乳腺癌细胞产生的HER2。在一些实施方案中，所述抗原可以是在B细胞白血病上表达的CD19。在一些实施方案中，所述抗原可以是在多形性胶质母细胞瘤(GBM)上表达但在健康CNS组织上表达少得多的EGFR。在一些实施方案中，所述抗原可以是与成人癌症例如结肠癌相关的CEA。
在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分对细胞表面靶标具有特异性，其中细胞表面靶标的非限制性例子包括CD19、CD30、Her2、CD22、ENPP3、EGFR、CD20、CD52、CD11α和α-整合素。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和铰链-Notch受体包含胞外结构域，所述胞外结构域具有结合CD19、CEA、HER2、MUC1、CD20、ALPPL2、BCMA或EGFR的抗原结合部分。在一些实施方案中，本文提供的嵌合多肽(例如，铰链-Notch受体)包含胞外结构域，所述胞外结构域包含结合CD19的抗原结合部分。在一些实施方案中，本文提供的嵌合多肽(例如，铰链-Notch受体)包含胞外结构域，所述胞外结构域包含结合ALPPL2的抗原结合部分。在一些实施方案中，本文提供的嵌合多肽(例如，铰链-Notch受体)包含胞外结构域，所述胞外结构域包含结合BCMA的抗原结合部分。在一些实施方案中，本文提供的嵌合多肽(例如，铰链-Notch受体)包含胞外结构域，所述胞外结构域包含结合Her2的抗原结合部分。
在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和铰链-Notch受体包含胞外结构域，所述胞外结构域包含结合CD19、ALPPL2、BCMA或Her2的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含与序列表中的SEQ ID NO:9-11、36-38和72中的一个或多个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含与选自SEQID NO:9-11、36-38和72的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含与选自SEQ ID NO:9-11、36-38和72的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含与SEQ ID NO:9-11、36-38和72中的一个或多个具有100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含具有选自SEQ ID NO:9-11、36-38和72的序列的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:9-11、36-38和72中任一个中的氨基酸残基中的一个、两个、三个、四个或五个被不同的氨基酸残基取代。
铰链结构域
如上所概述，位于本公开文本的嵌合多肽的TMD的N末端的Notch胞外结构域包含寡聚化结构域(例如，铰链结构域)，所述寡聚化结构域含有促进经由分子间二硫键合实现的嵌合多肽的寡聚体形成的一个或多个多肽基序。在这些情况下，在本文公开的嵌合Notch受体内，所述铰链结构域通常包含设置在ECD与TMD之间的柔性寡肽或多肽连接区域。因此，所述铰链结构域提供在ECD与TMD之间的柔性，并且还提供在两个或更多个嵌合多肽单体之间的分子间二硫键合的位点以形成寡聚复合物。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含促进本文公开的嵌合多肽的二聚体形成的基序。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含促进本文公开的嵌合多肽的三聚体形成的基序(例如，衍生自OX40的铰链结构域)。
适合于本公开文本的组合物和方法的铰链多肽序列可以是天然存在的铰链多肽序列(例如，来自天然存在的免疫球蛋白的那些)。替代性地，铰链多肽序列可以是对应于天然存在的铰链多肽序列的合成序列，或者可以是完全合成的铰链序列，或者可以被工程化、设计或修饰为提供期望的和/或改善的特性，例如调节转录。合适的铰链多肽序列包括但不限于衍生自IgA、IgD和IgG亚类的那些，如IgG1铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域和IgG4铰链结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，所述铰链多肽序列含有一个或多个CXXC基序。在一些实施方案中，所述铰链多肽序列含有一个或多个CPPC基序。关于这一点的另外信息可以在例如Vidarsson G等人,Frontiers Immunol.2014年10月20日的近期综述中见到，所述文献特此通过引用以其整体并入。
因此，在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自IgG1铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自IgG2铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自IgG3铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自IgG4铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自IgA铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自IgD铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。
适合于本文公开的组合物和方法的另外的铰链多肽序列包括但不限于衍生自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD-1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域、FcγRIIIα铰链结构域及其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自CD8α铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自CD28铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自OX40铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含衍生自IgG4铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。
原则上，除了铰链结构域应赋予柔性和寡聚化能力之外，对其长度和/或氨基酸组成没有特别限制。然而，本领域技术人员将容易地理解，可以优化铰链多肽序列的长度和氨基酸组成以改变ECD和TMD相对于彼此的取向和/或接近性，以及嵌合多肽单体相对于彼此的取向和/或接近性，以实现本公开文本的嵌合多肽的期望活性。在一些实施方案中，包含约一至100个氨基酸残基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等的氨基酸残基)的任何任意单链肽可以用作铰链结构域。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含约5至50、约10至60、约20至70、约30至80、约40至90、约50至100、约60至80、约70至100、约30至60、约20至80、约30至90个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25、约20至40、约30至50、约40至60、约50至70个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含约40至70、约50至80、约60至80、约70至90、或约80至100个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含与选自序列表中的SEQ ID NO:12-16和39-42的序列具有至少80％序列同一性，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含与选自SEQ ID NO:12-16和39-42的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含与选自SEQ ID NO:12-16和39-42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含与选自SEQ ID NO:12-16和39-42的序列具有约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含具有选自SEQ ID NO:12-16和39-42的序列的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:12-16和39-42中任一个中的氨基酸残基中的一个、两个、三个、四个或五个被不同的氨基酸残基取代。
跨膜结构域(TMD)
如上所概述，本公开文本的嵌合多肽包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点。
Notch受体中的蛋白水解切割位点(例如，S2或S3)的例子如上所述。适合于本文公开的组合物和方法的另外的蛋白水解切割位点包括但不限于选自以下的MMP的金属蛋白酶切割位点：胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3(MMP-1、MMP-8和MMP-13)，明胶酶A和明胶酶B(MMP-2和MMP-9)，溶基质蛋白酶1、溶基质蛋白酶2和溶基质蛋白酶3(MMP-3、MMP-10和MMP-11)，基质分解素(matrilysin)(MMP-7)，和膜金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。例如，MMP-9的切割序列是Pro-X-X-Hy(其中，X表示任意残基；Hy表示疏水残基，如Leu、Ile、Val、Phe、Trp、Tyr、Val、Met和Pro)(SEQ ID NO:64)，例如Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)(SEQ ID NO:65)，例如Pro-Leu/Gl n-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO:66)或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ IDNO:67)。合适的蛋白酶切割位点的另一个例子是纤溶酶原激活物切割位点，例如尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)或组织纤溶酶原激活物(tPA)切割位点。合适的蛋白酶切割位点的另一个例子是催乳素切割位点。uPA和tPA的切割序列的具体例子包括包含Val-Gly-Arg的序列(SEQ ID NO:68)。可以包含在蛋白水解可切割接头中的另一个示例性蛋白酶切割位点是烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割位点，例如Glu-Asn-Leu-Tyr-Thr-Gln-Ser(SEQ ID NO:69)，其中蛋白酶在谷氨酰胺与丝氨酸之间切割。可以包含在蛋白水解可切割接头中的蛋白酶切割位点的另一个例子是肠激酶切割位点，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:70)，其中切割发生在赖氨酸残基之后。可以包含在蛋白水解可切割接头中的蛋白酶切割位点的另一个例子是凝血酶切割位点，例如Leu-Val-Pro-Arg(SEQ ID NO:71)。包含蛋白酶切割位点的另外合适的接头包含可被以下蛋白酶切割的序列：PreSci ssionTM蛋白酶(包含人鼻病毒3C蛋白酶和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白)、凝血酶、组织蛋白酶B、EB病毒蛋白酶、MMP-3(溶基质蛋白酶)、MMP-7(基质分解素)、MMP-9；嗜热菌蛋白酶样MMP、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、组织蛋白酶L；组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶l(MMP-l)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、膜型基质金属蛋白酶1(MT-MMP)、溶基质蛋白酶3(或MMP-11)、嗜热菌蛋白酶、成纤维细胞胶原酶和溶基质蛋白酶-1、基质金属蛋白酶13(胶原酶-3)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、人前列腺特异性抗原、激肽释放酶(hK3)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和钙蛋白酶(钙激活的中性蛋白酶)。对于表达受体的宿主细胞来说非天然的蛋白酶(例如，TEV)可以用作另外的调节机制，其中铰链-Notch的激活直到蛋白酶被表达或以其他方式提供时才可能。另外，蛋白酶可以是肿瘤相关的或疾病相关的(表达程度显著高于在正常组织中的表达程度)，并且作为独立的调节机制。例如，一些基质金属蛋白酶在某些癌症类型中高度表达。
通常，适合于本文公开的嵌合多肽和铰链-Notch受体的TMD可以是1型跨膜受体的包含至少一个γ分泌酶切割位点的任何跨膜结构域。γ分泌酶复合物及其底物蛋白(包括淀粉样前体蛋白(APP)和Notch)的结构和功能的详细描述可以例如在Zhang等人,Frontiers Cell Neurosci(2014)的最近综述中见到。来自1型跨膜受体的非限制性的合适TMD包括来自CLSTN1、CLSTN2、APLP1、APLP2、LRP8、APP、BTC、TGBR3、SPN、CD44、CSF1R、CXCL16、CX3CL1、DCC、DLL1、DSG2、DAG1、CDH1、EPCAM、EPHA4、EPHB2、EFNB1、EFNB2、ErbB4、GHR、HLA-A和IFNAR2的那些，其中TMD包含至少一个γ分泌酶切割位点。适合于本文所述的组合物和方法的另外的TMD包括但不限于来自1型跨膜受体IL1R1、IL1R2、IL6R、INSR、ERN1、ERN2、JAG2、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNE4、KL、CHL1、PTPRF、SCN1B、SCN3B、NPR3、NGFR、PLXDC2、PAM、AGER、ROBO1、SORCS3、SORCS1、SORL1、SDC1、SDC2、SPN、TYR、TYRP1、DCT、VASN、FLT1、CDH5、PKHD1、NECTIN1、PCDHGC3、NRG1、LRP1B、CDH2、NRG2、PTPRK、SCN2B、Nradd和PTPRM的跨膜结构域。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或Notch受体的TMD是衍生自钙同线蛋白家族成员如阿卡德因(alcadein)α和阿卡德因γ的TMD。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或Notch受体的TMD是Notch受体的已知的TMD。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或Notch受体的TMD是衍生自不同Notch受体的TMD。例如，在基于人Notch1的铰链-Notch受体中，Notch1 TMD可以被Notch2 TMD、Notch3 TMD、Notch4 TMD或来自非人动物如斑马鱼、黑腹果蝇、非洲爪蟾或原鸡的Notch TMD取代。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含与序列表中的SEQ ID NO:17、77和78中的一个或多个展现出至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含与选自NO:17、77和78的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含与选自NO:17、77和78的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含与NO:17、77和78中的一个或多个具有约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含具有选自NO:17、77和78的序列的氨基酸序列，其中NO:17、77和78中任一个中的氨基酸残基中的一个、两个、三个、四个或五个被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述TMD内的一个或多个氨基酸取代包含TMD的“GV”基序内的一个或多个取代。在一些实施方案中，一个或多个这样的取代中的至少一个是丙氨酸取代。例如，序列FMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ IDNO:17)以及SEQ ID NO:77或78中所示的序列的氨基酸残基中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个可以被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:17内“GV”基序的位置18和/或19处的氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，SEQ IDNO:17的位置18处的甘氨酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:17的位置19处的缬氨酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含具有对应于SEQ ID NO:17的序列的氨基酸序列，在对应于SEQ ID NO:17的位置18的位置处具有突变，如G18A突变。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含具有对应于SEQ IDNO:17的序列的氨基酸序列，在对应于SEQ ID NO:17的位置19的位置处具有突变，如V19A突变。
终止转移序列
在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽和铰链-Notch受体包含终止转移序列(STS)，所述终止转移序列构成位于TMD的C末端的高电荷结构域。不受任何特定理论的约束，设置在TMD与ICD之间的这种高电荷结构域防止ICD进入膜。所述STS按以下顺序连接至TMD和ICD：从N末端到C末端为TMD-STS-ICD。原则上，对所述STS的长度和/或氨基酸组成没有特别限制。在一些实施方案中，包含约4至约40个氨基酸残基(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个等的氨基酸残基)的任何任意单链肽可以用作STS。在一些实施方案中，所述STS包含约4至15、约6至20、约8至25、约10至30、约12至35、约14至40、约5至40、约10至35、约15至30、约20至25、约20至40、约10至30、约4至20、或约5至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述STS包含约4至10、约5至12、约6至14、约7至18、约8至20、约9至22、约10至24、或约11至26个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述STS包含约4至10个残基，如4、5、6、7、8、9至10个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述STS包含与来自Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、CLSTN1、CLSTN2、CSF1R、CXCL16、DAG1、GHR、PTPRF、AGER、KL、NRG1、LRP1B、Jag2、EPCAM、KCNE3、CDH2、NRG2、PTPRK、BTC、EPHA3、IL1R2或PTPRM的STS序列具有至少70％序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述STS包含在前4个残基中仅包含Lys(K)或Arg(R)的序列。在一些实施方案中，所述STS包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个碱性残基。在一些实施方案中，所述STS包含五个、四个、三个、两个、一个或零个芳族残基或具有疏水和/或庞大侧链的残基。
