JP2002088100A - 抗原、抗体およびそれを使用した測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウマＣｇＡの測定・検出方法並びにそれに用
いる抗原および抗体を提供する。 【解決手段】 アミノ酸配列：ＤＥＥＥＤＤＰＤＲＳＭ
ＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰＧＬＱＬＲＲのペプチ
ド、または該アミノ酸配列において１ないし数個のアミ
ノ酸が欠失、置換または追加されたアミノ酸配列からな
りかつ該アミノ酸配列のペプチドと同等の抗原活性を示
すペプチドからなる抗原；該抗原を温血動物に免疫して
産生することにより取得されるウマ・クロモグラニンＡ
に特異的な反応性を有する抗体；および該抗体を使用し
てイムノアッセイを行うウマ・クロモグラニンＡおよび
その関連物質を特異的に測定および／または検出する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原、抗体および
それを使用した測定方法に関する。より詳しくは、本発
明はウマ・クロモグラニンＡ（以下、ＣｇＡと表記す
る。）のアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を有
するペプチド、または該アミノ酸配列において１ないし
数個のアミノ酸が欠失、置換または追加されたアミノ酸
配列を有するペプチドからなる抗原、該抗原を用いて産
生したウマＣｇＡに特異的な反応性を有する抗体、およ
び該抗体を用いたウマＣｇＡおよびその関連物質の測定
および／または検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣｇＡは、可溶性酸性タンパク質である
クロモグラニン類の一種であり、そしてクロム親和性細
胞内に見出される。またＣｇＡはカテコールアミンおよ
びペプチドホルモンを分泌する様々なニューロンおよび
パラニューロン中の分泌腺細胞中に貯蔵されており、内
臓の刺激に応答してアドレナリンおよびノルアドレナリ
ンと共に放出される。さらに、激しい運動が血漿中のＣ
ｇＡ濃度を増加させることも知られている。

【０００３】ＣｇＡの有する上記の性質に基づき、ウマ
において分泌されるウマＣｇＡの濃度を測定することに
よって、ウマのストレス指数を決定しようとする試みが
なされている。しかしながら、現在に至るまでウマＣｇ
Ａを有効に測定する方法は知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ウマＣｇＡおよびその関連ペプチドを特異的にかつ
高感度で測定・検出する方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の要求
に鑑み鋭意研究を行った結果、ウマＣｇＡのアミノ酸配
列の一部と同一なアミノ酸配列を有する特定のペプチド
を抗原として用いて免疫させることにより、ウマＣｇＡ
に対して特異的に反応する抗体を得ることができ、そし
てさらに該抗体を使用してイムノアッセイを行うことに
より、ウマＣｇＡおよびその関連物質を特異的にかつ高
感度で測定・検出することができることを見出し本発明
を完成させた。

【０００６】従って本発明は、第一の観点として、次の
アミノ酸配列（Ｉ） ＤＥＥＥＤＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰ
ＧＬＱＬＲＲ を有するペプチド、またはアミノ酸配列（Ｉ）において
１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換または追加された
アミノ酸配列を有しかつアミノ酸配列（Ｉ）を有するペ
プチドと同等の抗原活性を示すペプチドからなる抗原に
関する。アミノ酸配列（Ｉ）において１ないし数個のア
ミノ酸が欠失、置換または追加されたアミノ酸配列を有
しかつアミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチドと同等の抗
原活性を示すペプチドの例としては、次のアミノ酸配列
（ＩＩ） ＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰＧＬＱＬＲ
Ｒ を有するペプチドが挙げられる。なお上記のペプチドを
構成するアミノ酸残基の立体配置はＤ、ＬまたはＤＬで
あることができるが、該ペプチドは通常はＬ体である。

【０００７】また本発明の第二の観点は、上記の抗原を
ウマ、ヒトを除く温血動物に免疫して産生することによ
り取得されることを特徴とする、ウマＣｇＡに特異的な
反応性を有する抗体に関する。上記の免疫とは体液性免
疫を意味する。また得られる抗体には、抗血清、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体およびＩｇＹ等の一
般の抗体が包含される。そしてこれらの抗体は、各種の
イムノアッセイにより、ウマの組織中、血液中、尿中、
脊髄液中および唾液中等のウマＣｇＡを測定・検出する
ための有効な手段となり得る。また本発明の抗体は、ウ
マＣｇＡの測定・検出のみならず、ウマにおけるＣｇＡ
の刺激−分泌機構の解明等の研究のための有用な試薬と
しても役立つ。

【０００８】さらに本発明の第三の観点は、上記の抗体
を使用してイムノアッセイを行うことを特徴とする、ウ
マＣｇＡおよびその関連物質を特異的に測定および／ま
たは検出する方法に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の抗原である特定のアミノ
酸配列を有するペプチドは以下のようにして見出した。

【００１０】１．ｔｏｔａｌ・ＲＮＡの抽出 ウマの副腎髄質組織を死亡直後の成熟したサラブレッド
（２歳）から入手した。そしてその後該組織を液体窒素
中、−８０℃で冷凍した。該組織からｔｏｔａｌ・ＲＮ
Ａを、グアニジニウム／塩化セシウム超遠心分離によっ
て該組織から抽出し、以下のＲＴ−ＰＣＲに使用した。

