JPH09329600A - 抗Ｇｌｕ▲１７▼−オステオカルシン抗体 - Google Patents
抗Ｇｌｕ▲１７▼−オステオカルシン抗体Info
- Publication number
- JPH09329600A JPH09329600A JP4333197A JP4333197A JPH09329600A JP H09329600 A JPH09329600 A JP H09329600A JP 4333197 A JP4333197 A JP 4333197A JP 4333197 A JP4333197 A JP 4333197A JP H09329600 A JPH09329600 A JP H09329600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- osteocalcin
- glu
- antibody
- fragment
- residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 Glu17-オステオカルシンとオステオカルシン
を識別することができる抗体を提供する。 【解決手段】 オステオカルシンの17位がGlu残基であ
るGlu17-オステオカルシンもしくは17位Glu残基を含む
オステオカルシンフラグメントと特異的に結合すること
を特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体またはその
フラグメント。
を識別することができる抗体を提供する。 【解決手段】 オステオカルシンの17位がGlu残基であ
るGlu17-オステオカルシンもしくは17位Glu残基を含む
オステオカルシンフラグメントと特異的に結合すること
を特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体またはその
フラグメント。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は低カルボキシル化オ
ステオカルシン、特にGlu17-オステオカルシン（Ｎ端よ
り17位にグルタミン酸[Glu]残基を有するオステオカル
シンを意味する。以下同じ。）の検出や測定試薬として
有効な、抗Glu17-オステオカルシン抗体、およびそれを
用いた試料中のGlu17-オステオカルシンの測定方法に関
する。
ステオカルシン、特にGlu17-オステオカルシン（Ｎ端よ
り17位にグルタミン酸[Glu]残基を有するオステオカル
シンを意味する。以下同じ。）の検出や測定試薬として
有効な、抗Glu17-オステオカルシン抗体、およびそれを
用いた試料中のGlu17-オステオカルシンの測定方法に関
する。
【０００２】
〈発明の背景〉退行期女性の骨量減少に関与する因子と
して、閉経後の血中女性ホルモンの減少、ビタミンＤ代
謝の変化、カルシウム（Ｃａ）摂取不足、運動不足、喫
煙などが指摘されている（Aloia J, Cohn S, Vaswani A
N, Yeh JK, Yen K, Ellis K. 1985 Risk factors for p
ostmenopausal osteoporosis. Am J Med 1985;78:95-10
0.）。最近、骨折を併発した骨粗鬆症女性の血中ビタミ
ンＫ1およびＫ2濃度が低下していること（Hart JP, She
arer MJ, Klenerman L, Catterall A, Reeve J,Sambroo
k PN, Dodds RA, Bitensky L, Chayen J. Electrochemi
cal detection of depressed circulating levels of v
itamin K1 in osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab
1985;60:1268-1269.; Hodges SJ, Akesson K, Vergnau
d P, Obrant K, Delmas PD. Circulating levels of vi
tamins K1 and K2 decreased in elderly women with h
ip fracture. J Bone Miner Res 1993;10:1241-45.）、
ビタミンＫ2の一種であるMK-4を投与することにより退
行期女性の骨塩量が増加すること（Orimo H, Fujita T,
Onomura T, Inoue T, Kushida K, Shiraki M., Clinic
al evaluation of Ea-0167 (menatetrenone) in the tr
eatment of osteoporosis. Phase III double-blind mu
lti-center comparative study with alfacalcidol. Cl
in Eval 1992;20:45-100.）が報告され、ビタミンＫ代
謝もまた退行期女性の骨塩量減少に関与することが明ら
かとなった。
して、閉経後の血中女性ホルモンの減少、ビタミンＤ代
謝の変化、カルシウム（Ｃａ）摂取不足、運動不足、喫
煙などが指摘されている（Aloia J, Cohn S, Vaswani A
N, Yeh JK, Yen K, Ellis K. 1985 Risk factors for p
ostmenopausal osteoporosis. Am J Med 1985;78:95-10
0.）。最近、骨折を併発した骨粗鬆症女性の血中ビタミ
ンＫ1およびＫ2濃度が低下していること（Hart JP, She
arer MJ, Klenerman L, Catterall A, Reeve J,Sambroo
k PN, Dodds RA, Bitensky L, Chayen J. Electrochemi
cal detection of depressed circulating levels of v
itamin K1 in osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab
1985;60:1268-1269.; Hodges SJ, Akesson K, Vergnau
d P, Obrant K, Delmas PD. Circulating levels of vi
tamins K1 and K2 decreased in elderly women with h
ip fracture. J Bone Miner Res 1993;10:1241-45.）、
ビタミンＫ2の一種であるMK-4を投与することにより退
行期女性の骨塩量が増加すること（Orimo H, Fujita T,
Onomura T, Inoue T, Kushida K, Shiraki M., Clinic
al evaluation of Ea-0167 (menatetrenone) in the tr
eatment of osteoporosis. Phase III double-blind mu
lti-center comparative study with alfacalcidol. Cl
in Eval 1992;20:45-100.）が報告され、ビタミンＫ代
謝もまた退行期女性の骨塩量減少に関与することが明ら
かとなった。
【０００３】骨代謝に対するビタミンＫの作用点に関し
ては各種の報告があるが、このうちでも骨基質の非コラ
ーゲン性タンパク質のうちの主要タンパク質であるオス
テオカルシン中のGlu残基のγ-カルボキシル化に対し、
ビタミンＫは必須であり（Price PA, Fraser JD, Metz
VG. Molecular coning of matrix Gla protein: Implic
ations for substrate recognition by the vitamin K-
dependent gamma-carboxylase. Proc Natl Acad Sci US
A, 1987;84:8335-8339.）、γ−カルボキシルグルタミ
ン酸残基（γ-carboxyglutamic acid：Gla残基）はＣａ
に対する強い親和性を有し、オステオカルシンはこのγ
-カルボキシル化を受けて初めて骨の成分であるハイド
ロキシアパタイトへの結合能を発揮することが知られて
いる（Hauschka PV, Lian JB, Cole DE, et al. Osteoc
alcin and matrix Gla protein:vitamin K-dependent p
rotein in bone. Physiol Rev, 1989;69:990-1047.）。
さらに高齢者とくに骨折例では、流血中の低カルボキシ
ル化（または非カルボキシル化）オステオカルシン［１
残基以上のGla残基がGlu残基となったもの］量が増加す
ることが報告されており（Plantalech L, Guillaumont
M, Vergnaud P, Leclercq M, Delmas PD., Impairment
of gamma carboxylation of circulatingosteocalcin
(bone Gla protein) in elderly women. J Bone Miner
Res. 1991;6:1211-16.）、退行期骨塩量減少に、ビタミ
ンＫ作用不全による低カルボキシル化オステオカルシン
の増加が関与することが示唆されている。
ては各種の報告があるが、このうちでも骨基質の非コラ
ーゲン性タンパク質のうちの主要タンパク質であるオス
テオカルシン中のGlu残基のγ-カルボキシル化に対し、
ビタミンＫは必須であり（Price PA, Fraser JD, Metz
VG. Molecular coning of matrix Gla protein: Implic
ations for substrate recognition by the vitamin K-
dependent gamma-carboxylase. Proc Natl Acad Sci US
A, 1987;84:8335-8339.）、γ−カルボキシルグルタミ
ン酸残基（γ-carboxyglutamic acid：Gla残基）はＣａ
に対する強い親和性を有し、オステオカルシンはこのγ
-カルボキシル化を受けて初めて骨の成分であるハイド
ロキシアパタイトへの結合能を発揮することが知られて
いる（Hauschka PV, Lian JB, Cole DE, et al. Osteoc
alcin and matrix Gla protein:vitamin K-dependent p
rotein in bone. Physiol Rev, 1989;69:990-1047.）。
さらに高齢者とくに骨折例では、流血中の低カルボキシ
ル化（または非カルボキシル化）オステオカルシン［１
残基以上のGla残基がGlu残基となったもの］量が増加す
ることが報告されており（Plantalech L, Guillaumont
M, Vergnaud P, Leclercq M, Delmas PD., Impairment
of gamma carboxylation of circulatingosteocalcin
(bone Gla protein) in elderly women. J Bone Miner
Res. 1991;6:1211-16.）、退行期骨塩量減少に、ビタミ
ンＫ作用不全による低カルボキシル化オステオカルシン
の増加が関与することが示唆されている。
【０００４】オステオカルシンは、Bone Gla Protein
(BGP)又はvitamin K-dependent calcium binding prote
inとも呼ばれ、骨芽細胞によって生合成される４９〜５
０個のアミノ酸からなるタンパク質であり（分子量約６
０００；ヒト及びウシは４９個、ラットは５０個のアミ
ノ酸からなる）、生体のＣａの恒常性の維持に関与して
いるといわれている。ヒトオステオカルシンは、配列番
号４（配列中XaaはGla残基を示す。以下配列番号の記載
がある場合について同じ。）に記載されるアミノ酸配列
を有し、その分子中に、Ｎ末端から数えて１７位、２１
位及び２４位の３つのGla残基を有する。このように３
個のGla残基が存在するため、２3−１＝７通りの低カル
ボキシル化オステオカルシンのvariant typeが存在す
る。
(BGP)又はvitamin K-dependent calcium binding prote
inとも呼ばれ、骨芽細胞によって生合成される４９〜５
０個のアミノ酸からなるタンパク質であり（分子量約６
０００；ヒト及びウシは４９個、ラットは５０個のアミ