在一些实施方案中，所述STS包含与选自序列表中的SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80的序列具有至少80％序列同一性，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述STS包含与选自SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述STS包含与选自SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述STS包含与选自SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80的序列具有约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述STS包含具有选自SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80的序列的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80中任一个中的氨基酸残基中的一个、两个、三个、四个或五个被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述STS包含与来自Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、CLSTN1、CLSTN2、JAG2、PTPRF、LRP1B、NRG2、KCNE2、KCNE3、KCNE4、AGER、PKHD1、GHR、PTPRM、DAG1、NRG1、EPCAM、KL、PTPRK、CXCL16或表3和表4中列出的任一种的STS序列具有至少70％序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述STS包含在前4个残基中仅包含Lys(K)或Arg(R)的序列。在一些实施方案中，所述STS包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个碱性残基。在一些实施方案中，所述STS包含五个、四个、三个、两个、一个或零个芳族残基或具有疏水和/或庞大侧链的残基。
胞内结构域
本公开文本的嵌合多肽和铰链-Notch受体包含转录调节因子。本公开文本的转录调节因子是如下多肽元件，所述多肽元件用以激活或抑制启动子驱动的DNA序列的转录。适合于本公开文本的组合物和方法的转录调节因子可以是天然存在的转录调节因子，或者可以被工程化、设计或修饰以提供期望的和/或改善的特性，例如调节转录。如上所讨论，本公开文本的工程化受体的优点在于，它们可以提供在工程化细胞中触发定制转录程序的能力。在一些实施方案中，本公开文本的转录调节因子是驱动在工程化细胞中仅出现一次的特定序列的转录的定制转录调节因子。
在一些实施方案中，所述转录调节因子直接调节细胞的分化。在一些实施方案中，所述转录调节因子通过调节第二转录因子的表达来间接调节(例如，调控)细胞的分化。本领域普通技术人员将理解，转录调节因子可以是转录激活物或转录阻遏物。在一些实施方案中，所述转录调节因子是转录阻遏物。在一些实施方案中，所述转录调节因子是转录激活物。在一些实施方案中，所述转录调节因子还可以包含核定位信号。在一些实施方案中，所述转录调节因子选自Gal4-VP16、Gal4-VP64、tetR-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB和HAP1-VP16。在一些实施方案中，所述转录调节因子是Gal4-VP64。
本公开文本的嵌合多肽和铰链-Notch受体可以是任何长度的嵌合多肽，包括长度通常在约100个氨基酸(aa)至约1000个aa之间，例如约100个aa至约200个aa、约150个aa至约250个aa、约200个aa至约300个aa、约250个aa至约350个aa、约300个aa至约400个aa、约350个aa至约450个aa、约400个aa至约500个aa的嵌合多肽。在一些实施方案中，所公开的嵌合多肽的长度通常在约400个aa至约450个aa之间、约450个aa至约500个aa、约500个aa至约550个aa、约550个aa至约600个aa、约600个aa至约650个aa、约650个aa至约700个aa、约700个aa至约750个aa、约750个aa至约800个aa、约800个aa至约850个aa、约850个aa至约900个aa、约900个aa至约950个aa、或约950个aa至约1000个aa。在一些情况下，本公开文本的嵌合多肽的长度为约300个aa至约400个aa。在一些情况下，本公开文本的嵌合多肽的长度为约300个aa至约350个aa。在一些情况下，本公开文本的嵌合多肽的长度为约300个aa至约325个aa。在一些情况下，本公开文本的嵌合多肽的长度为约350个aa至约400个aa。在一些情况下，本公开文本的嵌合多肽的长度为750个aa至850个aa。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽的长度为约525个aa、约538个aa、约539个aa、约542个aa、约550个aa、约556个aa或约697个aa。
另外的结构域
在一些实施方案中，位于TMD的N末端的Notch胞外结构域还可以包含另外的结构域，例如膜定位信号如CD8A信号、可检测标记物如myc标签或his标签等。不受任何特定理论的约束，将另外的结构域并入铰链结构域的N末端可能是有益的。这是因为，将庞大特征(如NRR)邻近TMD并入将影响受体活性，除非其被足够远地间隔开。还考虑了如本文所述的嵌合多肽和铰链Notch受体可以被进一步工程化为包含一个或多个另外的特征如信号序列、可检测标记、肿瘤特异性切割位点、疾病特异性切割位点或其组合。例如，若干种蛋白酶(如基质金属蛋白酶)在癌症中上调，允许肿瘤特异性切割特异性不是经由特异性切割位点，而是经由更高水平的特异性蛋白酶。关于这一点的另外信息可以在例如J.S.Dudani等人,Annu.Rev.Cancer Biol.(2018),2:353–76中见到，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或铰链-Notch受体包含：(a)铰链结构域，其包含与SEQ ID NO:12-16和39-42中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，其包含与SEQ ID NO:17、77和78中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和(c)终止转移序列结构域，其包含与SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或铰链-Notch受体包含：(a)铰链结构域，其包含与SEQ ID NO:12-16和39-42中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，其包含与SEQ ID NO:17、77和78中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(c)终止转移序列结构域，其包含与SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或铰链-Notch受体包含：(a)铰链结构域，其包含与SEQ ID NO:12-16和39-42中的任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，其包含与SEQ ID NO:17、77和78中的任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和(c)终止转移序列结构域，其包含与SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80中的任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽包含与本文公开的嵌合受体具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供包含与序列表中标识的SEQ ID NO:1-8、24-35和73-76中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的嵌合多肽。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:24具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:26具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:28具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ IDNO:29具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:30具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:34具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:73具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:74具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:75具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:76具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
核酸分子
在另一方面，本文提供了包含编码本公开文本的嵌合多肽和铰链-Notch受体的核苷酸序列的各种核酸分子，包括含有这些核酸分子的表达盒和表达载体，这些核酸分子可操作地连接至异源核酸序列，例如允许在宿主细胞中体内表达受体的调节序列。
本公开文本的核酸分子可以具有以下任何长度，包括例如在约1.5Kb与约50Kb之间、在约5Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约30Kb之间、在约5Kb与约20Kb之间、或在约10Kb与约50Kb之间，例如在约15Kb至30Kb之间、在约20Kb与约50Kb之间、在约20Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约25Kb之间、或在约30Kb与约50Kb之间。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含编码嵌合多肽或铰链-Notch受体的核苷酸序列的核酸分子，所述嵌合多肽或铰链-Notch受体从N末端到C末端包含：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；(b)能够促进经由分子间二硫键合实现所述嵌合多肽的寡聚体形成的铰链结构域；(c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及(d)包含转录调节因子的胞内结构域，其中所述选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导设置在所述转录调节因子与所述铰链结构域之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包含Notch受体的LIN-12-Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达盒或表达载体中。应理解，表达盒通常包含遗传物质的构建体，所述构建体含有编码序列和足够的调节信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。通常，可以将所述表达盒插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或个体中。这样，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含：如本文公开的嵌合多肽的编码序列，所述编码序列可操作地连接至表达控制元件如启动子，以及任选的影响编码序列转录或翻译的其他核酸序列中的任一个或组合。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达载体中。本领域技术人员将理解，术语“载体”通常是指如下重组多核苷酸构建体，其被设计用于在宿主细胞之间转移并且可以用于转化的目的，例如将异源DNA引入宿主细胞中。这样，在一些实施方案中，所述载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以在其中插入另一个DNA区段以引起插入区段的复制。在一些实施方案中，所述表达载体可以是整合载体。
在一些实施方案中，所述表达载体可以是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，术语“病毒载体”广泛用于指包含衍生自病毒的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或指介导核酸转移的病毒颗粒，所述衍生自病毒的核酸元件通常有助于将核酸分子转移或整合到细胞的基因组中。病毒颗粒通常包含各种病毒组分，并且有时除一种或多种核酸外还包含宿主细胞组分。术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构性和/或功能性遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有包含主要衍生自慢病毒(为逆转录病毒的属)的结构性和功能性遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。
在一些实施方案中，本文提供了编码具有与本文公开的嵌合受体具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，本文提供了编码具有与序列表中标识的SEQ ID NO:1-8、24-35和73-76中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:1具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:4具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:5具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:6具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:7具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:8具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:24具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:25具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:26具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:27具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:28具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:29具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:30具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:31具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:32具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:33具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:34具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:35具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQID NO:73具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:74具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:75具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:76具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
可以针对在目的宿主细胞中的表达优化编码嵌合受体的核酸序列。例如，可以将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，如参考宿主细胞中表达的已知基因所计算的。密码子使用优化的方法是本领域已知的。可以优化本文公开的嵌合受体的编码序列内的密码子使用以增强在宿主细胞中的表达，使得编码序列内的密码子的约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或多达100％已针对特定宿主细胞中的表达进行优化。
本文公开的一些实施方案涉及载体或表达盒，所述载体或表达盒包含编码本文公开的嵌合受体的重组核酸分子。所述表达盒通常含有编码序列和足够的调节信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。可以将所述表达盒插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或个体中。可以将表达盒插入从能够进行基因组整合或自主复制的包含核酸分子的任何来源衍生的质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体(作为线性或环状的、单链或双链的DNA或RNA多核苷酸分子)中，其中一个或多个核酸序列已经以功能上操作性的方式连接，即可操作地连接。
本文还提供了含有编码本文公开的任何嵌合受体或铰链-Notch受体的核酸分子中的一个或多个的载体、质粒或病毒。所述核酸分子可以包含在载体内，所述载体能够引导所述核酸分子在例如已用所述载体转化/转导的细胞中表达。用于真核细胞和原核细胞的合适载体是本领域已知的，并且是可商购的或容易由技术人员制备的。参见例如Sambrook,J.和Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版).ColdSpring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中联合称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.New York,NY:Wiley(包括至2014年的补充)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.New York,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.San Diego:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy and Neuroscience Applications.SanDiego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).The Immunology Methods Manual:TheComprehensive Sourcebook of Techniques.San Diego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology.NewYork,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase ChainReaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:ALaboratory Manual(第2版).New York,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley,(包括至2014年的补充)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，其披露内容通过引用并入本文)。
可以经由常规转化或转染技术将DNA载体引入真核细胞中。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在以下文献中见到：Sambrook等人(2012年，同上)和其他标准分子生物学实验室手册，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、弹道引入、核穿孔、流体动力冲击和感染。
可以在本公开文本中使用的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如，Gluzman(编辑),Eukaryotic Viral Vectors,CSH Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.)。例如，如本文公开的嵌合受体可以在真核宿主如哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中产生。这些细胞可从许多来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)。在选择表达系统时，应注意确保组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。另外，如果在选择表达系统时需要指导，则技术人员可以查询P.Jones,“Vectors:Cloning Applications”,John Wiley and Sons,New York,N.Y.,2009)。
所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的那些序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽(例如，抗体)的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA，或合成DNA(如通过基于亚磷酰胺的合成产生的DNA))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。此外，所述核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。
