CN109180805A - 新型SynNotch合成受体及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型SynNotch合成受体及其编码基因。该SynNotch合成受体包含anti‑CD19scFV、斑马鱼Notch核心片段和GAL‑VP64片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，对应的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。经本发明改造后的synNotch受体系统，可以更高效的激活下游基因的表达。调控Mcherry荧光蛋白表达的平均荧光强度与原来的synNotch受体系统比较，改造后的synNotch受体系统可以有4.9倍的提升。本发明改造后的synNotch受体可扩展synNotch的应用范围，为细胞改造提供了新的应用前景，具有潜在的重要经济价值和意义。

Description

新型SynNotch合成受体及其编码基因

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型SynNotch合成受体及其编码基因。

背景技术

随着合成生物学和细胞改造的兴起，学术界追求的一个基本目标是让细胞可以识别胞外特定信号并作出特定的反应。在自定义的细胞识别反应系统中，细胞识别机体特定疾病或损伤信号后可起相应的响应，从而得到治疗或修复作用。一个成功的例子就是，CAR-T疗法已经被批准临床用于治疗血液肿瘤。机体细胞表面有许多受体，如何将胞外信号传导入胞内，这也就是科学家们改造细胞的研究热点之一。利用不同的受体类型，研究者们设计出了两大类的受体系统，能够识别可溶性小分子的受体系统和可以识别细胞膜表面配体的受体系统。为了可以灵活改变细胞的输入和输出，以及实现不同输入和输出的组合，Wendell A.Lim团队基于Notch信号通路设计出了SynNotch受体系统(Morsut,etal.2016)。该受体系统可以识别细胞膜表面配体，具有可调控性、简易性、正交性、普适性等特征，是细胞改造的一个强大工具。

传统的Notch信号通路包括Notch受体、Notch配体、细胞内效应分子、DNA结合蛋白、受调控的下游基因等。Notch受体是跨膜受体，当胞外域结合到Notch配体后，细胞运动致使S2位点暴露，被金属蛋白酶等识别切割，释放胞内段入核，从而启动下游基因表达。Wendell A.Lim团队改造了鼠的Notch1受体，将其胞外域用单链抗体或者纳米抗体替换，胞内域用转录激活或转录抑制的结构域替换，仅保留了可以被蛋白酶识别切割的跨膜核心域，还配备了下游被调控的基因元件。针对不同的疾病或者肿瘤抗原，胞外域采用特异识别该抗原的抗体单链，而胞内域调控预先设定的目标基因或因子的表达。难得的是，在同一细胞中可以设计由不同抗原启动的基因调控环路，并具有很好的正交性。SynNotch系统可以被应用到许多细胞类型中，包括神经细胞、免疫细胞。CAR-T技术和SynNotch系统组合应用到T细胞改造中，可以实现T细胞的与门激活，即只有当细胞同时表达两种特定的表面抗原时，才能将T细胞激活(Roybal,et al.2016b)。改变SynNotch下游调控的基因元件，T细胞可以在接触特定抗原后，分泌单链抗体、细胞因子等等具有治疗作用的因子，并且在体外、体内都具有抗肿瘤的作用(Roybal,et al.2016a)。可见SynNotch受体系统，在细胞改造中具有极大的技术优势。

原始版的SynNotch系统也具有一些缺点。我们课题组早期在应用该系统时，注意到原始版本的SynNotch被激活后，其下游转录表达调控能力并不是很强，也就是激活下游基因的表达量并不是很高。这样会局限SynNotch的使用，特别是需要要求下游基因或因子能有较高的表达量时。原始版的SynNotch系统，Lim研究组采用鼠的Notch跨膜核心域，它们并没有对这个合成受体进行升级。因此，有必要设计一种新型的SynNotch合成受体，提高SynNotch系统的转录激活效率，使SynNotch被激活后促进下游基因的表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型SynNotch合成受体，以增强其对下游基因的激活能力，提高SynNotch系统的应用范围。所述的SynNotch合成受体及其编码基因可显著提高SynNotch系统的转录激活效率，利用该合成受体或编码基因对活体细胞进行改造，让细胞可以识别特定表面抗原，并作出更强烈的特定反应，激活下游基因的表达。

