JPH05184388A - モノクローナル抗体、その製造法および用途 - Google Patents
モノクローナル抗体、その製造法および用途Info
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- JPH05184388A JPH05184388A JP3263686A JP26368691A JPH05184388A JP H05184388 A JPH05184388 A JP H05184388A JP 3263686 A JP3263686 A JP 3263686A JP 26368691 A JP26368691 A JP 26368691A JP H05184388 A JPH05184388 A JP H05184388A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】エンドセリン−２前駆体を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を提供する。 【構成】ヒトビッグエンドセリン−２あるいはそのＣ端
ペプチドに結合性を有するモノクローナル抗体、該抗体
を生産するハイブリドーマ細胞、および該モノクローナ
ル抗体を用いる被検液中のヒトビッグエンドセリン−２
あるいはそのＣ端ペプチドの定量法。 【効果】本発明の抗体を用いることによりビッグエンド
セリン−１，ビッグエンドセリン−３やＥＴ−２と交差
反応することなく、極めて高感度にヒトビッグエンドセ
リン−２（ｂｉｇＥＴ−２）を測定することができる。
この測定法は、培養細胞およびヒト血漿中のｂｉｇＥＴ
−２を検出し得ることからｂｉｇＥＴ−２の生理的、病
態生理的役割の解明、ひいては生化学的試薬として有用
である。
ノクローナル抗体を提供する。 【構成】ヒトビッグエンドセリン−２あるいはそのＣ端
ペプチドに結合性を有するモノクローナル抗体、該抗体
を生産するハイブリドーマ細胞、および該モノクローナ
ル抗体を用いる被検液中のヒトビッグエンドセリン−２
あるいはそのＣ端ペプチドの定量法。 【効果】本発明の抗体を用いることによりビッグエンド
セリン−１，ビッグエンドセリン−３やＥＴ−２と交差
反応することなく、極めて高感度にヒトビッグエンドセ
リン−２（ｂｉｇＥＴ−２）を測定することができる。
この測定法は、培養細胞およびヒト血漿中のｂｉｇＥＴ
−２を検出し得ることからｂｉｇＥＴ−２の生理的、病
態生理的役割の解明、ひいては生化学的試薬として有用
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトビッグエンドセリン
−２（ｂｉｇ ＥＴ−２と略すこともある）に結合特異
性を有する点で有用かつ新規な抗体に関する。更に詳し
くは、抗原抗体反応に基づくヒトビッグエンドセリン−
２の測定法の開発、およびヒトビッグエンドセリン−２
あるいはエンドセリン−２が関与する疾患の診断に有用
な抗体に関する。
−２（ｂｉｇ ＥＴ−２と略すこともある）に結合特異
性を有する点で有用かつ新規な抗体に関する。更に詳し
くは、抗原抗体反応に基づくヒトビッグエンドセリン−
２の測定法の開発、およびヒトビッグエンドセリン−２
あるいはエンドセリン−２が関与する疾患の診断に有用
な抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】エンドセリン−１は血管内皮細胞の培養
上清中に見出された２１個のアミノ酸からなるペプチド
であり、極めて強力かつ持続的な血管平滑筋収縮活性な
らびに血圧上昇活性を有する。また、エンドセリン−１
のｃＤＮＡの解析から、その生合成過程の中間体とし
て、アミノ酸約40個からなるビッグエンドセリン−１の
存在も想定されている。これまでにエンドセリン−１お
よびビッグエンドセリン−１に結合性を有するモノクロ
ーナル抗体が作製され、高感度な酵素免疫測定法が開発
されたことによりエンドセリン−１の生理的役割・病態
との関連の解明に向けて幅広い研究を展開することが可
能となった（柳沢ら，ネイチャー（Nature），332, 44
1, (1988），伊藤ら，フェブスレターズ(FEBS Letter
s),231 ,440 (1988），特開平１−２０６９９７号，特
開平２−７２８７７号，特開平２−２３８８９４号）。
上清中に見出された２１個のアミノ酸からなるペプチド
であり、極めて強力かつ持続的な血管平滑筋収縮活性な
らびに血圧上昇活性を有する。また、エンドセリン−１
のｃＤＮＡの解析から、その生合成過程の中間体とし
て、アミノ酸約40個からなるビッグエンドセリン−１の
存在も想定されている。これまでにエンドセリン−１お
よびビッグエンドセリン−１に結合性を有するモノクロ
ーナル抗体が作製され、高感度な酵素免疫測定法が開発
されたことによりエンドセリン−１の生理的役割・病態
との関連の解明に向けて幅広い研究を展開することが可
能となった（柳沢ら，ネイチャー（Nature），332, 44
1, (1988），伊藤ら，フェブスレターズ(FEBS Letter
s),231 ,440 (1988），特開平１−２０６９９７号，特
開平２−７２８７７号，特開平２−２３８８９４号）。
【０００３】一方、染色体ＤＮＡの解析から、新たにエ
ンドセリン−２，エンドセリン−３およびそれらのｃＤ
ＮＡが見出され、エンドセリンが遺伝子ファミリーを形
成していることが明らかにされた（柳沢ら、プロシージ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A．），85, 6964 (198
8)，井上ら、プロシージングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.），86，2863（1989），特願平１−274990号，特願平
２−257492号）。以下のアミノ酸配列にも示されるよう
に（アンダーライン参照）、エンドセリン−１とエンド
セリン−２とは２残基、エンドセリン−１とエンドセリ
ン−３とは６残基異なっている。エンドセリン−１（ブ
タ、ヒト、イヌ、ラット、マウス、ウシ由来。エンドセ
リン−αと呼ばれたこともあった。） Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ（配列番号：１） エンドセリン−２（ヒト、イヌ由来） Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ（配列番号：２） エンドセリン−３（ラット、ヒト、ブタ、ウサギ由来。
エンドセリン−γと呼ばれたこともあった。） Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ（配列番号：３） 既に、エンドセリン−３に結合性を有するモノクローナ
ル抗体が作製され、その特異的な測定法も開発されたこ
とから（特願平２−１９４０８１号）、エンドセリン−
３の生理的および病態生理的役割に関する研究を推進す
ることも可能となった。
ンドセリン−２，エンドセリン−３およびそれらのｃＤ
ＮＡが見出され、エンドセリンが遺伝子ファミリーを形
成していることが明らかにされた（柳沢ら、プロシージ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A．），85, 6964 (198
8)，井上ら、プロシージングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.），86，2863（1989），特願平１−274990号，特願平
２−257492号）。以下のアミノ酸配列にも示されるよう
に（アンダーライン参照）、エンドセリン−１とエンド
セリン−２とは２残基、エンドセリン−１とエンドセリ
ン−３とは６残基異なっている。エンドセリン−１（ブ
タ、ヒト、イヌ、ラット、マウス、ウシ由来。エンドセ
リン−αと呼ばれたこともあった。） Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ（配列番号：１） エンドセリン−２（ヒト、イヌ由来） Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ（配列番号：２） エンドセリン−３（ラット、ヒト、ブタ、ウサギ由来。
エンドセリン−γと呼ばれたこともあった。） Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ（配列番号：３） 既に、エンドセリン−３に結合性を有するモノクローナ
ル抗体が作製され、その特異的な測定法も開発されたこ
とから（特願平２−１９４０８１号）、エンドセリン−
３の生理的および病態生理的役割に関する研究を推進す
ることも可能となった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一方、エンドセリン−
１およびエンドセリン−３と比較し、エンドセリン−２
の生理的および病態生理的役割に関する研究は、これま
でほとんど進展していない。この主たる原因として、こ
れまでエンドセリン−２あるいはエンドセリン−２前駆
体を特異的に認識するモノクローナル抗体が作製されて
おらず、さらにエンドセリン−２あるいはエンドセリン
−２前駆体を特異的かつ高感度に測定する免疫学的測定
法が開発されていないことが挙げられる。これらの免疫
学的手法は、エンドセリン−２の研究、特に代謝経路、
分泌機構、リセプターシステム、病態との関連等に関す
る研究を総合的に行う上で最も有効な手段の一つと考え
られ、該手法の確立が各界から切望されていた。
１およびエンドセリン−３と比較し、エンドセリン−２
の生理的および病態生理的役割に関する研究は、これま
でほとんど進展していない。この主たる原因として、こ
れまでエンドセリン−２あるいはエンドセリン−２前駆
体を特異的に認識するモノクローナル抗体が作製されて
おらず、さらにエンドセリン−２あるいはエンドセリン
−２前駆体を特異的かつ高感度に測定する免疫学的測定
法が開発されていないことが挙げられる。これらの免疫
学的手法は、エンドセリン−２の研究、特に代謝経路、
分泌機構、リセプターシステム、病態との関連等に関す
る研究を総合的に行う上で最も有効な手段の一つと考え
られ、該手法の確立が各界から切望されていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、最近明ら
かにされたヒトエンドセリン−２前駆体のアミノ酸配列
（特願平３−１４３１２７号）から、ヒト由来のエンド
セリン−２の直接の前駆体であるヒトビッグエンドセリ
ン−２の配列に注目し、鋭意努力した結果、ヒトビッグ
エンドセリン−２に特異的な結合性を有するモノクロー
ナル抗体を作製することができた。即ち、下記に示すヒ
トビッグエンドセリン−１（ヒトビッグエンドセリン−
２との相同性 ３８残基中３０残基：７９％）およびヒ
トビッグエンドセリン−３（ヒトビッグエンドセリン−
３との相同性 ４１残基または４２残基中２６残基：６
２または６３％）と０．５％以下の交差反応性しか示さ
ない、ヒトビッグエンドセリン−２に結合性を有するモ
ノクローナル抗体を作製した。 ヒトビッグエンドセリン−１ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ
Ｓｅｒ（配列番号：４） ヒトビッグエンドセリン−２ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘａａ
（ただし、Ｘａａ＝ＰｒｏまたはＸａａ＝Ｐｒｏ Ａｒ
ｇである）（配列番号：５） 以後、ヒトビッグエンドセリン−２についてＸａａ＝Ｐ
ｒｏの構造のものを、ヒトビッグエンドセリン−２（１
−３７）あるいはｂｉｇＥＴ−２（１−３７）と、また
Ｘａａ＝Ｐｒｏ Ａｒｇの構造のものを、ヒトビッグエ
ンドセリン−２（１−３８）あるいはｂｉｇＥＴ−２
（１−３８）と表わすこともある。
かにされたヒトエンドセリン−２前駆体のアミノ酸配列
（特願平３−１４３１２７号）から、ヒト由来のエンド
セリン−２の直接の前駆体であるヒトビッグエンドセリ
ン−２の配列に注目し、鋭意努力した結果、ヒトビッグ
エンドセリン−２に特異的な結合性を有するモノクロー
ナル抗体を作製することができた。即ち、下記に示すヒ
トビッグエンドセリン−１（ヒトビッグエンドセリン−
２との相同性 ３８残基中３０残基：７９％）およびヒ
トビッグエンドセリン−３（ヒトビッグエンドセリン−
３との相同性 ４１残基または４２残基中２６残基：６
２または６３％）と０．５％以下の交差反応性しか示さ
ない、ヒトビッグエンドセリン−２に結合性を有するモ
ノクローナル抗体を作製した。 ヒトビッグエンドセリン−１ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ
Ｓｅｒ（配列番号：４） ヒトビッグエンドセリン−２ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘａａ
（ただし、Ｘａａ＝ＰｒｏまたはＸａａ＝Ｐｒｏ Ａｒ
ｇである）（配列番号：５） 以後、ヒトビッグエンドセリン−２についてＸａａ＝Ｐ
ｒｏの構造のものを、ヒトビッグエンドセリン−２（１
−３７）あるいはｂｉｇＥＴ−２（１−３７）と、また
Ｘａａ＝Ｐｒｏ Ａｒｇの構造のものを、ヒトビッグエ
ンドセリン−２（１−３８）あるいはｂｉｇＥＴ−２
（１−３８）と表わすこともある。
【０００６】ヒトビッグエンドセリン−３ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｘａａ（Ｘａａ＝Ｇｌｙ−ＯＨまたはＸａａ＝
ＮＨ2）（配列番号：６） さらに該抗体を用いてヒトビッグエンドセリン−２を高
感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発した。
すなわち、本発明はヒトビッグエンドセリン−２あるい
はそのＣ端ペプチドに結合性を有する新規なモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ、該抗体の製造法、および該抗体を用いた競合法あ
るいはサンドイッチ法によるヒトビッグエンドセリン−
２およびそのＣ端ペプチドの免疫測定法に関する。ヒト
ビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチドとしては、たと
えば式 Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘａａ（ただ
し、Ｘａａ＝ＰｒｏまたはＸａａ＝Ｐｒｏ Ａｒｇであ
る）（配列番号：７） で表わされるヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチ
ド（２２−３７）（Ｘａａ＝Ｐｒｏ）あるいは（２２−
３８）（Ｘａａ＝Ｐｒｏ Ａｒｇ）が挙げられる。
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｘａａ（Ｘａａ＝Ｇｌｙ−ＯＨまたはＸａａ＝
ＮＨ2）（配列番号：６） さらに該抗体を用いてヒトビッグエンドセリン−２を高
感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発した。
すなわち、本発明はヒトビッグエンドセリン−２あるい
はそのＣ端ペプチドに結合性を有する新規なモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ、該抗体の製造法、および該抗体を用いた競合法あ
るいはサンドイッチ法によるヒトビッグエンドセリン−
２およびそのＣ端ペプチドの免疫測定法に関する。ヒト
ビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチドとしては、たと
えば式 Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘａａ（ただ
し、Ｘａａ＝ＰｒｏまたはＸａａ＝Ｐｒｏ Ａｒｇであ
る）（配列番号：７） で表わされるヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチ
ド（２２−３７）（Ｘａａ＝Ｐｒｏ）あるいは（２２−
３８）（Ｘａａ＝Ｐｒｏ Ａｒｇ）が挙げられる。
【０００７】本発明のモノクローナル抗体の調製に当っ
ては、ヒトビッグエンドセリン−２あるいはそのＣ端ペ
プチドとキャリアー蛋白との複合体をつくり、このもの
を動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から抗体価の
高い個体を選び、最終免疫２〜５日後に脾臓あるいはリ
ンパ節を採取、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させ、安定的に力価の高い抗体を産生するハ
イブリドーマを選択し、モノクローナルなハイブリドー
マを得ることによる。免疫抗原としては、天然精製標
品、合成標品等いずれも使用でき、先に述べたヒトビッ
グエンドセリン−２あるいはそのＣ端ペプチドが用いら
れる。また免疫抗原として、ヒトビッグエンドセリン−
２の遺伝子配列を含むプラスミドを導入された細菌ある
いは細胞の生産物が用いられる場合もある。本発明で用
いられる種々のペプチドは、ペプチド合成の公知の常套
手段で製造しうる。固相合成法、液相合成法のいずれに
よってもよい。例えば固相法によりヒトビッグエンドセ
リン−２を合成する場合、メリーフィールドの固相ペプ
チド合成方法〔ジャーナル オブ ジ アメリカン ケミカ
ル ソサィエティ（J.Am.Chem.Soc.),85，2149(1963)〕
を用いるのが好ましい。不溶性樹脂としては当該技術分
野で知られたもののいずれであってもよく、例えばクロ
ロメチル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体、フェナシルアセティックメチル化されたスチレン−
ジビニルベンゼン共重合体のようなポリスチレン型樹