核酸分子不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包含位于编码序列(例如，嵌合受体的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)来产生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情况下，分子可以例如通过体外转录产生。
重组细胞和细胞培养物
可以将本公开文本的核酸引入宿主细胞，例如人T淋巴细胞，以产生含有所述核酸分子的重组细胞。因此，本公开文本的一些实施方案涉及用于制备重组细胞的方法，所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的细胞以及(b)使所提供的细胞与本公开文本的重组核酸接触。
将本公开文本的核酸分子引入细胞可以通过本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
因此，在一些实施方案中，所述核酸分子可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物递送。例如，所述核酸分子可以稳定地整合在宿主基因组中，或者可以以附加体复制，或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于瞬时表达。因此，在一些实施方案中，所述核酸分子在所述重组宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，所述核酸分子稳定地整合到所述重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典的随机基因组重组技术或使用更精确的技术来实现，所述更精确的技术如指导RNA引导的CRISPR/Cas9基因组编辑，或用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌Argonaute)进行的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑，或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，所述核酸分子作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于瞬时表达。
所述核酸分子可以被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中，或者可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送手段和方法如电穿孔来递送。例如，可以通过病毒转导实现核酸向细胞中的引入。在一个非限制性例子中，腺相关病毒(AAV)可以被工程化为经由病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了若干种AAV血清型，并且所有已知的血清型可以感染来自多种不同组织类型的细胞。AAV能够在体内转导广泛的物种和组织，没有毒性证据，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。
衍生自慢病毒的载体系统也可用于经由病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了若干种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞二者；(iii)具有广泛的组织趋性，包括重要的基因疗法靶细胞类型和细胞疗法靶细胞类型；(iv)载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和产生的系统。
在一些实施方案中，可以用例如本申请的载体构建体对宿主细胞进行基因工程化(例如，转导或转化或转染)，所述载体构建体可以是例如病毒载体或用于同源重组的载体(包含与宿主细胞基因组的一部分同源的核酸序列)，或者可以是用于表达目的多肽的表达载体。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。
在一些实施方案中，所述重组细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞在体内。在一些实施方案中，所述细胞是离体的。在一些实施方案中，所述细胞在体外。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞，或干细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是免疫系统细胞，例如淋巴细胞(例如，T细胞或NK细胞)或树突细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞(TH)、细胞毒性T细胞(TCTL)或其他T细胞。在一些实施方案中，所述免疫系统细胞是T淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞。在所述细胞的一些实施方案中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是前体T细胞或T调节性(Treg)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD34+细胞、CD8+细胞或CD4+细胞。在一些实施方案中，所述细胞是选自幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和大量(bulk)CD8+T细胞的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在所述细胞的一些实施方案中，所述细胞是选自幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和大量CD4+T细胞的CD4+T辅助性淋巴细胞。在一些实施方案中，可以通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞。在一些实施方案中，所述受试者是人患者。
在一些实施方案中，所述重组细胞还包含如本文公开的第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子不具有相同的序列。在一些实施方案中，所述重组细胞还包含如本文公开的第一嵌合多肽或铰链-Notch受体和第二嵌合多肽或铰链-Notch受体，其中所述第一嵌合多肽或铰链-Notch受体和所述第二嵌合多肽或铰链-Notch受体不具有相同的序列。在一些实施方案中，所述第一嵌合多肽或铰链-Notch受体调节所述第二嵌合多肽或铰链-Notch受体的表达和/或活性。
在一些实施方案中，所述重组细胞还包含编码目的蛋白的表达盒，所述目的蛋白可操作地连接至启动子，其中所述目的蛋白的表达由嵌合受体转录调节因子调节。在一些实施方案中，所述目的蛋白对于所述重组细胞是异源的。异源蛋白是通常在细胞中见不到的蛋白质，例如通常不是由细胞产生的蛋白质。原则上，对于其表达可以由嵌合受体转录调节因子调节的合适蛋白质没有特别限制。适合于与本文公开的组合物和方法一起使用的蛋白质的示例性类型包括细胞因子、细胞毒素、趋化因子、免疫调节剂、促凋亡因子、抗凋亡因子、激素、分化因子、去分化因子、免疫细胞受体或报告物。在一些实施方案中，所述免疫细胞受体是T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述免疫细胞受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，将编码目的蛋白的表达盒并入编码本公开文本的嵌合受体的相同核酸分子中。在一些实施方案中，将编码目的蛋白的表达盒并入与编码本公开文本的嵌合受体的核酸分子分开的第二表达载体中。在另一方面，本文提供了细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种如本文公开的重组细胞和培养基。通常，所述培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。用于转化多种多样的上述宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包含至少一种如本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适合于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。
药物组合物
在一些实施方案中，本公开文本的核酸和重组细胞可以并入组合物(包括药物组合物)中。这样的组合物通常包含核酸和/或重组细胞，以及药学上可接受的赋形剂，例如载体。
适合于注射使用的药物组合物包含无菌水溶液(水溶性的)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应是无菌的并且应是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应是稳定的并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，通常在所述组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)和氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。
在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽和Notch受体还可以通过转染或感染使用本领域已知的方法来施用，所述方法包括但不限于以下文献中描述的方法：McCaffrey等人(Nature 418:6893,2002)；Xia等人(Nature Biotechnol.20:1006-10,2002)；或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.53:151-60,1996,勘误于Am.J.Health Syst.Pharm.53:325,1996)。
本公开文本的方法
本文所述的治疗组合物中的任一种(例如，核酸、重组细胞和药物组合物)的施用可以用于治疗患者的相关健康状况或疾病，如癌症和慢性感染。在一些实施方案中，可以将本文所述的核酸、重组细胞和药物组合物并入治疗剂中以用于治疗患有、怀疑患有或者可能有高风险患上一种或多种与检查点抑制相关的自身免疫障碍或疾病的方法中。示例性的自身免疫障碍和疾病可以包括而不限于乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
因此，在一个方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于抑制个体中靶细胞的活性的方法，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含如本文公开的核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种，其中所述第一疗法抑制所述靶细胞。例如，如果所述靶细胞的增殖减少，如果其病理或致病行为减少，如果其被破坏或杀死等，则可以抑制所述靶细胞。抑制包括所测量的病理或致病行为减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效数量的本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞抑制所述个体中所述靶细胞的活性。通常，所公开的方法的靶细胞可以是个体中的任何细胞类型，并且可以是例如急性骨髓瘤白血病细胞(acutemyeloma leukemia cell)、间变性淋巴瘤细胞、星形细胞瘤细胞、B细胞癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、室管膜瘤细胞、食管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、少突神经胶质瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、外周T细胞淋巴瘤细胞、肾癌细胞、肉瘤细胞、胃癌细胞、癌细胞(carcinoma cell)、间皮瘤细胞或肉瘤细。在一些实施方案中，所述靶细胞是致病细胞。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含如本文公开的包含嵌合多肽或铰链Notch受体的重组细胞和/或如本文公开的药物组合物中的一种或多种，其中所述第一疗法治疗所述个体的健康状况。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含有效数量的如本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞治疗所述健康状况。
在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于辅助治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括向所述个体施用第一疗法和第二疗法，所述第一疗法包含如本文公开的嵌合多肽、铰链-Notch受体、核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种，其中所述第一疗法和所述第二疗法一起治疗所述个体的疾病。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含有效数量的如本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞治疗所述健康状况。
向个体施用重组细胞
在一些实施方案中，本公开文本的方法涉及将有效量的本公开文本的重组细胞施用于需要这种治疗的个体。此施用步骤可以使用本领域中的任何植入递送方法来完成。例如，可以将本公开文本的重组细胞直接输注到个体的血流中或以其他方式施用于所述个体。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将重组细胞通过导致将引入的细胞至少部分定位在期望部位从而产生一种或多种期望的作用的方法或途径施用(该术语与术语“引入”、“植入”和“移植”可互换使用)于个体。可以通过任何适当的途径施用重组细胞或其分化的后代，所述适当的途径导致递送至个体的期望位置，所施用的细胞或细胞组分的至少一部分在此位置保持存活。在施用于个体后细胞的活力时间段可以短至数小时，例如二十四小时，至数天，至长至数年，或甚至个体的寿命，即长期移植。
当预防性提供时，可以将本文所述的重组细胞在待治疗的疾病或病症的任何症状出现之前施用于个体。因此，在一些实施方案中，重组细胞群的预防性施用预防疾病或病症的症状的发生。
当在一些实施方案中以治疗方式提供时，在疾病或病症的症状或指征发作时(或之后)，例如在疾病或病症发作时，提供重组细胞。
为了在本文所述的各种实施方案中使用，如本文公开的重组细胞的有效量可以是至少102个细胞、至少5×102个细胞、至少103个细胞、至少5×103个细胞、至少104个细胞、至少5×104个细胞、至少105个细胞、至少2×105个细胞、至少3×105个细胞、至少4×105个细胞、至少5×105个细胞、至少6×105个细胞、至少7×105个细胞、至少8×105个细胞、至少9×105个细胞、至少1×106个细胞、至少2×106个细胞、至少3×106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少6×106个细胞、至少7×106个细胞、至少8×106个细胞、至少9×106个细胞、或其倍数。所述重组细胞可以源自一个或多个供体或者可以从自体来源获得。在一些实施方案中，将所述重组细胞在施用于有需要的个体之前在培养物中扩增。
在一些实施方案中，通过方法或途径将重组细胞组合物(例如，包含根据本文所述的任何细胞的多个重组细胞的组合物)递送至个体体内导致将细胞组合物至少部分定位于期望部位。可以通过任何导致个体中的有效治疗的适当途径施用包含重组细胞的组合物，例如，施用导致递送至个体中的期望位置，在该期望位置处所递送组合物的至少一部分例如至少1×104个细胞被递送至期望部位保持一段时间。施用方式包括注射、输注、滴注。“注射”包括而不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，通过注射或输注进行递送是优选的施用方式。
在一些实施方案中，将所述重组细胞例如经由输注或注射全身施用。例如，不是直接将重组细胞群施用于靶部位、组织或器官，而是使其进入个体的循环系统，从而进行代谢和其他类似的生物过程。
包含本文提供的任何组合物的用于治疗疾病或病症的治疗的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，本领域技术人员将理解，如果疾病的任何一种或全部体征或症状或标记物得到改善或改进，则认为治疗是有效的。还可以通过如由减少住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病进展停止或至少减缓)所评估的个体恶化的失败来测量疗效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；以及(3)预防或减少症状发展的可能性。
如上文所讨论的，治疗有效量包括治疗组合物当施用于个体时足以促进特定有益作用的量，所述个体如患有、怀疑患有或有风险患上疾病的个体。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病的症状的量。应理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的有效量。
在所公开的方法的一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述个体患有或怀疑患有与由细胞表面配体或抗原介导的细胞信号传导的抑制相关的疾病。适合于通过本公开文本的组合物和方法治疗的疾病包括但不限于癌症、自身免疫病、炎性疾病和感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症或慢性感染。
另外的疗法
如上所讨论的，可以将本文所述的重组细胞和药物组合物与一种或多种另外的治疗剂例如化学治疗剂或抗癌剂或抗癌疗法组合施用。与一种或多种另外治疗剂“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂、化学治疗剂、抗癌剂或抗癌疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。“化学疗法”和“抗癌剂”在本文中可互换使用。可以使用各种类别的抗癌剂。非限制性例子包括：烷化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、鬼臼毒素、抗体(例如，单克隆或多克隆的)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA0003648112840000291
或
Figure BDA0003648112840000292
))、激素治疗、可溶性受体和其他抗肿瘤药。
用于调节细胞的活性的方法
在另一方面，本文提供了用于调节细胞的活性的各种方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供有效量的本文提供的重组细胞中的任一种，以及(b)使其与选定的配体接触，其中所述选定的配体与胞外配体结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并释放转录调节因子，其中所释放的转录调节因子调节所述重组细胞的活性。本领域技术人员在阅读本公开文本后将理解，所公开的方法可以在体内、离体或体外进行。
可以使用本文提供的方法调节的非限制性示例性细胞活性包括但不限于基因表达、增殖、凋亡、非凋亡性死亡、分化、去分化、迁移、基因产物的分泌、细胞粘附和细胞溶解活性。
在一些实施方案中，所释放的转录调节因子调节细胞的基因产物的表达。在一些实施方案中，所释放的转录调节因子调节细胞中异源基因产物的表达。异源基因产物是通常在天然细胞中见不到的基因产物，例如通常不是由细胞产生的基因产物。例如，可以用包含编码所述异源基因产物的核苷酸序列的核酸对细胞进行遗传修饰。
在一些实施方案中，所述异源基因产物是分泌的基因产物。在一些实施方案中，所述异源基因产物是细胞表面基因产物。在一些情况下，所述异源基因产物是胞内基因产物。在一些实施方案中，所释放的转录调节因子同时调节细胞中两种或更多种异源基因产物的表达。
在一些实施方案中，所述细胞中的异源基因产物选自趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生的蛋白质、增殖诱导剂、受体、RNA指导的核酸酶、位点特异性核酸酶、T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、毒素、毒素衍生的蛋白质、转录调节因子、转录激活物、转录阻遏物、翻译调节因子、翻译激活物、翻译阻遏物、激活性免疫受体、抗体、凋亡抑制剂、凋亡诱导剂、工程化的T细胞受体、免疫激活物、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
在一些实施方案中，所释放的转录调节因子调节所述细胞的分化，并且其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、祖细胞或前体细胞。
当使用相同的结合结构域和ICD时，本公开文本的嵌合受体与标准SynNotch受体相比提供更高程度的表达。根据配体/结合结构域对及其亲和力，本公开文本的嵌合多肽或铰链-Notch受体与对应的SynNotch受体相比可以提供高约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的表达增强。