ノ酸からなる）、生体のＣａの恒常性の維持に関与して
いるといわれている。ヒトオステオカルシンは、配列番
号４（配列中XaaはGla残基を示す。以下配列番号の記載
がある場合について同じ。）に記載されるアミノ酸配列
を有し、その分子中に、Ｎ末端から数えて１７位、２１
位及び２４位の３つのGla残基を有する。このように３
個のGla残基が存在するため、２3−１＝７通りの低カル
ボキシル化オステオカルシンのvariant typeが存在す
る。
【０００５】〈従来の技術〉以上のように、骨代謝のマ
ーカーとして、流血中の低カルボキシル化（または非カ
ルボキシル化）オステオカルシンを測定することができ
れば、骨脆弱症や骨粗鬆症による骨折の危険度を判断す
るなどの上で有用である。そのため、例えばハイドロキ
シアパタイトに対して正常（カルボキシル化）オステオ
カルシンが親和性を持つことを利用し、これに吸着させ
た後、低カルボキシル化オステオカルシンを測定する方
法（Plantalech L, Guillaumont M, Vergnaud P, Lecle
rcq M, Delmas PD., Impairment of gamma carboxylati
on of circulating osteocalcin (bone Gla protein) i
n elderly women. J Bone Miner Res. 1991;6:1211-1
6.）などがとられている。例えば、デルマスらは、特開
平６−７８７８８号公報において、生体試料中の低カル
ボキシル化オステオカルシンの濃度を測定することによ
り、骨脆弱症や骨粗鬆症骨折の危険性の検査方法を開示
しているが、この中の実施例で、ハイドロキシアパタイ
ト吸着後に残ったオステオカルシンの濃度を抗体で測定
している。
ーカーとして、流血中の低カルボキシル化（または非カ
ルボキシル化）オステオカルシンを測定することができ
れば、骨脆弱症や骨粗鬆症による骨折の危険度を判断す
るなどの上で有用である。そのため、例えばハイドロキ
シアパタイトに対して正常（カルボキシル化）オステオ
カルシンが親和性を持つことを利用し、これに吸着させ
た後、低カルボキシル化オステオカルシンを測定する方
法（Plantalech L, Guillaumont M, Vergnaud P, Lecle
rcq M, Delmas PD., Impairment of gamma carboxylati
on of circulating osteocalcin (bone Gla protein) i
n elderly women. J Bone Miner Res. 1991;6:1211-1
6.）などがとられている。例えば、デルマスらは、特開
平６−７８７８８号公報において、生体試料中の低カル
ボキシル化オステオカルシンの濃度を測定することによ
り、骨脆弱症や骨粗鬆症骨折の危険性の検査方法を開示
しているが、この中の実施例で、ハイドロキシアパタイ
ト吸着後に残ったオステオカルシンの濃度を抗体で測定
している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの従来
技術はハイドロキシアパタイトに吸着しないオステオカ
ルシンを間接的に測定する方法であり、低カルボキシル
化オステオカルシンのみを直接測定する方法ではない。
特開平６−７８７８８号公報に開示されるような低カル
ボキシル化オステオカルシンに特異的なモノクローナル
抗体及びモノクローナル抗体を使用した測定系の報告は
あるが、１７位、２１位、２４位のどの部位の非カルボ
キシル化オステオカルシンを測定しているかについての
記述はなく、そのためにオステオカルシンの17位、21
位、24位のどの部位の非カルボキシル化が各種骨疾患の
病態あるいは生理的な骨代謝に重要であるかは明らかと
なっていない。以上の問題点を解決するために、本発明
者らは抗低カルボキシル化オステオカルシン抗体につい
て鋭意研究した結果、17位のγ-カルボキシル化グルタ
ミン酸残基の非カルボキシル化が他の部位の非カルボキ
シル化に比し生理的な条件下で容易に起こることを明ら
かにし、低カルボキシル化オステオカルシンの７つのva
riant typeの中でも、特に17位にGlu残基を有するオス
テオカルシンが低カルボキシル化オステオカルシンの本
態として重要であることを示した（Nakao M, Nishiguch
i Y, Nakata M, Kimura T, Sakakibara S. Synthesis o
f human osteocalcins: g-carboxyglutamic acid at po
sition 17 is essential for a calcium-dependent con
formational transition., Peptide Res 1994;7:171-17
4.）。このような知見の下、配列番号５記載のペプチド
断片を抗原として得られた抗Glu17-オステオカルシン抗
体が、Glu17-オステオカルシンとGla17-オステオカルシ
ンに対し優れた選択結合性を有することを見いだし、本
発明を完成した。
技術はハイドロキシアパタイトに吸着しないオステオカ
ルシンを間接的に測定する方法であり、低カルボキシル
化オステオカルシンのみを直接測定する方法ではない。
特開平６−７８７８８号公報に開示されるような低カル
ボキシル化オステオカルシンに特異的なモノクローナル
抗体及びモノクローナル抗体を使用した測定系の報告は
あるが、１７位、２１位、２４位のどの部位の非カルボ
キシル化オステオカルシンを測定しているかについての
記述はなく、そのためにオステオカルシンの17位、21
位、24位のどの部位の非カルボキシル化が各種骨疾患の
病態あるいは生理的な骨代謝に重要であるかは明らかと
なっていない。以上の問題点を解決するために、本発明
者らは抗低カルボキシル化オステオカルシン抗体につい
て鋭意研究した結果、17位のγ-カルボキシル化グルタ
ミン酸残基の非カルボキシル化が他の部位の非カルボキ
シル化に比し生理的な条件下で容易に起こることを明ら
かにし、低カルボキシル化オステオカルシンの７つのva
riant typeの中でも、特に17位にGlu残基を有するオス
テオカルシンが低カルボキシル化オステオカルシンの本
態として重要であることを示した（Nakao M, Nishiguch
i Y, Nakata M, Kimura T, Sakakibara S. Synthesis o
f human osteocalcins: g-carboxyglutamic acid at po
sition 17 is essential for a calcium-dependent con
formational transition., Peptide Res 1994;7:171-17
4.）。このような知見の下、配列番号５記載のペプチド
断片を抗原として得られた抗Glu17-オステオカルシン抗
体が、Glu17-オステオカルシンとGla17-オステオカルシ
ンに対し優れた選択結合性を有することを見いだし、本
発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、1)オ
ステオカルシンの17位がGlu残基であるGlu17-オステオ
カルシンもしくは17位Glu残基を含むオステオカルシン
フラグメントと特異的に結合することを特徴とする抗Gl
u17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであ
り、2)オステオカルシンの21位がGla残基であるGla21-
オステオカルシンもしくは21位Gla残基を含むオステオ
カルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴と
する前記1)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメントであり、3)配列番号１または２記載の
ペプチド断片と特異的に結合することを特徴とする前記
1)または2)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメント、詳細に述べればTyr Leu Tyr Gln Tr
p Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu
Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cy
s Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala
Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号１または
２）のペプチド断片と特異的に結合することを特徴とす
る前記1)または2)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体
またはそのフラグメントであり、4)配列番号３または４
記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記
1)ないし3)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメント、詳細に述べれば、Tyr Leu Tyr Gln
Trp Leu Gly Ala Pro Val ProTyr Pro Asp Pro Leu Gla
Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro AspCy
s Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala
Tyr Arg Arg Phe TyrGly Pro Val（配列番号３または
４）のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記
1)ないし3)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメントであり、5)配列番号５記載のペプチド
断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと特異的
に結合する前記1)ないし4)記載の抗Glu17-オステオカル
シン抗体またはそのフラグメント、詳細に述べれば、Va
l Pro Tyr Pro Asp Pro Leu GluPro Arg Arg Gla Val
（配列番号５）のペプチド断片もしくはGlu残基を含む
そのフラグメントと特異的に結合する前記1)ないし4)記
載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメ
ントであり、6)配列番号５記載のペプチド断片もしくは
Glu残基を含むそのフラグメントと結合し、配列番号６
記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記
1)ないし5)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメント、詳細に述べれば、Val Pro Tyr Pro
Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val（配列番号５）
のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメン
トと結合し、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Ar
g Arg GlaVal（配列番号６）のペプチド断片と結合しな
いことを特徴とする前記1)ないし5)記載の抗Glu17-オス
テオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、7)配
列番号５記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそ
のフラグメントを抗原として得られた前記1)ないし6)記
載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメ
ント、詳細に述べれば、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu
Glu Pro Arg Arg Gla Val（配列番号５）のペプチド断
片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原とし
て得られた前記1)ないし6)記載の抗Glu17-オステオカル
シン抗体またはそのフラグメントであり、8)抗体がモノ
クローナル抗体である前記1)ないし7)記載の抗Glu17-オ
ステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、9)
前記1)ないし8)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体ま
たはそのフラグメントを含有するGlu17-オステオカルシ
ン検出試薬であり、10)Glu17-オステオカルシンを蛍光
もしくは発光物質、酵素、またはラジオアイソトープで
標識（ラベル）し、前記1)ないし8)記載の抗Glu17-オス
テオカルシン抗体またはそのフラグメントを用いて、競
合法により検出することを特徴とする、試料中のGlu17-
オステオカルシンの測定方法に関する。
ステオカルシンの17位がGlu残基であるGlu17-オステオ
カルシンもしくは17位Glu残基を含むオステオカルシン
フラグメントと特異的に結合することを特徴とする抗Gl
u17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであ
り、2)オステオカルシンの21位がGla残基であるGla21-
オステオカルシンもしくは21位Gla残基を含むオステオ
カルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴と
する前記1)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメントであり、3)配列番号１または２記載の
ペプチド断片と特異的に結合することを特徴とする前記
1)または2)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメント、詳細に述べればTyr Leu Tyr Gln Tr
p Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu
Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cy
s Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala
Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号１または
２）のペプチド断片と特異的に結合することを特徴とす
る前記1)または2)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体
またはそのフラグメントであり、4)配列番号３または４
記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記
1)ないし3)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメント、詳細に述べれば、Tyr Leu Tyr Gln
Trp Leu Gly Ala Pro Val ProTyr Pro Asp Pro Leu Gla
Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro AspCy
s Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala
Tyr Arg Arg Phe TyrGly Pro Val（配列番号３または
４）のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記
1)ないし3)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメントであり、5)配列番号５記載のペプチド
断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと特異的
に結合する前記1)ないし4)記載の抗Glu17-オステオカル
シン抗体またはそのフラグメント、詳細に述べれば、Va
l Pro Tyr Pro Asp Pro Leu GluPro Arg Arg Gla Val
（配列番号５）のペプチド断片もしくはGlu残基を含む
そのフラグメントと特異的に結合する前記1)ないし4)記
載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメ
ントであり、6)配列番号５記載のペプチド断片もしくは
Glu残基を含むそのフラグメントと結合し、配列番号６
記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記
1)ないし5)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体または
そのフラグメント、詳細に述べれば、Val Pro Tyr Pro
Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val（配列番号５）
のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメン
トと結合し、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Ar
g Arg GlaVal（配列番号６）のペプチド断片と結合しな
いことを特徴とする前記1)ないし5)記載の抗Glu17-オス
テオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、7)配
列番号５記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそ
のフラグメントを抗原として得られた前記1)ないし6)記
載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメ
ント、詳細に述べれば、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu
Glu Pro Arg Arg Gla Val（配列番号５）のペプチド断
片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原とし
て得られた前記1)ないし6)記載の抗Glu17-オステオカル
シン抗体またはそのフラグメントであり、8)抗体がモノ
クローナル抗体である前記1)ないし7)記載の抗Glu17-オ
ステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、9)
前記1)ないし8)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体ま
たはそのフラグメントを含有するGlu17-オステオカルシ
ン検出試薬であり、10)Glu17-オステオカルシンを蛍光
もしくは発光物質、酵素、またはラジオアイソトープで
標識（ラベル）し、前記1)ないし8)記載の抗Glu17-オス
テオカルシン抗体またはそのフラグメントを用いて、競
合法により検出することを特徴とする、試料中のGlu17-
オステオカルシンの測定方法に関する。
【０００８】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
Glu17-オステオカルシンに選択的に結合し、Gla17-オス
テオカルシンとは結合しない抗体を提供するものであ
る。
Glu17-オステオカルシンに選択的に結合し、Gla17-オス
テオカルシンとは結合しない抗体を提供するものであ
る。
【０００９】本発明抗体は、オステオカルシンのＮ端よ
り17位にGlu残基を有するGlu17-オステオカルシンもし
くは17位Glu残基を含むオステオカルシンフラグメント
と特異的に結合する。17位Glu残基を含むオステオカル
シンフラグメントとは、17位Glu残基を含み、全体とし
て６残基以上のアミノ酸を含むペプチドフラグメントで
あることが望ましい。より好ましくは21位のGla残基を
含むペプチドフラグメントである。さらに、Tyr Leu Ty
r Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro
Leu GluPro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro
Asp Cys Asp Glu Leu Ala AspHis Ile Gly Phe Gln Gl
u Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号１
または２）のペプチド断片と結合性を有し、Tyr Leu Ty
r Gln Trp Leu Gly AlaPro Val Pro Tyr Pro Asp Pro L
eu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu LeuAsn Pro
Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Gl
u Ala Tyr ArgArg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号３ま
たは４）のペプチド断片と結合しないことが好ましい。
り17位にGlu残基を有するGlu17-オステオカルシンもし
くは17位Glu残基を含むオステオカルシンフラグメント
と特異的に結合する。17位Glu残基を含むオステオカル
シンフラグメントとは、17位Glu残基を含み、全体とし
て６残基以上のアミノ酸を含むペプチドフラグメントで
あることが望ましい。より好ましくは21位のGla残基を
含むペプチドフラグメントである。さらに、Tyr Leu Ty
r Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro
Leu GluPro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro
Asp Cys Asp Glu Leu Ala AspHis Ile Gly Phe Gln Gl
u Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号１
または２）のペプチド断片と結合性を有し、Tyr Leu Ty
r Gln Trp Leu Gly AlaPro Val Pro Tyr Pro Asp Pro L
eu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu LeuAsn Pro
Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Gl
u Ala Tyr ArgArg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号３ま
たは４）のペプチド断片と結合しないことが好ましい。
【００１０】本発明にかかる抗Glu17-オステオカルシン
抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナ
ル抗体であってもよく、さらにはその反応性を有する限
り、抗体のフラグメントであっても良い。この抗体のフ
ラグメントとは、Ｆｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦ
(ab')2、Ｆａｂ’あるいはＦａｂ画分、あるいはその重
合体であってもよく、また、そのキメラ抗体であっても
よい。
抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナ
ル抗体であってもよく、さらにはその反応性を有する限
り、抗体のフラグメントであっても良い。この抗体のフ
ラグメントとは、Ｆｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦ
(ab')2、Ｆａｂ’あるいはＦａｂ画分、あるいはその重
合体であってもよく、また、そのキメラ抗体であっても
よい。
【００１１】本発明抗体は、配列番号５記載のペプチド
断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原ペ
プチド（またはエピトープ）として用いることにより作
成することができる。ここで、配列番号５に記載された
ペプチド断片（Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro
Arg Arg Gla Val）とは、オステオカルシンの10位から2
2位にわたるペプチドフラグメントのうち、17位のGla残
基がGlu残基に置換された１３個のアミノ酸からなるポ
リペプチドである。Glu残基を含むそのフラグメントと
は、配列番号５記載のペプチド断片中、Glu残基を含む
その一部のフラグメントをいう。また、エピトープとは