脂、ポリジメチルアクリルアミド樹脂のようなポリアミ
ド型樹脂が挙げられる。Ｃ末端のＮ−保護アミノ酸を不
溶性樹脂に結合させた後、ヒトビッグエンドセリン−２
のＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次結合
し、次いでフッ化水素で処理した後、ジスルフィド結合
を形成させ目的とするヒトビッグエンドセリン−２を合
成することができる。Ｎ−保護アミノ酸としては、α−
アミノ基はすべてＢｏｃ基で保護し、セリンおよびスレ
オニンの水酸基はＢｚｌ基で、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸のω−カルボン酸はＯＢｚｌ基、リジンのε−ア
ミノ基はＣｌ−Ｚ基、システインのチオール基はＡｃｍ
基、ＭｅＢｚｌ基、チロシンの水酸基はＢｒ−Ｚ基、ヒ
スチジンのイミダゾール基およびアルギニンのグアニド
基はＴｏｓ基、トリプトファンのインドール基はＣＨＯ
基で保護するのが好ましい。
ては、ヒトビッグエンドセリン−２あるいはそのＣ端ペ
プチドとキャリアー蛋白との複合体をつくり、このもの
を動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から抗体価の
高い個体を選び、最終免疫２〜５日後に脾臓あるいはリ
ンパ節を採取、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させ、安定的に力価の高い抗体を産生するハ
イブリドーマを選択し、モノクローナルなハイブリドー
マを得ることによる。免疫抗原としては、天然精製標
品、合成標品等いずれも使用でき、先に述べたヒトビッ
グエンドセリン−２あるいはそのＣ端ペプチドが用いら
れる。また免疫抗原として、ヒトビッグエンドセリン−
２の遺伝子配列を含むプラスミドを導入された細菌ある
いは細胞の生産物が用いられる場合もある。本発明で用
いられる種々のペプチドは、ペプチド合成の公知の常套
手段で製造しうる。固相合成法、液相合成法のいずれに
よってもよい。例えば固相法によりヒトビッグエンドセ
リン−２を合成する場合、メリーフィールドの固相ペプ
チド合成方法〔ジャーナル オブ ジ アメリカン ケミカ
ル ソサィエティ（J.Am.Chem.Soc.),85，2149(1963)〕
を用いるのが好ましい。不溶性樹脂としては当該技術分
野で知られたもののいずれであってもよく、例えばクロ
ロメチル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体、フェナシルアセティックメチル化されたスチレン−
ジビニルベンゼン共重合体のようなポリスチレン型樹
脂、ポリジメチルアクリルアミド樹脂のようなポリアミ
ド型樹脂が挙げられる。Ｃ末端のＮ−保護アミノ酸を不
溶性樹脂に結合させた後、ヒトビッグエンドセリン−２
のＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次結合
し、次いでフッ化水素で処理した後、ジスルフィド結合
を形成させ目的とするヒトビッグエンドセリン−２を合
成することができる。Ｎ−保護アミノ酸としては、α−
アミノ基はすべてＢｏｃ基で保護し、セリンおよびスレ
オニンの水酸基はＢｚｌ基で、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸のω−カルボン酸はＯＢｚｌ基、リジンのε−ア
ミノ基はＣｌ−Ｚ基、システインのチオール基はＡｃｍ
基、ＭｅＢｚｌ基、チロシンの水酸基はＢｒ−Ｚ基、ヒ
スチジンのイミダゾール基およびアルギニンのグアニド
基はＴｏｓ基、トリプトファンのインドール基はＣＨＯ
基で保護するのが好ましい。
【０００８】液相法による合成の手段としては、たとえ
ば「ザ ペプチズ（The Peptides）」、第１巻（1966
年）、Schroder and Lubke 著、Academic Press, New Y
ork，U.S.A.あるいは“ペプチド合成"、泉屋ら著、丸善
株式会社（1975年）に記載された方法、たとえばアジド
法、クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣ
Ｃ法、活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方
法、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ／ア
ディテイブ（例、ＨＯＮＢ，ＨＯＢｔ，ＨＯＳｕ）法な
どがあげられる。また、本発明で用いられる種々のペプ
チドとして、ヒトビッグエンドセリン−２の遺伝子配列
を含むプラスミドを導入された細菌あるいは細胞の生産
物が用いられる場合もある。これら、遺伝子操作による
ヒトビッグエンドセリン−２関連ペプチドの作製法とし
て、例えばＥＴ−２前駆体 ｃＤＮＡの発現ベクターを
導入した形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞の産生物を用いる方
法（例えば特願平３−１４３１２７号）が挙げられる。
ば「ザ ペプチズ（The Peptides）」、第１巻（1966
年）、Schroder and Lubke 著、Academic Press, New Y
ork，U.S.A.あるいは“ペプチド合成"、泉屋ら著、丸善
株式会社（1975年）に記載された方法、たとえばアジド
法、クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣ
Ｃ法、活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方
法、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ／ア
ディテイブ（例、ＨＯＮＢ，ＨＯＢｔ，ＨＯＳｕ）法な
どがあげられる。また、本発明で用いられる種々のペプ
チドとして、ヒトビッグエンドセリン−２の遺伝子配列
を含むプラスミドを導入された細菌あるいは細胞の生産
物が用いられる場合もある。これら、遺伝子操作による
ヒトビッグエンドセリン−２関連ペプチドの作製法とし
て、例えばＥＴ−２前駆体 ｃＤＮＡの発現ベクターを
導入した形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞の産生物を用いる方
法（例えば特願平３−１４３１２７号）が挙げられる。
【０００９】哺乳動物を免疫するために用いられる免疫
抗原とキャリアー蛋白との蛋白複合体に関しては、キャ
リアー蛋白の種類およびキャリアーとハプテンとの混合
比は、キャリアーにカプリングさせて免疫したハプテン
に対して抗体が効率よく出来れば、どの様なものをどの
様な比率でカプリングさせてもよいが、例えば、牛血清
アルブミンや牛チログロブリン、ヘモシアニン等を重量
比でハプテン１に対し0.1〜20、好ましくは１〜５の割
合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンと
キャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いるこ
とが出来るが、グルタルアルデビトやカルボジイミド、
マレイミド活性エステル等が好都合に用いられる。縮合
生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が可能な
部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与され
る。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイ
ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投
与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ行われ
る。用いられる温血動物としては、たとえばマウス、ラ
ット、ウサギなどがあげられる。
抗原とキャリアー蛋白との蛋白複合体に関しては、キャ
リアー蛋白の種類およびキャリアーとハプテンとの混合
比は、キャリアーにカプリングさせて免疫したハプテン
に対して抗体が効率よく出来れば、どの様なものをどの
様な比率でカプリングさせてもよいが、例えば、牛血清
アルブミンや牛チログロブリン、ヘモシアニン等を重量
比でハプテン１に対し0.1〜20、好ましくは１〜５の割
合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンと
キャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いるこ
とが出来るが、グルタルアルデビトやカルボジイミド、
マレイミド活性エステル等が好都合に用いられる。縮合
生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が可能な
部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与され
る。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイ
ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投
与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ行われ
る。用いられる温血動物としては、たとえばマウス、ラ
ット、ウサギなどがあげられる。
【００１０】次に、免疫された温血動物、たとえばマウ
スから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜
５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれ
る抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、
抗ヒトビッグエンドセリン−２抗体産生ハイブリドーマ
を調製することができる。融合操作は既知の方法、たと
えばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Natu
re）、256、495 (1975)〕に従い実施できる。融合促進
剤としてはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)やセンダイ
ウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用い
られる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０などがあげられるが、特にＰ３Ｕ１が好
ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は１：１〜20：１
程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ1000〜ＰＥＧ60
00）が10〜80％程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ま
しくは30〜37℃で１〜10分間インキュベートすることに
より効率よく細胞融合を実施できる。
スから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜
５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれ
る抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、
抗ヒトビッグエンドセリン−２抗体産生ハイブリドーマ
を調製することができる。融合操作は既知の方法、たと
えばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Natu
re）、256、495 (1975)〕に従い実施できる。融合促進
剤としてはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)やセンダイ
ウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用い
られる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０などがあげられるが、特にＰ３Ｕ１が好
ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は１：１〜20：１
程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ1000〜ＰＥＧ60
00）が10〜80％程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ま
しくは30〜37℃で１〜10分間インキュベートすることに
より効率よく細胞融合を実施できる。
【００１１】抗ヒトビッグエンドセリン−２抗体産生ハ
イブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用で
きるが、たとえばヒトビッグエンドセリン−２、ヒトビ
ッグエンドセリン−２のＣ端ペプチドあるいは、それら
をキャリヤー蛋白質に結合させた複合体を吸着させた固
相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を
添加し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ）で
標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる
細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用
いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した
モノクローナル抗体を検出するＥＬＩＳＡ(Enzyme-link
ed immunosorbent assay)法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、ＨＲＰで標識したヒトビッグエンドセ
リン−２、あるいはヒトビッグエンドセリン−２のＣ端
ペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を
検出するＥＩＡ(Enzyme immunoassay)法などがあげられ
る。ハイブリドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、10
〜20％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む動物細胞用培地
（例、ＲＰＭＩ1640)で行われる。ハイブリドーマ培養
上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様
にして測定できる。このようにして得られたハイブリド
ーマからヒトビッグエンドセリン−２やそのＣ端ペプチ
ドに結合性を有する抗体を製造する方法としては、通常
の細胞培養法や腹水形成法などが用いられる。細胞培養
法においては、ハイブリドーマをたとえば、１０〜１５
％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地、無血清培地などの
動物細胞培養用培地中で培養し、その培養上清液から抗
体を取得することができる。一方、腹水形成法を用いて
腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと主要組織
適合性が一致する動物に、プリスタン（２，４，６，１
０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を
腹水内に投与した後、ハイブリドーマを約１０ 7個腹腔
内投与する。ハイブリドーマは１０〜１８日ほどで腹水
腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体を産生
する。
イブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用で
きるが、たとえばヒトビッグエンドセリン−２、ヒトビ
ッグエンドセリン−２のＣ端ペプチドあるいは、それら
をキャリヤー蛋白質に結合させた複合体を吸着させた固
相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を
添加し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ）で
標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる
細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用
いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した
モノクローナル抗体を検出するＥＬＩＳＡ(Enzyme-link
ed immunosorbent assay)法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、ＨＲＰで標識したヒトビッグエンドセ
リン−２、あるいはヒトビッグエンドセリン−２のＣ端
ペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を
検出するＥＩＡ(Enzyme immunoassay)法などがあげられ
る。ハイブリドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、10