【００１１】２．ウマＣｇＡのｃＤＮＡのクローニング
および配列決定 ウマＣｇＡ遺伝子を増幅するために、ウシおよびヒト由
来のＣｇＡの配列から誘導した変性プライマーを使用す
るＲＴ−ＰＣＲを、ジーンＡｍｐ・ＰＣＲシステム２４
００（パーキンエルマー社製）を使用して上記ｔｏｔａ
ｌ・ＲＮＡについて行った。ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ−
Ｔイージーベクター（プロメガ社製）中にサブクローニ
ングした。ｃＤＮＡ配列をサンガー法に従って、Ａ．
Ｌ．Ｆ．自動シークエンサー（ファルマシア・バイオテ
ック社製）、蛍光標識配列プライマー（Ｍ４およびＲＶ
−Ｍ、宝酒造社製）、およびオートシークエンサー・コ
アキット（東洋紡社製）を用いて決定した。完全なｃＤ
ＮＡ配列を得るために、５’および３’末端のｃＤＮＡ
末端高速増殖法（ＲＡＣＥ）を５’／３’ＲＡＳＥキッ
ト（ベーリンガー・マンハイム社製）を使用して行っ
た。別のＰＣＲプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を使
用して識別したｃＤＮＡ配列に基づいて作成した。使用
した各々のプライマーの方向および位置を図１に示す。
５’−および３’−ＲＡＣＥのＰＣＲ生成物を同様にｐ
ＧＥＭ−Ｔイージーベクター中に導入し、そしてＤＮＡ
配列を決定した。

【００１２】３．ウマＣｇＡのｃＤＮＡ配列およびアミ
ノ酸配列の解析 上記で得られたｃＤＮＡ配列は、全部で１８２８ｂｐの
ｃＤＮＡからなり、７８ｂｐの５’末端未翻訳領域と、
ウマＣｇＡのアミノ酸４４８残基をエンコードする１３
４７ｂｐのオープン・リーディング・フレームと、およ
び４０３ｂｐの３’末端未翻訳領域を含んでいた。得ら
れたアミノ酸配列を配列分析ソフトウェア（ＤＮＡＳＩ
Ｓ−Ｍａｃ、日立ソフトウェアエンジニアリング社製）
により、ウシ、ブタ、ヒト、マウス、ラットおよびカエ
ルのＣｇＡのアミノ酸配列と比較した。比較結果を図２
に示す。図２は、ウシ、ブタ、ヒト、マウス、ラットお
よびカエルのＣｇＡのアミノ酸配列とウマＣｇＡアミノ
酸配列を併記したものであり、黒丸はウマＣｇＡのアミ
ノ酸と同じ残基を表し、また横棒はウマＣｇＡ配列と最
も良く合致させるために挿入されたものを表す。図２よ
り明らかなように、ＣｇＡのアミノ酸配列がＮ末端およ
びＣ末端において各動物間で非常に良く保存されてい
る。ウマＣｇＡのアミノ酸配列の類似度は、アミノ酸残
基番号１〜７７のＮ末端において、ウシ、ブタ、ヒト、
マウス、ラットおよびカエルの配列に対して各々９４．
８％、９３．５％、９２．２％、８１．８％、８３．１
％および６６．２％であり、アミノ酸残基番号３１４〜
４３０番のＣ末端においては各々９０．６％、８１．４
％、９０．６％、８０．５％、８３．３％および３９．
０％であった。しかしながらウマＣｇＡのアミノ酸配列
の中央部分（アミノ酸残基番号７８〜３１３）は保存さ
れておらず、この部分の類似性は各々５２．５％、４
９．１％、３８．９％、２６．６％、２７．９％および
６．２％であった。

【００１３】４．抗原として用いるペプチド配列の決定 上記のようにＣｇＡのＮ末端およびＣ末端において存在
する保存された配列は、タンパク質加水分解部位または
生体活性ペプチドに相当する部位を含むことが知られて
いる。なかんずく、ウシＣｇＡのアミノ酸残基番号３４
４〜３６４の配列は、カテコールアミン放出を抑制する
ペプチドであるカテスタチンに相当する。従って、該ウ
シＣｇＡのアミノ酸配列に対応しさらにその前後のアミ
ノ酸残基を含むウマＣｇＡのアミノ酸配列、即ちウマＣ
ｇＡのアミノ酸残基番号３３５〜３６５の配列と同じ次
のアミノ酸配列（Ｉ） ＤＥＥＥＤＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰ
ＧＬＱＬＲＲ を有するペプチドを抗原として用いると、ウマＣｇＡを
有効に測定するイムノアッセイのための抗体を産生する
ことができることを見出した。

