CN110749735A - 一种示踪剂 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术领域，提供了一种示踪剂，包括能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。其中，能够特异性识别CD19抗原的重组质粒可特异性识别血液中携带有CD19抗原的肿瘤细胞，当两者发生特异性识别后，具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒则会被诱导激活其下游荧光蛋白的表达，发出荧光，从而使得医务人员可根据荧光蛋白表达的结果来观察、确定血液中的肿瘤细胞的动态、位置及水平，进而为患者预后判断、疗效评价和个体化治疗提供临床指导。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种示踪剂。
背景技术
据统计，2018年全球大约有1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例，严重威胁到了人类的健康和生活，其中各类血液系统肿瘤发病率较高并呈持续上升态势。
常见的血液肿瘤主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。血液肿瘤一般存在于患者的外周血中，可通过血液传播转移到身体和其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞CTC，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。
因此，早期发现并精准识别血液中的循环肿瘤细胞，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。
发明内容
本发明实施例提供一种示踪剂，旨在提供一种可用于精准识别血液汇总的循环肿瘤细胞的示踪剂，为患者预后判断、疗效评价和个体化治疗提供临床指导。
本发明实施例是这样实现的，一种示踪剂，所述示踪剂包括能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。
本发明实施例提供的示踪剂，包括能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒，CD19是簇分化抗原的一种，是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原，CD19分布于全体B细胞、毛细胞白血病细胞等恶性B细胞、滤泡树状细胞上，因此可作为诊断B细胞系肿瘤(如白血病、淋巴瘤)的标记。能够特异性识别CD19抗原的重组质粒可特异性识别血液中携带有CD19抗原的肿瘤细胞，当两者发生特异性识别后，具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒则会被诱导激活其下游荧光蛋白的表达，从而使得医务人员可根据荧光蛋白表达的结果来确定血液中的肿瘤细胞的动态、位置及水平，进而为患者预后判断、疗效评价和个体化治疗提供临床指导。
附图说明
图1是本发明实施例提供的具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒的展开结构示意图；
图2是本发明实施例提供的具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒的整体结构示意图；
图3是本发明实施例提供的能够特异性识别CD19抗原的重组质粒的展开结构示意图；
图4是本发明实施例提供的能够特异性识别CD19抗原的重组质粒的整体结构示意图；
图5是本发明实施例提供的Pscst-CD19 sender质粒的展开结构示意图；
图6是体外示踪模拟实验中的对照组一的细胞荧光显微镜观察结果图；
图7是体外示踪模拟实验中的实验组的细胞的荧光显微镜观察结果图；
图8是体外示踪模拟实验中的对照组一、实验组以及空白对照的流式细胞检测对比结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本发明实施例提供的示踪剂，包括能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。能够特异性识别CD19抗原的重组质粒可特异性识别血液中携带有CD19抗原的肿瘤细胞，当两者发生特异性识别后，具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒则会被诱导激活其下游荧光蛋白的表达，从而使医务人员可根据荧光蛋白表达的结果来确定血液中的肿瘤细胞的动态、位置及水平，进而为患者预后判断、疗效评价和个体化治疗提供临床指导。
本发明实施例提供了一种示踪剂，示踪剂包括能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。
本发明实施例提供的示踪剂可以用于体外或者体内血液肿瘤的示踪。
作为本发明的实施例，上述具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒包括plv1载体和拼接在所述plv1载体上的UAS-mCherry基因片段。
在本发明实施例中，plv1载体可由以下步骤构建得到：
设计上游引物F1：ggatcatgagatccttg；下游引物R1:ggtggcggcgatccact。构建PCR扩增体系，首先取1.5mL离心管按照基因模板1uL、上/下游引物1uL、2x PRrime Star max25uL，加ddH2O(双蒸水)至总体积共50uL配置好PCR反应体系。将离心管放置在PCR扩增仪，按照预定程序进行PCR扩增循环34次，程序如下：预变性：95℃，5min；循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s；末次延伸：72℃10min。PCR扩增完成后，将样品取出并保存于12℃环境中。
PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收得到plv1载体片段备用。其中，琼脂凝胶电泳和胶回收的方法可参照现有的DNA琼脂糖凝胶电泳方法。
在本发明实施例中，UAS-mCherry基因片段包括UAS上游激活序列和mCherry荧光蛋白。其中，UAS上游激活序列可与Gal4结合后激活下游基因表达。
在本发明实施例中，UAS-mCherry基因片段由以下步骤构建得到：
设计第一上游引物和第一下游引物，其中，所述第一上游引物包括序列一和序列二，所述第一下游引物包括序列三和序列四，所述第一上游引物的序列一和第一下游引物的序列三与所述plv1载体匹配，所述第一上游引物的序列二与第一下游引物的序列四与UAS-mCherry基因片段匹配；利用所述第一上游引物和第一下游引物构建PCR扩增体系，经PCR扩增得到包括UAS-mCherry基因片段的产物；通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收产物中的UAS-mcherry基因片段。
在本发明的示例性实施例中，第一上游引物的序列一为ctgatatcgaat，序列二为cggagcactgt；第一下游引物的序列三为ggagttgcggcc，序列四为ctacttgtacag。其中，第一上游引物的ctgatatcgaatt部分与第一下游引物的ggagttgcggcc部分与plv1载体匹配，F1：cggagcactgt部分与R1：ctacttgtacag部分与UAS-mcherry片段匹配。
构建PCR扩增体系，首先取1.5mL离心管按照基因模板1uL、上/下游引物1uL、2xPRrime Star max 25uL，加ddH2O(双蒸水)至总体积共50uL配置好PCR反应体系。将离心管放置在PCR扩增仪，按照预定程序进行PCR扩增循环34次，程序如下：预变性：95℃，5min；循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s；末次延伸：72℃10min。PCR扩增完成后，将样品取出并保存于12℃环境中。
PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收得到UAS-mcherry基因片段备用。其中，琼脂凝胶电泳和胶回收的方法可参照现有的DNA琼脂糖凝胶电泳方法。
在本发明实施例中，上述具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒由以下步骤制备得到：使用infusion酶将所述plv1载体与UAS-mcherry基因片段进行连接，得到第一连接产物；将所述第一连接产物分别转入DH5a和stbl3感受态细胞中，涂板过夜，挑取单克隆摇菌，再进行菌落PCR扩增，扩增完成后对扩增产物进行测序，其中含有UAS-mcherry基因片段的产物即为具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。
在本发明的示例性实施例中，infusion酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
首先配置Infusion酶连接体系：plv1载体1uL、UAS-mcherry基因片段4uL、infusion酶20uL。将该Infusion酶连接体系置于55℃环境下反应60min，再将得到的第一连接产物取出放置在4℃下保存。
将上述第一连接产物分别转入DH5a和stbl3感受态细胞中，涂板过夜，挑取单克隆摇菌，再进行菌落PCR扩增，扩增完成后对扩增产物进行测序，其中含有UAS-mcherry基因片段的产物即为具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒(其展开的质粒结构示意图如图1所示，整体结构示意图如图2所示)。其中，图1中的UAS-mCherry部分的基因序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明实施例中，上述能够特异性识别CD19抗原的重组质粒包括pHR载体和拼接在所述pHR载体上的CD19-scfv基因片段。
在本发明实施例中，pHR载体可由以下步骤构建得到：
设计上游引物F1：gatccttgacttgcggc；下游引物R1：tgaactcactgtcactga。构建PCR扩增体系，首先取1.5mL离心管按照基因模板1uL、上/下游引物1uL、2x PRrime Starmax 25uL，加ddH2O(双蒸水)至总体积共50uL配置好PCR反应体系。将离心管放置在PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增循环34次，程序如下：预变性：95℃，5min；循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s；末次延伸：72℃10min。PCR扩增完成后，将样品取出并保存于12℃环境中。
PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收得到pHR载体片段备用。其中，琼脂凝胶电泳和胶回收的方法可参照现有的DNA琼脂糖凝胶电泳方法。
在本发明实施例中，CD19-scfv基因片段包括CD8α信号序列、cMyc标签、特异性识别CD19信号的scfv、synnotch元件、能与UAS特异结合使其激活靶基因表达的Gal4转录调控因子和增强基因表达的VP64转录活化因子。