〜20％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む動物細胞用培地
（例、ＲＰＭＩ1640)で行われる。ハイブリドーマ培養
上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様
にして測定できる。このようにして得られたハイブリド
ーマからヒトビッグエンドセリン−２やそのＣ端ペプチ
ドに結合性を有する抗体を製造する方法としては、通常
の細胞培養法や腹水形成法などが用いられる。細胞培養
法においては、ハイブリドーマをたとえば、１０〜１５
％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地、無血清培地などの
動物細胞培養用培地中で培養し、その培養上清液から抗
体を取得することができる。一方、腹水形成法を用いて
腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと主要組織
適合性が一致する動物に、プリスタン（２，４，６，１
０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を
腹水内に投与した後、ハイブリドーマを約１０ 7個腹腔
内投与する。ハイブリドーマは１０〜１８日ほどで腹水
腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体を産生
する。
【００１２】抗ヒトビッグエンドセリン−２抗体の分離
精製は上記したハイブリドーマの培養上清あるいはハイ
ブリドーマを投与された動物の腹水などから、免疫グロ
ブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、
等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡ
Ｅ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合
物あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活
性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗
体を得る特異的精製法〕に従って行われる。ヒトビッグ
エンドセリン−２の一部領域（たとえばＮ端部分、Ｃ端
部分、中間部分）と反応するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマおよび、ヒトビッグエンドセリン−
２とは反応するがその一部領域とは反応しないモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの選別はたとえば
その一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産
生する抗体との結合性を測定することにより行うことが
できる。
精製は上記したハイブリドーマの培養上清あるいはハイ
ブリドーマを投与された動物の腹水などから、免疫グロ
ブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、
等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡ
Ｅ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合
物あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活
性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗
体を得る特異的精製法〕に従って行われる。ヒトビッグ
エンドセリン−２の一部領域（たとえばＮ端部分、Ｃ端
部分、中間部分）と反応するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマおよび、ヒトビッグエンドセリン−
２とは反応するがその一部領域とは反応しないモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの選別はたとえば
その一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産
生する抗体との結合性を測定することにより行うことが
できる。
【００１３】本発明においては、ヒトビッグエンドセリ
ン−２（配列番号：５）に結合性を有し、エンドセリン
−２（配列番号：２）と反応しないモノクローナル抗体
およびヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチド（配
列番号：７）に結合性を有するモノクローナル抗体が得
られる。
ン−２（配列番号：５）に結合性を有し、エンドセリン
−２（配列番号：２）と反応しないモノクローナル抗体
およびヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチド（配
列番号：７）に結合性を有するモノクローナル抗体が得
られる。
【００１４】ヒトビッグエンドセリン−２の測定法には
通常、以下に述べる競合法が用いられるが、後述するサ
ンドイッチ法を用いるのがより好ましい。競合法におい
ては、本発明で得られた抗ヒトビッグエンドセリン−２
抗体と、被検液および標識化ヒトビッグエンドセリン−
２あるいはそのＣ端ペプチドとを競合的に反応させたの
ち、抗体に結合した標識剤の割合を測定することによ
り、被検液中のヒトビッグエンドセリン−２、あるいは
ヒトビッグエンドセリン−２のＣ端ペプチドを定量す
る。
通常、以下に述べる競合法が用いられるが、後述するサ
ンドイッチ法を用いるのがより好ましい。競合法におい
ては、本発明で得られた抗ヒトビッグエンドセリン−２
抗体と、被検液および標識化ヒトビッグエンドセリン−
２あるいはそのＣ端ペプチドとを競合的に反応させたの
ち、抗体に結合した標識剤の割合を測定することによ
り、被検液中のヒトビッグエンドセリン−２、あるいは
ヒトビッグエンドセリン−２のＣ端ペプチドを定量す
る。
【００１５】該標識剤あるいは後記の抗体の標識剤とし
ては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質など
が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば
125Ｉ，131Ｉ，3Ｈ，14Ｃなどが、上記酵素としては、
安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等
が、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが、発光物質としては、ル
ミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニ
ンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいはヒ
トビッグエンドセリン−２、あるいはそのＣ端ペプチド
と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いること
もできる。
ては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質など
が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば
125Ｉ，131Ｉ，3Ｈ，14Ｃなどが、上記酵素としては、
安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等
が、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが、発光物質としては、ル
ミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニ
ンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいはヒ
トビッグエンドセリン−２、あるいはそのＣ端ペプチド
と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いること
もできる。
【００１６】上記の標識剤の活性の測定に当っては、抗
体に結合した標識剤と遊離の標識剤とを分離（以後Ｂ／
Ｆ分離と略す）する必要があるが、標識剤として酵素を
用いた場合には、このための試薬に、測定に用いられる
抗体に対する抗体を不溶化したもの、あるいは不溶化し
たプロテインＡ等の活性吸着剤が有利に用いられる。例
えば、抗ＩｇＧ抗体（抗ヒトビッグエンドセリン−２抗
体に対する抗体に相当）を固相として用い、これと反応
性のある上記抗体を介して標識化ヒトビッグエンドセリ
ン−２を固相にある抗ＩｇＧ抗体に結合させ、該固相上
の標識剤を測定することによって行なうことができる。
標識剤として酵素を用いた場合には、不溶化担体上の酵
素活性の測定には通常の比色法あるいは蛍光法が用いら
れる。標識剤にラジオアイソトープ等、非蛋白性物質を
用いた場合には、Ｂ／Ｆ分離に上記の試薬以外にも例え
ば不溶化しない抗ヒトビッグエンドセリン−２に結合性
を有する抗体、硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポ
リエチレングリコール等の試薬が用いられる。いずれの
方法においても上清中あるいは沈降物中の標識剤の活性
を測定する。上記の不溶化に当っては、物理的吸着を用
いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、
固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよ
い。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロ
ースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリル
アミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙
げられる。
体に結合した標識剤と遊離の標識剤とを分離（以後Ｂ／
Ｆ分離と略す）する必要があるが、標識剤として酵素を
用いた場合には、このための試薬に、測定に用いられる
抗体に対する抗体を不溶化したもの、あるいは不溶化し
たプロテインＡ等の活性吸着剤が有利に用いられる。例
えば、抗ＩｇＧ抗体（抗ヒトビッグエンドセリン−２抗
体に対する抗体に相当）を固相として用い、これと反応
性のある上記抗体を介して標識化ヒトビッグエンドセリ
ン−２を固相にある抗ＩｇＧ抗体に結合させ、該固相上
の標識剤を測定することによって行なうことができる。
標識剤として酵素を用いた場合には、不溶化担体上の酵
素活性の測定には通常の比色法あるいは蛍光法が用いら
れる。標識剤にラジオアイソトープ等、非蛋白性物質を
用いた場合には、Ｂ／Ｆ分離に上記の試薬以外にも例え
ば不溶化しない抗ヒトビッグエンドセリン−２に結合性
を有する抗体、硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポ
リエチレングリコール等の試薬が用いられる。いずれの
方法においても上清中あるいは沈降物中の標識剤の活性
を測定する。上記の不溶化に当っては、物理的吸着を用
いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、
固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよ
い。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロ
ースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリル
アミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙
げられる。
【００１７】競合法においては、例えばヒトビッグエン
ドセリン−２の測定の場合、抗ヒトビッグエンドセリン
−２抗体、被検液、標識化ヒトビッグエンドセリン−
２、およびＢ／Ｆ分離用試薬は、どのような順序に反応
させることも可能であり、また全部あるいは一部を同時
に反応させてもよいが、少なくとも標識化ヒトビッグエ
ンドセリン−２は、被検液と抗ヒトビッグエンドセリン
−２抗体との反応と同時に、あるいは反応後に遅れて反
応系に加えられることが好ましい。ただし硫酸ナトリウ
ム、デキストラン炭末、ポリエチレングリコール等のＢ
／Ｆ分離試薬は主として反応系の最後に用いられる。一
方、サンドイッチ法においては不溶化した抗ヒトビッグ
エンドセリン−２抗体に被検液を接触（反応）させ（１
次反応）、さらに標識化抗ヒトビッグエンドセリン−２
抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標
識剤の活性を測定することにより被検液中のヒトビッグ
エンドセリン−２を定量することができる。１次反応と
２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行な
ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれ
らに準じることができる。
ドセリン−２の測定の場合、抗ヒトビッグエンドセリン
−２抗体、被検液、標識化ヒトビッグエンドセリン−
２、およびＢ／Ｆ分離用試薬は、どのような順序に反応
させることも可能であり、また全部あるいは一部を同時
に反応させてもよいが、少なくとも標識化ヒトビッグエ
ンドセリン−２は、被検液と抗ヒトビッグエンドセリン
−２抗体との反応と同時に、あるいは反応後に遅れて反
応系に加えられることが好ましい。ただし硫酸ナトリウ
ム、デキストラン炭末、ポリエチレングリコール等のＢ
／Ｆ分離試薬は主として反応系の最後に用いられる。一
方、サンドイッチ法においては不溶化した抗ヒトビッグ
エンドセリン−２抗体に被検液を接触（反応）させ（１
次反応）、さらに標識化抗ヒトビッグエンドセリン−２
抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標
識剤の活性を測定することにより被検液中のヒトビッグ
エンドセリン−２を定量することができる。１次反応と
２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行な
ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれ
らに準じることができる。
【００１８】２次反応に用いられるヒトビッグエンドセ
リン−２抗体としては、１次反応に用いられる抗ビッグ
エンドセリン−２抗体とはヒトビッグエンドセリン−２
の該抗体と結合する部位が相異なる抗体が好ましく用い
られる。たとえば１次反応で用いられる抗体がヒトビッ
グエンドセリン−２のＣ端部に結合性を有する場合、２
次反応では、好ましくはＣ端部以外（例、Ｎ端部）と結
合する抗ヒトビッグエンドセリン−２抗体が用いられ、
また１次反応で用いられる抗体がヒトビッグエンドセリ
ン−２のＮ端部に結合性を有する場合、２次反応では、
好ましくはＮ端部以外（例、Ｃ端部）と結合する抗ヒト
ビッグエンドセリン−２抗体が用いられる。サンドイッ
チ法によるヒトビッグエンドセリン−２の免疫学的測定
法において特に好ましくは、エンドセリン−２とは反応
するが、エンドセリン−２のＣ端ペプチド、Ｃys−Ｈis
−Ｌeu−Ａsp−Ｉle−Ｉle−Ｔrp（配列番号：８）とは
反応しない抗エンドセリン−２モノクローナル抗体とヒ
トビッグエンドセリン−２Ｃ端ペプチド（２２−３７）
あるいは（２２−３８）に対するモノクローナル抗体と
が用いられる。サンドイッチ法による免疫測定法におい
ては、固相用抗体および標識用抗体いずれもいかなるク
ラス、サブクラスのものでもよく、また、抗体活性が保
持されているなら、それらからＦｃ’あるいはＦｃ領域
を除去したＦ(ａｂ’)2画分、Ｆａｂ’画分あるいはＦ
ａｂ画分でもよい。サンドイッチ法による免疫測定法に
おいて、モノクローナル抗体を用いる場合、固相用抗体
あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類
である必要はなく、測定感度や特異性を向上させる等の
目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
リン−２抗体としては、１次反応に用いられる抗ビッグ
エンドセリン−２抗体とはヒトビッグエンドセリン−２
の該抗体と結合する部位が相異なる抗体が好ましく用い
られる。たとえば１次反応で用いられる抗体がヒトビッ
グエンドセリン−２のＣ端部に結合性を有する場合、２
次反応では、好ましくはＣ端部以外（例、Ｎ端部）と結
合する抗ヒトビッグエンドセリン−２抗体が用いられ、
また１次反応で用いられる抗体がヒトビッグエンドセリ
ン−２のＮ端部に結合性を有する場合、２次反応では、
好ましくはＮ端部以外（例、Ｃ端部）と結合する抗ヒト
ビッグエンドセリン−２抗体が用いられる。サンドイッ
チ法によるヒトビッグエンドセリン−２の免疫学的測定
法において特に好ましくは、エンドセリン−２とは反応
するが、エンドセリン−２のＣ端ペプチド、Ｃys−Ｈis
−Ｌeu−Ａsp−Ｉle−Ｉle−Ｔrp（配列番号：８）とは
反応しない抗エンドセリン−２モノクローナル抗体とヒ
トビッグエンドセリン−２Ｃ端ペプチド（２２−３７）
あるいは（２２−３８）に対するモノクローナル抗体と
が用いられる。サンドイッチ法による免疫測定法におい
ては、固相用抗体および標識用抗体いずれもいかなるク
ラス、サブクラスのものでもよく、また、抗体活性が保
持されているなら、それらからＦｃ’あるいはＦｃ領域