構造既知の抗原決定基を意味し、タンパク質（ポリペプ
チド）においては、一般に少なくとも６個のアミノ酸で
構成される（６個のアミノ酸で構成されるポリペプチド
が抗体と結合することは特表昭60-500684号公報に開示
されている）。そのため、本願における抗Glu17-オステ
オカルシン抗体の作成にあたっては、配列番号５記載の
ペプチド断片をエピトープとして用いるだけでなく、Gl
u残基を含むそのフラグメントをエピトープとして調製
することも可能であり、好ましくは少なくとも６以上の
連続したペプチド断片が選択される。
断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原ペ
プチド（またはエピトープ）として用いることにより作
成することができる。ここで、配列番号５に記載された
ペプチド断片（Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro
Arg Arg Gla Val）とは、オステオカルシンの10位から2
2位にわたるペプチドフラグメントのうち、17位のGla残
基がGlu残基に置換された１３個のアミノ酸からなるポ
リペプチドである。Glu残基を含むそのフラグメントと
は、配列番号５記載のペプチド断片中、Glu残基を含む
その一部のフラグメントをいう。また、エピトープとは
構造既知の抗原決定基を意味し、タンパク質（ポリペプ
チド）においては、一般に少なくとも６個のアミノ酸で
構成される（６個のアミノ酸で構成されるポリペプチド
が抗体と結合することは特表昭60-500684号公報に開示
されている）。そのため、本願における抗Glu17-オステ
オカルシン抗体の作成にあたっては、配列番号５記載の
ペプチド断片をエピトープとして用いるだけでなく、Gl
u残基を含むそのフラグメントをエピトープとして調製
することも可能であり、好ましくは少なくとも６以上の
連続したペプチド断片が選択される。
【００１２】このように調製された抗体の中から、特に
好ましくは配列番号３または４記載のペプチド断片（Ty
r Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro
AspPro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu
Asn Pro Asp Cys Asp GluLeu Ala Asp His Ile Gly Ph
e Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val）お
よび／または配列番号６記載のペプチド断片（Val Pro
Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val）と結
合しないものが選択される。
好ましくは配列番号３または４記載のペプチド断片（Ty
r Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro
AspPro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu
Asn Pro Asp Cys Asp GluLeu Ala Asp His Ile Gly Ph
e Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val）お
よび／または配列番号６記載のペプチド断片（Val Pro
Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val）と結
合しないものが選択される。
【００１３】本発明にかかる抗体は、低カルボキシル化
オステオカルシン検出用試薬、特にGlu17-オステオカル
シンの検出に利用することができ、近年問題となってい
る骨脆弱症や骨粗鬆症による骨折の危険性の判断にも有
用である。本発明にかかるGlu17-オステオカルシンの検
出試薬は、本発明抗体を含むことにより調製することが
でき、例えば標準抗原、抗原希釈用溶液、発色剤、基質
溶解液、洗浄液、反応停止液などの他、一般に検出試薬
の原料として用いられる成分を配合して目的とするキッ
トとすることができる。血液、血漿、血清、尿などの試
料中のGlu17-オステオカルシン量を測定するには、蛍光
もしくは発光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、また
は125Ｉなどのラジオアイソトープで標識（ラベル）し
たGlu17-オステオカルシンを、試料中の抗原と本発明抗
体に対して競合させることにより、試料中のGlu17-オス
テオカルシンを測定することができる。
オステオカルシン検出用試薬、特にGlu17-オステオカル
シンの検出に利用することができ、近年問題となってい
る骨脆弱症や骨粗鬆症による骨折の危険性の判断にも有
用である。本発明にかかるGlu17-オステオカルシンの検
出試薬は、本発明抗体を含むことにより調製することが
でき、例えば標準抗原、抗原希釈用溶液、発色剤、基質
溶解液、洗浄液、反応停止液などの他、一般に検出試薬
の原料として用いられる成分を配合して目的とするキッ
トとすることができる。血液、血漿、血清、尿などの試
料中のGlu17-オステオカルシン量を測定するには、蛍光
もしくは発光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、また
は125Ｉなどのラジオアイソトープで標識（ラベル）し
たGlu17-オステオカルシンを、試料中の抗原と本発明抗
体に対して競合させることにより、試料中のGlu17-オス
テオカルシンを測定することができる。
【００１４】本発明抗体は、以上のような性質を有する
ものであるが、その中でも特に好ましい抗体を挙げる
と、1)Glu17-オステオカルシンに特異的に結合する、2)
Glu17,Gla21-オステオカルシンに特異的に結合する、3)
配列番号１または２記載のペプチド断片と特異的に結合
し、配列番号３または４記載のペプチド断片と結合しな
い、4)配列番号５記載のペプチド断片と特異的に結合
し、配列番号６記載のペプチド断片と結合しない、また
は5)[配列番号１または２]および[配列番号５]記載のペ
プチド断片と特異的に結合し、[配列番号３または４]お
よび[配列番号６]記載のペプチド断片と結合しないなど
の性質を有する抗体が挙げられる。
ものであるが、その中でも特に好ましい抗体を挙げる
と、1)Glu17-オステオカルシンに特異的に結合する、2)
Glu17,Gla21-オステオカルシンに特異的に結合する、3)
配列番号１または２記載のペプチド断片と特異的に結合
し、配列番号３または４記載のペプチド断片と結合しな
い、4)配列番号５記載のペプチド断片と特異的に結合
し、配列番号６記載のペプチド断片と結合しない、また
は5)[配列番号１または２]および[配列番号５]記載のペ
プチド断片と特異的に結合し、[配列番号３または４]お
よび[配列番号６]記載のペプチド断片と結合しないなど
の性質を有する抗体が挙げられる。
【００１５】したがってこれらの性質を有する抗体を使
用すれば、17位にGlu残基を有する４つの低カルボキシ
ル化オステオカルシンのvariant typeを識別することが
でき、さらに、その中で17位にGlu残基および21位にGla
残基を有する２つの低カルボキシル化オステオカルシン
のvariant type（17位Glu残基、21位Gla残基、24位Gla
またはGlu残基）を識別することが可能となる。
用すれば、17位にGlu残基を有する４つの低カルボキシ
ル化オステオカルシンのvariant typeを識別することが
でき、さらに、その中で17位にGlu残基および21位にGla
残基を有する２つの低カルボキシル化オステオカルシン
のvariant type（17位Glu残基、21位Gla残基、24位Gla
またはGlu残基）を識別することが可能となる。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明抗体の調製は配列番号５記
載のGlu17-オステオカルシンのペプチドフラグメントを
抗原とし、必要に応じてキャリアータンパク質（ＢＳＡ
[bovine serum albumin]やＯＶＡ[ovalbumin]など）と
の複合体を作り、これを動物に接種して免疫する。ま
た、Tam JPによって開発されたＭＡＰ系（Maltiple ant
igen peptide system）を使用して免役することもでき
る（Tam JP,Synthetic Peptide:Approaches to Biologi
cal Problems,p3-18,1989;Tam JP,PNAS USA,85,5409,19
88;Tam et al.,J.Exp.Med.,171,299,1990;Tam and Lu.,
PNAS USA,86,9084,1989）。上記免疫動物の脾臓あるい
はリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融
合し、配列番号５記載のペプチド断片および低カルボキ
シル化オステオカルシン（Glu17-オステオカルシン）に
強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択
することにより調製される。その操作は従来既知の方法
に準ずればよい。
載のGlu17-オステオカルシンのペプチドフラグメントを
抗原とし、必要に応じてキャリアータンパク質（ＢＳＡ
[bovine serum albumin]やＯＶＡ[ovalbumin]など）と
の複合体を作り、これを動物に接種して免疫する。ま
た、Tam JPによって開発されたＭＡＰ系（Maltiple ant
igen peptide system）を使用して免役することもでき
る（Tam JP,Synthetic Peptide:Approaches to Biologi
cal Problems,p3-18,1989;Tam JP,PNAS USA,85,5409,19
88;Tam et al.,J.Exp.Med.,171,299,1990;Tam and Lu.,
PNAS USA,86,9084,1989）。上記免疫動物の脾臓あるい
はリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融
合し、配列番号５記載のペプチド断片および低カルボキ
シル化オステオカルシン（Glu17-オステオカルシン）に
強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択
することにより調製される。その操作は従来既知の方法
に準ずればよい。
【００１７】免疫抗原としては天然もしくはワーファリ
ンによって誘発されたGlu17-オステオカルシンのフラグ
メント、遺伝子組換手法により得られたGlu17-オステオ
カルシンのフラグメント、天然もしくは遺伝子組換えに
よりえられたオステオカルシンを熱的もしくは化学的に
脱カルボキシル化の操作をしたもののフラグメント、ま
たは化学合成手法により生産したものなどいずれも使用
できる。
ンによって誘発されたGlu17-オステオカルシンのフラグ
メント、遺伝子組換手法により得られたGlu17-オステオ
カルシンのフラグメント、天然もしくは遺伝子組換えに
よりえられたオステオカルシンを熱的もしくは化学的に
脱カルボキシル化の操作をしたもののフラグメント、ま
たは化学合成手法により生産したものなどいずれも使用
できる。
【００１８】しかし、天然物のGlu17-オステオカルシン
を免疫用抗原とするために分離・精製することは、その
生体試料中濃度がとても低いことから実用的ではない
（例えば血中の含量はpg/mlのオーダーであり、免疫に
供する量を確保するには数トンの血液が必要である）。
もし大量に試料を使うことができるのであれば、公知の
分離・精製法を適宜組み合わせて実施することができ
る。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透
析ゲルろ過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどが挙げられる。
を免疫用抗原とするために分離・精製することは、その
生体試料中濃度がとても低いことから実用的ではない
（例えば血中の含量はpg/mlのオーダーであり、免疫に
供する量を確保するには数トンの血液が必要である）。
もし大量に試料を使うことができるのであれば、公知の
分離・精製法を適宜組み合わせて実施することができ
る。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透