在本发明实施例中，上述CD19-scfv基因片段由以下步骤构建得到：
设计第二上游引物和第二下游引物；其中，所述第二上游引物包括序列五和序列六，所述第二下游引物包括序列七和序列八，所述第二上游引物的序列五和第二下游引物的序列七与所述pHR载体匹配，所述第二上游引物的序列六与第二下游引物的序列八与CD19-scfv基因片段匹配；利用所述第二上游引物和第二下游引物构建PCR扩增体系，经PCR扩增得到包括CD19-scfv基因片段的产物；通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收产物中的CD19-scfv基因片段。
在本发明的示例性实施例中，第二上游引物的序列五为atggcgctccctg，序列六为atggcgctccct；第二下游引物的序列七为agtcaaggatc，序列八为tcatgatccgagca。其中第二上游引物的atggcgctccctg部分和第二下游引物的agtcaaggatc部分与pHR载体匹配；第二上游引物的atggcgctccct部分和第二下游引物的tcatgatccgagca部分与CD19-scfv基因片段匹配。
构建PCR扩增体系，首先取1.5mL离心管按照基因模板1uL、上/下游引物1uL、2xPRrime Star max 25uL，加ddH2O(双蒸水)至总体积共50uL配置好PCR反应体系。将离心管放置在PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增循环34次，程序如下：预变性：95℃，5min；循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s；末次延伸：72℃10min。PCR扩增完成后，将样品取出并保存于12℃环境中。
PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收得到CD19-scfv基因片段备用。其中，琼脂凝胶电泳和胶回收的方法可参照现有的DNA琼脂糖凝胶电泳方法。
在本发明实施例中，能够特异性识别CD19抗原的重组质粒由以下步骤制备得到：使用infusion酶将所述pHR载体与CD19-scfv基因片段进行连接，得到第二连接产物；将所述第二连接产物分别转入DH5a和stbl3感受态细胞中，涂板过夜，挑取单克隆摇菌，再进行菌落PCR扩增，扩增完成后对扩增产物进行测序，其中含有CD19-scfv基因片段的产物即为能够特异性识别CD19抗原的重组质粒。
首先配置Infusion酶连接体系：pHR载体1uL、CD19-scfv基因片段4uL、infusion酶20uL。将该Infusion酶连接体系置于55℃环境下反应60min，再将得到的第二连接产物取出放置在4℃下保存。
将上述第二连接产物分别转入DH5a和stbl3感受态细胞中，涂板过夜，挑取单克隆摇菌，再进行菌落PCR扩增，扩增完成后对扩增产物进行测序，其中含有CD19-scfv基因片段的产物即为能够特异性识别CD19抗原的重组质粒(其展开的质粒结构示意图如图3所示，整体结构示意图如图4所示)。其中，图3中的CD19 scfv部分的基因序列如SEQ ID NO:3所示，SynNotch元件的基因序列如SEQ ID NO:4所示，GAL4 AGSlinker VP64部分的基因序列如SEQ ID NO:5所示。
为了进一步说明本发明实施例提供的示踪剂的应用，下面采用本发明实施例提供的示踪剂进行了体外血液肿瘤细胞的示踪模拟实验，具体实验过程如下：
首先，构建Pscst-CD19 sender质粒用以转染293T细胞，以模拟人体的血液肿瘤细胞。
具体的Pscst-CD19 sender质粒的构建方法如下：
①Pscst载体的构建：
设计引物上游引物F1为agcggaggaggccatcacca；下游引物R1为gctaccggaacctgatccagg。
构建PCR扩增体系，首先取1.5mL离心管按照基因模板1uL、上/下游引物1uL、2xPRrime Star max 25uL，加ddH2O(双蒸水)至总体积共50uL配置好PCR反应体系。将离心管放置在PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增循环34次，程序如下：预变性：95℃，5min；循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s；末次延伸：72℃10min。PCR扩增完成后，将样品取出并保存于12℃环境中。
PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收得到Pscst载体片段备用。其中，琼脂凝胶电泳和胶回收的方法可参照现有的DNA琼脂糖凝胶电泳方法。
②CD19-sender基因片段构建：
CD19-sender基因片段包括表达CD19的目的基因与PDGFR跨膜序列。
设计引物上游引物F1：aggttccggtagc aggcccgaggaac；下游引物R1：ggcctcctccgct ctaacgtggcttc。其中F1的aggttccggtagc部分与R1的ggcctcctccgct部分与Pscst载体匹配；F1的aggcccgaggaac部分与R1的ctaacgtggcttc部分与CD19-sender片段匹配。
构建PCR扩增体系，首先取1.5mL离心管按照基因模板1uL、上/下游引物1uL、2xPRrime Star max 25uL，加ddH2O(双蒸水)至总体积共50uL配置好PCR反应体系。将离心管放置在PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增，程序如下：预变性：95℃，5min；循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s；末次延伸：72℃10min。PCR扩增完成后，将样品取出并保存于12℃环境中。
PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收得到CD19-sender基因片段备用。其中，琼脂凝胶电泳和胶回收的方法可参照现有的DNA琼脂糖凝胶电泳方法。
③使用infusion酶将Pscst载体与CD19-sender基因片段进行连接。
首先配置Infusion酶连接体系：Pscst载体1uL、CD19-sender基因片段4uL、infusion酶20uL。将该Infusion酶连接体系置于55℃环境下反应60min，再将得到的第二连接产物取出放置在4℃下保存。
将上述连接产物分别转入DH5a和stbl3感受态细胞中，涂板过夜，挑取单克隆摇菌，再进行菌落PCR扩增，扩增完成后对扩增产物进行测序，其中含有CD19-sender基因片段的产物即为Pscst-CD19 sender质粒(其展开的质粒结构示意图如图5所示)。其中，图5中的CD19区域的基因序列如SEQ ID NO:1所示，PDGFR部分的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
在转染前1天，先对293T细胞进行传代培养，使转染时12孔板细胞密度60％左右。转染前1小时每孔吸去旧培养基加入750ul新鲜完全DMEM培养基(10％FBS+1％PS)，每孔转染Pscst-CD19 sender质粒的量为750ng，使用2.25uL SignaGen polyJet转染试剂，转染后6h换液，转染24h后得到拟血液肿瘤细胞。
另外，取另一块传代培养有293T细胞的12孔板，以本发明实施例提供的具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒和能够特异性识别CD19抗原的重组质粒同时转染该12孔板上的293T细胞，具体的转染操作及参数与上述以Pscst-CD19 sender质粒转染293T细胞的相同，转染24h后，得到携带有本发明示踪剂的转染293T细胞。
将拟血液肿瘤细胞和携带有本发明示踪剂的转染293T细胞按照细胞比例为1:1进行混合共培养，得到混合共培养细胞。其中，混合共培养是将拟血液肿瘤细胞吹打下来后铺在携带有本发明示踪剂的转染293T细胞上进行培养。
对照组一：未转染的293T细胞与上述携带有本发明示踪剂的转染293T细胞进行混合共培养，得到第一混合共培养细胞。
待上述各组实验组、对照组细胞进行混合共培养24h后通过荧光显微镜观察或流式细胞仪检测各组细胞的荧光蛋白的表达情况，检测结果见附图3～5所示。
图6为对照组一的细胞荧光显微镜观察结果，图7为实验组的细胞的荧光显微镜观察结果，图8为对照组一、实验组以及空白对照(单纯的293T细胞)的流式细胞检测结果。
荧光激活的原理：Pscst-CD19 sender质粒可在细胞表面上表达CD19抗原信号，能够特异性识别CD19抗原的重组质粒中的CD19-scfv基因片段可以特异性识别CD19抗原信号，并激活其上的synnotch元件进行剪切，经剪切后，能与UAS特异结合使其激活靶基因表达的Gal4转录调控因子和增强基因表达的VP64转录活化因子释放入胞质中并与具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒中的UAS上游激活序列区域特异结合，从而诱导激活下游荧光蛋白的表达，产生红色荧光。
结合图6，在荧光蛋白被激活前，即没有引入Pscst-CD19 sender质粒之前，只引入携带有本发明示踪剂的转染293T细胞，mCherry的荧光表达为本底水平。
结合图7，在转染了Pscst-CD19 sender质粒的293T细胞与同时转染了能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒的293T细胞的混合共培养细胞体系中，可发现其相较于对照组一的荧光信号大幅增强，其流式细胞检测结果与荧光显微镜观察结果一致(见图8所示)。图8中的1号线表示的是未经转染的293T细胞的流式细胞检测结果，2号线表示的是对照组一的流式细胞检测结果，3号线表示的是实验组(即转染了Pscst-CD19sender质粒的293T细胞与同时转染了能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒的293T细胞的混合共培养细胞体系)的流式细胞检测结果。该测试结果显示，实验组中转染了本发明实施例提供的示踪剂的293T细胞与拟血液肿瘤细胞(即转染了Pscst-CD19 sender质粒的293T细胞)的混合培养，本发明实施例提供的示踪剂能够特异性识别拟血液肿瘤细胞上的CD19抗原，并可激活SynNotch进行剪切，使得能与UAS特异结合使其激活靶基因表达的Gal4转录调控因子和增强基因表达的VP64转录活化因子释放入胞质中并与具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒中的UAS上游激活序列区域特异结合，从而诱导激活下游荧光蛋白的表达，产生红色荧光，进而可以观察到携带有CD19抗原的细胞的水平。
由此可以推导，本发明实施例提供的示踪剂可应用于血液肿瘤细胞的体外或体内示踪，使医务人员可根据相应的体内或体外示踪检测结果确定血液肿瘤细胞的水平、在体内的动态等，以为患者提供准确的预后判断、疗效评价和个体化治疗提供更为精确的临床指导。
在本发明的一个示例性实施例中，本发明的示踪剂可用于血液肿瘤细胞的体外示踪。当需要对待检测对象(人或动物)的外周血中的血液肿瘤细胞水平进行体外检测时，可以先抽取待检测对象的部分外周血置于检测容器中；然后将在体外以本发明实施例所述的示踪剂转染后的293T细胞加入该检测容器中，进行混合培养，得到混合共培养细胞；培养24h后再通过荧光显微镜观察或流式细胞仪检测混合共培养细胞的荧光蛋白的表达情况，并根据该检测结果确定待检测对象的外周血中是否存在血液肿瘤细胞，血液肿瘤细胞的的水平，进而使得医务人员可根据相应的检测结果为患者提供准确的预后判断、疗效评价和个体化治疗提供临床指导。