を除去したＦ(ａｂ’)2画分、Ｆａｂ’画分あるいはＦ
ａｂ画分でもよい。サンドイッチ法による免疫測定法に
おいて、モノクローナル抗体を用いる場合、固相用抗体
あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類
である必要はなく、測定感度や特異性を向上させる等の
目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００１９】また、本発明で得られた抗体を用いる免疫
測定法は、ヒトビッグエンドセリン−２あるいはエンド
セリン−２が関与する疾患の診断および予後管理に使用
し得る。被検試料としては、血漿、血清、尿、脳脊髄
液、腹水、胸水、羊水等の体液や、痰、便などが使用し
得る。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液
で希釈あるいは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料と
し得る。試料の希釈あるいは抽出に用いられる溶媒とし
てはどのような緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよい
が、好ましくはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食塩
水、酢酸緩衝液、アセトン、クロロホルム−メタノール
あるいは、界面活性剤を含むこれらの溶液が用いられ
る。また、濃縮は、試料を直接減圧下、あるいは常圧、
窒素気流下濃縮してもよいし、また試料をイオン交換あ
るいは逆相クロマトグラフィー用担体あるいは抗ヒトビ
ッグエンドセリン−２抗体結合担体に添加したのち、適
当な溶出条件で溶出後、減圧下あるいは常圧、窒素気流
下濃縮しても良い。濃縮用担体として特に好ましくは、
逆相クロマトグラフィー用担体のＣ２，Ｃ８あるいはＣ
18カートリッジが用いられる。濃縮物はイムノアッセイ
用緩衝液に溶解後、イムノアッセイの試料とする。さら
に、本発明で得られた抗ヒトビッグエンドセリン−２抗
体はヒトビッグエンドセリン−２の免疫組織染色法等に
も用いる事ができる。その方法は、例えば標識化抗ヒト
ビッグエンドセリン−２抗体を用いる直接法、抗ヒトビ
ッグエンドセリン−２抗体および該抗体に対する抗体の
標識化されたものを用いる間接法等に準ずることができ
る。
測定法は、ヒトビッグエンドセリン−２あるいはエンド
セリン−２が関与する疾患の診断および予後管理に使用
し得る。被検試料としては、血漿、血清、尿、脳脊髄
液、腹水、胸水、羊水等の体液や、痰、便などが使用し
得る。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液
で希釈あるいは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料と
し得る。試料の希釈あるいは抽出に用いられる溶媒とし
てはどのような緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよい
が、好ましくはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食塩
水、酢酸緩衝液、アセトン、クロロホルム−メタノール
あるいは、界面活性剤を含むこれらの溶液が用いられ
る。また、濃縮は、試料を直接減圧下、あるいは常圧、
窒素気流下濃縮してもよいし、また試料をイオン交換あ
るいは逆相クロマトグラフィー用担体あるいは抗ヒトビ
ッグエンドセリン−２抗体結合担体に添加したのち、適
当な溶出条件で溶出後、減圧下あるいは常圧、窒素気流
下濃縮しても良い。濃縮用担体として特に好ましくは、
逆相クロマトグラフィー用担体のＣ２，Ｃ８あるいはＣ
18カートリッジが用いられる。濃縮物はイムノアッセイ
用緩衝液に溶解後、イムノアッセイの試料とする。さら
に、本発明で得られた抗ヒトビッグエンドセリン−２抗
体はヒトビッグエンドセリン−２の免疫組織染色法等に
も用いる事ができる。その方法は、例えば標識化抗ヒト
ビッグエンドセリン−２抗体を用いる直接法、抗ヒトビ
ッグエンドセリン−２抗体および該抗体に対する抗体の
標識化されたものを用いる間接法等に準ずることができ
る。
【００２０】本発明明細書においてアミノ酸等を略号で
表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢCommission on Bioc
hemical Nomenclature による略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＰＡＭ ：フェニルアセタミドメチル ＢＨＡ ：ベンツヒドリルアミン Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｂг−Ｚ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル ＯＢｚｌ：ベンジルエステル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル Ａｃｍ ：アセトアミドメチル ＨＯＢｔ：１−ベンゾトリアゾール ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＰＢＳ ：リン酸緩衡化生理食塩水 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオライド Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｍｅｔ ：メチオニン Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン Ｃｙｓ ：システイン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン
表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢCommission on Bioc
hemical Nomenclature による略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＰＡＭ ：フェニルアセタミドメチル ＢＨＡ ：ベンツヒドリルアミン Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｂг−Ｚ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル ＯＢｚｌ：ベンジルエステル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル Ａｃｍ ：アセトアミドメチル ＨＯＢｔ：１−ベンゾトリアゾール ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＰＢＳ ：リン酸緩衡化生理食塩水 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオライド Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｍｅｔ ：メチオニン Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン Ｃｙｓ ：システイン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン
【００２１】
【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれに限定されるべきものではな
い。
説明するが、本発明はこれに限定されるべきものではな
い。
【００２２】後述の実施例で用いられているマウスモノ
クローナル抗体ｂＥＴ−２０ａを産生するハイブリドー
マ細胞ｂＥＴ−２０は財団法人発酵研究所(IFO)に受託
番号ＩＦＯ ５０２５６として平成２年９月２１日から
寄託されている。また、該ハイブリドーマは通商産業省
工業技術院微生物工業研究所（FRI)に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３１３２としてブダペスト条約に基き平成２年
１０月１６日から寄託され、ＦＲＩに保管されている。
クローナル抗体ｂＥＴ−２０ａを産生するハイブリドー
マ細胞ｂＥＴ−２０は財団法人発酵研究所(IFO)に受託
番号ＩＦＯ ５０２５６として平成２年９月２１日から
寄託されている。また、該ハイブリドーマは通商産業省
工業技術院微生物工業研究所（FRI)に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３１３２としてブダペスト条約に基き平成２年
１０月１６日から寄託され、ＦＲＩに保管されている。
【００２３】実施例１ Ｉ ペプチドの合成 （Ｉ−１）ｂｉｇＥＴ−２(22−37）： Ｈ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号：７，Ｘａａ＝Ｐｒ
ｏ）の合成 市販の Boc-Pro-OCH2-PAM樹脂 (アプライド バイオシ
ステムズ社製) 0.77ｇ(0.5 n mole)を用い、ペプチド合
成機（アブライド バイオシステムズ社製モデル430A)
を使用し、合成した。樹脂上のBoc基を50％トリフルオ
ロ酢酸/塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた
後、このアミノ基に、Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Gly, Boc
-Leu, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Ala, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gl
n, Boc-Glu(OBzl), Boc-Valをbig ET-2(22-37)のアミノ
酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDC
Cまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で
再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセ
チル化し、bigET-2(22−37）-OCH2-PAM樹脂 2.35ｇを得
た。
ｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号：７，Ｘａａ＝Ｐｒ
ｏ）の合成 市販の Boc-Pro-OCH2-PAM樹脂 (アプライド バイオシ
ステムズ社製) 0.77ｇ(0.5 n mole)を用い、ペプチド合
成機（アブライド バイオシステムズ社製モデル430A)
を使用し、合成した。樹脂上のBoc基を50％トリフルオ
ロ酢酸/塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた
後、このアミノ基に、Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Gly, Boc
-Leu, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Ala, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gl
n, Boc-Glu(OBzl), Boc-Valをbig ET-2(22-37)のアミノ
酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDC
Cまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で
再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセ
チル化し、bigET-2(22−37）-OCH2-PAM樹脂 2.35ｇを得
た。
【００２４】この樹脂0.30ｇをｐ−クレゾール0.55ｇ共
存下無水フッ化水素５mlで０℃, 60分間処理した後、フ
ッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５mlで２
回洗浄した後、残渣を50％-酢酸水５mlで抽出した。不
溶物を濾去し、50％-酢酸水５mlで洗浄した。濾液、洗
液を合し、２〜３mlに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ
−２０(2×90cm)のカラムに付し、50％-酢酸で溶出し
た。主要画分を集め濃縮し0.1％トリフルオロ酢酸水100
mlに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ ＡＭ１２０ Ｓ−５０樹
脂カラム（2.6×7cm）に付し、0.1％トリフルオロ酢酸
水と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有)
の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合
し、凍結乾燥し、白色粉末77ｍｇを得た。 アミノ酸分析値 Asp 1.92(2), Thr 1.76(2), Glu 2.04(2), Gly 2.00
(2), Ala 1.02(1), Val 1.00(1), Pro 3.90(4), Leu 0.
99(1), Tyr 0.95(1), 質量分析による (Ｍ＋Ｈ)+ 1654.776 ＨＰＬＣ溶出時間 ２０．０分 カラム条件 カラム: WAKOSIL 5C18-200（4.6×２５０） 溶離液： Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速 : 1.0ml/分 (Ｉ−２) big ET-2(1-37);H-Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Trp-
Leu-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Il
e-Ile-Trp-Val-Asn-Thr-Pro-Glu-Gln-Thr-Ala-Pro-Tyr-
Gly-Leu-Gly-Asn-Pro-Pro-OH（配列番号：５，Ｘａａ＝
Ｐｒｏ）の合成 市販の Boc-Pro-OCH2-PAM樹脂 (アプライド バイオシ
ステムズ社製) 0.78ｇ(0.5 n mole)を用い、ペプチド合
成機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A)
を使用し、合成した。樹脂上のBoc基を50％トリフルオ
ロ酢酸/塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた
後、このアミノ基に、Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Gly, Boc
-Leu, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Ala, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gl
n, Boc-Glu(OBzl), Boc-Val, Boc-Trp(CHO), Boc-Ile,
Boc-Asp(0Bzl), Boc-His(DNP), Boc-Cys(MeBzl),Boc-Ph
e, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Ser(Bzl)をbig ET-2(1-37)のア
ミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さら
にDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導
体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸で
アセチル化し、保護されたbig-ET-2(1-37)-OCH2-PAM 樹
脂を得た。これをN,N'-ジメチルホルムアミド30mlに懸
濁し、チオフェノール３mlを加え、室温で２時間ゆるや
かに撹拌した後グラスフィルター上に樹脂を濾過し、N,
N'-ジメチルホルムアミドとジクロロメタンで洗浄の後
乾燥し3.36ｇの樹脂を得た。
存下無水フッ化水素５mlで０℃, 60分間処理した後、フ
ッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５mlで２
回洗浄した後、残渣を50％-酢酸水５mlで抽出した。不
溶物を濾去し、50％-酢酸水５mlで洗浄した。濾液、洗
液を合し、２〜３mlに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ
−２０(2×90cm)のカラムに付し、50％-酢酸で溶出し
た。主要画分を集め濃縮し0.1％トリフルオロ酢酸水100
mlに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ ＡＭ１２０ Ｓ−５０樹
脂カラム（2.6×7cm）に付し、0.1％トリフルオロ酢酸
水と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有)
の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合
し、凍結乾燥し、白色粉末77ｍｇを得た。 アミノ酸分析値 Asp 1.92(2), Thr 1.76(2), Glu 2.04(2), Gly 2.00
(2), Ala 1.02(1), Val 1.00(1), Pro 3.90(4), Leu 0.