【００１４】なお本発明の抗原は、アミノ酸配列（Ｉ）
を有するペプチドのみならず、アミノ酸配列（Ｉ）にお
いて１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換または追加さ
れたアミノ酸配列からなりかつアミノ酸配列（Ｉ）を有
するペプチドと同等の抗原活性を示すペプチドからなる
抗原をも含む。そのような抗原としては、アミノ酸配列
（Ｉ）のＮ末端側の５残基を除いた次のアミノ酸配列
（ＩＩ） ＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰＧＬＱＬＲ
Ｒ であって、ウマＣｇＡのアミノ酸残基番号３４０〜３６
５に相当する配列を有するペプチドからなる抗原が挙げ
られる。

【００１５】本発明の抗体を含む抗血清は、例えば次の
アミノ酸配列（ＩＩＩ） Ｈ−ＤＥＥＥＤＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲ
ＧＰＧＬＱＬＲＲ−ＯＨ または（ＩＶ） Ｈ−ＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰＧＬＱ
ＬＲＲ−ＯＨ を有するペプチドを抗原として用い、ウサギ、ヒツジお
よびモルモット等の温血動物に免疫することにより産生
し、そして該温血動物の血液より取得することができ
る。得られた抗血清は上記アミノ酸配列（ＩＩＩ）また
は（ＩＶ）を有するペプチドに特異的な反応性を有する
のは勿論のこと、ウマＣｇＡに対して特異的な反応性を
有するものである。

【００１６】上記の抗血清を含めて、本発明の抗体は例
えば次の手順により得ることができる。 （１）先ず、上記アミノ酸配列（Ｉ）および（ＩＩ）を
有するペプチドを固相法または液相法により合成し、続
いて得た粗生成物を逆相クロマトグラフィーにより９５
％以上の純度に精製する。ペプチドの合成のためには、
固相法に従って合成すべきペプチドのアミノ酸をカルボ
キシル末端のアミノ酸残基から１残基ずつ導入し、ペプ
チド鎖を逐次延長する方法が好ましく採用され得る。こ
の場合、ペプチド合成装置を利用することが大変好都合
である。なお上記の合成において、反応に関与しないカ
ルボキシル基の保護基として、トリチルクロリド基、第
三ブチルエステル基等が利用され、反応に関与しないア
ミノ基の保護基として、第三ブチルオキシカルボニル基
等が利用されることができる。

【００１７】（２）続いて、上記の精製したペプチドを
例えば以下の（ｉ）ないし（ｉｉｉ）の方法に従って、
免疫をなすための抗原に調製する。 （ｉ）水溶性カルボジイミド、例えば１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（ＥＣＤＩ）またはジメチルスベルイミデート（ＤＭ
Ｓ）のような縮合剤の作用によって、ペプチドを血清蛋
白等の担体に結合させ、これを抗原として使用する方
法。 （ｉｉ）グルタルアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジジ
ンまたはｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸のような二官能
性試薬を用いてペプチドと担体との間に架橋を形成し、
高分子の抗原に調整してこれを抗原として使用する方
法。 （ｉｉｉ）ペプチドを炭素またはポリビニルピロリドン
のような不活性ポリマーからなる微粒子に吸着させ、こ
れを抗原として使用する方法。

【００１８】（３）次に、上記のようにして得られた抗
原を温血動物に免疫することにより、抗体を該温血動物
の血液等の体液内または該温血動物が産卵した卵内に産
生させ、そしてそれらより抗体を取得する。例えば該温
血動物がウサギ、ヒツジ、モルモット等の場合には、上
記の抗原を通常のフロイント完全アジュバントと共に複
数回免疫することにより、該温血動物に抗血清を産生さ
せ、そしてその血液を採取して常法に従い抗血清を取得
する。また該温血動物がニワトリである場合には、上記
の抗原を複数回免疫することにより、該ニワトリが産卵
する鶏卵にＩｇＹを産生させ、そして該鶏卵の卵黄より
常法に従い粗ＩｇＹを採取し、続いて精製を行ってＩｇ
Ｙを取得する。あるいは、上記の抗原をフロイント完全
アジュバントと共に複数回免疫をなすことによりマウス
に抗体を産生させると共に、細胞融合法に従い該抗体産
生細胞と骨髄腫細胞とを融合してクローニングを行い、
そして目的とする抗体を産生する単一クローン細胞を分
離することによりモノクローナル抗体を取得することも
可能である。。

【００１９】上記の手順により得られた本発明の抗体で
ある抗血清、ＩｇＹおよびモノクローナル抗体は、上記
アミノ酸配列（Ｉ）の全部または一部を有するペプチド
並びにウマＣｇＡに特異的に反応する性質を有する。そ
れ故、該性質に基づいてアミノ酸配列（Ｉ）の全部また
は一部を有するウマＣｇＡ関連ペプチドおよびウマＣｇ
Ａを標的とするイムノアッセイ、例えばラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）、ラジオイムノメトリックアッセイ
（ＲＩＭＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素イ
ムノメトリックアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノア
ッセイ（ＦＩＡ）、レーザーを利用するイムノアッセイ
等に使用することができ、高感度の測定・検出が可能と
なる。