在本发明的另一个示例性实施例中，可将本发明实施例提供的示踪剂导入待测对象的外周血中，通过该示踪剂与外周血中携带有CD19抗原的细胞的特异性结合后所激发的红色荧光可以追踪到外周血中的肿瘤细胞的动态，并且可以确定外周血中的肿瘤细胞的数量等，并且为后续进一步研究针对肿瘤细胞的靶向免疫治疗或者药物治疗奠定了坚实的研究基础，提高血液肿瘤细胞的免疫治疗安全性，减少对患者身体的毒害等副作用。
本发明实施例提供的示踪剂，包括能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。能够特异性识别CD19抗原的重组质粒可特异性识别血液中携带有CD19抗原的肿瘤细胞，当两者发生特异性识别后，具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒则会被诱导激活其下游荧光蛋白的表达，从而使得医务人员可根据荧光蛋白表达的结果来确定血液中的肿瘤细胞的动态、位置及水平，进而为患者预后判断、疗效评价和个体化治疗提供更为精确的临床指导。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 合肥中科干细胞再生医学有限公司
<120> 一种示踪剂
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 60
ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 120
aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 180
gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 240
ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 300
ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 360
aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 420
tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 480
agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 540
tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc aggggccccc tctcctggac ccatgtgcac 600
cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 660
atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 720
tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcca 780
gtactatggc actggctgct gaggactggt ggctggaag 819
<210> 2
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgtgggcc aggacacgca ggaggtcatc gtggtgccac actccttgcc ctttaaggtg 60
gtggtgatct cagccatcct ggccctggtg gtgctcacca tcatctccct tatcatcctc 120
atcatgcttt ggcagaagaa gccacgttag 150
<210> 3
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatatacaga tgacgcagac aacgtcaagt ctttccgcca gcttgggaga ccgagtgact 60
atatcttgta gagcaagcca ggatatttct aagtatctta actggtacca acaaaagccc 120
gatggaacgg ttaagctgct tatataccat accagtagac tccactccgg cgtaccatca 180
cggttttctg gcagtggctc cgggaccgac tattctttga cgatctctaa tctcgaacaa 240
gaggatattg caacatactt ttgtcagcaa ggcaatacct tgccatatac gtttgggggc 300
gggacaaaac ttgagataac cggcggcggt ggttcaggcg gtggcggttc cggtggtggg 360
ggatcagagg ttaagcttca ggaatccgga ccaggtttgg ttgcccccag ccaatctctc 420
agcgttacat gcacggtttc aggcgtcagt ctccccgatt acggtgtaag ttggattcgg 480
caacctccgc gaaagggtct ggaatggctg ggggttattt gggggagtga gacaacttat 540
tacaactctg cacttaagag tcggcttacc atcatcaagg ataattcaaa atcacaagta 600