另外，本公开文本的嵌合受体可以提供转录调节，所述转录调节响应于T细胞激活的程度，而与配体结合无关。例如，当在T细胞中表达时，本公开文本的一些受体在T细胞被激活时提供的由配体诱导的信号比在T细胞未被激活时提供的由配体诱导的信号更强。这允许在使用中具有额外的灵活性，例如在尽管不存在嵌合受体配体但当被激活时仍期望增强或阻遏T细胞应答的情况下。
系统和试剂盒
本文还提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包含本文提供和描述的嵌合多肽、铰链-Notch受体、重组核酸、重组细胞或药物组合物以及用于制备和使用它们的书面说明书。例如，在一些实施方案中，本文提供了包含以下中的一种或多种的系统和/或试剂盒：如本文所述的嵌合多肽、如本文所述的铰链-Notch受体、如本文所述的重组核酸、如本文所述的重组细胞、或如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本公开文本的系统和/或试剂盒还包含用于向个体施用所提供的嵌合多肽、铰链-Notch受体、重组核酸、重组细胞或药物组合物中的任一种的一个或多个注射器(包括预填充注射器)和/或导管(包括预填充注射器)。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述治疗剂可与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于期望目的，例如用于调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)。
任何上述系统和试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照多肽、阳性对照多肽、用于体外产生所述嵌合受体多肽的试剂。
在一些实施方案中，系统或试剂盒的组分可以在分开的容器中。在一些其他实施方案中，系统或试剂盒的组分可以组合在单个容器中。
在一些实施方案中，系统或试剂盒还可以包含使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在基材如纸或塑料等上。所述说明书可以作为包装插入物存在于试剂盒中、试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或分包装相关联)等。所述说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情形下，实际说明书不存在于所述试剂盒中，而是可以提供用于从远程源(例如，经由互联网)获得所述说明书的手段。这个实施方案的例子是包括网址的试剂盒，在其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
本公开文本中所提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且诸位发明人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但是该提及并不意味着承认这些文件中的任何文件构成了本领域中公知常识的一部分。
本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本之后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
在整个说明书中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。本文引用的所有专利、专利申请和其他出版物的披露内容出于所有目的特此通过引用以其整体并入。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且诸位发明人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但是该提及并不意味着承认这些文件中的任何文件构成了本领域中公知常识的一部分。
实施例
除非另有说明，否则本公开文本的实践将采用本领域技术人员众所周知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。在上面引用的文献中对此类技术进行了充分解释。
在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。
实施例1
嵌合受体和应答元件构建体的设计和构建
此实施例描述了嵌合Notch受体家族的设计和构建。本公开文本的各种示例性受体的详细信息可以在下表1和表2中见到。
表1.这个表提供了对如序列表中所示的嵌合Notch受体、其对应组分以及对应序列标识符中的每一种的简要描述。ECD：胞外结构域；N-JMD：N末端近膜结构域(即，铰链结构域)；TMD：跨膜结构域；STS：终止转移序列；TF：转录因子。
Figure BDA0003648112840000311
Figure BDA0003648112840000321
Figure BDA0003648112840000331
表2.这个表提供了对每种嵌合Notch受体和相应组分(其中组分由逗号分开)的简要描述。除非另有说明，否则条目是指人来源的蛋白质。例如，“Notch1，Notch1”指示将来自Notch1的两个序列融合以产生此蛋白模块。
Figure BDA0003648112840000341
Figure BDA0003648112840000351
Figure BDA0003648112840000361
通过将识别CD19(Porter DL等人,2011)、ALPPL2(FYIA)、BCMA、Her2或抗BCMA完全人源化VH结构域的单链抗原结合片段(scFv)融合至对应的受体支架和合成的转录调节因子GAL4-VP64，构建以上表1-表2中所述的嵌合受体。为了构建这些受体，将编码表1和序列表中提供的氨基酸序列的DNA片段从合成的基因片段或含有指定蛋白质的DNA序列的质粒PCR扩增，并且使用标准克隆技术(例如，突出端PCR、融合PCR和In-fusion克隆)用侧翼翻译起始和终止序列组装到慢病毒表达载体pHR-SIN-pGK(L.Morsut等人,Cell(2016)164:780-91；Addgene质粒#76120)的BamHI克隆位点中。
用于这些实验的转录调节因子GAL4-VP64含有与激活结构域VP64融合的来自酵母GAL4转录因子的DNA结构域，所述激活结构域VP64由单纯疱疹蛋白VP16的最小激活结构域(氨基酸437-447)的四聚体重复组成。如表2中所展示，大多数示例性受体含有用于膜靶向的N末端CD8α信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARP)(SEQ ID NO:21)，而一种示例性受体(pIZ343eGFP)含有小鼠IgKVIII信号肽。此外，大多数示例性受体含有myc标签(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:22)，从而用缀合至荧光染料(α-myc
Figure BDA0003648112840000363
Cell SignalingTechnology,目录号2233)的抗体适当地确定表面表达。对于以下实施例3-4所述的所有原代T细胞实验，将受体各自克隆到含有磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的修饰的慢病毒pHR'SIN:CSW载体(KT Roybal等人,Cell 2016年10月6日；167(2):419–32)中。
pHR'SIN:CSW载体也被修饰以产生应答元件质粒。为此目的，将用于结合GAL4 DBD结构域(GGAGCACTGTCCTCCGAACG)(SEQ ID NO:23)的靶序列的五个拷贝克隆至最小pybTATA启动子的5'侧。应答元件质粒中还包含组成型驱动黄色荧光报告蛋白(mCitrine)表达以适当地鉴定成功转导的T细胞的PGK启动子。
为了构建所有诱导型BFP载体，经由位于GAL4应答元件的3'侧的多克隆位点中的BamHI位点克隆蓝色荧光报告蛋白(BFP)的编码序列。为了构建所有诱导型CAR载体，将CAR在C末端用绿色荧光报告蛋白(GFP)标记，并且经由位于GAL4应答元件3'侧的多克隆位点中的BamHI位点克隆。所有构建体都是根据制造商的说明书经由克隆试剂盒(
Figure BDA0003648112840000362
克隆，Clontech#ST0345)克隆的。
实施例2
原代人T细胞分离和培养
此实施例描述了原代人T细胞的分离和培养，所述原代人T细胞随后用于以下实施例3中描述的各种细胞转导实验。
在这些实验中，原代CD4+T细胞和原代CD8+T细胞在单采术后从血液中分离，并且使用人T细胞分离试剂盒(人CD4+和CD8+富集混合物；STEMCELL Technologies目录号15062和15063)通过阴性选择富集。血液获自太平洋血液中心(Blood Centers of the Pacific)(加利福尼亚州旧金山市)，如大学机构审查委员会(University Institutional ReviewBoard)批准的。将T细胞冷冻保存在具有20％人AB血清(Valley Biomedical Inc.，#HP1022)和10％DMSO的生长培养基(RPMI-1640，UCSF细胞培养核心)中。解冻后，对于所有实验，在补充有30单位/毫升IL-2(NCI BRB临床前储存库)的含有X-VIVOTM 15(Lonza#04-418Q)、5％人AB血清和10mM中和的N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich#A9165)的人T细胞培养基中培养T细胞。
实施例3
用慢病毒载体稳定转导人T细胞
除非本说明书中另有说明，否则该实施例描述了用于人T细胞的慢病毒转导的一般方案。
通常，经由用pHR'SIN:CSW转基因表达载体和病毒包装质粒pCMVdR8.91和pMD2.G使用Mirus
Figure BDA0003648112840000371
(Mirus，#MIR 6606)转染Lenti-XTM 293T细胞(Clontech#11131D)产生用水疱性口炎病毒包膜G蛋白(VSV-G)假型化的慢病毒载体(泛嗜性载体)。通常，将原代T细胞在同一天解冻，并且在培养24小时后，用具有结合至表面的抗CD3抗体和抗CD28抗体的珠粒(人T激活物CD3/CD28
Figure BDA0003648112840000372
Life Technologies#11131D)以1:3细胞:珠粒比刺激原代T细胞。在48小时，收获病毒上清液，并且将原代T细胞暴露于病毒，持续24小时。在T细胞刺激后第5天，去除珠粒，并且进行T细胞扩增，直到第14天，此时它们静止并且可以用于测定。用Beckton Dickinson(BD Biosciences)FACSAriaTM II流式细胞仪分选T细胞用于测定。在分选期间门控出展现基础CAR表达的与门T细胞。
实施例4
体外刺激原代T细胞
除非本说明书中另有说明，否则此实施例描述了为了展现本文所述的嵌合铰链-Notch多肽对原代T细胞的体外刺激而进行的实验。
对于所有体外T细胞刺激，将1×105个T细胞与发送细胞以1:1比率在平底96孔组织培养板中共培养。在24小时用BD FortessaTM X-50分析培养物的报告物激活。所有流式细胞术分析都在FlowJoTM软件(TreeStar,Inc.)中进行。
实施例5
原代T CD4+T细胞中CD8铰链-Notch受体的设计、表达和激活
此实施例描述了CD8铰链-Notch受体的设计，以及为了评价它们在原代T CD4+T细胞中的表达和激活而进行的实验的结果。构建了CD8铰链-Notch受体的两种变体。如图2A中所示，在左小图中示出了示例性SynNotch1受体，所述SynNotch1受体基于人Notch1蛋白设计。中间小图示意性地示出了示例性CD8铰链-Notch1受体。与左小图中的SynNotch1受体相比，CD8铰链-Notch1受体用CD8铰链结构域替代NRR，所述CD8铰链结构域含有已知形成二硫键的半胱氨酸残基。右小图示意性地示出了示例性截短的CD8铰链-Notch1受体(truncCD8铰链-Notch1)。与CD8铰链-Notch1受体相比，truncCD8铰链-Notch1受体含有CD8铰链序列的C末端缺失，留下单个半胱氨酸残基和较短的胞外区。图2B是受体表达的流式细胞术数据的汇总。在这些实验中，将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用表达受体或转录报告物构建体的两种慢病毒构建体转导。使用AlexaFluor647标记的抗myc抗体(Cell Signaling)测量受体表达。通过在报告质粒上发现的组成型mCitrine基因测量报告物表达。在初始T细胞刺激后第5天分选双阳性细胞，并且进一步扩增用于激活测试。图2C汇总了受体激活测试的结果。在这些实验中，将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下共培养24小时：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。在此实施例中描述的结果展现出CD8铰链-Notch受体和truncCD8铰链-Notch1两者都在原代T CD4+T细胞中表达。
实施例6
用T细胞刺激激活CD8铰链受体
此实施例描述了为了展现由本文所述的CD8铰链-Notch受体介导的基因激活与并行的T细胞激活而进行的实验的结果。这些实验使用与上面在实施例5中描述的相同CD8铰链-Notch受体变体进行。具有并行的T细胞激活的受体激活测试的结果示于图3B中。在这些实验中，为了模拟T细胞激活，使用抗MCAM、抗CD3双特异性T细胞接合器(MCAM BiTE)，所述双特异性T细胞接合器在K562细胞的存在下激活T细胞受体。将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下共培养24小时：MCAM BiTE(上部迹线)、1x105个K562细胞+MCAM BiTE(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞+MCAM BiTE(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。在此实施例中描述的结果展现出CD8铰链-Notch受体和truncCD8铰链-Notch1两者都可以在有或没有并行的T细胞激活的情况下激活转录。
实施例7
CD8铰链优化
此实施例描述了为了在嵌合Notch受体的背景下优化CD8铰链结构域而进行的实验的结果。测试了CD8铰链结构域的四种变体：truncCD8铰链1、truncCD8铰链2、truncCD8铰链3和truncCD8铰链4。这些CD8铰链结构域变体之间的结构差异示于图4A中，其中铰链组分表示为“a”、“b”、“c”和“d”。组分“a”表示第一半胱氨酸残基的N末端区域。组分“b”表示第一半胱氨酸残基。组分“c”表示在第一半胱氨酸残基与第二半胱氨酸残基之间的区域。组分“d”表示第二半胱氨酸残基和从第二半胱氨酸残基到受体跨膜结构域的区域。图4B汇总了在Jurkat T细胞中受体激活测试的结果。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。图4C示出了来自图4B中的数据的BFP阳性细胞％的量化。在此实施例中描述的结果展现出CD8铰链结构域的所有四种变体可以激活转录，如通过BFP表达水平所测量的。然而，truncCD8铰链1-Notch1和truncCD8铰链2-Notch1受体是最佳的，因为它们用配体激活转录至高水平，并且展现出最小的配体非依赖性转录调节(图4B)。
实施例8
具有并行的PKC信号传导的TruncCD8铰链2受体激活测试
此实施例描述了来自为了测试由以上实施例7中描述的truncCD8铰链2受体介导的基因激活以及并行的PKC信号传导而进行的实验的结果。在这些实验中，为了模拟PKC信号传导，添加了佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(DAG类似物)。如图5中所示，将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下在有和没有PMA的情况下共培养24小时：没有另外的细胞(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。此实施例中描述的结果展现出在有或没有并行的PKC信号传导的情况下，truncCD8铰链2-Notch1可以激活转录。
实施例9
来自替代性来源的铰链结构域的测试
此实施例描述了来自用含有衍生自其他来源的替代性铰链结构域的铰链-Notch受体而进行的实验的结果。在这些实验中，用衍生自CD28、OX40和IgG4的铰链结构域构建铰链-Notch受体(参见例如，图6A)。测试了四种示例性铰链-Notch受体：pIZ343(截短的CD8铰链2-Notch)、pIZ358(CD28铰链-Notch)、pIZ360(OX40铰链-Notch)、pIZ359(IgG4铰链-Notch)。铰链-Notch受体中的每一种的简要描述也提供在表2中。如图6B中所示，铰链-Notch构建体pIZ343(截短的CD8铰链-Notch)、pIZ358(CD28铰链-Notch)、pIZ360(OX40铰链-Notch)、pIZ359(IgG4铰链-Notch)中的每一种能够刺激原代T细胞，如通过BFP报告基因的表达所确定的。用受体构建体转导先前产生的报告物阳性Jurkat T细胞系。使用AlexaFluor647标记的抗myc抗体(Cell Signaling)测量受体表达。对于受体激活测试，将1x105个表达抗CD19受体的Jurkat T细胞与以下共培养24小时：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BDBiosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。图6B描绘了来自图6A中的测试结果的BFP阳性细胞％的量化。此实施例中描述的实验展现出除了CD8A外，其他可用的铰链结构域还可以衍生自替代性来源，如CD28、OX40和IgG4。
实施例10
含有替代性配体识别结构域的铰链-Notch受体的测试
此实施例描述了来自为了测试含有替代性配体识别结构域的铰链-Notch受体而进行的实验的结果。
如图7A中展现的，除了抗CD19 scFv之外，抗ALPPL2 scFv和eGFP也可以用作配体识别结构域。如图7B中所示，用受体构建体转导先前产生的报告物阳性Jurkat T细胞系。使用AlexaFluor647标记的抗myc抗体(Cell Signaling)测量受体表达。对于受体激活测试，将1x105个表达抗CD19受体的Jurkat T细胞与以下共培养24小时：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个ALPPL2+K562细胞/1x105个在细胞表面上表达抗GFP纳米抗体的K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。此实施例中描述的实验展现出除了CD19之外，其他可用的配体识别结构域还可以衍生自替代性来源。
实施例11
含有替代性终止转移序列(STS)的铰链-Notch受体的测试。
此实施例描述了来自为了测试含有替代性STS的铰链-Notch受体而进行的实验的结果。
如图8A中所展示，除了Notch1 STS之外，还可以使用另一STS(例如，Notch2STS、Notch4 STS、DAG STS、PTPRF STS和KL STS)来影响受体行为。在这些实验中，将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用表达受体或转录报告物构建体的两种慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天分选受体/报告物阳性细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下共培养24小时：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。图8B描绘了图8A中的激活数据的量化。此实施例中描述的实验展现出除了Notch1 STS之外，其他可用的终止转移序列还可以衍生自替代性来源。
实施例12
报告物Jurkat T细胞的产生
此实施例描述了报告物Jurkat T细胞的产生，随后将所述报告物Jurkat T细胞用于测试本文所述的各种铰链-Notch受体。
在这些实验中，用携带诱导型BFP报告基因和组成型mCitrine报告基因的报告质粒慢病毒转导E6-1 Jurkat T细胞(ATCC#TIB-152)，如先前所述(K.T.Roybal等人,Cell,164:1-10,2016)。使用Beckton Dickinson(BD Biosciences)FACSAriaTM II流式细胞仪针对mCitrine表达分选报告物阳性Jurkat细胞并且进行扩增。
用受体转基因表达载体产生慢病毒颗粒，如先前所述(L.Morsut等人,Cell(2016)164:780-91)。用单独的受体转导报告物阳性Jurkat细胞，并且在96孔板中扩增用于实验。
实施例13
此实施例描述了为了展现本文所述的嵌合铰链-Notch多肽对Jurkat T细胞的体外刺激而进行的实验。
测试了四种CD8铰链-Notch变体。图4A示意性地展示了包含一个或多个铰链组分的四种CD8铰链-Notch截短变体。图4B汇总了为了测试Jurkat T细胞中的受体激活而进行的实验的结果。在这些实验中，用CD8铰链-Notch变体中的每一种转导先前产生的报告物阳性Jurkat T细胞系。使用AlexaFluor647标记的抗myc抗体(Cell Signaling)测量受体表达。对于受体激活测试，将1x105个表达抗CD19受体的Jurkat T细胞与以下共培养24小时：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。从此测试中，确定truncCD8铰链2是最佳构型，并且将其用于随后的研究。图4C示出了来自图4B中的数据(无添加、具有K562、具有CD19+K562细胞)的BFP阳性细胞％的量化。图4D是来自图4B中的数据的信噪比的图。将来自用CD19+K562刺激的Jurkat T细胞的值除以来自用K562细胞刺激的Jurkat T细胞的值。