本申请人考虑到不同物种和不同家族Notch信号通路其Notch核心区域可能有不同激活能力，通过筛选了人，鼠，斑马鱼，果蝇等Notch跨膜核心域，发现采用斑马鱼Notch3跨膜核心域可以显著提高SynNotch系统对下游基因转录激活的能力和效率，具体地，通过质粒改造的方式将不同物种的Notch跨膜核心域的DNA编码序列连接至胞外与胞内域之间，通过测试我们发现采用斑马鱼Notch跨膜核心域时激活能力及效率最佳。

本发明的新型SynNotch合成受体，包括胞外域、Notch跨膜核心域和胞内域，其中，所述的Notch跨膜核心域是斑马鱼Notch跨膜核心域。

优选，所述的新型SynNotch合成受体，包括anti-CD19scFV片段、斑马鱼Notch跨膜核心域和GAL-VP64片段。

所述的斑马鱼Notch跨膜核心域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的编码斑马鱼Notch跨膜核心域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述SynNotch合成受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种所述的新型SynNotch合成受体的编码基因。

所述SynNotch合成受体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种表达载体，其特征在于，含有所述SynNotch合成受体的编码基因。

一种宿主细胞，其特征在于，含有所述的编码基因或所述的表达载体。

一种提高细胞识别特定胞外信号的方法，该方法利用所述的SynNotch合成受体或所述的SynNotch合成受体的编码基因对活体细胞进行改造，让细胞可以识别特定表面抗原，并作出更强烈的特定反应，激活下游基因的表达。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明公开了一种采用斑马鱼Notch核心域的synNotch合成受体，实验证明该改造后的synNotch受体系统，可以更高效的激活下游基因的表达。调控Mcherry荧光蛋白表达的平均荧光强度与原来的synNotch受体系统比较，改造后的synNotch受体系统可以有4.9倍的提升。本发明改造后的synNotch受体可扩展synNotch的应用范围，为细胞改造提供了新的应用前景，具有潜在的重要经济价值和意义。

附图说明

图1为synNotch系统示意图。当anti-CD19抗体单链结合到CD19抗原后，Notch核心域被蛋白酶切割，GAL4VP64被释放入胞内，GAL4可以特异识别并结合到GAL4结合位点，VP64转录激活元件就会激活下游mcherry基因的转录。

图2为包含有不同Notch核心域的synNotch结构示意图。

图3为质粒pHR-PGK-antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64构建流程图。

图4为在U2OS细胞系中不同synNotch系统对下游基因激活能力比较。将表达CD19的K562细胞与表达synNotch受体的U2OS细胞共培养48小时后进行检测。图A为荧光显微镜照片比较，M-N表示鼠来源的synNotch系统，也即是原始的系统；ZFN-N表示斑马鱼Notch跨膜核心域升级的synNotch系统。图B为流式细胞仪分析U2OS细胞中表达红色荧光蛋白荧光强度。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1含斑马鱼Notch核心域的synNotch合成受体设计

synNotch受体的结构包括胞外域、Notch跨膜核心域和胞内域，其中，胞外域可用单链抗体或者纳米抗体替换，胞内域可用转录激活或转录抑制的结构域替换。本发明以antiCD19单链抗体作为胞外域部分，GAL4VP64作为胞内域部分，并以能够被蛋白酶识别切割的斑马鱼Notch跨膜核心域取代鼠的Notch跨膜核心域，获得改造后的synNotch受体，本发明设计改造的synNotch受体的结构如图2所示。图2显示了包含有鼠的或斑马鱼的Notch跨膜核心域的synNotch受体的结构。

实施例2含斑马鱼Notch跨膜核心域的表达质粒载体构建

含斑马鱼Notch核心域的表达质粒载体(pHR-PGK-antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64)构建的流程图见图3所示，具体包括以下步骤：