ttcctgaaga tgaactcatt gcaaacagat gatacagcta tatactattg tgccaagcat 660
tactattatg gtggttctta tgcaatggat tactgggggc aaggcacgtc agtgacagtg 720
agttca 726
<210> 4
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcctggact acagcttcac aggtggcgct gggcgcgaca ttcccccacc gcagattgag 60
gaggcctgtg agctgcctga gtgccaggtg gatgcaggca ataaggtctg caacctgcag 120
tgtaataatc acgcatgtgg ctgggatggt ggcgactgct ccctcaactt caatgacccc 180
tggaagaact gcacgcagtc tctacagtgc tggaagtatt ttagcgacgg ccactgtgac 240
agccagtgca actcggccgg ctgcctcttt gatggcttcg actgccagct caccgaggga 300
cagtgcaacc ccctgtatga ccagtactgc aaggaccact tcagtgatgg ccactgcgac 360
cagggctgta acagtgccga atgtgagtgg gatggcctag actgtgctga gcatgtaccc 420
gagcggctgg cagccggcac cctggtgctg gtggtgctgc ttccacccga ccagctacgg 480
aacaactcct tccactttct gcgggagctc agccacgtgc tgcacaccaa cgtggtcttc 540
aagcgtgatg cgcaaggcca gcagatgatc ttcccgtact atggccacga ggaagagctg 600
cgcaagcacc caatcaagcg ctctacagtg ggttgggcca cctcttcact gcttcctggt 660
accagtggtg ggcgccagcg cagggagctg gaccccatgg acatccgtgg ctccattgtc 720
tacctggaga tcgacaaccg gcaatgtgtg cagtcatcct cgcagtgctt ccagagtgcc 780
accgatgtgg ctgccttcct aggtgctctt gcgtcacttg gcagcctcaa tattccttac 840
aagattgagg ccgtgaagag tgagccggtg gagcctccgc tgccctcgca gctgcacctc 900
atgtacgtgg cagcggccgc cttcgtgctc ctgttctttg tgggctgtgg ggtgctgctg 960
tcccgcaagc gccggcgg 978
<210> 5
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggcc tgtgacatct gccggctgaa gaaactgaag 60
tgcagcaaag aaaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgccggtac 120
agccccaaga ccaagagaag ccccctgacc agagcccacc tgaccgaggt ggaaagccgg 180
ctggaaagac tggaacagct gtttctgctg atcttcccac gcgaggacct ggacatgatc 240
ctgaagatgg acagcctgca ggacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300
aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacaga ctggccagcg tggaaaccga catgcccctg 360
accctgcggc agcacagaat cagcgccacc agcagcagcg aggaaagcag caacaagggc 420
cagcggcagc tgacagtgtc tgctgctgca ggcggaagcg gaggctctgg cggatctgat 480
gccctggacg acttcgacct ggatatgctg ggcagcgacg ccctggatga ttttgatctg 540
gacatgctgg gatctgacgc tctggacgat ttcgatctcg acatgttggg atcagatgca 600
ctggatgact ttgacctgga catgctcgga tcatga 636
<210> 6
<211> 986
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggagcactg tcctccgaac gtcggagcac tgtcctccga acgtcggagc actgtcctcc 60
gaacgtcgga gcactgtcct ccgaacggag catgtcctcc gaacgtcgga gcactgtcct 120
ccgaacgact agttaggcgt gtacggtggg aggcctatat aagcagagct cgtttagtga 180
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 240