【００２０】

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。しかしながら、これらの実施例は非制限的なも
のであり、本発明はこれらの実施例によって制限して解
釈されるべきではない。なお、以下の実施例において、
特に記載がない限り、アミノ酸残基の立体配置はＬ体で
ある。また次の略号を使用する。 Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル基 ｔＢｏｃ：第三ブトキシカルボニル基 ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベ
ンゾフラン−５−スルホニル基 ＯｔＢｕ：第三ブチルエーテル基 ｔＢｕ：第三ブチル基 Ｔｒｔ：トリチル基 ＨＡＴＵ：７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオ
ロホスフェイド

【００２１】実施例１：次のアミノ酸配列を有するペプ
チドの合成 Ｈ−ＤＥＥＥＤＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲ
ＧＰＧＬＱＬＲＲ−ＯＨ上記のペプチドを、ペプチド合
成装置を用いて固相法に従う自動操作により以下のよう
に行った。先ず、ペプチド合成装置（９０５０プラス・
ペプシンセサイザー）の反応器にＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ
（Ｐｂｆ）−ポリエチレングリコール樹脂０．７２ｇを
入れ、これに順次アミノ酸を１残基ずつ結合させて目的
とするペプチド鎖を合成した。合成の１サイクルは次の
操作手順よりなる。 １）ＤＮＦによる洗浄（１分間）、 ２）Ｆｍｏｃ基の脱離（７分間）、 ３）ＤＮＦによる洗浄（７分間）、 ４）ＨＡＴＵによるＦｍｏｃ−アミノ酸の活性化、 ５）Ｆｍｏｃ−アミノ酸のカップリング（縮合）反応
（６０分間）、および ６）ＤＮＦによる洗浄（４分間）。 合成の際の反応器の内部は、空気による酸化を最小限に
するために、窒素でパージして窒素雰囲気下に保持し
た。手順２）でのＦｍｏｃ保護基の脱離は、ＤＭＦ中の
２０％ピペリジン溶液中で６分間処理することにより行
った。手順４）および５）については、各Ｆｍｏｃ−ア
ミノ酸０．４ｍＭの連続的カップリングをＨＡＴＵ０．
４ｍＭの存在下ＤＭＦ中で６０分間行った。その際のＦ
ｍｏｃ−アミノ酸としては、次の保護アミノ酸を使用し
た。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、
Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍ
ｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒ
ｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅ
ｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔＢｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌ
ｙ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−
Ｓｅｒ（ｔＢｕ）およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）。
以上の合成により、目的の保護ペプチド樹脂１．２０ｇ
を得た。合成後、保護ペプチド樹脂０．９８ｇを、ｍ−
クレゾール０．６ｍＬ、エタンジチオール１．８ｍＬ、
チオアニソール３．６ｍＬおよびトリフルオロ酢酸２
４．０ｍＬの混合物の存在下で室温で２時間処理し、そ
の後該樹脂を濾過により除去し、次いでトリフルオロ酢
酸を減圧下で留去した。蒸留物に乾燥ジエチルエーテル
を加えて、ペプチドを沈殿させた。さらに０℃で遠心分
離し、沈殿したペプチドをジエチルエーテルで洗浄し
た。上記の一連の操作を繰り返すことにより、粗ペプチ
ド２６１ｍｇを得た。得られた粗ペプチドを逆相高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。カ
ラムについてはＹＭＣ−パック−Ｄ−ＯＤＳ−５（２０
×２５０ｍｍ）を使用した。また溶出は０．０１Ｎ・Ｈ
Ｃｌ／ＣＨ₃ＣＮの濃度比８２／１８から７８／２２へ
の直線濃度勾配（流速：７ｍＬ／分、検出波長２３０ｎ
ｍ）の条件下で行った。得られた精製ペプチドについ
て、分析用逆相ＨＰＬＣにより純度の検定を行った。該
検定の実施条件は次の通りである。 カラム：ＹＭＣ−パック−Ｄ−ＯＤＳ−５（４．６×２
５０ｍｍ） 溶媒：０．０１Ｎ・ＨＣｌ／ＣＨ₃ＣＮ 直線濃度勾配：９５／５から４０／６０への勾配 流速：１．０ｍＬ／分 検出波長：２１０ｎｍ 目的の精製ペプチドは１３．８分に鋭い単一ピークとし
て溶出した。また該精製ペプチドのアミノ酸配列をシー
ケンサー（４７７４Ａ型、アプライドバイオシステム社
製）によって検定し、得られたペプチドが上記アミノ酸
配列（Ｉ）を有することを確認した。該ペプチドを以下
ペプチド（Ｉ）と呼ぶ。