(1)用Trizol试剂盒提取斑马鱼胚胎RNA，反转成cDNA，采用PCR引物对(上游引物F：5’-GGCTGCTCCTCCAAGCCATG-3’和下游引物R：5’-ACGCTTGCGGCGGGCAATCA-3’)扩张出斑马鱼Notch跨膜核心域，所述斑马鱼Notch跨膜核心域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将pHR-PGK-antiCD19-oligo(含BamH I/Xho I)-Gal4VP64质粒(由pHR-PGK-antiCD19-synNotch-Gal4VP64(addgene#79125)改建而得，具体为：将synNotch核心域切去，替换成一个oligo，以便于下一步把斑马鱼Notch核心域连接进入；该质粒中基因片段antiCD19-oligo(含BamH I/Xho I)-Gal4VP64的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)使用BamHI/Xho I进行双酶切，然后将步骤(1)扩张出的斑马鱼Notch跨膜核心域(核苷酸序列如SEQID NO.1所示)克隆进入含慢病毒pHR骨架载体的antiCD19与Gal4VP64之间，即得慢病毒表达质粒载体pHR-PGK-antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64(antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，启动pHR为慢病毒质粒骨架载体，PGK为启动子，antiCD19为表达CD19抗原的scFV，z ebra synNotch为调控跨膜核心域，Gal4VP64为融合的转录激活因子，可激活调控基因)；

(3)将构建好的含斑马鱼Notch跨膜核心域的表达质粒载体(pHR-PGK-antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64)进行测序验证，测序结果验证了构建成功。

实施例3含斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch系统在细胞上试验及验证

含斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch系统(pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64)如图1所示。图1显示了synNotch系统提高细胞识别特定胞外信号的具体过程为：当synNotch受体的胞外域部分anti-CD19抗体单链结合到传输细胞(sendercell)的CD19抗原后，Notch跨膜核心域被蛋白酶切割，GAL4VP64被释放入胞内，GAL4可以特异识别并结合到GAL4结合位点，VP64转录激活元件就会激活下游mcherry基因的转录，促进Mcherry荧光蛋白表达。

本发明以K562细胞作为传输细胞，以U2OS细胞作为受体细胞(receiver cell)，对改造后的synNotch系统(pHR-PGK-antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64)增强下游基因转录激活的能力进行细胞水平的验证，具体包括以下步骤：

(1)K562细胞系感染慢病毒，可稳定表达CD19和BFP，作为传输细胞。U2OS细胞作为受体细胞，先感染pHR-Gal4UAS-IRES-mC-pGK-tBFP(Addgene#79123)慢病毒，挑选出能稳定表达pHR-Gal4UAS-IRES-mC-pGK-tBFP的单克隆细胞，然后感染pHR-PGK-antiCD19-zebrasynNotch-Gal4VP64慢病毒。上述用到的pHR-PGK-antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64慢病毒是将表达质粒(pHR-PGK-antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64)和pMD2.G和psPAX2共转染进入含密度为70％的HEK293-FT细胞的六孔板中，三天后收取细胞上清液，使用0.45uM滤器过滤病毒液并行病毒浓缩即得。

(2)取上述稳定表达的U2OS细胞，以细胞密度为3×10⁵个/mL接种到24孔板中，加入细胞密度为3×10⁵个/mL且能表达CD19的K562细胞共培养48小时后，吸去刺激的K562细胞。使用Nikon倒置荧光显微镜拍摄细胞照片，并使用流式仪(BD,bioscience)分析细胞表达的荧光强度，结果如图4所示。图4A为荧光显微镜照片比较，M-N表示鼠来源的synNotch系统，也即是原始的系统；ZFN-N表示斑马鱼Notch跨膜核心域升级的synNotch系统(antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64)，由图4A可知，与含鼠Notch核心域的synNotch系统(M-N)比较，含斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch系统(ZFN-N)可显著提高Mcherry红色荧光蛋白强度。图4B为流式细胞仪分析U2OS细胞中表达Mcherry红色荧光蛋白荧光强度，由图4B可知，使用斑马鱼Notch跨膜核心域的synNotch受体系统(ZFN-N)荧光表达强度，比原始文章报道的含鼠Notch核心域的synNotch系统(M-N)具有4.9倍的提升。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 新型SynNotch合成受体及其编码基因