99(1), Tyr 0.95(1), 質量分析による (Ｍ＋Ｈ)+ 1654.776 ＨＰＬＣ溶出時間 ２０．０分 カラム条件 カラム: WAKOSIL 5C18-200（4.6×２５０） 溶離液： Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速 : 1.0ml/分 (Ｉ−２) big ET-2(1-37);H-Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Trp-
Leu-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Il
e-Ile-Trp-Val-Asn-Thr-Pro-Glu-Gln-Thr-Ala-Pro-Tyr-
Gly-Leu-Gly-Asn-Pro-Pro-OH（配列番号：５，Ｘａａ＝
Ｐｒｏ）の合成 市販の Boc-Pro-OCH2-PAM樹脂 (アプライド バイオシ
ステムズ社製) 0.78ｇ(0.5 n mole)を用い、ペプチド合
成機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A)
を使用し、合成した。樹脂上のBoc基を50％トリフルオ
ロ酢酸/塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた
後、このアミノ基に、Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Gly, Boc
-Leu, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Ala, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gl
n, Boc-Glu(OBzl), Boc-Val, Boc-Trp(CHO), Boc-Ile,
Boc-Asp(0Bzl), Boc-His(DNP), Boc-Cys(MeBzl),Boc-Ph
e, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Ser(Bzl)をbig ET-2(1-37)のア
ミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さら
にDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導
体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸で
アセチル化し、保護されたbig-ET-2(1-37)-OCH2-PAM 樹
脂を得た。これをN,N'-ジメチルホルムアミド30mlに懸
濁し、チオフェノール３mlを加え、室温で２時間ゆるや
かに撹拌した後グラスフィルター上に樹脂を濾過し、N,
N'-ジメチルホルムアミドとジクロロメタンで洗浄の後
乾燥し3.36ｇの樹脂を得た。
【００２５】この樹脂0.71ｇをｐ−クレゾール1.50ｇ,
1,4−ブタンジチオール1.0ml共存下無水フッ化水素 10m
lで０℃, 60分間処理した後、フッ化水素を減圧留去
し、残渣をエチルエーテル５mlで２回洗浄した後、残渣
をトリフルオロ酢酸４mlで抽出した。不溶物を濾去し、
トリフルオロ酢酸２mlで２回洗浄した。これを2.5Ｍ-ウ
レア水溶液750mlにそそぎ、氷冷下にpH8.25に調節し、
緩やかに空気を吹き込みながら一晩撹拌した。Ellmanテ
ストが陰性になったことを確認した後、全溶液をＹＭＣ
−ＯＤＳ ＡＭ１２０ Ｓ−５０樹脂カラム（2.6×7c
m）に付し、0.1％トリフルオロ酢酸水と50％アセトニト
リル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃
度勾配で溶出した。主要画分を合し、濃縮した後セファ
デックスＬＨ−２０(2×90cm)のカラムに付し、50％-酢
酸で溶出した。主要画分を凍結乾燥し、白色粉末35ｍｇ
を得た。これを20％アセトニトリル10mlに溶解し、DEAE
セルロファインカラム（2.6×６cm）に付し、同溶媒と
アセトニトリル20％含有の0.5Ｍ−酢酸アンモニウムと
の直線型濃度勾配で溶出し、主要画分を再度ＹＭＣ−Ｏ
ＤＳ ＡＭ１２０ Ｓ−５０樹脂カラム（2.6×7cm）に
付し、29％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含
有）で溶出し、主要画分を凍結乾燥し、７mgの白色粉末
を得た。
1,4−ブタンジチオール1.0ml共存下無水フッ化水素 10m
lで０℃, 60分間処理した後、フッ化水素を減圧留去
し、残渣をエチルエーテル５mlで２回洗浄した後、残渣
をトリフルオロ酢酸４mlで抽出した。不溶物を濾去し、
トリフルオロ酢酸２mlで２回洗浄した。これを2.5Ｍ-ウ
レア水溶液750mlにそそぎ、氷冷下にpH8.25に調節し、
緩やかに空気を吹き込みながら一晩撹拌した。Ellmanテ
ストが陰性になったことを確認した後、全溶液をＹＭＣ
−ＯＤＳ ＡＭ１２０ Ｓ−５０樹脂カラム（2.6×7c
m）に付し、0.1％トリフルオロ酢酸水と50％アセトニト
リル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃
度勾配で溶出した。主要画分を合し、濃縮した後セファ
デックスＬＨ−２０(2×90cm)のカラムに付し、50％-酢
酸で溶出した。主要画分を凍結乾燥し、白色粉末35ｍｇ
を得た。これを20％アセトニトリル10mlに溶解し、DEAE
セルロファインカラム（2.6×６cm）に付し、同溶媒と
アセトニトリル20％含有の0.5Ｍ−酢酸アンモニウムと
の直線型濃度勾配で溶出し、主要画分を再度ＹＭＣ−Ｏ
ＤＳ ＡＭ１２０ Ｓ−５０樹脂カラム（2.6×7cm）に
付し、29％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含
有）で溶出し、主要画分を凍結乾燥し、７mgの白色粉末
を得た。
【００２６】アミノ酸分析値 Asp 3.84(4), Thr 1.76(2), Ser 2.87(3), Glu 3.04
(3), Pro 4.22(4), Gly 2.11(2), Cys 1.20(2),Val 1.8
3(2), Ile 1.77(3), Leu 3.00(3), Tyr 1.90(2), Phe
0.95(1), Lys 0.93(1), His 0.88(1) 質量分析による (Ｍ＋Ｈ)+ 4181.731 ＨＰＬＣ溶出時間 ２６．５分 カラム条件 カラム: WAKOSIL 5C18-200（4.6×250) 溶離液: Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル) を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速 : 1.0ml/分 II．抗ｂｉｇＥＴ−２(22−37）モノクローナル抗体の
作製 （II−１）免疫原の作製 上記Ｉで得られたｂｉｇＥＴ−２(22−37）と牛チログ
ロブリン（ＴＧ）とを以下に述べるマレイミド架橋法に
より縮合させ、免疫原とした。即ち、ポリペプチド1.9
μmoleを400μｌの0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に溶
解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニ
ミド（以下ＧＭＢＳ）28.2μmoleを含むＤＭＦ溶液100
μｌと混合し、室温で60分反応させた。一方、ＴＧ 20
ｍｇ（40 ｎmole）を0.15Ｍ食塩を含む 0.02Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ 6.8、1.4ｍｌに溶解させ、Ｎ−サクシニミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以
下ＳＰＤＰと略す）2.5ｍｇ（8.0 μmole）を含むＤＭ
Ｆ溶液100μｌを混合したのち室温40分間反応させた。
反応後、ジチオスレイトール 24.6ｍｇ（160 μmole）
を含む0.1Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ 4.5、0.5ｍｌを加え、室
温20分反応させたのち、セファデックスＧ−25カラムで
分画を行ない、ＳＨ基の導入されたＴＧ10ｍｇ（20 ｎm
ole）を得た。次にマレイミド基導入ポリペプタイド 95
0ｎmoleと、ＳＨ基導入ＴＧ 12ｎmole とを混合し、４
℃で２日間反応させたのち、生理食塩水に対し、４℃で
２日間透析した。
(3), Pro 4.22(4), Gly 2.11(2), Cys 1.20(2),Val 1.8
3(2), Ile 1.77(3), Leu 3.00(3), Tyr 1.90(2), Phe
0.95(1), Lys 0.93(1), His 0.88(1) 質量分析による (Ｍ＋Ｈ)+ 4181.731 ＨＰＬＣ溶出時間 ２６．５分 カラム条件 カラム: WAKOSIL 5C18-200（4.6×250) 溶離液: Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル) を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速 : 1.0ml/分 II．抗ｂｉｇＥＴ−２(22−37）モノクローナル抗体の
作製 （II−１）免疫原の作製 上記Ｉで得られたｂｉｇＥＴ−２(22−37）と牛チログ
ロブリン（ＴＧ）とを以下に述べるマレイミド架橋法に
より縮合させ、免疫原とした。即ち、ポリペプチド1.9
μmoleを400μｌの0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に溶
解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニ
ミド（以下ＧＭＢＳ）28.2μmoleを含むＤＭＦ溶液100
μｌと混合し、室温で60分反応させた。一方、ＴＧ 20
ｍｇ（40 ｎmole）を0.15Ｍ食塩を含む 0.02Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ 6.8、1.4ｍｌに溶解させ、Ｎ−サクシニミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以
下ＳＰＤＰと略す）2.5ｍｇ（8.0 μmole）を含むＤＭ
Ｆ溶液100μｌを混合したのち室温40分間反応させた。
反応後、ジチオスレイトール 24.6ｍｇ（160 μmole）
を含む0.1Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ 4.5、0.5ｍｌを加え、室
温20分反応させたのち、セファデックスＧ−25カラムで
分画を行ない、ＳＨ基の導入されたＴＧ10ｍｇ（20 ｎm
ole）を得た。次にマレイミド基導入ポリペプタイド 95
0ｎmoleと、ＳＨ基導入ＴＧ 12ｎmole とを混合し、４
℃で２日間反応させたのち、生理食塩水に対し、４℃で
２日間透析した。
【００２７】（II−２）免疫 ６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに上記II−１記載の
免疫原100 μg／匹をアジュバントとともに皮下免疫し
た。以後３週間おきに２〜３回追加免疫を実施した。 （II−３）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
化ｂｉｇＥＴ−２(22−37）の作製 ｂｉｇＥＴ−２(22−37） 650 nmoleを400μｌの0.1Ｍ
リン酸緩衝液、ｐＨ 6.8に溶解させ、ＧＭＢＳ 2.7ｍg
（9.8μmole）を含むＤＭＦ溶液 100μｌと混合し、室
温で60分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５
カラムで分画を行ないマレイミド基の導入されたポリペ
プチド390nmoleを得た。一方、ＨＲＰ ８ｍｇ（200ｎmo
le）を0.15Ｍ食塩を含む0.02Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ 6.
8、1.14ｍｌに溶解させ、ＳＰＤＰ 1.56mg(5.0μmole）
を含むＤＭＦ溶液60μｌを混合したのち室温40分間反応
させた。反応後、ジチオスレイトール10.5mg（68μmol
e）を含む 0.1Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ4.5、0.4ｍｌを加
え、室温20分反応させたのち、セファデックスＧ−25カ
ラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入された酵素4.8ｍｇ
（120 ｎmole）を得た。次に、マレイミド基導入ｂｉｇ
ＥＴ−２(22−37） 390ｎmoleとＳＨ基導入ペルオキシ
ダーゼ120ｎmole とを混合し、４℃、16時間反応させ
た。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ44（ＬＫＢ−ファルマ
シア社製）カラムで分画し、ペルオキシダーゼ標識化ｂ
ｉｇＥＴ−２を得た。
免疫原100 μg／匹をアジュバントとともに皮下免疫し
た。以後３週間おきに２〜３回追加免疫を実施した。 （II−３）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
化ｂｉｇＥＴ−２(22−37）の作製 ｂｉｇＥＴ−２(22−37） 650 nmoleを400μｌの0.1Ｍ
リン酸緩衝液、ｐＨ 6.8に溶解させ、ＧＭＢＳ 2.7ｍg
（9.8μmole）を含むＤＭＦ溶液 100μｌと混合し、室
温で60分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５
カラムで分画を行ないマレイミド基の導入されたポリペ
プチド390nmoleを得た。一方、ＨＲＰ ８ｍｇ（200ｎmo
le）を0.15Ｍ食塩を含む0.02Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ 6.