【００２２】実施例２：次のアミノ酸配列を有するペプ
チドの合成 Ｈ−ＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰＧＬＱ
ＬＲＲ−ＯＨ 上記のペプチドを実施例１と同様に、ペプチド合成装置
を用いて固相法に従う自動操作により合成した。即ち、
ペプチド合成装置の反応器にＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐ
ｂｆ）−ポリエチレングリコール樹脂を入れ、これに順
次アミノ酸を１残基ずつ結合させて目的とするペプチド
鎖を合成した。合成サイクルの操作手順、各合成の条件
および使用した保護アミノ酸は実施例１の場合と同様で
ある。以上の合成により、目的の保護ペプチド樹脂１．
３０ｇを得た。合成後、保護ペプチド樹脂１．００ｇ
を、ｍ−クレゾール０．６ｍＬ、エタンジチオール１．
８ｍＬ、チオアニソール３．６ｍＬおよびトリフルオロ
酢酸２４．０ｍＬの混合物の存在下で室温で２時間処理
し、その後該樹脂を濾過により除去し、次いでトリフル
オロ酢酸を減圧下で留去した。蒸留物に乾燥ジエチルエ
ーテルを加えて、ペプチドを沈殿させた。さらに０℃で
遠心分離し、沈殿したペプチドをジエチルエーテルで洗
浄した。上記の一連の操作を繰り返すことにより、粗ペ
プチド１９０ｍｇを得た。得られた粗ペプチドを実施例
１と同じ条件に従い逆相ＨＰＬＣにより精製した。得ら
れた精製ペプチドについて、分析用逆相ＨＰＬＣにより
純度の検定を行った。該検定の実施条件は実施例１に準
じた。目的の精製ペプチドは１４．８分に鋭い単一ピー
クとして溶出した。また該精製ペプチドのアミノ酸配列
を実施例１と同様にして検定し、得られたペプチドが上
記アミノ酸配列（ＩＩ）を有することを確認した。該ペ
プチドを以下ペプチド（ＩＩ）と呼ぶ。

【００２３】実施例３：次のアミノ酸配列を有するビオ
チン化ペプチドの合成 ＧＧ−ＤＥＥＥＤＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦ
ＲＧＰＧＬＱＬＲＲ−ＯＨ 実施例１におけるペプチド（Ｉ）の合成過程で生じた保
護ペプチド樹脂０．１５ｇを出発原料として用いて、実
施例１の方法および条件に従ってペプチド合成装置によ
る自動操作により、最初にＦｍｏｃ基を除去し、続いて
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．０５ｍＭ）を２回連続カップリ
ングし、その後ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを用いてビオチン化を行った。以上の合成に
より、目的のビオチン化保護ペプチド樹脂０．１６ｇを
得た。合成後、ビオチン化保護ペプチド樹脂０．１６ｇ
を、ｍ−クレゾール０．１５ｍＬ、エタンジチオール
０．４５ｍＬ、チオアニソール０．９ｍＬおよびトリフ
ルオロ酢酸１４．０ｍＬの混合物の存在下で室温で２時
間処理し、その後該樹脂を濾過により除去し、次いでト
リフルオロ酢酸を減圧下で留去した。以降、実施例１と
同様な操作を行うことにより、粗ペプチド４０ｍｇを得
た。得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製し
た。カラムについてはＹＭＣ−パック−Ｄ−ＯＤＳ−５
（２０×２５０ｍｍ）を使用した。また溶出は０．０１
Ｎ・ＨＣｌ／ＣＨ₃ＣＮの濃度比８０／２０から７６／
２４への直線濃度勾配（流速：７ｍＬ／分、検出波長２
３０ｎｍ）の条件下で行った。得られた精製ペプチドに
ついて、分析用逆相ＨＰＬＣにより純度の検定を行っ
た。該検定の実施条件は次の通りである。 カラム：ＹＭＣ−パック−Ｄ−ＯＤＳ−５（４．６×２
５０ｍｍ） 溶媒：０．０１Ｎ・ＨＣｌ／ＣＨ₃ＣＮ 直線濃度勾配：９５／５から４０／６０への勾配 流速：１．０ｍＬ／分 検出波長：２１０ｎｍ 目的の精製ペプチドは１４．４分に鋭い単一ピークとし
て溶出した。また該精製ペプチドのアミノ酸配列を実施
例１と同様に検定し、得られたペプチドが上記のアミノ
酸配列を有することを確認した。該ペプチドを以下ペプ
チド（ＩＩＩ）と呼ぶ。

【００２４】実施例４：抗血清の取得１ 実施例１で得られたペプチド（Ｉ）２．０ｍｇを分子量
５０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の５０％水
溶液１．５ｍＬに溶解し、その後フロイント完全アジュ
バント１．６ｍＬを加え、そして該混合物をホモゲナイ
ザーにより氷冷下で３０分間攪拌した。得られた乳液
１．５ｍＬをイエウサギ（体重：２．０〜２．２ｋｇ）
に皮下注射した。追加免疫を最初の注射量の１／２の投
与量で２週間毎に繰り返すことによって行った。その
後、イエウサギの血液を常法に従い全採血し、続いて該
血液を３７℃で１時間および４℃で一晩放置し、その後
回転数３０００ｒｐｍで遠心分離して血清を取得して冷
凍保存した。実施例２で得られたペプチド（ＩＩ）を用
いて、上記と同様な手順により免疫用抗原を調整し、そ
してイエウサギに免疫し、その後常法に従い抗血清を取
得した。