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> 斑马鱼(Barchydanio rerio var)

<400> 1

ggctgctcct ccaagccatg ccacaatgga ggcttatgta cagaggaaac cagctatcca 60

ttttttcact gccagtgcac caatggctgg aaaggcaaac gatgtgaaca gaaaactggg 120

ccatcggctc cacttccttc tccttgccct attgctgact gcttcagcaa ggccaatgac 180

ggtgtgtgtg acaaagaatg caactccttg gactgccgct gggatggagg tgactgttct 240

cttgctgtaa acccctgggc acgctgtgca gaccctcgat gctggcggct cttcaacaac 300

agccaatgtg acgagttttg caataacgca gagtgcctgt tcgataattt cgactgcata 360

aacaaagaga aagtctgcaa ccccatctat gaagcatact gtactgacca ttatgcagat 420

ggactctgtg atcaaggatg caatactgaa gaatgtggct gggatggact ggattgtgca 480

aggaagattc cagaagacct tgctgaagat atgcttgtta ttgtagtcct actgccccca 540

gaggagcttc taaggacaca aacagctttc ctgcagaaac taagtgccat cctacgcacc 600

acgttgcgct tccgtctcga tcgaaatgga gattacatga tccgacctta cacaggccgt 660

gagacgcgca ttaaacggga gcttaatcct caggaggtca ttgggtccat tgtatatttg 720

gaaatagaca acaggctgtg ctctcagggc tcagatgact gcttccgcaa tgctgacagt 780

gctgctgaat accttggtgc tctgtctgct cgggaaatgt tgcgcttccc ataccccatt 840

aaagaagtga caagtgaaaa aagagagccc ttgattactg agatacctga atgggctagg 900

ctactgctag taggtgtagc ttctctcttc ttgttggtaa tcttgatggt tggcatgttg 960

attgcccgcc gcaagcgt 978

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 斑马鱼(Barchydanio rerio var)

<400> 2

Gly Cys Ser Ser Lys Pro Cys His Asn Gly Gly Leu Cys Thr Glu Glu

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Pro Phe Phe His Cys Gln Cys Thr Asn Gly Trp Lys Gly

20 25 30

Lys Arg Cys Glu Gln Lys Thr Gly Pro Ser Ala Pro Leu Pro Ser Pro

35 40 45

Cys Pro Ile Ala Asp Cys Phe Ser Lys Ala Asn Asp Gly Val Cys Asp

50 55 60

Lys Glu Cys Asn Ser Leu Asp Cys Arg Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser

65 70 75 80

Leu Ala Val Asn Pro Trp Ala Arg Cys Ala Asp Pro Arg Cys Trp Arg

85 90 95

Leu Phe Asn Asn Ser Gln Cys Asp Glu Phe Cys Asn Asn Ala Glu Cys

100 105 110

Leu Phe Asp Asn Phe Asp Cys Ile Asn Lys Glu Lys Val Cys Asn Pro

115 120 125

Ile Tyr Glu Ala Tyr Cys Thr Asp His Tyr Ala Asp Gly Leu Cys Asp

130 135 140

Gln Gly Cys Asn Thr Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala

145 150 155 160

Arg Lys Ile Pro Glu Asp Leu Ala Glu Asp Met Leu Val Ile Val Val

165 170 175

Leu Leu Pro Pro Glu Glu Leu Leu Arg Thr Gln Thr Ala Phe Leu Gln

180 185 190

Lys Leu Ser Ala Ile Leu Arg Thr Thr Leu Arg Phe Arg Leu Asp Arg

195 200 205

Asn Gly Asp Tyr Met Ile Arg Pro Tyr Thr Gly Arg Glu Thr Arg Ile

210 215 220

Lys Arg Glu Leu Asn Pro Gln Glu Val Ile Gly Ser Ile Val Tyr Leu

225 230 235 240

Glu Ile Asp Asn Arg Leu Cys Ser Gln Gly Ser Asp Asp Cys Phe Arg

245 250 255

Asn Ala Asp Ser Ala Ala Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Ser Ala Arg Glu