实施例14
此实施例描述了为了优化本文所述的嵌合CD8铰链-Notch多肽而进行的实验。
制备了多种示例性CD8铰链截短变体。如图9A中所示，示例性变体包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:12)的全长或截短形式，这些形式对应于构建体pIZ341的N-JMD结构域。黑色棒指示构成每种变体的氨基酸。作为结果，图9A-图9C中用于比较的变体是：“全长”变体，其包含SEQ ID NO:12；“Trunc 1”变体，其包含SEQ IDNO:39；“Trunc 2”变体，其包含SEQ ID NO:13；“Trunc 3”变体，其包含SEQ ID NO:40；以及“Trunc 4”变体，其包含SEQ ID NO:41。这些CD8铰链变体的表达的比较示于图9B中。具体地，将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达铰链截短变体受体，而另一种慢病毒构建体表达BFP转录报告物加抗ALPPL2 CAR。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。图9B的左侧五个小图示出了通过抗myc标签染色测量的每种受体的相对表达水平(y轴)与通过GFP测量的报告物构建体表达水平(x轴)的关系。图9B的最右侧小图示出了在双阳性细胞中CD8铰链变体的受体表达的MFI量化。如图9C的每个小图中从顶到底所示，将表达抗CD19受体的T细胞与以下共培养：无添加(顶部迹线)、ALPPL2+K562细胞(从顶部起第二个迹线)、CD19+K562细胞(从顶部起第三个迹线)、或ALPPL2+CD19+(底部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
实施例15
此实施例描述了为了展现具有不同配体结合结构域的铰链-Notch构建体的激活及这些构建体对ADAM蛋白酶和γ分泌酶的蛋白水解活性的依赖性而进行的实验。
制备了三种示例性铰链-Notch构建体，包括一种具有抗CD19 scFv(作为配体识别结构域)和Notch2 STS结构域的构建体，另一种具有抗LaG17纳米抗体(作为配体识别结构域)和Notch2 STS结构域的构建体，以及第三种具有eGFP胞外结构域和Notch1 STS结构域的构建体。将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有指示的结合头截短变体受体的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物(图10)。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养：1x105个K562细胞(顶部迹线)、1x105个配体+K562细胞(从顶部起第二个迹线)、1x105个配体+K562细胞及ADAM10抑制剂(从顶部起第三个迹线)、或1x105个配体+K562细胞及γ分泌酶抑制剂DAPT(底部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
实施例16
此实施例描述了为了展现具有扩展组的配体结合结构域的示例性Notch2 STS铰链-Notch构建体的激活特征而进行的实验。
用针对BCMA抗原的不同结合头进行测试。将原代CD4+人T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有指示的结合头铰链Notch受体的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养两天：无添加(上部迹线)、1x105个K562细胞(中间迹线)、或1x105个BCMA+K562细胞(下部迹线)(图11A)。随后使用Fortessa X-50(BDBiosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。在图11A中，左小图是指具有抗BCMAscFv结合头的构建体，中间小图是指具有抗BCMA完全人源化VH结合头的构建体，并且右小图是指具有具备针对结合结构域优化的铰链结构域(铰链5)的抗BCMA完全人源化VH结合头的构建体。
类似地测试SIRPa结合头。将原代CD8+人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有指示的结合头铰链Notch受体的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养两天：无添加(蓝色)或1x105个如指示的K562细胞(红色)(图11B)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
测试并比较了针对HER2抗原的不同scFv。将原代CD4+人T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有指示的结合头铰链Notch受体的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养两天：无添加(顶部迹线)、贴壁HEK 293T细胞(从顶部起第二个迹线)、贴壁MBMDA-468细胞(从顶部起第三个迹线)、贴壁MCF7细胞(从顶部起第四个迹线)、或贴壁SKBR3细胞(底部迹线)(图11C)。随后使用Fortessa X-50(BDBiosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。在图11C中，左小图代表抗HER2 4D5-7scFv结合头，而右小图代表抗HER2 4D5-8 scFv结合头。
实施例17
此实施例描述了为了比较具有不同启动子和STS结构域的铰链-Notch变体的激活而进行的实验。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的双阳性T细胞与以下共培养：无添加(顶部迹线)、1x105个ALPPL2+K562细胞(从顶部起第二个迹线)、1x105个CD19+K562细胞(从顶部起第三个迹线)、或1x105个ALPPL2+CD19+K562细胞(底部迹线)(图12)。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。包括使用鼠原始SynNotch构建体和人原始SynNotch构建体的激活用于比较。
实施例18
此实施例描述了铰链-Notch构建体中Notch1跨膜结构域(TMD)的突变分析。
制备在铰链-Notch构建体的TMD结构域中具有不同丙氨酸突变的变体。在铰链-Notch的TMD中从301位(F)至322位(S)的每个氨基酸残基单独突变为丙氨酸。将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达TMD突变体变体，而另一种慢病毒构建体含有BFP转录报告物。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。在图13A中，左小图示出了通过抗myc标签染色测量的不同受体的相对表达(y轴)与报告物构建体标记物表达(x轴)的关系，而右小图代表了在双阳性细胞中TMD突变体变体的受体表达的MFI量化。
如图13B中所示，将表达抗CD19受体的T细胞与对照CD19(-)K562细胞或对照CD19(+)K562细胞以1:1的比率共培养。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。左小图示出了激活概况的流式图。右小图代表绘制为线图的BFP％。结果指示TMD的C末端中甘氨酸(G)残基和缬氨酸(V)残基的重要性。
实施例19
此实施例描述了针对铰链-Notch构建体中跨膜结构域(TMD)和STS结构域的突变分析。
在此实施例中使用四种类型的示例性铰链Notch受体(SEQ ID NO:73-76)，所有这些都包含抗CD19 scFv结构域、截短的CD8铰链结构域和Gal4VP64结构域。对于STS和TMD结构域的选择，这四种构建体包含：CLSTN1 TMD和CLSTN1 STS(SEQ ID NO:73)、CLSTN2 TMD和CLSTN2 STS(SEQ ID NO:74)、CLSTN1 TMD和Notch1 STS(SEQ ID NO:75)、CLSTN2 TMD和Notch1 STS(SEQ ID NO:76)。将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有所指示的TMD/STS组合的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物及组成型表达的抗ALPPL2 CAR。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如图14中所示，将1x105个表达受体的双阳性T细胞与以下共培养：1x105个K562细胞(“-CAR”小图，蓝色)、或1x105个CD19+K562细胞(“-CAR”小图，红色)。类似地，在存在CAR活性的情况下，通过与1x105个ALPPL2+K562细胞(“+CAR”小图，蓝色)或1x105个ALPPL2+CD19+K562细胞(“+CAR”小图，红色)共培养，测试1x105个表达受体的双阳性T细胞。随后使用Fortessa X-50(BDBiosciences)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。
实施例20
此实施例描述了没有另外的T细胞刺激的情况下铰链Notch STS变体的激活特征的表3。
将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物及组成型表达eGFP标记的抗ALPPL2 CAR。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将表达受体的T细胞与K562细胞或CD19+K562细胞共培养。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量BFP报告基因。将来自在CD19+K562相比K562条件下BFP+细胞的MFI的信噪比相对于在这两种条件下MFI的Δ变化作图，如在下表3中。
表3.此表提供了在没有用ALPPL2+K562刺激共表达的抗ALPPL2 CAR的情况下的数据。“仅报告物”代表报告质粒，并且在所有样品中表达。
Figure BDA0003648112840000431
实施例21
此实施例描述了在T细胞刺激的情况下铰链Notch STS变体的激活特征的表4。
将原代人CD4+T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物及组成型表达eGFP+抗ALPPL2 CAR。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。为了测试，将表达受体的T细胞与K562细胞或CD19+K562细胞共培养。随后使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量BFP报告基因。将来自在CD19+K562相比K562条件下BFP+细胞的MFI的信噪比相对于在这两种条件下MFI的Δ变化作图。如实施例19中那样检查激活，但用另外的ALPPL2+K562共孵育进行CAR激活。
表4.此表提供了在用ALPPL2+K562刺激共表达的抗ALPPL2 CAR的情况下的数据。“仅报告物”代表报告质粒，并且在所有样品中表达。
Figure BDA0003648112840000432
Figure BDA0003648112840000441
实施例22
此实施例描述了为了展现由T细胞工程化的铰链-Notch STS变体实现的受控IL-2产生而进行的实验。
图15A示出了如下的图：用铰链-Notch STS变体工程化T细胞，以提供工程化细胞因子的由配体触发的分泌以用于T细胞的自分泌和旁分泌扩增。具有指示的STS修饰的抗CD19铰链-Notch受体的表达概况示于图15B中。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达针对MCAM抗原的CAR，而一种慢病毒构建体表达铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(在Gal4-UAS控制下)。在初始T细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。通过抗myc标签染色确定受体表达(y轴)。
实施例23
此实施例描述了为了展现超级IL2的由配体触发的表达改善CAR-T细胞的细胞活力而进行的实验。
将1x105个表达抗CD19铰链-Notch Notch1 STS受体的双阳性T细胞在不含IL-2的培养基中与以下共培养：无K562细胞(左上)、CD19+K562细胞(以触发铰链-Notch)(右上)、MCAM+K562细胞(以触发CAR激活)(左下)或MCAM+和CD19+K562细胞(以触发两种受体的激活)(右下)(图16)。9天后，通过使用Fortessa X-50(BD Biosciences)的前向散射测量和侧向散射测量来评估活T细胞的比例。两种受体的共激活产生的细胞最具活力，其次是铰链-Notch激活(和随后的超级IL2诱导)、单独的CAR激活、以及任一受体未激活的情况。
实施例24
此实施例描述了为了展现在用铰链-Notch的STS变体的情况下T细胞的可调增殖而进行的实验。
将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达针对MCAM抗原的CAR，而一种慢病毒构建体表达铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(在Gal4-UAS控制下)(图17的右侧四个小图)。针对无铰链-Notch对照测试含有3种不同STS变体(NRG1、Notch1、Notch2)的铰链-Notch受体。类似地，在没有CAR表达的情况下产生原代人T细胞(图17的左小图)。根据制造商的方案，将T细胞用CellTraceViolet(Invitrogen)染色，与CD19+K562靶细胞一起在不含IL-2的培养基中共孵育，并且在指示的时间点使用Fortessa X-50(BD Biosciences)测量以通过CTV信号衰减评估增殖。
实施例25
此实施例描述了为了展现在用铰链-Notch的STS变体的情况下超级IL2的可调分泌而进行的实验。
将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用慢病毒构建体(铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(在Gal4-UAS控制下))转导(图18A)。针对无铰链Notch对照测试含有3种不同STS变体(NRG1、Notch1、Notch2)的铰链-Notch受体。将T细胞与MCAM+CD19+K562细胞一起在缺乏IL-2的培养基中共孵育，并且在指示的时间点，使用InstantELISA试剂盒(Invitrogen)根据制造商的方案用酶标仪(Tecan)测量上清液IL-2。红色虚线指示用于培养T细胞的IL-2的标准浓度。通过STS调节的铰链Notch受体的激活实现了超级IL2的分级分泌。
对于图18B，用表达针对MCAM的CAR的另外的慢病毒载体产生原代人T细胞。由表达CAR的细胞实现的IL-2的增强摄取导致仅CAR和NRG1-STS铰链-Notch T细胞中上清液IL2的损失。相比之下，在增殖之前，基于Notch1和Notch2-STS的受体实现的超级IL2的更大程度诱导最初超过了这种摄取，并且K562消除降低了上清液水平。
实施例26
此实施例描述了为了展现在用铰链-Notch的STS变体的情况下超级IL2的可调分泌增强旁邻T细胞的增殖而进行的实验。
将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用包含铰链-Notch受体及诱导型超级IL2(在Gal4-UAS控制下)的慢病毒构建体转导(图19的右小图)。针对无铰链Notch对照测试含有3种不同STS变体(NRG1、Notch1、Notch2)的铰链Notch受体。将铰链Notch T细胞与用CellTrace Far Red(Invitrogen)染色的“旁邻”T细胞共孵育，所述“旁邻”T细胞表达针对MCAM的CAR(图19的左小图)或不表达CAR(图19的右小图)。将T细胞与MCAM+CD19+K562细胞在缺乏IL-2的培养基中共孵育，并且通过在Fortessa X-50(BDBiosciences)上测量信号衰减来评估旁邻T细胞的增殖。对于具有和不具有CAR表达的旁邻T细胞，通过铰链-Notch激活的T细胞的STS变体以分级方式增强增殖。
实施例27
此实施例描述了为了测试含有铰链-Notch受体CAR回路的单一慢病毒载体构建体而进行的实验。
将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用含有组成型表达的铰链-Notch受体及诱导型抗MCAM CAR盒(在Gal4-UAS控制下)的单一慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天，经由myc标签针对铰链-Notch受体表达分选细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如所指示测试了三种STS变体，其中组成型表达的CAR用作对照(图20)。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的T细胞与以下共培养：无添加(上部迹线)、5x105个K562细胞(中间迹线)、或5x104个CD19+K562细胞(下部迹线)。随后使用Fortessa X-50(BDBiosciences)通过GFP标签测量诱导型CAR的转录激活。
实施例28
此实施例描述了为了展现通过用含有铰链Notch CAR回路的单一慢病毒载体工程化的T细胞实现的特异性双重抗原靶细胞杀伤而进行的实验。
将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用含有组成型表达的铰链Notch-受体及诱导型抗MCAM CAR盒(在Gal4-UAS控制下)的单一慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天，经由myc标签针对铰链-Notch受体表达分选细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如所指示测试了三种STS变体，其中组成型表达的CAR用作对照。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的T细胞与5x105个MCAM+K562细胞或5x104个MCAM+CD19+K562细胞共培养。使用Fortessa X-50(BD Biosciences)通过K562群体的前向/侧向散射评估靶细胞杀伤。如图21中所示，铰链-Notch回路有效且特异性地清除含有MCAM+和CD19+抗原两者的靶细胞。
实施例29
此实施例描述了为了测试含有铰链-Notch受体的单一慢病毒载体构建体控制T细胞激活和耗尽而进行的实验。
将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活，并且用含有组成型表达的铰链-Notch受体及诱导型抗MCAM CAR盒(在Gal4-UAS控制下)的单一慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天，经由myc标签针对铰链-Notch受体表达分选细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如所指示测试了三种STS变体，其中组成型表达的CAR用作对照。为了测试，将1x105个表达抗CD19受体的T细胞与5x104个CD19+K562细胞共培养。随后使用FortessaX-50(BD Biosciences)通过GFP标签测量诱导型CAR的转录激活(图22的最左侧小图)。T细胞激活和耗尽分别通过CD25和CD39的表达来测量(图22)。
实施例30
此实施例描述了为了体内测试铰链-Notch-至-CAR回路而进行的实验。
如图23中所示，对于单侧肿瘤，对NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠在左侧腹皮下植入1x106个K562-BCMA/CD19肿瘤细胞。对于对侧肿瘤，对NSG小鼠在左侧腹植入1x106个K562-BCMA/CD19肿瘤细胞，并且在右侧腹植入1x106个K562-CD19肿瘤细胞。肿瘤植入后四天，通过尾静脉注射静脉内输注2.5x106个工程化的原代人CD4+T细胞和工程化的原代人CD8+T细胞(总共5x106个T细胞)。每周2-3次经由卡尺监测肿瘤大小，并且当测量到肿瘤≥20mm时，确定小鼠已经达到终点。对于免疫表型分析，在T细胞植入后10天收获肿瘤和脾。手工切碎肿瘤并且在37℃下在具有4mg/ml胶原酶IV(Worthington BiochemicalCorporation)和0.1mg/ml DNA酶I(MilliporeSigma)的RPMI-1640中消化30min，并且手动分离脾脏并进行红细胞裂解(ACK；KD medical)。使用以下抗体：抗CD45(2D1，368516，Biolegend)、抗CD3(UCHT1，300464，Biolegend)、抗CD4(SK3，563552，BD biosciences)和抗CD8(RPA-T8，563823，BD biosciences)。用Draq7(Abcam)排除死细胞。使用FACSymphonyX50 SORP(BD Biosciences)分析样品，并且使用FlowJo软件(BD Biosciences)分析数据。