8、1.14ｍｌに溶解させ、ＳＰＤＰ 1.56mg(5.0μmole）
を含むＤＭＦ溶液60μｌを混合したのち室温40分間反応
させた。反応後、ジチオスレイトール10.5mg（68μmol
e）を含む 0.1Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ4.5、0.4ｍｌを加
え、室温20分反応させたのち、セファデックスＧ−25カ
ラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入された酵素4.8ｍｇ
（120 ｎmole）を得た。次に、マレイミド基導入ｂｉｇ
ＥＴ−２(22−37） 390ｎmoleとＳＨ基導入ペルオキシ
ダーゼ120ｎmole とを混合し、４℃、16時間反応させ
た。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ44（ＬＫＢ−ファルマ
シア社製）カラムで分画し、ペルオキシダーゼ標識化ｂ
ｉｇＥＴ−２を得た。
【００２８】（II−４）細胞融合 ｂｉｇＥＴ−２(22−37）を免疫中のマウスに対して、2
50μgの免疫原を生理食塩水 0.25ｍｌに溶解させたもの
を静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最
終免疫３日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメ
ツシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エツセ
ンシヤルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、脾臓細胞浮
遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／
Ｃマウス由来ミエローマ細胞 Ｐ３−× 63.Ａg８．Ｕ１
（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント トピツクス イン マ
イクロバイオロジー アンド イムノロジー、81、１（19
78)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャー、256、495(197
5)〕に準じて行なった。即ち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１
をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓
細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１になるよう混合して、
800 回転で15分間遠心を行なって細胞を沈殿させた。上
清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、45％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）6000（コッホライト社製）
を0.3mｌ加え、37℃温水槽中で７分間静置して融合を行
なった。融合後細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加
し、合計12ｍｌのＭＥＭを加えた後 600回転15分間遠心
して上清を除去した。この細胞沈殿物を10％牛胎児血清
を含有するＧＩＴメデイウム(和光純薬）（ＧＩＴ−１
０ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当り２× 106個になるよ
うに浮遊し、24穴マルチデイシユ(リンブロ社製)に１ウ
ェル１ｍｌずつ 120ウェルに播種した。播種後、細胞を
37℃で５％炭酸ガスフラン器中培養した。24時間後Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン１×10~4Ｍ、アミノブリテリン４
×10~7Ｍ、チミジン 1.6×10~3Ｍ）を含んだＧＩＴ−10
ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添
加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ
選択培養は、培養開始３、６、９日後に旧液を１ｍｌ捨
てたあと、１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継
続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜14日
で認められ、培養液が黄変したとき(約１×106セル／ｍ
ｌ)、上清を採取し、後述するＥＩＡ法で、抗体価を測
定した。
50μgの免疫原を生理食塩水 0.25ｍｌに溶解させたもの
を静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最
終免疫３日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメ
ツシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エツセ
ンシヤルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、脾臓細胞浮
遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／
Ｃマウス由来ミエローマ細胞 Ｐ３−× 63.Ａg８．Ｕ１
（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント トピツクス イン マ
イクロバイオロジー アンド イムノロジー、81、１（19
78)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャー、256、495(197
5)〕に準じて行なった。即ち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１
をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓
細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１になるよう混合して、
800 回転で15分間遠心を行なって細胞を沈殿させた。上
清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、45％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）6000（コッホライト社製）
を0.3mｌ加え、37℃温水槽中で７分間静置して融合を行
なった。融合後細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加
し、合計12ｍｌのＭＥＭを加えた後 600回転15分間遠心
して上清を除去した。この細胞沈殿物を10％牛胎児血清
を含有するＧＩＴメデイウム(和光純薬）（ＧＩＴ−１
０ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当り２× 106個になるよ
うに浮遊し、24穴マルチデイシユ(リンブロ社製)に１ウ
ェル１ｍｌずつ 120ウェルに播種した。播種後、細胞を
37℃で５％炭酸ガスフラン器中培養した。24時間後Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン１×10~4Ｍ、アミノブリテリン４
×10~7Ｍ、チミジン 1.6×10~3Ｍ）を含んだＧＩＴ−10
ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添
加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ
選択培養は、培養開始３、６、９日後に旧液を１ｍｌ捨
てたあと、１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継
続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜14日
で認められ、培養液が黄変したとき(約１×106セル／ｍ
ｌ)、上清を採取し、後述するＥＩＡ法で、抗体価を測
定した。
【００２９】（II−５) ハイブリドーマのスクリーニ
ング ハイブリドーマ培養上清中の抗体価を以下の方法により
測定した。まず、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マ
イクロプレートを作製した。抗マウスイムノグロブリン
抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を 20μg／mｌ含む
0.1Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ 9.6溶液を 96ウェルマイクロプ
レートに 100μｌずつ分注し、４℃で24 時間放置し
た。次に、プレートをＰＢＳで洗浄したのち、ウェルの
余剰の結合部位をふさぐため25％ブロックエース（雪印
乳業社製）を含むＰＢＳを300μｌずつ分注し、少なく
とも４℃で 24時間処理した。次に、該プレートにバッ
ファーＥ(10％ブロックエース、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、
0.4Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび0.1％ＮａＮ3
を含む0.02Ｍリン酸緩衝液、pH7.0）50μｌおよびハイ
ブリドーマ培養上清50μｌを加え、室温４時間反応させ
た。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち、上記II−３で作製
したＨＲＰ標識化ｂｉｇＥＴ−２(22−37）〔１％ＢＳ
Ａ 0.4Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む0.02Ｍリン
酸緩衝液、pH７（バッファーＣ）で100倍希釈〕100μｌ
を加え、４℃で16時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄
したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルペ
ルオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD & PERRY LA
B,INC. フナコシ薬品（株）取扱い）を100μｌ加え、室
温で20分反応させた。１Ｍリン酸100μｌを加え、反応
を停止させたのち、450ｎｍの吸収をプレートリーダー
（ＭＴＰ−32,コロナ社製)で測定した。このようにし
て、ハイブリドーマの増殖が認められた全240ウェルの
上清を調べたところ、Ｎｏ．70，96，101および196のウ
ェルに強い抗体価が検出された。
ング ハイブリドーマ培養上清中の抗体価を以下の方法により
測定した。まず、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マ
イクロプレートを作製した。抗マウスイムノグロブリン
抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を 20μg／mｌ含む
0.1Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ 9.6溶液を 96ウェルマイクロプ
レートに 100μｌずつ分注し、４℃で24 時間放置し
た。次に、プレートをＰＢＳで洗浄したのち、ウェルの
余剰の結合部位をふさぐため25％ブロックエース（雪印
乳業社製）を含むＰＢＳを300μｌずつ分注し、少なく
とも４℃で 24時間処理した。次に、該プレートにバッ
ファーＥ(10％ブロックエース、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、
0.4Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび0.1％ＮａＮ3
を含む0.02Ｍリン酸緩衝液、pH7.0）50μｌおよびハイ
ブリドーマ培養上清50μｌを加え、室温４時間反応させ
た。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち、上記II−３で作製
したＨＲＰ標識化ｂｉｇＥＴ−２(22−37）〔１％ＢＳ
Ａ 0.4Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡを含む0.02Ｍリン
酸緩衝液、pH７（バッファーＣ）で100倍希釈〕100μｌ
を加え、４℃で16時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄
したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルペ
ルオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD & PERRY LA
B,INC. フナコシ薬品（株）取扱い）を100μｌ加え、室
温で20分反応させた。１Ｍリン酸100μｌを加え、反応
を停止させたのち、450ｎｍの吸収をプレートリーダー
（ＭＴＰ−32,コロナ社製)で測定した。このようにし
て、ハイブリドーマの増殖が認められた全240ウェルの
上清を調べたところ、Ｎｏ．70，96，101および196のウ
ェルに強い抗体価が検出された。
【００３０】（II−６）クローニング 抗体活性が陽性を示したＮｏ．70，96，101および196の
ウェルの各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニ
ングに付した。即ちハイブリドーマが 1.5個／ｍｌにな
るようＲＰＭＩ1640−20ＦＣＳに浮遊させ、96穴マイク
ロプレート(ヌンク社製)に１ウェル当り 0.2ｍｌずつ分
注した。分注する際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／
Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り５× 105個になるよう
に加えた。約１週間後には細胞の増殖が認められるよう
になり、上清中の抗体価を上記II−５記載のＥＩＡ法に
より調べたところ、Ｎo.70のハイブリドーマでは 30ク
ローン中12クローンが、Ｎｏ.96のハイブリドーマでは7
0クローン中６クローンが、Ｎｏ.101のハイブリドーマ
では30クローン中25クローンが抗体を産生していた。こ
れらのクローンのうち、ｂＥＴ−２０（No.70のクロー
ンに由来）、ｂＥＴ−２２（No.96のクローンに由来）
およびｂＥＴ−２４（No.101のクローンに由来）を選択
した。さらにNo. 196のハイブリドーマからは、３回の
クローニングののち、ｂＥＴ−２５クローンを選択し
た。
ウェルの各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニ
ングに付した。即ちハイブリドーマが 1.5個／ｍｌにな
るようＲＰＭＩ1640−20ＦＣＳに浮遊させ、96穴マイク
ロプレート(ヌンク社製)に１ウェル当り 0.2ｍｌずつ分
注した。分注する際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／
Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り５× 105個になるよう
に加えた。約１週間後には細胞の増殖が認められるよう
になり、上清中の抗体価を上記II−５記載のＥＩＡ法に
より調べたところ、Ｎo.70のハイブリドーマでは 30ク
ローン中12クローンが、Ｎｏ.96のハイブリドーマでは7
0クローン中６クローンが、Ｎｏ.101のハイブリドーマ
では30クローン中25クローンが抗体を産生していた。こ
れらのクローンのうち、ｂＥＴ−２０（No.70のクロー
ンに由来）、ｂＥＴ−２２（No.96のクローンに由来）
およびｂＥＴ−２４（No.101のクローンに由来）を選択
した。さらにNo. 196のハイブリドーマからは、３回の
クローニングののち、ｂＥＴ−２５クローンを選択し
た。
【００３１】（II−７）モノクローナル抗体のクラス・
サブクラスの決定 次に、培養上清を用いて、これらのクローンが産生する
モノクローナル抗体、ｂＥＴ−２０ａ、ｂＥＴ−２２
ａ、ｂＥＴ−２４ａおよびｂＥＴ−２５ａのクラス、サ
ブクラスを調べた。まずマイクロプレートに、ｂｉｇＥ
Ｔ−２(22−37）を物理吸着により固定した。即ちｂｉ
ｇＥＴ−２(22−37)を５μｇ／ｍｌの濃度で、0.1Ｍ炭
酸緩衝液、ｐＨ9.6に溶解し、100μｌずつ各ウェルに分
注した。４℃で１日放置したのち、ＰＢＳで洗浄し、上
記II−５で述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部
位をブロックエースでふさいだ。このようにして作製し
たｂｉｇＥＴ−２(22−37）結合マイクロプレートを用
いて、アイソタイプタイピングキット（ Mouse-Typer
（登録商標）Sub-Isotyping Kit バイオラッド社製）を
用いるエンザイム−リンクトイムノソーベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）によってクラス、サブクラスを調べた。
その結果ｂＥＴ−２０ａ、ｂＥＴ−２２ａ、ｂＥＴ−２
４ａおよびｂＥＴ−２５ａは全て、ＩgＧ１、κクラス
に属することが分かった。
サブクラスの決定 次に、培養上清を用いて、これらのクローンが産生する
モノクローナル抗体、ｂＥＴ−２０ａ、ｂＥＴ−２２
ａ、ｂＥＴ−２４ａおよびｂＥＴ−２５ａのクラス、サ
ブクラスを調べた。まずマイクロプレートに、ｂｉｇＥ
Ｔ−２(22−37）を物理吸着により固定した。即ちｂｉ
ｇＥＴ−２(22−37)を５μｇ／ｍｌの濃度で、0.1Ｍ炭
酸緩衝液、ｐＨ9.6に溶解し、100μｌずつ各ウェルに分
注した。４℃で１日放置したのち、ＰＢＳで洗浄し、上
記II−５で述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部
位をブロックエースでふさいだ。このようにして作製し
たｂｉｇＥＴ−２(22−37）結合マイクロプレートを用
いて、アイソタイプタイピングキット（ Mouse-Typer
（登録商標）Sub-Isotyping Kit バイオラッド社製）を
用いるエンザイム−リンクトイムノソーベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）によってクラス、サブクラスを調べた。
その結果ｂＥＴ−２０ａ、ｂＥＴ−２２ａ、ｂＥＴ−２
４ａおよびｂＥＴ−２５ａは全て、ＩgＧ１、κクラス
に属することが分かった。
【００３２】（II−８）大量のモノクローナル抗体の調
製 ミネラルオイル 0.5ｍｌを腹腔内投与されたマウス、あ
るいは未処置マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）にハイブリドーマ
ｂＥＴ−２０、ｂＥＴ−２２あるいはｂＥＴ−２４ １
〜３×106セル／匹を腹腔内注射したのち、10〜30日後
に抗体含有腹水を採取した。次に、ｂＥＴ−２０の腹水
から常法に従って、Protein Ａカラム（ＩＰＡ-300，Re
pligen 社製）によりモノクローナル抗体を精製した。
その結果、腹水１ｍｌより5.8ｍｇの抗体が精製され
た。
製 ミネラルオイル 0.5ｍｌを腹腔内投与されたマウス、あ
るいは未処置マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）にハイブリドーマ
ｂＥＴ−２０、ｂＥＴ−２２あるいはｂＥＴ−２４ １
〜３×106セル／匹を腹腔内注射したのち、10〜30日後
に抗体含有腹水を採取した。次に、ｂＥＴ−２０の腹水
から常法に従って、Protein Ａカラム（ＩＰＡ-300，Re
pligen 社製）によりモノクローナル抗体を精製した。
その結果、腹水１ｍｌより5.8ｍｇの抗体が精製され
た。
【００３３】実施例２．競合法−ＥＩＡ 上記II−５記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マ
イクロプレートに、バッファーＣで希釈した抗ｂｉｇＥ
Ｔ−２モノクローナル抗体含有培養上清50μｌ、および
各ｂｉｇＥＴ Ｃ端ペプチド（特開平２−238894号、特
願平２−194081号）を加え、室温で１時間反応させたの
ち、上記II−３記載ＨＲＰ標識化ｂｉｇＥＴ−２(22−3
7）（バッファーＣで100倍希釈)を加え、４℃で16時間
反応させた。抗ｂｉｇＥＴ−２モノクローナル抗体含有
培養上清の希釈倍数としては、ｂＥＴ−２０（×75)、
ｂＥＴ−２２（×20）、ｂＥＴ−２４（×15）およびｂ
ＥＴ−２５（×５）を用いた。結果を図１に示す。図
中、−●−がｂｉｇＥＴ−２(22−37）、−○−がｂｉ
ｇＥＴ−１(22−38）、−△−がｂｉｇＥＴ−３(22−4
2）および−□−がｂｉｇＥＴ−３(22−41）ＮＨ2を示
す。図１から、これらの抗体を用いることにより、約３
〜12ｎｇ／ｍｌ（約0.15ｎｇ〜0.6ｎｇ／ｗｅｌｌ）の
ｂｉｇＥＴ−２(22−37）を測定し得ることがわかる。
また、これらの抗体はｂｉｇＥＴ−１あるいはｂｉｇＥ
Ｔ−３のＣ端ペプチドとはほとんど交差反応しないこと
が明らかとなった。
イクロプレートに、バッファーＣで希釈した抗ｂｉｇＥ
Ｔ−２モノクローナル抗体含有培養上清50μｌ、および
各ｂｉｇＥＴ Ｃ端ペプチド（特開平２−238894号、特
願平２−194081号）を加え、室温で１時間反応させたの
ち、上記II−３記載ＨＲＰ標識化ｂｉｇＥＴ−２(22−3
7）（バッファーＣで100倍希釈)を加え、４℃で16時間
反応させた。抗ｂｉｇＥＴ−２モノクローナル抗体含有
培養上清の希釈倍数としては、ｂＥＴ−２０（×75)、
ｂＥＴ−２２（×20）、ｂＥＴ−２４（×15）およびｂ
ＥＴ−２５（×５）を用いた。結果を図１に示す。図
中、−●−がｂｉｇＥＴ−２(22−37）、−○−がｂｉ
ｇＥＴ−１(22−38）、−△−がｂｉｇＥＴ−３(22−4
2）および−□−がｂｉｇＥＴ−３(22−41）ＮＨ2を示
す。図１から、これらの抗体を用いることにより、約３
〜12ｎｇ／ｍｌ（約0.15ｎｇ〜0.6ｎｇ／ｗｅｌｌ）の
ｂｉｇＥＴ−２(22−37）を測定し得ることがわかる。
また、これらの抗体はｂｉｇＥＴ−１あるいはｂｉｇＥ
Ｔ−３のＣ端ペプチドとはほとんど交差反応しないこと
が明らかとなった。
【００３４】実施例３．サンドイッチ法−ＥＩＡ （１）ｂＥＴ−２０ａのＦ(ａｂ')2画分の調製 上記実施例II−７記載のｂＥＴ−２０ａをコロジオンバ
ッグ(エムエス機器社製）で7.5ｍｇ／ｍｌにまで濃縮し
たのち、0.1Ｍ ＮａＣｌを含む0.1Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．５）に対し透析した。該抗体溶液１ｍｌにペプシン
（シグマ社、２回結晶）0.19ｍｇを加え、37℃、20時間
反応させたのち、0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.8で平衡化
したスーパーロース12カラムを用いるＦＰＬＣ（ファル
マシア社製）でＦ(ａｂ')2画分を精製した。 （２）ＨＲＰ標識化ｂＥＴ−２０ａ Ｆ(ａｂ')2の作製 上記実施例３の（１）記載ｂＥＴ−２０ａ Ｆ(ａｂ')2
画分1.6ｍｇ（16n mole)／mｌ、１mｌにＧＭＢＳ、225n
moleを含むＤＭＦ50μｌを加え、室温で60分反応させ
た。反応液をセファデックスＧ−25カラム（１×30cm、
溶離液、0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.8）で分離し、得ら
れたマレイミド基の導入されたＦ(ａｂ')2画分と、上記
実施例１のII−３記載の方法により調製されたＳＨ基の
導入されたＨＲＰ5.5ｍｇとを混合し、コロジオンバッ
グで約0.3mｌにまで濃縮したのち、４℃で16時間放置し
た。反応液を溶離液に0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.5を用
いるウルトロゲルＡcＡ44カラム(10mmφ×40mm)に供
し、Ｆ(ａｂ')2−ＨＲＰ複合体画分を精製した。
ッグ(エムエス機器社製）で7.5ｍｇ／ｍｌにまで濃縮し
たのち、0.1Ｍ ＮａＣｌを含む0.1Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．５）に対し透析した。該抗体溶液１ｍｌにペプシン
（シグマ社、２回結晶）0.19ｍｇを加え、37℃、20時間
反応させたのち、0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.8で平衡化
したスーパーロース12カラムを用いるＦＰＬＣ（ファル
マシア社製）でＦ(ａｂ')2画分を精製した。 （２）ＨＲＰ標識化ｂＥＴ−２０ａ Ｆ(ａｂ')2の作製 上記実施例３の（１）記載ｂＥＴ−２０ａ Ｆ(ａｂ')2
画分1.6ｍｇ（16n mole)／mｌ、１mｌにＧＭＢＳ、225n
moleを含むＤＭＦ50μｌを加え、室温で60分反応させ
た。反応液をセファデックスＧ−25カラム（１×30cm、
溶離液、0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.8）で分離し、得ら
れたマレイミド基の導入されたＦ(ａｂ')2画分と、上記
実施例１のII−３記載の方法により調製されたＳＨ基の
導入されたＨＲＰ5.5ｍｇとを混合し、コロジオンバッ
グで約0.3mｌにまで濃縮したのち、４℃で16時間放置し
た。反応液を溶離液に0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.5を用
いるウルトロゲルＡcＡ44カラム(10mmφ×40mm)に供
し、Ｆ(ａｂ')2−ＨＲＰ複合体画分を精製した。
【００３５】（３）サンドイッチ法−ＥＩＡ サンドイッチ−ＥＩＡの固相用抗体として、ＥＴ−１の
Ｎ端部を認識するモノクローナル抗体で、ＥＴ−２とも
160％の交差反応性を示す、ＡｗＥＴＮ40〔ジャーナル
・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J. Immunol. Meth
ods)，118, 245(1989)，バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bioche
m. Biophys. Res. Commun., 164, 74(1989)〕を用い
た。精製したＡｗＥＴＮ40 20μｇ／ｍｌを含む 0.1Ｍ
炭酸緩衝液、ｐＨ 9.6溶液を 96ウェルマイクロプレー
トに100μｌずつ分注し、４℃で24時間放置した。ウェ
ルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエ
ース（雪印乳業社製、大日本製薬社販売 ）300μｌを加
え不活化した。以上のように調製したプレートにバッフ
ァーＥで希釈したｂｉｇＥＴ−２(1−37）、ｂｉｇＥＴ
−１(1−38）(ヒト)、ｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ
2（ペプチド研究所より購入）およびＥＴ−２（ペプチ
ド研究所より購入）標準液100μｌを加え、４℃で24時
間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例３の
（２）で作製したｂｉｇＥＴ−２(1−37）Ｆ（ａｂ’）
2−ＨＲＰ(バッファーＣで150倍希釈)100μｌを加え、
４℃で24時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記
実施例１のII−５記載の方法により固相上の酵素活性を
測定した。結果を図２に示す。図中、−●−がｂｉｇＥ
Ｔ−２(1−37）、−○−がｂｉｇＥＴ−１(1−38）（ヒ
ト）、−△−がｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ2、また−
▲−がＥＴ−２の標準曲線を示す。この測定法を用いる
ことにより、１ｐｇ／ｍｌ（0.1ｐｇ／ｗｅｌｌ）のｂ
ｉｇＥＴ−２(1−37）を、ｂｉｇＥＴ−１(1−38）ある
いはｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ2と0.1％以下の交差反
応性で検出し得ることが分った。即ち、本発明のｂｉｇ
ＥＴ−２(22−37）（ヒト）に対するモノクローナル抗
体と、ｂｉｇＥＴ−２(１−37）のＮ端部を認識するモ
ノクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫
学的測定法によりｂｉｇＥＴ−２(１−37）を、ｂｉｇ
ＥＴ−１(1−38）、ｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ2，Ｅ
Ｔ−２と交差反応することなく、極めて高感度に測定す
ることができる。
Ｎ端部を認識するモノクローナル抗体で、ＥＴ−２とも
160％の交差反応性を示す、ＡｗＥＴＮ40〔ジャーナル
・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J. Immunol. Meth
ods)，118, 245(1989)，バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bioche
m. Biophys. Res. Commun., 164, 74(1989)〕を用い
た。精製したＡｗＥＴＮ40 20μｇ／ｍｌを含む 0.1Ｍ
炭酸緩衝液、ｐＨ 9.6溶液を 96ウェルマイクロプレー
トに100μｌずつ分注し、４℃で24時間放置した。ウェ
ルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエ
ース（雪印乳業社製、大日本製薬社販売 ）300μｌを加
え不活化した。以上のように調製したプレートにバッフ
ァーＥで希釈したｂｉｇＥＴ−２(1−37）、ｂｉｇＥＴ
−１(1−38）(ヒト)、ｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ
2（ペプチド研究所より購入）およびＥＴ−２（ペプチ
ド研究所より購入）標準液100μｌを加え、４℃で24時
間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例３の
（２）で作製したｂｉｇＥＴ−２(1−37）Ｆ（ａｂ’）
2−ＨＲＰ(バッファーＣで150倍希釈)100μｌを加え、
４℃で24時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記
実施例１のII−５記載の方法により固相上の酵素活性を
測定した。結果を図２に示す。図中、−●−がｂｉｇＥ
Ｔ−２(1−37）、−○−がｂｉｇＥＴ−１(1−38）（ヒ
ト）、−△−がｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ2、また−
▲−がＥＴ−２の標準曲線を示す。この測定法を用いる
ことにより、１ｐｇ／ｍｌ（0.1ｐｇ／ｗｅｌｌ）のｂ
ｉｇＥＴ−２(1−37）を、ｂｉｇＥＴ−１(1−38）ある
いはｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ2と0.1％以下の交差反
応性で検出し得ることが分った。即ち、本発明のｂｉｇ
ＥＴ−２(22−37）（ヒト）に対するモノクローナル抗
体と、ｂｉｇＥＴ−２(１−37）のＮ端部を認識するモ
ノクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫
学的測定法によりｂｉｇＥＴ−２(１−37）を、ｂｉｇ
ＥＴ−１(1−38）、ｂｉｇＥＴ−３(1−41）ＮＨ2，Ｅ
Ｔ−２と交差反応することなく、極めて高感度に測定す
ることができる。
【００３６】実施例４．ヒト腎ガン細胞ＡＣＨＮの培養
上清中のｂｉｇＥＴ−２免疫活性の検出と同定 ヒト腎ガン細胞ＡＣＨＮはＥＴ−２を産生することが知
られている（フェブスレターズ（FEBS Lett.), 274, 13
6-140, 1990)。そこで、実施例３で作製したサンドイッ
チ−ＥＩＡを用いて、ＡＣＨＮの産生するｂｉｇＥＴ−
２免疫活性の検出と同定を行なった。ＡＣＨＮ細胞を１
０％のウシ胎児血清と非必須アミノ酸液（大日本製薬販
売）を含むイーグルミニマムエッセンシャルメディウム
中で培養し、コンフルエント２日後の培養上清４リット
ルを得た。該上清をゲル体積１．５ｍｌのＡｗＥＴＮ４
０結合固相〔３ｍｇのＡｗＥＴＮ４０を１ｇのＴｒｅｓ
ｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴＯＳＯＨ社製）に常法に
従い結合させたもの〕に供し、ＰＢＳ １０ ｍｌで洗浄
したのち、３ｍｌの蒸留水で洗浄し、１ｍｌの０．１％
ＴＦＡ含有６０％ＣＨ3ＣＮで溶出した。溶出液をＳｐ
ｅｅｄ Ｖａｃ（Ｓａｒｖａｎｔ社製）で濃縮し、逆相
−ＨＰＬＣで分析した。逆相−ＨＰＬＣの条件は以下の
通りである。カラムはＴＳＫ，ＯＤＳ−８０ＴＭ（４．
６×２５０ｍｍ，ＴＯＳＯＨ社製）、溶出条件はＡ液：
５％ＣＨ3ＣＮ，０．５％ＴＦＡ；Ｂ液：６０％ＣＨ3Ｃ
Ｎ，０．５％ＴＦＡであり、Ｂ液の割合を最初の５分間
で０から４０％に、次の２０分間で４０から６５％に、
さらに次の５分間に６５から１００％に上昇させ、１ｍ