260 265 270

Met Leu Arg Phe Pro Tyr Pro Ile Lys Glu Val Thr Ser Glu Lys Arg

275 280 285

Glu Pro Leu Ile Thr Glu Ile Pro Glu Trp Ala Arg Leu Leu Leu Val

290 295 300

Gly Val Ala Ser Leu Phe Leu Leu Val Ile Leu Met Val Gly Met Leu

305 310 315 320

Ile Ala Arg Arg Lys Arg

325

<210> 3

<211> 1378

<212> DNA

<213> 人工序列antiCD19-oligo(含BamH I/Xho I-Gal4VP64)

<400> 3

gatatacaga tgacgcagac aacgtcaagt ctttccgcca gcttgggaga ccgagtgact 60

atatcttgta gagcaagcca ggatatttct aagtatctta actggtacca acaaaagccc 120

gatggaacgg ttaagctgct tatataccat accagtagac tccactccgg cgtaccatca 180

cggttttctg gcagtggctc cgggaccgac tattctttga cgatctctaa tctcgaacaa 240

gaggatattg caacatactt ttgtcagcaa ggcaatacct tgccatatac gtttgggggc 300

gggacaaaac ttgagataac cggcggcggt ggttcaggcg gtggcggttc cggtggtggg 360

ggatcagagg ttaagcttca ggaatccgga ccaggtttgg ttgcccccag ccaatctctc 420

agcgttacat gcacggtttc aggcgtcagt ctccccgatt acggtgtaag ttggattcgg 480

caacctccgc gaaagggtct ggaatggctg ggggttattt gggggagtga gacaacttat 540

tacaactctg cacttaagag tcggcttacc atcatcaagg ataattcaaa atcacaagta 600

ttcctgaaga tgaactcatt gcaaacagat gatacagcta tatactattg tgccaagcat 660

tactattatg gtggttctta tgcaatggat tactgggggc aaggcacgtc agtgacagtg 720

agttcactcg aggcgaggat ccatgaagct gctgagcagc atcgagcagg cctgtgacat 780

ctgccggctg aagaaactga agtgcagcaa agaaaagccc aagtgcgcca agtgcctgaa 840

gaacaactgg gagtgccggt acagccccaa gaccaagaga agccccctga ccagagccca 900

cctgaccgag gtggaaagcc ggctggaaag actggaacag ctgtttctgc tgatcttccc 960

acgcgaggac ctggacatga tcctgaagat ggacagcctg caggacatca aggccctgct 1020

gaccggcctg ttcgtgcagg acaacgtgaa caaggacgcc gtgaccgaca gactggccag 1080

cgtggaaacc gacatgcccc tgaccctgcg gcagcacaga atcagcgcca ccagcagcag 1140

cgaggaaagc agcaacaagg gccagcggca gctgacagtg tctgctgctg caggcggaag 1200

cggaggctct ggcggatctg atgccctgga cgacttcgac ctggatatgc tgggcagcga 1260

cgccctggat gattttgatc tggacatgct gggatctgac gctctggacg atttcgatct 1320

cgacatgttg ggatcagatg cactggatga ctttgacctg gacatgctcg gatcatga 1378

<210> 4

<211> 2346

<212> DNA

<213> antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64(synNotch receptor)

<400> 4

gatatacaga tgacgcagac aacgtcaagt ctttccgcca gcttgggaga ccgagtgact 60

atatcttgta gagcaagcca ggatatttct aagtatctta actggtacca acaaaagccc 120

gatggaacgg ttaagctgct tatataccat accagtagac tccactccgg cgtaccatca 180

cggttttctg gcagtggctc cgggaccgac tattctttga cgatctctaa tctcgaacaa 240

gaggatattg caacatactt ttgtcagcaa ggcaatacct tgccatatac gtttgggggc 300

gggacaaaac ttgagataac cggcggcggt ggttcaggcg gtggcggttc cggtggtggg 360

ggatcagagg ttaagcttca ggaatccgga ccaggtttgg ttgcccccag ccaatctctc 420

agcgttacat gcacggtttc aggcgtcagt ctccccgatt acggtgtaag ttggattcgg 480

caacctccgc gaaagggtct ggaatggctg ggggttattt gggggagtga gacaacttat 540

tacaactctg cacttaagag tcggcttacc atcatcaagg ataattcaaa atcacaagta 600

ttcctgaaga tgaactcatt gcaaacagat gatacagcta tatactattg tgccaagcat 660

tactattatg gtggttctta tgcaatggat tactgggggc aaggcacgtc agtgacagtg 720

agttcactcg gctgctcctc caagccatgc cacaatggag gcttatgtac agaggaaacc 780

agctatccat tttttcactg ccagtgcacc aatggctgga aaggcaaacg atgtgaacag 840

aaaactgggc catcggctcc acttccttct ccttgcccta ttgctgactg cttcagcaag 900

gccaatgacg gtgtgtgtga caaagaatgc aactccttgg actgccgctg ggatggaggt 960

gactgttctc ttgctgtaaa cccctgggca cgctgtgcag accctcgatg ctggcggctc 1020

ttcaacaaca gccaatgtga cgagttttgc aataacgcag agtgcctgtt cgataatttc 1080

gactgcataa acaaagagaa agtctgcaac cccatctatg aagcatactg tactgaccat 1140

tatgcagatg gactctgtga tcaaggatgc aatactgaag aatgtggctg ggatggactg 1200

gattgtgcaa ggaagattcc agaagacctt gctgaagata tgcttgttat tgtagtccta 1260

ctgcccccag aggagcttct aaggacacaa acagctttcc tgcagaaact aagtgccatc 1320

ctacgcacca cgttgcgctt ccgtctcgat cgaaatggag attacatgat ccgaccttac 1380

acaggccgtg agacgcgcat taaacgggag cttaatcctc aggaggtcat tgggtccatt 1440

gtatatttgg aaatagacaa caggctgtgc tctcagggct cagatgactg cttccgcaat 1500

gctgacagtg ctgctgaata ccttggtgct ctgtctgctc gggaaatgtt gcgcttccca 1560

taccccatta aagaagtgac aagtgaaaaa agagagccct tgattactga gatacctgaa 1620

tgggctaggc tactgctagt aggtgtagct tctctcttct tgttggtaat cttgatggtt 1680

ggcatgttga ttgcccgccg caagcgttcc atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggcc 1740

tgtgacatct gccggctgaa gaaactgaag tgcagcaaag aaaagcccaa gtgcgccaag 1800

tgcctgaaga acaactggga gtgccggtac agccccaaga ccaagagaag ccccctgacc 1860

agagcccacc tgaccgaggt ggaaagccgg ctggaaagac tggaacagct gtttctgctg 1920

atcttcccac gcgaggacct ggacatgatc ctgaagatgg acagcctgca ggacatcaag 1980

gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacaga 2040

ctggccagcg tggaaaccga catgcccctg accctgcggc agcacagaat cagcgccacc 2100

agcagcagcg aggaaagcag caacaagggc cagcggcagc tgacagtgtc tgctgctgca 2160

ggcggaagcg gaggctctgg cggatctgat gccctggacg acttcgacct ggatatgctg 2220

ggcagcgacg ccctggatga ttttgatctg gacatgctgg gatctgacgc tctggacgat 2280

ttcgatctcg acatgttggg atcagatgca ctggatgact ttgacctgga catgctcgga 2340

tcatga 2346

<210> 5

<211> 781

<212> PRT

<213> antiCD19-zebra synNotch-Gal4VP64(synNotch receptor)

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Leu Gly Cys Ser Ser Lys Pro Cys His Asn Gly Gly Leu Cys

245 250 255

Thr Glu Glu Thr Ser Tyr Pro Phe Phe His Cys Gln Cys Thr Asn Gly

260 265 270

Trp Lys Gly Lys Arg Cys Glu Gln Lys Thr Gly Pro Ser Ala Pro Leu

275 280 285

Pro Ser Pro Cys Pro Ile Ala Asp Cys Phe Ser Lys Ala Asn Asp Gly

290 295 300

Val Cys Asp Lys Glu Cys Asn Ser Leu Asp Cys Arg Trp Asp Gly Gly

305 310 315 320

Asp Cys Ser Leu Ala Val Asn Pro Trp Ala Arg Cys Ala Asp Pro Arg

325 330 335

Cys Trp Arg Leu Phe Asn Asn Ser Gln Cys Asp Glu Phe Cys Asn Asn

340 345 350

Ala Glu Cys Leu Phe Asp Asn Phe Asp Cys Ile Asn Lys Glu Lys Val

355 360 365

Cys Asn Pro Ile Tyr Glu Ala Tyr Cys Thr Asp His Tyr Ala Asp Gly

370 375 380

Leu Cys Asp Gln Gly Cys Asn Thr Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu

385 390 395 400

Asp Cys Ala Arg Lys Ile Pro Glu Asp Leu Ala Glu Asp Met Leu Val

405 410 415

Ile Val Val Leu Leu Pro Pro Glu Glu Leu Leu Arg Thr Gln Thr Ala

420 425 430

Phe Leu Gln Lys Leu Ser Ala Ile Leu Arg Thr Thr Leu Arg Phe Arg

435 440 445

Leu Asp Arg Asn Gly Asp Tyr Met Ile Arg Pro Tyr Thr Gly Arg Glu

450 455 460

Thr Arg Ile Lys Arg Glu Leu Asn Pro Gln Glu Val Ile Gly Ser Ile

465 470 475 480

Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg Leu Cys Ser Gln Gly Ser Asp Asp

485 490 495

Cys Phe Arg Asn Ala Asp Ser Ala Ala Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Ser

500 505 510

Ala Arg Glu Met Leu Arg Phe Pro Tyr Pro Ile Lys Glu Val Thr Ser

515 520 525

Glu Lys Arg Glu Pro Leu Ile Thr Glu Ile Pro Glu Trp Ala Arg Leu

530 535 540

Leu Leu Val Gly Val Ala Ser Leu Phe Leu Leu Val Ile Leu Met Val

545 550 555 560

Gly Met Leu Ile Ala Arg Arg Lys Arg Ser Met Lys Leu Leu Ser Ser

565 570 575

Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser

580 585 590

Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys

595 600 605

Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu

610 615 620

Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu

625 630 635 640

Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu

645 650 655

Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val

660 665 670

Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met

675 680 685

Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu

690 695 700

Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala

705 710 715 720

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp

725 730 735

Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met

740 745 750

Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser

755 760 765

Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser

770 775 780

Claims (10)

1.一种新型SynNotch合成受体，包括胞外域、Notch跨膜核心域和胞内域，其特征在于，所述的Notch跨膜核心域是斑马鱼Notch跨膜核心域。

2.根据权利要求1所述的新型SynNotch合成受体，其特征在于，包括anti-CD19scFV片段、斑马鱼Notch跨膜核心域和GAL-VP64片段。

3.根据权利要求1或2所述的SynNotch合成受体，其特征在于，所述的斑马鱼Notch跨膜核心域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的SynNotch合成受体，其特征在于，所述的编码斑马鱼Notch跨膜核心域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述的SynNotch合成受体，其特征在于，所述SynNotch合成受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.一种权利要求1所述的新型SynNotch合成受体的编码基因。

7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于，所述SynNotch合成受体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求6或7所述的编码基因。

9.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求6所述的编码基因或权利要求8所述的表达载体。

10.一种提高细胞识别特定胞外信号的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的SynNotch合成受体或权利要求6所述的SynNotch合成受体的编码基因对活体细胞进行改造，让细胞可以识别特定表面抗原，并作出更强烈的特定反应，激活下游基因的表达。