accgatccag cctctcgaca ttcgttggat ccaccatggt gagcaagggc gaggaggata 300
acatggccat catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg 360
gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc acccagaccg 420
ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc 480
agttcatgta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc gactacttga 540
agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg 600
tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc 660
tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg 720
aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga 780
ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca 840
agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca acgtcaacat caagttggac atcacctccc 900
acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc cactccaccg 960
gcggcatgga cgagctgtac aagtag 986
Claims (9)
1.一种示踪剂，其特征在于，所述示踪剂包括能够特异性识别CD19抗原的重组质粒和具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。
2.如权利要求1所述的示踪剂，其特征在于，所述具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒包括plv1载体和拼接在所述plv1载体上的UAS-mCherry基因片段。
3.如权利要求2所述的示踪剂，其特征在于，所述UAS-mCherry基因片段包括UAS上游激活序列和mCherry荧光蛋白。
4.如权利要求2所述的示踪剂，其特征在于，所述UAS-mCherry基因片段由以下步骤构建得到：
设计第一上游引物和第一下游引物，其中，所述第一上游引物包括序列一和序列二，所述第一下游引物包括序列三和序列四，所述第一上游引物的序列一和第一下游引物的序列三与所述plv1载体匹配，所述第一上游引物的序列二与第一下游引物的序列四与UAS-mCherry基因片段匹配；
利用所述第一上游引物和第一下游引物构建PCR扩增体系，经PCR扩增得到包括UAS-mCherry基因片段的产物；
通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收产物中的UAS-mcherry基因片段。
5.如权利要求2所述的示踪剂，其特征在于，所述具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒由以下步骤制备得到：
使用infusion酶将所述plv1载体与UAS-mcherry基因片段进行连接，得到第一连接产物；
将所述第一连接产物分别转入DH5a和stbl3感受态细胞中，涂板过夜，挑取单克隆摇菌，再进行菌落PCR扩增，扩增完成后对扩增产物进行测序，其中含有UAS-mcherry基因片段的产物即为具有激活荧光蛋白表达功能的重组质粒。
6.如权利要求1所述的示踪剂，其特征在于，所述能够特异性识别CD19抗原的重组质粒包括pHR载体和拼接在所述pHR载体上的CD19-scfv基因片段。
7.如权利要求6所述的示踪剂，其特征在于，所述CD19-scfv基因片段包括CD8α信号序列、cMyc标签、特异性识别CD19信号的scfv、synnotch元件、能与UAS特异结合使其激活靶基因表达的Gal4转录调控因子和增强基因表达的VP64转录活化因子。
8.如权利要求6所述的示踪剂，其特征在于，所述CD19-scfv基因片段由以下步骤构建得到：
设计第二上游引物和第二下游引物；其中，所述第二上游引物包括序列五和序列六，所述第二下游引物包括序列七和序列八，所述第二上游引物的序列五和第二下游引物的序列七与所述pHR载体匹配，所述第二上游引物的序列六与第二下游引物的序列八与CD19-scfv基因片段匹配；
利用所述第二上游引物和第二下游引物构建PCR扩增体系，经PCR扩增得到包括CD19-scfv基因片段的产物；
通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收产物中的CD19-scfv基因片段。
9.如权利要求6所述的示踪剂，其特征在于，所述能够特异性识别CD19抗原的重组质粒由以下步骤制备得到：
使用infusion酶将所述pHR载体与CD19-scfv基因片段进行连接，得到第二连接产物；
将所述第二连接产物分别转入DH5a和stbl3感受态细胞中，涂板过夜，挑取单克隆摇菌，再进行菌落PCR扩增，扩增完成后对扩增产物进行测序，其中含有CD19-scfv基因片段的产物即为能够特异性识别CD19抗原的重组质粒。
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