ｌ／分の流速で溶出した。各分画（０．５ｍｌ）から一
部をとり、実施例３記載のサンドイッチ−ＥＩＡで測定
した。標準試料としてｂｉｇＥＴ−３（１−41）Ｎ
Ｈ2、ＥＴ−３、ｂｉｇＥＴ−１、ＥＴ−１、ｂｉｇＥ
Ｔ−２（１−３７）およびＥＴ−２（以上ペプチド研
製）、さらにｂｉｇＥＴ−２（１−３８）（特願平３−
１４３１２７号）を用い、その溶出位置を調べた。溶出
結果を図３に示す。ＡＣＨＮの培養上清には、ｂｉｇＥ
Ｔ−２免疫活性が検出され、その溶出位置から、その分
子種はｂｉｇＥＴ−２（１−３８）であることが明らか
になった。
上清中のｂｉｇＥＴ−２免疫活性の検出と同定 ヒト腎ガン細胞ＡＣＨＮはＥＴ−２を産生することが知
られている（フェブスレターズ（FEBS Lett.), 274, 13
6-140, 1990)。そこで、実施例３で作製したサンドイッ
チ−ＥＩＡを用いて、ＡＣＨＮの産生するｂｉｇＥＴ−
２免疫活性の検出と同定を行なった。ＡＣＨＮ細胞を１
０％のウシ胎児血清と非必須アミノ酸液（大日本製薬販
売）を含むイーグルミニマムエッセンシャルメディウム
中で培養し、コンフルエント２日後の培養上清４リット
ルを得た。該上清をゲル体積１．５ｍｌのＡｗＥＴＮ４
０結合固相〔３ｍｇのＡｗＥＴＮ４０を１ｇのＴｒｅｓ
ｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（ＴＯＳＯＨ社製）に常法に
従い結合させたもの〕に供し、ＰＢＳ １０ ｍｌで洗浄
したのち、３ｍｌの蒸留水で洗浄し、１ｍｌの０．１％
ＴＦＡ含有６０％ＣＨ3ＣＮで溶出した。溶出液をＳｐ
ｅｅｄ Ｖａｃ（Ｓａｒｖａｎｔ社製）で濃縮し、逆相
−ＨＰＬＣで分析した。逆相−ＨＰＬＣの条件は以下の
通りである。カラムはＴＳＫ，ＯＤＳ−８０ＴＭ（４．
６×２５０ｍｍ，ＴＯＳＯＨ社製）、溶出条件はＡ液：
５％ＣＨ3ＣＮ，０．５％ＴＦＡ；Ｂ液：６０％ＣＨ3Ｃ
Ｎ，０．５％ＴＦＡであり、Ｂ液の割合を最初の５分間
で０から４０％に、次の２０分間で４０から６５％に、
さらに次の５分間に６５から１００％に上昇させ、１ｍ
ｌ／分の流速で溶出した。各分画（０．５ｍｌ）から一
部をとり、実施例３記載のサンドイッチ−ＥＩＡで測定
した。標準試料としてｂｉｇＥＴ−３（１−41）Ｎ
Ｈ2、ＥＴ−３、ｂｉｇＥＴ−１、ＥＴ−１、ｂｉｇＥ
Ｔ−２（１−３７）およびＥＴ−２（以上ペプチド研
製）、さらにｂｉｇＥＴ−２（１−３８）（特願平３−
１４３１２７号）を用い、その溶出位置を調べた。溶出
結果を図３に示す。ＡＣＨＮの培養上清には、ｂｉｇＥ
Ｔ−２免疫活性が検出され、その溶出位置から、その分
子種はｂｉｇＥＴ−２（１−３８）であることが明らか
になった。
【００３７】実施例５．ヒト血漿中のｂｉｇＥＴ−２免
疫活性の検出と同定 健常人血漿３０ｍｌを以下のプロテアーゼ阻害剤を含む
等量のＰＢＳ（０．２ｍＭ ＰＭＳＦ，２μＭ Ｅ６４，
２μｇ／ｍｌペプチタチン，２μｇ／ｍｌロイペプチ
ン、２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０００ＫＩＵ／ｍｌアプロチ
ニンおよび０．６ｍＭホスホラミドン）で希釈した。次
に実施例４記載の方法により、ｂｉｇＥＴ−２免疫活性
をＡｗＥＴＮ４０結合固相により濃縮し、逆相−ＨＰＬ
Ｃで分析した。結果を図４に示す。健常人血漿中にもｂ
ｉｇＥＴ−２免疫活性が検出され、その主たる分子種は
ｂｉｇＥＴ−２（１−３８）であることが明らかとなっ
た。
疫活性の検出と同定 健常人血漿３０ｍｌを以下のプロテアーゼ阻害剤を含む
等量のＰＢＳ（０．２ｍＭ ＰＭＳＦ，２μＭ Ｅ６４，
２μｇ／ｍｌペプチタチン，２μｇ／ｍｌロイペプチ
ン、２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０００ＫＩＵ／ｍｌアプロチ
ニンおよび０．６ｍＭホスホラミドン）で希釈した。次
に実施例４記載の方法により、ｂｉｇＥＴ−２免疫活性
をＡｗＥＴＮ４０結合固相により濃縮し、逆相−ＨＰＬ
Ｃで分析した。結果を図４に示す。健常人血漿中にもｂ
ｉｇＥＴ−２免疫活性が検出され、その主たる分子種は
ｂｉｇＥＴ−２（１−３８）であることが明らかとなっ
た。
【００３８】
【効果】本発明のヒトビッグエンドセリン−２あるいは
そのＣ端ペプチドに結合性を有するモノクローナル抗体
を用いることにより、ビッグエンドセリン−１，ビッグ
エンドセリン−３やＥＴ−２と交差反応することなく、
極めて高感度にヒトビッグエンドセリン−２を測定する
ことができる。この測定法は、培養細胞およびヒト血漿
中のｂｉｇＥＴ−２を検出し得ることからｂｉｇＥＴ−
２の生理的、病態生理的役割の解明におおいに役立つも
のである。
そのＣ端ペプチドに結合性を有するモノクローナル抗体
を用いることにより、ビッグエンドセリン−１，ビッグ
エンドセリン−３やＥＴ−２と交差反応することなく、
極めて高感度にヒトビッグエンドセリン−２を測定する
ことができる。この測定法は、培養細胞およびヒト血漿
中のｂｉｇＥＴ−２を検出し得ることからｂｉｇＥＴ−
２の生理的、病態生理的役割の解明におおいに役立つも
のである。
【００３９】
配列番号：1 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １ 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp 20。
Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １ 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp 20。
【００４０】配列番号：2 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Ser Cys Ser Ser Trp Leu Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp 20。
【００４１】配列番号：3 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp 20。
【００４２】配列番号：4 配列の長さ：38 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly 20 25 30 Leu Gly Ser Pro Arg Ser 35。
【００４３】配列番号：5 配列の長さ：37 又は 38 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：37 他の情報:Xaa=Pro またはPro Arg 配列 Cys Ser Cys Ser Ser Trp Leu Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu Gln Thr Ala Pro Tyr Gly 20 25 30 Leu Gly Asn Pro Xaa 35。
【００４４】配列番号：6 配列の長さ：41 又は 42 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 存在位置：42 他の情報:Xaa=Gly-OH またはNH2 配列 Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly 20 25 30 Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Xaa 35 40。
【００４５】配列番号：7 配列の長さ：16 又は 17 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:Ｃ末端型フラグメント 配列の特徴： 存在位置：16 他の情報:Xaa=Pro またはPro Arg 配列 Val Asn Thr Pro Glu Gln Thr Ala Pro Tyr Gly Leu Gly Asn Pro Xaa 1 5 10 15。
【００４６】配列番号：8 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:Ｎ末端型フラグメント
【図１】モノクローナル抗ｂｉｇＥＴ−２(22−37）抗
体４種類を用いた競合法−ＥＩＡによる、ｂｉｇＥＴ−
２(22−37）（−●−）、ｂｉｇＥＴ−１(22−38）（−
○−）、ｂｉｇＥＴ−３(22−42）（−△−）、および
ｂｉｇＥＴ−３（22−41）ＮＨ2（−□−）の測定結果
を示している。
体４種類を用いた競合法−ＥＩＡによる、ｂｉｇＥＴ−
２(22−37）（−●−）、ｂｉｇＥＴ−１(22−38）（−
○−）、ｂｉｇＥＴ−３(22−42）（−△−）、および
ｂｉｇＥＴ−３（22−41）ＮＨ2（−□−）の測定結果
を示している。
【図２】ｂｉｇＥＴ−２のＮ端部に対する抗体と本発明
により得られたＣ端部に対する抗体を用いたサンドイッ
チ法−ＥＩＡによる、ｂｉｇＥＴ−２(１−37）（−●
−）、ｂｉｇＥＴ−１(１−38）（−○−）、ｂｉｇＥ
Ｔ−３（22−41）ＮＨ2（−△−）およびＥＴ−２（−
▲−）の測定結果を示している。
により得られたＣ端部に対する抗体を用いたサンドイッ
チ法−ＥＩＡによる、ｂｉｇＥＴ−２(１−37）（−●
−）、ｂｉｇＥＴ−１(１−38）（−○−）、ｂｉｇＥ
Ｔ−３（22−41）ＮＨ2（−△−）およびＥＴ−２（−
▲−）の測定結果を示している。
【図３】腎臓ガン細胞ＡＣＨＮの産生するｂｉｇＥＴ−
２免疫活性の、逆相−ＨＰＬＣによる分析および本発明
により得られたサンドイッチ−ＥＩＡによる検出結果を
示しており、ｂｉｇＥＴ−２(１−38）が主たる分子種
であることが明らかにされた。
２免疫活性の、逆相−ＨＰＬＣによる分析および本発明
により得られたサンドイッチ−ＥＩＡによる検出結果を
示しており、ｂｉｇＥＴ−２(１−38）が主たる分子種
であることが明らかにされた。
【図４】健常人血漿中ｂｉｇＥＴ−２免疫活性の、逆相
−ＨＰＬＣによる分析および本発明により得られたサン
ドイッチ−ＥＩＡによる検出結果を示しており、ｂｉｇ
ＥＴ−２(１−38）が主たる分子種であることが明らか
にされた。
−ＨＰＬＣによる分析および本発明により得られたサン
ドイッチ−ＥＩＡによる検出結果を示しており、ｂｉｇ
ＥＴ−２(１−38）が主たる分子種であることが明らか
にされた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (12)
- 【請求項１】ヒトビッグエンドセリン−２あるいはその
Ｃ端ペプチドに結合性を有するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】ヒトビッグエンドセリン−２が式 Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌu Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘａａ
（ただし、Ｘａａ＝ＰｒｏまたはＸａａ＝Ｐｒｏ Ａｒ
ｇである） のアミノ酸配列を有するものである、請求項１記載のモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項３】ヒトビッグエンドセリン−２に結合性を有
し、式 Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ のアミノ酸配列を有するエンドセリン−２と反応しな
い、請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】式 Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｘａａ（ただ
し、Ｘａａ＝ＰｒｏまたはＸａａ＝Ｐｒｏ Ａｒｇであ
る） で表わされるヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチ
ドに結合性を有する、請求項３記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項５】ｂＥＴ−２０ａである、請求項４記載のモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項６】ヒトビッグエンドセリン−２あるいはその
Ｃ端ペプチドに結合性を有するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - 【請求項７】ｂＥＴ−２０である、請求項６記載のハイ
ブリドーマ。 - 【請求項８】請求項６記載のハイブリドーマを培養する
ことを特徴とするヒトビッグエンドセリン−２あるいは
そのＣ端ペプチドに結合性を有するモノクローナル抗体
の製造法。 - 【請求項９】ヒトビッグエンドセリン−２に結合性を有
する抗体と、被検液および標識化ヒトビッグエンドセリ
ン−２あるいは標識化ヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ
端ペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化ヒトビッグエンドセリン−２あるいは標識化ヒトビ
ッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチドの割合を測定する
ことを特徴とする、被検液中のヒトビッグエンドセリン
−２あるいはそのＣ端ペプチドの定量法。 - 【請求項１０】担体上で不溶化したヒトビッグエンドセ
リン−２に結合性を有する抗体に被検液を接触させた
後、標識化されたヒトビッグエンドセリン−２に結合性
を有する抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性
を測定することを特徴とする、被検液中のヒトビッグエ
ンドセリン−２の定量法。 - 【請求項１１】担体上で不溶化したヒトビッグエンドセ
リン−２に結合性を有する抗体、および標識化されたヒ
トビッグエンドセリン−２に結合性を有する抗体の一方
がヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペプチドに結合性
を有するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗
体であり、他方がヒトビッグエンドセリン−２に結合性
を有するが、上記ヒトビッグエンドセリン−２ Ｃ端ペ
プチドとは反応しないポリクローナル抗体あるいはモノ
クローナル抗体である、請求項１０記載のヒトビッグエ
ンドセリン−２の定量法。 - 【請求項１２】担体上で不溶化したヒトビッグエンドセ
リン−２に結合性を有するが、ヒトビッグエンドセリン
−２ Ｃ端ペプチドと反応しないモノクローナル抗体
と、標識化されたｂＥＴ−２０ａとを用いる、請求項１
１記載のヒトビッグエンドセリン−２の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26368691A JP3194762B2 (ja) | 1990-10-12 | 1991-10-11 | モノクローナル抗体、その製造法および用途 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27215890 | 1990-10-12 | ||
| JP2-272158 | 1990-10-22 | ||
| JP2-282024 | 1990-10-22 | ||
| JP28202490 | 1990-10-22 | ||
| JP26368691A JP3194762B2 (ja) | 1990-10-12 | 1991-10-11 | モノクローナル抗体、その製造法および用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184388A true JPH05184388A (ja) | 1993-07-27 |
| JP3194762B2 JP3194762B2 (ja) | 2001-08-06 |
Family
ID=27335244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26368691A Expired - Fee Related JP3194762B2 (ja) | 1990-10-12 | 1991-10-11 | モノクローナル抗体、その製造法および用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3194762B2 (ja) |
-
1991
- 1991-10-11 JP JP26368691A patent/JP3194762B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3194762B2 (ja) | 2001-08-06 |
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