析ゲルろ過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１９】従って実用的には、免疫抗原用Glu17-オス
テオカルシンのフラグメントペプチドの調製は化学合成
法、上記遺伝子組換法あるいは天然物を分解する方法な
どが用いられるが、簡便には、常法によりペプチドシン
セサイザーを用いて行うことができる。
テオカルシンのフラグメントペプチドの調製は化学合成
法、上記遺伝子組換法あるいは天然物を分解する方法な
どが用いられるが、簡便には、常法によりペプチドシン
セサイザーを用いて行うことができる。
【００２０】抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製
は種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアル
デヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が
使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、
サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているも
のでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる
方法が用いられる。
は種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアル
デヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が
使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、
サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているも
のでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる
方法が用いられる。
【００２１】免疫される動物としてはマウス、ラット、
ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、
筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全
フロイントアジュバンド（ＦＣＡ：Freund's complete
adjuvant）や不完全フロイントアジュバンド（ＦＩＡ：
Freund's incomplete adjuvant）と混和して投与しても
よく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫
された動物より血液を採取し、血清を分離し、血清より
抗体を硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーなど常用されている方法で
精製してポリクローナル抗体とする。また、免疫された
動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞
は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリドーマとして
単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト
等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のも
のであることが好ましいが、異種間においても可能な場
合もある。
ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、
筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全
フロイントアジュバンド（ＦＣＡ：Freund's complete
adjuvant）や不完全フロイントアジュバンド（ＦＩＡ：
Freund's incomplete adjuvant）と混和して投与しても
よく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫
された動物より血液を採取し、血清を分離し、血清より
抗体を硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーなど常用されている方法で
精製してポリクローナル抗体とする。また、免疫された
動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞
は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリドーマとして
単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト
等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のも
のであることが好ましいが、異種間においても可能な場
合もある。
【００２２】細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケ
ーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 197
5）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられるが、
通常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平
均分子量1000〜4000）を用いて20〜40℃、好ましくは30
〜37℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は
通常１：１〜１０：１程度、約１〜10分間程度反応させ
ることにより細胞融合を実施することができる。抗Glu
17-オステオカルシン抗体産生ハイブリドーマのスクリ
ーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。たと
えば、Glu17-オステオカルシンをコートしたマイクロプ
レートを用いるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorb
ent assay）法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマ
イクロプレートを用いるＥＩＡ（enzyme immunoassay）
法、Glu17-オステオカルシンを含むサンプルを電気泳動
後ニトロセルロース転写膜を用いるウエスタンブロット
法などがあげられる。
ーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 197
5）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられるが、
通常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平
均分子量1000〜4000）を用いて20〜40℃、好ましくは30
〜37℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は
通常１：１〜１０：１程度、約１〜10分間程度反応させ
ることにより細胞融合を実施することができる。抗Glu
17-オステオカルシン抗体産生ハイブリドーマのスクリ
ーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。たと
えば、Glu17-オステオカルシンをコートしたマイクロプ
レートを用いるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorb
ent assay）法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマ
イクロプレートを用いるＥＩＡ（enzyme immunoassay）
法、Glu17-オステオカルシンを含むサンプルを電気泳動
後ニトロセルロース転写膜を用いるウエスタンブロット
法などがあげられる。
【００２３】このようなウエルから更に例えば限界希釈
法によってクローニングを行いクローンを得る。ハイブ
リドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎
児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ1640）で行
われる。このようにして得られたクローンはあらかじめ
ブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移
植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む
腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。ま
た、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料
とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は免疫
グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、
たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画
法、陰イオン交換体の利用、さらにアフィニティクロマ
トグラフィなどの手段により容易に達成することができ
る。
法によってクローニングを行いクローンを得る。ハイブ
リドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎
児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ1640）で行
われる。このようにして得られたクローンはあらかじめ
ブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移
植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む
腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。ま
た、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料
とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は免疫
グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、
たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画
法、陰イオン交換体の利用、さらにアフィニティクロマ
トグラフィなどの手段により容易に達成することができ
る。
【００２４】本発明によって得られた抗Glu17-オステオ
カルシン抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中の
Glu17-オステオカルシン（正常オステオカルシンが有す
る17位のGla残基が脱カルボキシル化してGlu残基になっ
たものや、ビタミンＫの代謝異常等により生じたオステ
オカルシンの17位のＰＩＶＫＡ体(Protein Induced by
Vitamin K Absence or Antagonist)などの17位非カルボ
キシル化オステオカルシンなどが含まれる）の定性、定
量を行うことができる。免疫学的方法としては、生体試
料を必要に応じて適切に処理、たとえば血液、血漿、血
清、尿などを試料とすることができる。また、細胞の分
離、抽出操作などした試料についても試料とすることが
できる。これらの試料について、免疫組織染色法、ＥＬ
ＩＳＡ法やＲＩＡ（radioimmunoassay）法などの免疫測
定法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法
を適用することができる。免疫組織染色法あるいは免疫
測定法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に
対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などによ
り行いうる。標識化剤としては螢光物質・発光物質、放
射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質はいず
れも使用できる。