【００２５】実施例５：抗血清の取得２ 実施例１で得られたペプチド（Ｉ）９．０ｍｇを、０．
１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液中で担体：キーホール・リ
ンペット・ヘモシアニン（ＫＨＨ）１．０ｍＬに縮合
剤：ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ・２ＨＣｌ）５
ｍｇの存在下で結合させた。反応混合液を透析すること
により、実施例１で得られたペプチドとＫＬＨの複合物
１８ｍｇを得た。その後該複合物３．６ｍｇを５０％Ｐ
ＶＰ水溶液３．０ｍＬに溶解し、続いてフロイント完全
アジュバント３．６ｍＬを加え、そしてホモゲナイザー
により混和した。得られた乳液を２等分し、等分した乳
化物を実施例４と同様にして２匹のイエウサギ注射免疫
した。その後、イエウサギの血液を常法に従い全採血
し、実施例４と同様にして血清を取得して冷凍保存し
た。実施例２で得られたペプチド（ＩＩ）を用いて、上
記と同様な手順により免疫用抗原を調整し、そしてイエ
ウサギに免疫し、その後常法に従い抗血清を取得した。

【００２６】実施例６：モノクローナル抗体の取得 １．モノクローナル抗体の作製 （動物への免疫）実施例１で得られたペプチド（Ｉ）を
５匹の健常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）に、常法に従い３週
間毎に３回腹腔内投与した。その後、投与したマウスの
抗体力価を測定し、抗体力価が最も高いマウスを選択し
て細胞融合に利用した。 （細胞融合）無菌下において、上記で選択したマウスよ
り脾臓を取り出し、これより抗体産生細胞としてリンパ
球を常法に従い採取した。得られたリンパ球をミエロー
マ（骨髄腫）細胞と混合し、続いて細胞融合促進物質と
して４．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加
することにより該細胞同士を融合させた。この際の培地
としては、ＲＰＭＩ培地１６４０（ギブコ社製）を使用
した。促進剤としては上記のものに加えて、リゾレシチ
ン、グリセロールオレイン酸エステル等を利用すること
も可能である。 （スクリーニングおよびクローニング）融合した細胞を
ＨＡＴ選択培地において培養し、そして培養した細胞を
ＥＬＩＳＡ法に従ってスクリーニングして、ペプチド
（Ｉ）の特異抗体を産生し得る抗体産生ハイブリドーマ
を選択し、続いて該ハイブリドーマのクローニングを限
界希釈法に従って行った。クローンをある程度増殖させ
た段階で再び同様のスクリーニングを行い、スクリーニ
ングとクローニングとを単一クローンが得られるまで同
様に繰り返した。 （腹水の作製）上記より得られた単一クローン（モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ）を大量に培養増殖
し、そしてそれを予めブリスタンしたヌードマウス（Ｂ
ＡＬＢ／Ｃ）に腹腔内投与し、その後投与したマウスか
ら生成した腹水を採取した。 ２．モノクローナル抗体の精製 得られた腹水中のモノクローナル抗体を、プロテインＡ
（バイオ−ラッド）アフィニティクロマトグラフィーに
より精製した。その際、免疫グロブリンの含有量は波長
２８０ｎｍの吸光度により算出した。 ３．抗体力価の検定 精製したモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡ法に従って
スクリーニングし、続いてペプチド（Ｉ）に対するモノ
クローナル抗体の力価を検定した。検定は以下の手順に
従って行った。 （プレートへの注入）濃度０．１μｇ／ｍＬのペプチド
（Ｉ）溶液を固相化プレート：９６ウエルマイクロプレ
ート（マスキシソープ・ヌンク・イムノ・プレート（ヌ
ンク４４２４０４））の各ウエルに注入し、その後該プ
レートを４℃で一晩放置した。 （第一反応）濃度が異なる上記の精製したモノクローナ
ル抗体溶液０．１ｍＬを上記プレートの各ウエルに添加
し、その後該プレートを室温で３時間放置して反応させ
た。 （第二反応）第一反応後、西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲ
Ｐ）標識抗マウスＩｇＧ（バイオ−ラッド）の５０００
倍希釈溶液を、各ウエル毎に０．１ｍＬ添加し、そして
上記プレートを室温で２時間放置して反応させた。 （第三反応）第二反応後、ｏ−フェニレンジアミン溶液
を基質溶液として各ウエル毎に０．１ｍＬ添加し、続い
て室温で１０分間反応させて発色させた。その後、該反
応を２Ｎ・Ｈ₂ＳＯ₄の添加によって停止させて、そして
速やかにマイクロプレート光度計を用いて各ウエルの吸
光度測定を行った。上記のごとくモノクローナル抗体の
力価を検定した結果、得られた抗体濃度と吸光度とのグ
ラフには良好な直線性が認められ、また上記モノクロー
ナル抗体はペプチド（Ｉ）に対する高い結合活性を有す
ることが確認された。

【００２７】実施例７：標識抗原の作製 実施例１で得られたペプチド（Ｉ）を、ハンターおよび
グリーンウッドが考案したクロラミンＴ法（ハンターお
よびグリーンウッド、Ｎａｔｕｒｅ、１９４、４９５〜
４９６頁（１９６２））に従って¹²⁵Ｉ化した。¹²⁵Ｉ化
は以下の手順に従って行った。実施例１で合成したペプ
チド（Ｉ）２．６μｇを０．０１Ｎ・ＨＣｌ溶液２．５
μＬに溶解し、そして該溶液に１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．３）４０μＬ、^{12 5}ＩＮａ溶液（２００μＣｉ、ア
マシャム社製）１μＬおよび精製水２０μＬに溶解した
クロラミンＴ・１０μｇの溶液を連続的に添加した。続
いて該混合物を２０秒間振盪し、そして精製水２０μＬ
に溶解したメタ重亜硫酸ナトリウム２０μｇおよび１０
％ヨウ素カリウム１０μＬ溶液を添加して反応を停止さ
せた。その後、該混合物を０．１％ウシ血清アルブミン
を含む１Ｍ酢酸を溶離液とするプレパックしたカラム
（ＮＡＰ−１０、ファルマシア・バイオテック社製）で
精製した。

【００２８】実施例８：ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）１ 実施例４で得られたペプチド（Ｉ）に対する抗血清を用
いてラジオイムノアッセイを行い、試料中のウマＣｇＡ
濃度を測定した。該ラジオイムノアッセイでは、希釈剤
として、ウシ血清アルブミン（０．５％Ｗ／Ｖ）、０．
０２５Ｍエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴ
Ａ）および０．１４Ｍ・ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）を、並びに標準品として、実施
例１で合成したペプチド（Ｉ）を使用した。希釈剤０．
４ｍＬ、ウマＣｇＡ含有試料（または標準品）０．１ｍ
Ｌ、最終的に８５００倍に希釈した実施例４で得られた
ペプチド（Ｉ）に対する抗血清０．１ｍＬおよび標識抗
原（５０００〜１００００ｃｐｍ）０．１ｍＬを培養チ
ューブ中で混合した。培養チューブとしてはホウ素シリ
コン化ガラスチューブ（チェース・インストルメント社
製）を使用した。得られた混合物を４℃で４８時間培養
し、その後希釈正常ウサギ血清（１：５０、第一ラジオ
アイソトープ研究所社製）０．０５ｍＬ、希釈ヤギ抗ウ
サギＩｇＧ血清（１：１０、第一ラジオアイソトープ研
究所社製）０．０５ｍＬおよび１０％（Ｗ／Ｖ）ポリエ
チレングリコール６０００（分子量７５００）０．５ｍ
Ｌを添加した。得られた混合物をさらに３時間培養し、
その後４℃で３０分間遠心分離（回転数３０００ｒｐ
ｍ）した。遠心分離後、該混合物から上澄液を採取し、
上澄液の放射線量をガンマー計数管を用いて測定した。
上記の測定を濃度が異なるいくつかの標準品について行
い、各標準品についての放射線量の測定値から検量線を
作成した。そしてウマＣｇＡ含有試料についての放射線
量を測定し、測定値から該検量線に基づいて試料中のウ
マＣｇＡ濃度を決定した。その結果、試料中のウマＣｇ
Ａ濃度は、ラジオイムノアッセイを用いて本発明の測定
方法により非常に高感度で測定することができた。

【００２９】実施例９：ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）２ 実施例４で得られたペプチド（ＩＩ）に対する抗血清を
用いたことを除いて、実施例８と同様な方法でラジオイ
ムノアッセイを行い、試料中のウマＣｇＡ濃度を測定し
た。その結果、試料中のウマＣｇＡ濃度は、実施例４で
得られたペプチド（Ｉ）に対する抗血清を用いた場合と
同様に、本実施例のラジオイムノアッセイによっても非
常に高感度で測定することができた。

【００３０】実施例１０：酵素イムノメトリックアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ） 実施例４で得られたペプチド（Ｉ）に対する抗血清を用
いて酵素イムノメトリックアッセイを行い、試料中のウ
マＣｇＡ濃度を測定した。該酵素イムノメトリックアッ
セイでは、ヤギ抗ウサギＩｇＧを固定化した９６ウエル
マイクロプレートを、また標準品として、実施例１で合
成したペプチド（Ｉ）を７種の異なる濃度に調製したも
のを使用した。測定を行う試料としてはウマの唾液およ
びウマの血漿を用い、唾液および血漿の各々について希
釈無し（１倍希釈）、３倍希釈および９倍希釈の希釈列
試料を調製して測定を行った。先ず、該プレートの各々
のウエルを０．９％ＮａＣｌおよび０．０５％トゥイー
ン２０を含む洗浄液により良く洗浄し、続いて０．４％
ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
３００μＬを各ウエル毎にそれぞれ注入した。その後、
該プレートを密封し、そして室温で２時間保存した。保
存終了後、各ウエル中の液体を流去させ、そして上記洗
浄液を用いて３回洗浄をした。次に、各ウエルに０．０
２５Ｍ・ＥＤＴＡと０．５％ウシ血清アルブミンを含む
リン酸緩衝溶液５０μＬを注入し、続いて測定すべきウ
マＣｇＡ含有試料（または標準品）１０μＬおよび実施
例４で得られたペプチド（Ｉ）に対する抗血清の溶液を
添加した。加えて、実施例３で合成したビオチン化ペプ
チド（ＩＩＩ）の溶液５０μＬおよび実施例４で得られ
たペプチド（Ｉ）に対する抗血清の溶液１００μＬをウ
エル毎に添加した。添加後、該プレートを密封し、プレ
ート振盪器を用いてゆっくりと振盪しながら室温で１６
〜２０時間反応させた。反応終了後、各ウエル中の液体
を流去させ、そして上記洗浄液を用いて３回洗浄した。
その後、各ウエルに０．１％ウシ血清アルブミンを含む
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させたストレプト
ゾシン−西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）の溶液１００
μＬを注入した。注入後、該プレートを密封し、室温で
２時間振盪して反応させた。反応終了後、各ウエル中の
液体を流去させ、そして上記洗浄液を用いて洗浄した。
続いて、Ｏ−フェニレンジアミン（１ｍｇ／ｍＬ）含有
０．０１５％過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム−クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させた酵素
基質の溶液１００μＬを各ウエルに添加した。添加後、
該プレートを密封し、室温で３０分間ゆっくりと振盪し
て反応させた。反応終了後、酵素反応停止液として２Ｎ
・Ｈ₂ＳＯ₄１００μＬを添加した。以上のように反応さ
せた該プレートの各ウエルについて、マイクロプレート
吸光度計を用いて波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
先ず、各標準品について測定を行い、測定された吸光度
から検量線を作成した。そしてウマＣｇＡ含有試料につ
いての吸光度を測定し、測定値から該検量線に基づいて
試料中のウマＣｇＡ濃度を決定した。結果を図３に図示
する。図３のグラフにおいて縦軸は４９２ｎｍでの吸光
度であり、また横軸はウマＣｇＡの濃度である。そして
黒丸は標準品についての測定結果を示し、また黒三角は
ウマの唾液、そして白丸はウマの血漿についての測定結
果を示す。グラフから明らかなように標準品によって作
成した検量線は略直線であり、酵素イムノメトリックア
ッセイにおける吸光度とウマＣｇＡ濃度との間には高い
相関性が見られる。またこのことは、ウマの唾液および
ウマの血漿の希釈列試料についての測定結果からも確認
することができる。また本発明の測定・検出方法は、
０．１０ｐモル／ｍＬ以下のような低濃度に至るまで非
常に高感度で測定することができることがわかる。

【００３１】

【発明の効果】本発明の抗原を使用することにより、ウ
マＣｇＡおよびその関連物質に特異的な反応性を有する
抗体を産生することが可能となる。そして、該抗体を使
用する本発明の測定および／または検出方法に従うと、
ウマＣｇＡおよびその関連物質をイムノアッセイにより
非常に高感度に測定・検出することが可能となり、その
結果、ウマ中で分泌されるウマＣｇＡの濃度測定による
ウマのストレス指数の決定に道が開かれる。また本発明
の抗体は、ウマＣｇＡの濃度測定についての利用のみな
らず、刺激−分泌機構の解明等の研究に有用な試薬とし
ても役立つことが期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ウマＣｇＡのｃＤＮＡの配列決定の
ために使用したプライマーを表す模式図である。

【図２】 図２は、ウマＣｇＡアミノ酸配列を他の動物
のＣｇＡアミノ酸配列と比較した図である。

【図３】 図３は、本発明の酵素イムノメトリックアッ
セイの測定結果について、縦軸を４９２ｎｍでの吸光度
としかつ横軸をウマＣｇＡの濃度としたグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁夫 静岡県富士宮市粟倉2480番地の１ 株式会 社矢内原研究所内 (72)発明者 長澤 晋吾 静岡県富士宮市粟倉2480番地の１ 株式会 社矢内原研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 CA04 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4H045 AA11 AA30 BA10 BA18 CA40 DA75 DA76 DA86 EA50 FA34 FA58 FA59 FA72 GA25 HA03 HA05

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列（Ｉ） ＤＥＥＥＤＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰ
   ＧＬＱＬＲＲ を有するペプチド、またはアミノ酸配列（Ｉ）において
   １ないし数個のアミノ酸が欠失、置換または追加された
   アミノ酸配列からなりかつアミノ酸配列（Ｉ）を有する
   ペプチドと同等の抗原活性を示すペプチドからなる抗
   原。
2. 【請求項２】 次のアミノ酸配列（ＩＩ） ＤＰＤＲＳＭＫＬＳＦＲＡＲＡＹＧＦＲＧＰＧＬＱＬＲ
   Ｒ を有するペプチドである、請求項１記載の抗原。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の抗原をウマお
   よびヒトを除く温血動物に免疫して産生することにより
   取得されることを特徴とする、ウマ・クロモグラニンＡ
   に特異的な反応性を有する抗体。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の抗体を使用してイムノ
   アッセイを行うことを特徴とする、ウマ・クロモグラニ
   ンＡおよびその関連物質を特異的に測定および／または
   検出する方法。