实施例31
此实施例汇总了如本文对于表1中描述的Notch受体提供和讨论的实验的结果。
表5
Figure BDA0003648112840000471
Figure BDA0003648112840000481
尽管已经公开了本公开文本的特定替代方案，但是应理解，各种修改和组合是可能的并且涵盖于所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。
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<130> 048536-654001WO
<140> 同此一起
<141> 同此一起
<150> US 62/905,251
<151> 2019-09-24
<150> US 62/905,263
<151> 2019-09-24
<160> 80
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<210> 1
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Met
305 310 315 320
Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly
325 330 335
Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile
340 345 350
Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys
355 360 365
Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg
370 375 380
Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr
385 390 395 400
Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile
405 410 415
Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln
420 425 430
Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn
435 440 445
Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro
450 455 460
Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu
465 470 475 480
Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly
485 490 495
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Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu
355 360 365
Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu
370 375 380
Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu
385 390 395 400
Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val
405 410 415
Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met
420 425 430
Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu
435 440 445
Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
465 470 475 480
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
485 490 495
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
500 505 510
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
515 520 525
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<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
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Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
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210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
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<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln
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Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
50 55 60
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
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Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
165 170 175
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
180 185 190
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
195 200 205
Gly Lys Ala Pro Lys Val Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser
210 215 220
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
225 230 235 240
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
245 250 255
Ser Ser Tyr Thr Ile Ala Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
260 265 270
Lys Leu Thr Val Leu
275
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<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
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Gly Ser Thr Gly Asp Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
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65 70 75 80
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Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
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Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
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Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
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260
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
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1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
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20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Lys Arg Lys Arg Lys His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
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Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp
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Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp
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Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
180 185 190
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
195 200 205
Leu Gly Ser
210
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
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<211> 20
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
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1 5 10 15
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
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Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
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Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
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Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
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290 295 300
Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu
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Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala
325 330 335
Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro
340 345 350
Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro
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Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu
370 375 380
Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg
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Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys
405 410 415
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450 455 460
Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly
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Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
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Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp
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Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
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Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe
290 295 300
Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys
305 310 315 320
Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys
325 330 335
Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn
340 345 350
Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr
355 360 365
Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln
370 375 380
Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys
385 390 395 400
Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val
405 410 415
Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val
420 425 430
Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr
435 440 445
Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val
450 455 460
Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu
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Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe
485 490 495
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
500 505 510
Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly
515 520 525
Ser
<210> 26
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
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Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
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Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Cys Asp Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu
290 295 300
Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met
305 310 315 320
Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys
325 330 335
Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys
340 345 350
Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu
355 360 365
Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu
370 375 380
Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu
385 390 395 400
Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe
405 410 415
Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser
420 425 430
Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala
435 440 445
Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr
450 455 460
Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala
465 470 475 480
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp
485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
515 520 525
Gly Ser
530
<210> 27
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln
20 25 30
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
50 55 60
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
65 70 75 80
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
85 90 95
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
100 105 110
Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
115 120 125
Lys Glu Gly Asp Ser Ser Arg Trp Ser Tyr Asp Leu Trp Gly Arg Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
165 170 175
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
180 185 190
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
195 200 205
Gly Lys Ala Pro Lys Val Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser
210 215 220
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
225 230 235 240
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245 250 255
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Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu
260 265 270
Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met
275 280 285
Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln
290 295 300
Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu
305 310 315 320
Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser
325 330 335
Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser
340 345 350
Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp
355 360 365
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
370 375 380
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
385 390 395 400
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
405 410 415
<210> 35
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Val Gln
20 25 30
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
50 55 60
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
100 105 110
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu
115 120 125
Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr
130 135 140
Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
165 170 175
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Phe Met Tyr Val Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu
195 200 205
Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln
210 215 220
Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys
225 230 235 240
Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser
245 250 255
Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val
260 265 270
Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro
275 280 285
Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile
290 295 300
Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp
305 310 315 320
Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr
325 330 335
Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser
340 345 350
Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
370 375 380
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
385 390 395 400
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu
405 410 415
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
420 425
<210> 36
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln
20 25 30
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
35 40 45
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr
50 55 60
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
65 70 75 80
Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr
85 90 95
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met
100 105 110
Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
115 120 125
Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
130 135 140
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
165 170 175
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
180 185 190
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
195 200 205
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
225 230 235 240
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr
245 250 255
Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Lys Leu Glu Ile Lys
275
<210> 37
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val
50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val
180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro
195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly
245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser
275
<210> 38
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Val Gln
20 25 30
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
50 55 60
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
100 105 110
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu
115 120 125
Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr
130 135 140
Leu Val Thr Val Ser Ser
145 150
<210> 39
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
20 25
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
1 5 10 15
Cys Asp
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
1 5 10 15
Ala Cys Asp
<210> 42
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys
35
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Arg Arg Arg Arg Glu His
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Lys Tyr Lys Gln Lys Pro Lys
1 5
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Lys Arg Arg Arg
1
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Lys Gln Gln Arg Ile Lys
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Lys Arg Lys Arg Thr His
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Arg Arg Gln Arg Arg
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Lys Lys Gly Arg Arg Ser Tyr Lys
1 5
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Lys Thr Lys Lys Gln Arg Lys Lys Leu His Asp Arg Leu Arg
1 5 10
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Lys Arg Lys Arg Arg Thr Lys Thr Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Arg Lys Arg Arg Lys Glu Arg Glu Arg Ser Arg Leu Pro Arg
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Arg Ser Arg Lys Val Asp Lys Arg
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Lys Arg Arg Asp Lys Glu Arg Gln Ala Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Lys Thr Lys Lys Gln Arg Lys Gln Met His Asn His Leu Arg
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Lys Lys Ser Lys Leu Ala Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
His Pro Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Arg Arg Arg Ser Lys Tyr Ser Lys Ala Lys
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
His Arg Arg Cys Lys His Arg Thr Gly Lys
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Lys Lys Arg Lys Leu Ala Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Arg Arg Lys Arg Glu His
1 5
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(3)
<223> X可以是任何氨基酸残基
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> X代表疏水残基，如Leu、Ile、Val、Phe、Trp、Tyr、Val、Met和Pro
<400> 64
Pro Xaa Xaa Xaa
1
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(3)
<223> X可以是任何氨基酸残基
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> X代表疏水残基，如Leu、Ile、Val、Phe、Trp、Tyr、Val、Met和Pro
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> X是Ser或Thr
<400> 65
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> X是Leu或Gln
<400> 66
Pro Xaa Gly Met Thr Ser
1 5
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> X是Leu或Gln
<400> 67
Pro Xaa Gly Met Thr
1 5
<210> 68
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Val Gly Arg
1
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Glu Asn Leu Tyr Thr Gln Ser
1 5
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 71
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Leu Val Pro Arg
1
<210> 72
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val
50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val
180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro
195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly
245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser
275
<210> 73
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ala Thr Val Val
290 295 300
Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile Ile Leu Gly Val
305 310 315 320
Phe Arg Ile Arg Ala Ala His Arg Arg Thr Met Arg Met Lys Leu Leu
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys
340 345 350
Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp
355 360 365
Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala
370 375 380
His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe
385 390 395 400
Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp
405 410 415
Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp
420 425 430
Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr
435 440 445
Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala
465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp
485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu
500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
515 520 525
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535 540
<210> 74
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ile Ala Thr Val
290 295 300
Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val Ala Met Gly
305 310 315 320
Val Tyr Arg Val Arg Ile Ala His Gln His Met Lys Leu Leu Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser
340 345 350
Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys
355 360 365
Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu
370 375 380
Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu
385 390 395 400
Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu
405 410 415
Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val
420 425 430
Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met
435 440 445
Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu
450 455 460
Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
485 490 495
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
500 505 510
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
515 520 525
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535 540
<210> 75
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ala Thr Val Val
290 295 300
Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile Ile Leu Gly Val
305 310 315 320
Phe Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala
325 330 335
Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro
340 345 350
Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro
355 360 365
Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu
370 375 380
Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg
385 390 395 400
Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys
405 410 415
Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala
420 425 430
Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu
435 440 445
Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn
450 455 460
Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
485 490 495
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp
500 505 510
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp
515 520 525
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 76
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ile Ala Thr Val
290 295 300
Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val Ala Met Gly
305 310 315 320
Val Tyr Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln
325 330 335
Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys
340 345 350
Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser
355 360 365
Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val
370 375 380
Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro
385 390 395 400
Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile
405 410 415
Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp
420 425 430
Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr
435 440 445
Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser
450 455 460
Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met
485 490 495
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
500 505 510
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu
515 520 525
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Ala Thr Val Val Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile
1 5 10 15
Ile Leu Gly Val Phe
20
<210> 78
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Ile Ala Thr Val Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val
1 5 10 15
Val Ala Met Gly Val Tyr
20
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Arg Ile Arg Ala Ala His Arg Arg Thr Met Arg
1 5 10
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Arg Val Arg Ile Ala His Gln His
1 5

Claims (78)

1.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽从N末端到C末端包含：
a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；
b)能够促进经由分子间二硫键合实现所述嵌合多肽的寡聚体形成的铰链结构域；
c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及
d)包含转录调节因子的胞内结构域，其中所述选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导设置在所述转录调节因子与所述铰链结构域之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，
并且其中所述嵌合多肽不包含Notch受体的LIN-12-Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。
2.根据权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域还包含终止转移序列。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。
4.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述细胞是病原体。
5.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述细胞是人细胞。
6.根据权利要求5所述的嵌合多肽，其中所述人细胞是肿瘤细胞。
7.根据权利要求5所述的嵌合多肽，其中所述人细胞是终末分化细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体包括蛋白质或碳水化合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC-1、MAGE、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及信号调节蛋白α(SIRPα)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体选自细胞表面受体、粘附蛋白、整合素、粘蛋白、凝集素、肿瘤相关抗原以及肿瘤特异性抗原。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞外配体结合结构域包含受体的配体结合部分。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体、微型抗体、F(ab')2片段、F(ab)v片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)及其功能片段。
14.根据权利要求13所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分包含scFv。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分特异性结合至选自以下的肿瘤相关抗原：CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、ALPPL2、CD123、CD171、CD179a、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Rα、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SIRPα、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet以及Axl。
16.根据权利要求15所述的嵌合多肽，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、CEA、HER2、MUC1、CD20、ALPPL2、SIRPα或EGFR。
17.根据权利要求16所述的嵌合多肽，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、HER2或ALPPL2。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽，其中所述一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点包含γ分泌酶切割位点。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的嵌合多肽，其中所述转录调节因子包含转录激活物或转录阻遏物。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞内结构域包含核定位序列和选自Gal4-VP16、Gal4-VP64、tetR-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB和HAP1-VP16的转录调节因子序列。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的嵌合多肽，所述嵌合多肽还包含另外的蛋白水解切割位点、信号序列、可检测标记、肿瘤特异性切割位点、疾病特异性切割位点及其组合。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域衍生自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD-1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域、IgG1铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域以及IgG4铰链结构域，或其任一个的功能变体。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域衍生自CD8α铰链结构域或其功能变体。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域衍生自CD28铰链结构域或其功能变体。
25.根据权利要求1至22中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域衍生自OX40铰链结构域或其功能变体。
26.根据权利要求1至22中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域衍生自IgG4铰链结构域或其功能变体。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域包含与SEQ IDNO:12-16和39-42中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的嵌合多肽，其中所述终止转移序列包含与SEQID NO:18-19、43-63、79和80中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ IDNO:17、77或78中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的嵌合多肽，其中：
a)所述铰链结构域包含与SEQ ID NO:12-16和39-42中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
b)所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:17、77或78中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；以及
c)所述终止转移序列结构域包含与SEQ ID NO:18-19、43-63、79和80中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ IDNO:1-8、24-35和73-76中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
32.一种重组核酸，所述重组核酸包含编码根据权利要求1至31中任一项所述的嵌合多肽的核苷酸序列。
33.根据权利要求32所述的重组核酸，其中所述核苷酸序列被并入表达盒或表达载体中。
34.根据权利要求33所述的重组核酸，其中所述表达载体是病毒载体。
35.根据权利要求34所述的重组核酸，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。
36.一种重组细胞，所述重组细胞包含：
a)根据权利要求1至31中任一项所述的嵌合多肽；和/或
b)根据权利要求32至35中任一项所述的重组核酸。
37.根据权利要求36所述的重组细胞，其中所述重组细胞是真核细胞。
38.根据权利要求37所述的重组细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
39.根据权利要求38所述的重组细胞，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞，或干细胞。
40.根据权利要求39所述的重组细胞，其中所述免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞或其他T细胞。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的重组细胞，所述重组细胞包含：
a)根据权利要求1至31中任一项所述的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽；和/或
b)根据权利要求32至35中任一项所述的第一核酸和第二核酸；
其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽不具有相同的序列，和/或所述第一核酸或所述第二核酸不具有相同的序列。
42.根据权利要求41所述的重组细胞，其中所述第一嵌合多肽调节所述第二嵌合多肽的表达和/或活性。
43.根据权利要求36至42中任一项所述的重组细胞，所述重组细胞还包含编码可操作地连接至启动子的蛋白质的表达盒，其中所述蛋白质的表达由所述转录调节因子调节。
44.根据权利要求43所述的重组细胞，其中所述蛋白质对于所述细胞是异源的。
45.根据权利要求44所述的重组细胞，其中所述启动子是酵母GAL4启动子。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的重组细胞，其中所述蛋白质是细胞因子、细胞毒素、趋化因子、免疫调节剂、促凋亡因子、抗凋亡因子、激素、分化因子、去分化因子、免疫细胞受体(例如，TCR或CAR)或报告物。
47.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞和培养基。
48.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体以及以下中的一种或多种：
a)根据权利要求32至35中任一项所述的重组核酸；以及
b)根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞。
49.根据权利要求48所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据权利要求32至35中任一项所述的重组核酸以及药学上可接受的载体。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。
51.一种用于调节细胞的活性的方法，所述方法包括：
a)提供根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞；以及
b)使所述重组细胞与选定的配体接触，其中所述选定的配体与胞外配体结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并释放所述转录调节因子，其中所释放的转录调节因子调节所述重组细胞的活性。
52.根据权利要求51所述的方法，所述接触在体内、离体或体外进行。
53.根据权利要求51至52中任一项所述的方法，其中待调节的细胞的活性选自：选定基因的表达、增殖、凋亡、非凋亡性死亡、分化、去分化、迁移、分子分泌、细胞粘附和细胞溶解活性。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所释放的转录调节因子调节所述细胞的基因产物的表达。
55.根据权利要求51至53所述的方法，其中所释放的转录调节因子调节异源基因产物的表达。
56.根据权利要求54至55中任一项所述的方法，其中所述细胞的基因产物选自趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生的蛋白质、增殖诱导剂、受体、RNA指导的核酸酶、位点特异性核酸酶、T细胞受体、毒素、毒素衍生的蛋白质、转录调节因子、转录激活物、转录阻遏物、翻译调节因子、翻译激活物、翻译阻遏物、激活性免疫受体、抗体、凋亡抑制剂、凋亡诱导剂、工程化的T细胞受体、免疫激活物、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
57.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所释放的转录调节因子调节所述细胞的分化，并且其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、祖细胞或前体细胞。
58.一种用于抑制个体中靶细胞的活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效数量的根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞抑制所述个体中所述靶细胞的活性。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述靶细胞是致病细胞。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述致病细胞是癌细胞。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述靶癌细胞是急性骨髓瘤白血病细胞、间变性淋巴瘤细胞、星形细胞瘤细胞、B细胞癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、室管膜瘤细胞、食管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、少突神经胶质瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、外周T细胞淋巴瘤细胞、肾癌细胞、肉瘤细胞、胃癌细胞、癌细胞、间皮瘤细胞或肉瘤细胞。
62.一种用于治疗有需要的个体的健康状况的方法，所述方法包括向所述个体施用包含有效数量的根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞的第一疗法，其中所述重组细胞治疗所述个体的健康状况。
63.根据权利要求62所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用第二疗法。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法以及毒素疗法。
65.根据权利要求63至64中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法在同一组合物中一起施用或在分开的组合物中施用。
66.根据权利要求65所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法同时施用。
67.根据权利要求63至64中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。
68.根据权利要求67所述的方法，其中将所述第一疗法在所述第二疗法之前施用。
69.根据权利要求67所述的方法，其中将所述第一疗法在所述第二疗法之后施用。
70.根据权利要求67所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。
71.一种用于调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗有需要的个体的健康状况的系统，所述系统包含以下中的一种或多种：
a)根据权利要求1至31中任一项所述的嵌合多肽；
b)根据权利要求32至35中任一项所述的重组核酸；
c)根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞；以及
d)根据权利要求48至50中任一项所述的药物组合物。
72.一种用于制造根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞的方法，所述方法包括：
a)提供能够表达蛋白质的细胞；
b)使所提供的细胞与根据权利要求32至35中任一项所述的重组核酸接触至所提供的细胞中。
73.根据权利要求72所述的方法，其中通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞，并且离体接触所述细胞。
74.根据权利要求72所述的方法，其中所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。
75.以下中的一种或多种用于治疗健康状况的用途：
a)根据权利要求1至31中任一项所述的嵌合多肽；
b)根据权利要求32至35中任一项所述的重组核酸；
c)根据权利要求36至46中任一项所述的重组细胞；以及
d)根据权利要求48至50中任一项所述的组合物。
76.根据权利要求75所述的用途，其中所述健康状况是癌症。
77.根据权利要求76所述的用途，其中所述癌症是实体瘤、软组织瘤或转移病灶。
78.根据权利要求1至74中任一项所述的本发明用于制造治疗健康状况的药物的用途。
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