カルシン抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中の
Glu17-オステオカルシン（正常オステオカルシンが有す
る17位のGla残基が脱カルボキシル化してGlu残基になっ
たものや、ビタミンＫの代謝異常等により生じたオステ
オカルシンの17位のＰＩＶＫＡ体(Protein Induced by
Vitamin K Absence or Antagonist)などの17位非カルボ
キシル化オステオカルシンなどが含まれる）の定性、定
量を行うことができる。免疫学的方法としては、生体試
料を必要に応じて適切に処理、たとえば血液、血漿、血
清、尿などを試料とすることができる。また、細胞の分
離、抽出操作などした試料についても試料とすることが
できる。これらの試料について、免疫組織染色法、ＥＬ
ＩＳＡ法やＲＩＡ（radioimmunoassay）法などの免疫測
定法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法
を適用することができる。免疫組織染色法あるいは免疫
測定法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に
対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などによ
り行いうる。標識化剤としては螢光物質・発光物質、放
射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質はいず
れも使用できる。
【００２５】
【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【００２６】実施例１．抗原ペプチドの合成 抗原とする配列番号５記載のペプチドを米国Applied Bi
osystems社製のペプチド自動合成機で合成した。合成法
としては、高分子樹脂担体を用いる固相合成法によりＣ
端より逐次合成を行い、相当する保護ペプチド樹脂を合
成した。保護ペプチド樹脂から酸処理にて目的とする粗
ペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィーで精製を行
い目的とする抗原用のペプチドを得た。このペプチド
は、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gl
a Valの１３残基で、正常なオステオカルシンの10位か
ら22位にわたるペプチドフラグメントのうち、17位のGl
a残基がGlu残基に置換されたものである。Ｎ末端にコン
ジュゲーションのためにシステイン残基を付加した。
osystems社製のペプチド自動合成機で合成した。合成法
としては、高分子樹脂担体を用いる固相合成法によりＣ
端より逐次合成を行い、相当する保護ペプチド樹脂を合
成した。保護ペプチド樹脂から酸処理にて目的とする粗
ペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィーで精製を行
い目的とする抗原用のペプチドを得た。このペプチド
は、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gl
a Valの１３残基で、正常なオステオカルシンの10位か
ら22位にわたるペプチドフラグメントのうち、17位のGl
a残基がGlu残基に置換されたものである。Ｎ末端にコン
ジュゲーションのためにシステイン残基を付加した。
【００２７】実施例２．抗体の調製 このように合成したペプチドをＢＳＡ、ＯＶＡなどに結
合させて高分子とし、これを免疫原としてマウスに免疫
した。具体的には、前記のペプチド断片を、まず０日目
に免疫前血清の力価測定用血液をサンプリングした後、
マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）２匹にＦＣＡとエマルジョンを
作り、５０μg／匹を腹腔に２〜３ヶ月間定期的に投与
して免疫した。その後脾臓細胞を採取し、Myeloma細胞P
3U1と融合した。これを培養し、HAT培地で選択した。こ
のうち、配列番号５に記載のペプチド断片および配列番
号１または２記載の低カルボキシル化オステオカルシン
（Glu17-オステオカルシン）と反応し、配列番号３また
は４記載のオステオカルシンおよび配列番号６に記載の
ペプチド断片と反応しない融合細胞をクローニングし
た。ＩｇＧを分泌する細胞のみを選択し、培養上清中の
ＩｇＧをprotein Aまたはprotein Gで精製して精製モノ
クローナル抗体を得た。
合させて高分子とし、これを免疫原としてマウスに免疫
した。具体的には、前記のペプチド断片を、まず０日目
に免疫前血清の力価測定用血液をサンプリングした後、
マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）２匹にＦＣＡとエマルジョンを
作り、５０μg／匹を腹腔に２〜３ヶ月間定期的に投与
して免疫した。その後脾臓細胞を採取し、Myeloma細胞P
3U1と融合した。これを培養し、HAT培地で選択した。こ
のうち、配列番号５に記載のペプチド断片および配列番
号１または２記載の低カルボキシル化オステオカルシン
（Glu17-オステオカルシン）と反応し、配列番号３また
は４記載のオステオカルシンおよび配列番号６に記載の
ペプチド断片と反応しない融合細胞をクローニングし
た。ＩｇＧを分泌する細胞のみを選択し、培養上清中の
ＩｇＧをprotein Aまたはprotein Gで精製して精製モノ
クローナル抗体を得た。
【００２８】実施例３．力価検定など 抗体の性質や力価の検定はＥＬＩＳＡ法で検討した。Ｅ
ＬＩＳＡは、マイクロプレート（住友ベークライト社
製；Ｈタイプ、Ａタイプ）を用い、まず、抗原ペプチド
をコーティングした。カゼイン溶液でブロッキングした
後、培養上清あるいは精製モノクローナル抗体を適当に
段階的に希釈して加え、固相上で抗原抗体反応を行わせ
て、免疫複合体を形成させ、さらに酵素標識第２抗体
（抗マウスＩｇＧ抗体）を反応させた。洗浄後、固相上
に結合した酵素活性を測定することで抗体の産生の有
無、力価変動、特異性を検討した。ここで得られた抗体
は、配列番号５記載のペプチドとは反応したが、配列番
号６記載のペプチドとは交差反応を示さなかった。
ＬＩＳＡは、マイクロプレート（住友ベークライト社
製；Ｈタイプ、Ａタイプ）を用い、まず、抗原ペプチド
をコーティングした。カゼイン溶液でブロッキングした
後、培養上清あるいは精製モノクローナル抗体を適当に
段階的に希釈して加え、固相上で抗原抗体反応を行わせ
て、免疫複合体を形成させ、さらに酵素標識第２抗体
（抗マウスＩｇＧ抗体）を反応させた。洗浄後、固相上
に結合した酵素活性を測定することで抗体の産生の有
無、力価変動、特異性を検討した。ここで得られた抗体
は、配列番号５記載のペプチドとは反応したが、配列番
号６記載のペプチドとは交差反応を示さなかった。
【００２９】実施例４．Glu17-オステオカルシン のラ
ジオイムノアッセイ Glu17-オステオカルシンを酵素法にて125Iで標識し標識
物質とした後、Glu17-オステオカルシンのラジオイムノ
アッセイを、抗Glu17-オステオカルシン抗体、標準物質
としてGlu17-オステオカルシン(1-49)あるいはGla17-オ
ステオカルシン(1-49)を用い、さらに0.5％ウシ血清ア
ルブミン、5 mM Tris-塩酸緩衝液(pH 7.4)を緩衝液とし
て用いることにより行った。また各ラジオイムノアッセ
イ系における緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討する
ため、塩化カルシウムを0.03〜10 mM の濃度にて添加し
た。さらに緩衝液中カルシウム濃度 0 mM の条件にはEG
TA 1 mM を添加した。Ｂ/F 分離は二抗体法にて行っ
た。ラジオイムノアッセイ系におけるGlu17-オステオカ
ルシン(1-49)およびGla17-オステオカルシン(1-49)の標
準曲線の緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討した結果
を図１に示す。いずれのラジオイムノアッセイ系におい
ても各２種の標準曲線は緩衝液中カルシウム濃度依存性
を示した。抗体として実施例２で得られた抗Glu17-オス
テオカルシン抗体を用いたラジオイムノアッセイ系では
緩衝液中カルシウム濃度が０ mM あるいは0.03 mM のと
きに標準物質Glu17-オステオカルシン(1-49)では良好な
標準曲線が得られた。さらに、同抗体はGla17-オステオ
カルシン(1-49)を高濃度まで認識せず、Glu17-オステオ
カルシン(1-49)とGla17-オステオカルシン(1-49)を分離
識別することが可能であった。
ジオイムノアッセイ Glu17-オステオカルシンを酵素法にて125Iで標識し標識
物質とした後、Glu17-オステオカルシンのラジオイムノ
アッセイを、抗Glu17-オステオカルシン抗体、標準物質
としてGlu17-オステオカルシン(1-49)あるいはGla17-オ
ステオカルシン(1-49)を用い、さらに0.5％ウシ血清ア
ルブミン、5 mM Tris-塩酸緩衝液(pH 7.4)を緩衝液とし
て用いることにより行った。また各ラジオイムノアッセ
イ系における緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討する
ため、塩化カルシウムを0.03〜10 mM の濃度にて添加し
た。さらに緩衝液中カルシウム濃度 0 mM の条件にはEG
TA 1 mM を添加した。Ｂ/F 分離は二抗体法にて行っ
た。ラジオイムノアッセイ系におけるGlu17-オステオカ
ルシン(1-49)およびGla17-オステオカルシン(1-49)の標
準曲線の緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討した結果
を図１に示す。いずれのラジオイムノアッセイ系におい
ても各２種の標準曲線は緩衝液中カルシウム濃度依存性
を示した。抗体として実施例２で得られた抗Glu17-オス
テオカルシン抗体を用いたラジオイムノアッセイ系では
緩衝液中カルシウム濃度が０ mM あるいは0.03 mM のと
きに標準物質Glu17-オステオカルシン(1-49)では良好な
標準曲線が得られた。さらに、同抗体はGla17-オステオ
カルシン(1-49)を高濃度まで認識せず、Glu17-オステオ
カルシン(1-49)とGla17-オステオカルシン(1-49)を分離
識別することが可能であった。
【００３０】実施例５．ヒト血漿Glu17-オステオカルシ
ン濃度の測定 ヒト血漿Glu17-オステオカルシン濃度のラジオイムノア
ッセイに、抗Glu17-オステオカルシン抗体を用い、測定
緩衝液としては0.5％ウシ血清アルブミン、1 mM EGTA、
5 mM Tris-塩酸緩衝液 (pH 7.4)を用いた。いずれの血
漿の希釈曲線もGlu17-オステオカルシン (1-49）の標準
曲線と良好な平行関係を示した。この結果よりヒト血中
にもGlu17-オステオカルシン免疫活性が存在することを
示すとともに、ヒトの体内におけるGlu17-オステオカル
シンの測定に本ラジオイムノアッセイ系が有効であるこ
とが示された。以下のヒト血漿Glu17-オステオカルシン
濃度測定時には全ての血漿検体につき希釈曲線を作成し
標準曲線の上下端20％に入る測定値は除外し、標準曲線
の中央80％に位置する希釈の血漿検体の値のみを採用し
た。
ン濃度の測定 ヒト血漿Glu17-オステオカルシン濃度のラジオイムノア
ッセイに、抗Glu17-オステオカルシン抗体を用い、測定
緩衝液としては0.5％ウシ血清アルブミン、1 mM EGTA、
5 mM Tris-塩酸緩衝液 (pH 7.4)を用いた。いずれの血
漿の希釈曲線もGlu17-オステオカルシン (1-49）の標準
曲線と良好な平行関係を示した。この結果よりヒト血中
にもGlu17-オステオカルシン免疫活性が存在することを
示すとともに、ヒトの体内におけるGlu17-オステオカル
シンの測定に本ラジオイムノアッセイ系が有効であるこ
とが示された。以下のヒト血漿Glu17-オステオカルシン
濃度測定時には全ての血漿検体につき希釈曲線を作成し
標準曲線の上下端20％に入る測定値は除外し、標準曲線
の中央80％に位置する希釈の血漿検体の値のみを採用し
た。
【００３１】実施例６．女性における血漿Glu17-オステ
オカルシン濃度の加齢変化 健常女性322例における血漿Glu17-オステオカルシン濃
度の平均値の加齢変化を図２に示した。肥満度BMI (bod
y mass index) が正常範囲 (18〜26）を示す健常かつ歩
行可能な16歳〜93歳の女性322例を対象とし、早朝空腹
時にEGTAチューブに採血し直ちに血漿を分離したもの
を、-20℃にて保存した後測定に供した。血漿Glu17-オ
ステオカルシン濃度は加齢とともに上昇し、特に閉経前
後および高齢者での上昇率が高いことが窺えた。この血
漿Glu17-オステオカルシン濃度の加齢による上昇はPlan
talechらの報告（Plantalech L, Guillaumont M, Vergn
aud P, Leclercq M, Delmas PD., Impairment of gamma
carboxylation of circulating osteocalcin (bone Gl
a protein) in elderly women. J Bone Miner Res.199
1;6:1211-16.）と類似するものである。
オカルシン濃度の加齢変化 健常女性322例における血漿Glu17-オステオカルシン濃
度の平均値の加齢変化を図２に示した。肥満度BMI (bod
y mass index) が正常範囲 (18〜26）を示す健常かつ歩
行可能な16歳〜93歳の女性322例を対象とし、早朝空腹
時にEGTAチューブに採血し直ちに血漿を分離したもの
を、-20℃にて保存した後測定に供した。血漿Glu17-オ
ステオカルシン濃度は加齢とともに上昇し、特に閉経前
後および高齢者での上昇率が高いことが窺えた。この血
漿Glu17-オステオカルシン濃度の加齢による上昇はPlan
talechらの報告（Plantalech L, Guillaumont M, Vergn
aud P, Leclercq M, Delmas PD., Impairment of gamma
carboxylation of circulating osteocalcin (bone Gl
a protein) in elderly women. J Bone Miner Res.199
1;6:1211-16.）と類似するものである。
【００３２】実施例７．健常女性における血漿Glu17-オ
ステオカルシン濃度と腰椎骨塩量との関係 女性における血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と、二
重Ｘ線吸収骨量測定（Lunar社製DPXを使用）にて測定し
た第二〜第四腰椎骨塩量との相関を検討した。その結果
として、対象とした全322例の女性の血漿Glu17-オステ
オカルシン濃度と、各年齢における日本人の腰椎骨塩量
の平均値を０とし標準偏差を１として各個人の骨塩量が
各年齢の日本人平均値よりどのくらい解離しているかを
示す値であるZ score との相関を図３に示した。全女性
においては血漿Glu17-オステオカルシン 濃度が高値を
示す例ほどこの腰椎骨塩量 Z score は低下しており、
両値の間には p<0.001 の負の相関関係を認めた。さら
に、図４にはこれらの女性を16歳〜29歳の若年群、30歳
〜49歳の壮年群、50〜69歳の閉経後群、70〜93歳の高齢
群の４群に分け、それぞれの年代での血漿Glu17-オステ
オカルシン 濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関を検討
した結果を示す。各年代群の中では50歳〜69歳の閉経後
群において血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨
塩量絶対値との間に負の相関を認めた。上記のように、
健常女性の血漿Glu17-オステオカルシン濃度と腰椎骨塩
量Z scoreの間に p<0.001 の有意の負の相関関係を認
め、全年齢を通じて年齢相応よりも骨塩量が低下してい
る例において血漿Glu17-オステオカルシン 濃度は高値
を呈することが示された。また女性における年代別での
血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量の絶対
値との相関の検討では各50歳〜69歳の閉経後群において
血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量絶対値
との間に負の相関を認め、この時期の女性の著しい骨量
減少、すなわち閉経後骨粗鬆症に血漿Glu17-オステオカ
ルシン 濃度高値が関与することが推察された。今回の
検討においては健常女性を対象としたが、罹患頻度が極
めて高い骨粗鬆症以外にも、多種の骨疾患における低カ
ルボキシル化オステオカルシンの病態生理的意義の解明
およびビタミンＫ作用の解明に本測定系が有用であると
考えられる。以上のように、本発明抗体を用いることに
より、Glu17-オステオカルシンを容易に検出・測定する
ことができ、それが関連する骨疾患の診断などに非常に
有用である。
ステオカルシン濃度と腰椎骨塩量との関係 女性における血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と、二
重Ｘ線吸収骨量測定（Lunar社製DPXを使用）にて測定し
た第二〜第四腰椎骨塩量との相関を検討した。その結果
として、対象とした全322例の女性の血漿Glu17-オステ
オカルシン濃度と、各年齢における日本人の腰椎骨塩量
の平均値を０とし標準偏差を１として各個人の骨塩量が
各年齢の日本人平均値よりどのくらい解離しているかを
示す値であるZ score との相関を図３に示した。全女性
においては血漿Glu17-オステオカルシン 濃度が高値を
示す例ほどこの腰椎骨塩量 Z score は低下しており、
両値の間には p<0.001 の負の相関関係を認めた。さら
に、図４にはこれらの女性を16歳〜29歳の若年群、30歳
〜49歳の壮年群、50〜69歳の閉経後群、70〜93歳の高齢
群の４群に分け、それぞれの年代での血漿Glu17-オステ
オカルシン 濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関を検討
した結果を示す。各年代群の中では50歳〜69歳の閉経後
群において血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨
塩量絶対値との間に負の相関を認めた。上記のように、
健常女性の血漿Glu17-オステオカルシン濃度と腰椎骨塩
量Z scoreの間に p<0.001 の有意の負の相関関係を認
め、全年齢を通じて年齢相応よりも骨塩量が低下してい
る例において血漿Glu17-オステオカルシン 濃度は高値
を呈することが示された。また女性における年代別での
血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量の絶対
値との相関の検討では各50歳〜69歳の閉経後群において
血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量絶対値
との間に負の相関を認め、この時期の女性の著しい骨量
減少、すなわち閉経後骨粗鬆症に血漿Glu17-オステオカ
ルシン 濃度高値が関与することが推察された。今回の
検討においては健常女性を対象としたが、罹患頻度が極
めて高い骨粗鬆症以外にも、多種の骨疾患における低カ
ルボキシル化オステオカルシンの病態生理的意義の解明
およびビタミンＫ作用の解明に本測定系が有用であると
考えられる。以上のように、本発明抗体を用いることに
より、Glu17-オステオカルシンを容易に検出・測定する
ことができ、それが関連する骨疾患の診断などに非常に
有用である。
【００３３】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu 1 5 10 15 Glu Pro Arg Arg Xaa Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu 20 25 30 Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro 35 40 45 Val
【００３４】配列番号：2 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu 1 5 10 15 Glu Pro Arg Arg Xaa Val Cys Xaa Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu 20 25 30 Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro 35 40 45 Val
【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu 1 5 10 15 Xaa Pro Arg Arg Xaa Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu 20 25 30 Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro 35 40 45 Val
【００３６】配列番号：４ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu 1 5 10 15 Xaa Pro Arg Arg Xaa Val Cys Xaa Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu 20 25 30 Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro 35 40 45 Val
【００３７】配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Xaa Val 1 5 10
【００３８】配列番号：６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Xaa Pro Arg Arg Xaa Val 1 5 10
【００３９】
【図１】抗Glu17-オステオカルシン抗体を用いたGlu17-
オステオカルシンのラジオイムノアッセイの標準曲線の
緩衝液中カルシウム濃度依存性を示す図である。標準物
質としてはGlu17-オステオカルシン(1-49) 「○」
（丸）あるいはGla17-オステオカルシン(1-49) 「◇」
（四角）を用いた。
オステオカルシンのラジオイムノアッセイの標準曲線の
緩衝液中カルシウム濃度依存性を示す図である。標準物
質としてはGlu17-オステオカルシン(1-49) 「○」
（丸）あるいはGla17-オステオカルシン(1-49) 「◇」
（四角）を用いた。
【図２】健常女性322例における血漿Glu17-オステオカ
ルシン濃度の加齢変化を示す図である。
ルシン濃度の加齢変化を示す図である。
【図３】健常女性322例における血漿Glu17-オステオカ
ルシン濃度と腰椎骨塩量Zscoreの相関を示す図である。
ルシン濃度と腰椎骨塩量Zscoreの相関を示す図である。
【図４】各年代女性における血漿Glu17-オステオカルシ
ン濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関を示す図である。
ン濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (10)
- 【請求項１】オステオカルシンの17位がGlu残基であるG
lu17-オステオカルシンもしくは17位Glu残基を含むオス
テオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特
徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラ
グメント。 - 【請求項２】オステオカルシンの21位がGla残基であるG
la21-オステオカルシンもしくは21位Gla残基を含むオス
テオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特
徴とする請求項１記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体
またはそのフラグメント。 - 【請求項３】配列番号１または２（配列中XaaはGla残基
を示す）記載のペプチド断片と特異的に結合することを
特徴とする請求項１または２記載の抗Glu17-オステオカ
ルシン抗体またはそのフラグメント。 - 【請求項４】配列番号３または４（配列中XaaはGla残基
を示す）記載のペプチド断片と結合しないことを特徴と
する請求項１ないし３記載の抗Glu17-オステオカルシン
抗体またはそのフラグメント。 - 【請求項５】配列番号５（配列中XaaはGla残基を示す）
記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグ
メントと特異的に結合する請求項１ないし４記載の抗Gl
u17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。 - 【請求項６】配列番号５（配列中XaaはGla残基を示す）
記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグ
メントと結合し、配列番号６（配列中XaaはGla残基を示
す）記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする
請求項１ないし５記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体
またはそのフラグメント。 - 【請求項７】配列番号５（配列中XaaはGla残基を示す）
記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグ
メントを抗原として得られた請求項１ないし６記載の抗
Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。 - 【請求項８】抗体がモノクローナル抗体である請求項１
ないし７記載の抗Glu1 7-オステオカルシン抗体またはそ
のフラグメント。 - 【請求項９】請求項１ないし８記載の抗Glu17-オステオ
カルシン抗体またはそのフラグメントを含有するGlu17-
オステオカルシン検出試薬。 - 【請求項１０】Glu17-オステオカルシンを蛍光もしくは
発光物質、酵素、またはラジオアイソトープで標識し、
請求項１ないし８記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体
またはそのフラグメントを用いて、競合法により検出す
ることを特徴とする、試料中のGlu17-オステオカルシン
の測定方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4333197A JP3894381B2 (ja) | 1996-04-10 | 1997-02-27 | 抗Ｇｌｕ▲１７▼−オステオカルシン抗体 |
| PCT/JP1997/001246 WO1997038309A1 (fr) | 1996-04-10 | 1997-04-10 | ANTICORPS ANTI-Glu17-OSTEOCALCINE |
| EP97915706A EP0834740A1 (en) | 1996-04-10 | 1997-04-10 | Anti-glu17-osteocalcin antibody |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-88608 | 1996-04-10 | ||
| JP8860896 | 1996-04-10 | ||
| JP4333197A JP3894381B2 (ja) | 1996-04-10 | 1997-02-27 | 抗Ｇｌｕ▲１７▼−オステオカルシン抗体 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006262146A Division JP2007045834A (ja) | 1996-04-10 | 2006-09-27 | 抗Ｇｌｕ１７−オステオカルシン抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09329600A true JPH09329600A (ja) | 1997-12-22 |
| JP3894381B2 JP3894381B2 (ja) | 2007-03-22 |
Family
ID=26383089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4333197A Expired - Lifetime JP3894381B2 (ja) | 1996-04-10 | 1997-02-27 | 抗Ｇｌｕ▲１７▼−オステオカルシン抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0834740A1 (ja) |
| JP (1) | JP3894381B2 (ja) |
| WO (1) | WO1997038309A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI973371A0 (fi) * | 1997-08-15 | 1997-08-15 | Jukka Hellman | Nya isolerade peptider |
| WO2002015918A2 (en) * | 2000-08-23 | 2002-02-28 | Biomep Inc. | Method and compositions for promoting osteogenesis |
| CH695985A5 (de) * | 2002-01-21 | 2006-11-15 | Straumann Holding Ag | Oberflächenmodifizierte Implantate. |
| JP5421109B2 (ja) * | 2006-09-13 | 2014-02-19 | ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク | 低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンはベータ細胞増殖、インスリン分泌、インスリン感受性、耐糖能を増加させ、体脂肪量を減少させる |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ207394A (en) * | 1983-03-08 | 1987-03-06 | Commw Serum Lab Commission | Detecting or determining sequence of amino acids |
| JPH0768271B2 (ja) * | 1989-08-31 | 1995-07-26 | 三菱化学株式会社 | ヒトオステオカルシンの製造法 |
| JPH0532697A (ja) * | 1991-07-31 | 1993-02-09 | Teijin Ltd | 合成ヒトオステオカルシンおよびその製造方法 |
-
1997
- 1997-02-27 JP JP4333197A patent/JP3894381B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-10 EP EP97915706A patent/EP0834740A1/en not_active Withdrawn
- 1997-04-10 WO PCT/JP1997/001246 patent/WO1997038309A1/ja not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3894381B2 (ja) | 2007-03-22 |
| WO1997038309A1 (fr) | 1997-10-16 |
| EP0834740A1 (en) | 1998-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7264938B2 (en) | Method of detecting native proBNP | |
| US7670805B2 (en) | Antibodies and peptide antigens for producing antibodies having a selective binding specificity to bioactive intact parathyroid hormone (PTH) 1-84 | |
| US6689566B1 (en) | Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone | |
| JPH06500001A (ja) | Ｐａｃａｐに対する抗体およびその用途 | |
| US10634676B2 (en) | Method and kit for simultaneously detecting human parvovirus B19 antigen and antibody | |
| JP3894381B2 (ja) | 抗Ｇｌｕ▲１７▼−オステオカルシン抗体 | |
| AU669490B2 (en) | Immunoassay for identifying alcoholics and monitoring alcohol consumption | |
| US20050095236A1 (en) | Antibodies and peptide antigens for producing antibodies having a selective binding specificity to bioactive intact parathyroid hormone (PTH) 1-84 | |
| EP0485525B1 (en) | Monoclonal antibody to acetylated lysine residues in recombinant bovine somatotropin | |
| JP2007045834A (ja) | 抗Ｇｌｕ１７−オステオカルシン抗体 | |
| CN117820482A (zh) | 一种抗孕酮-孕酮抗体复合物的抗体及其制备方法和应用 | |
| JPH06319586A (ja) | イン・ビボ糖化アルブミンに対するモノクローナル抗体 | |
| EP2236517A1 (en) | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody | |
| JP2010189381A (ja) | 抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体 | |
| JPH06335397A (ja) | ビッグエンドセリン−３に対する抗体およびその用途 | |
| JP2003277398A (ja) | トランスフェリンを含む免疫複合体に対する抗体、抗体の製造方法、ハイブリドーマ及び免疫測定方法 | |
| JPH05184388A (ja) | モノクローナル抗体、その製造法および用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060329 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060515 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060515 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060728 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060908 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060927 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20061030 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20061206 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20061207 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091222 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101222 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101222 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111222 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111222 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121222 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131222 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |