JP2003189854A - 抗体およびその用途 - Google Patents
抗体およびその用途Info
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- JP2003189854A JP2003189854A JP2002279091A JP2002279091A JP2003189854A JP 2003189854 A JP2003189854 A JP 2003189854A JP 2002279091 A JP2002279091 A JP 2002279091A JP 2002279091 A JP2002279091 A JP 2002279091A JP 2003189854 A JP2003189854 A JP 2003189854A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ＧＡＬＰまたはその誘導体が関与する疾患等
の治療剤、予防剤、診断剤の開発に有用なＧＡＬＰまた
はその誘導体に結合特異性を有する新規なモノクローナ
ル抗体および該抗体を用いたＧＡＬＰの定量法の提供。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に
反応する抗体および該抗体を用いたＧＡＬＰまたはその
誘導体の定量方法。
の治療剤、予防剤、診断剤の開発に有用なＧＡＬＰまた
はその誘導体に結合特異性を有する新規なモノクローナ
ル抗体および該抗体を用いたＧＡＬＰの定量法の提供。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に
反応する抗体および該抗体を用いたＧＡＬＰまたはその
誘導体の定量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、配列番号：１、配
列番号：２、または配列番号：３で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部
分ペプチドに結合特異性を有する抗体に関する。更に詳
しくは、抗原抗体反応に基づく配列番号：１、配列番
号：２、または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法の開発、
配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘
導体が関与する疾患の診断および予防・治療剤の開発な
どに有用な抗体に関する。
列番号：２、または配列番号：３で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部
分ペプチドに結合特異性を有する抗体に関する。更に詳
しくは、抗原抗体反応に基づく配列番号：１、配列番
号：２、または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはその誘導体の定量法の開発、
配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：３で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘
導体が関与する疾患の診断および予防・治療剤の開発な
どに有用な抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプターを通じて生体機能を調節
している。これらのレセプターの多くは共役しているグ
アニンヌクレオチド結合性タンパク質（guanine nucleo
tide-binding protein、以下Ｇタンパク質と略称する）
の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う。Ｇタン
パク質共役型レセプターであるガラニン・レセプター・
サブタイプ２（ＧＡＬＲ２）に対するペプチド性リガン
ドとして、ブタ型のリガンド、ヒト型のリガンドおよび
ラット型のリガンドが取得されており（特許文献１ 特
開２０００−１５７２７３号公報，ＷＯ ９９／４８９
２０号公報）、これらリガンドを、Galanin-like Pepti
de（ＧＡＬＰ）と略称することもある（非特許文献１
J. Biol. Chem. 274巻, 37041頁, 1999年）。ＧＡＬＰ
は、ガラニン・レセプターに結合するガラニンに比べて
ＧＡＬＲ２に強い親和性を示し、そのレセプターの分布
から幅広い生理作用を有することが推測される。ＧＡＬ
Ｐの生理的意義についてさらに詳細な研究が必要であ
る。
に存在する特異的なレセプターを通じて生体機能を調節
している。これらのレセプターの多くは共役しているグ
アニンヌクレオチド結合性タンパク質（guanine nucleo
tide-binding protein、以下Ｇタンパク質と略称する）
の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う。Ｇタン
パク質共役型レセプターであるガラニン・レセプター・
サブタイプ２（ＧＡＬＲ２）に対するペプチド性リガン
ドとして、ブタ型のリガンド、ヒト型のリガンドおよび
ラット型のリガンドが取得されており（特許文献１ 特
開２０００−１５７２７３号公報，ＷＯ ９９／４８９
２０号公報）、これらリガンドを、Galanin-like Pepti
de（ＧＡＬＰ）と略称することもある（非特許文献１
J. Biol. Chem. 274巻, 37041頁, 1999年）。ＧＡＬＰ
は、ガラニン・レセプターに結合するガラニンに比べて
ＧＡＬＲ２に強い親和性を示し、そのレセプターの分布
から幅広い生理作用を有することが推測される。ＧＡＬ
Ｐの生理的意義についてさらに詳細な研究が必要であ
る。
【特許文献１】特開２０００−１５７２７３号公報
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry 27
4巻, 37041頁, 1999年
4巻, 37041頁, 1999年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＧＡＬＰを簡便かつ高
感度に検出・定量する測定系が切望されていた。本発明
は、ＧＡＬＰまたはその誘導体を感度よく特異的に定量
することができる抗体（好ましくはモノクローナル抗
体）、該抗体を用いるＧＡＬＰまたはその誘導体の検出
・定量法、およびこれを用いた診断薬などを提供するこ
とを目的とする。
感度に検出・定量する測定系が切望されていた。本発明
は、ＧＡＬＰまたはその誘導体を感度よく特異的に定量
することができる抗体（好ましくはモノクローナル抗
体）、該抗体を用いるＧＡＬＰまたはその誘導体の検出
・定量法、およびこれを用いた診断薬などを提供するこ
とを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、［Ｃｙｓ43］
ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）を免疫原として、モノ
クローナル抗体を複数作製し、これらを組み合わせるこ
とにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体を高感度にかつ特
異的に検出し得る免疫測定法を開発した。即ち、keyhol
e limpet hemocyanin（キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン、以下ＫＬＨと記載する。）と［Ｃｙｓ43］ラ
ット型ＧＡＬＰ（４３−６０）との複合体を免疫原とし
てＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端部の部分ペプチドを
認識するモノクローナル抗体（例、ＧＲ−１Ｃａ）を得
た。これらの抗体は、パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
化した［Ｃｙｓ43］ラット型（４３−６０）を用いる競
合法免疫測定法では、ＧＡＬＰに対して極めて高い親和
性を示した。さらに、この抗体と、すでに開発したＧＡ
ＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的
に反応する抗体ＧＲ２−１Ｎａ（特開２０００−１５７
２７３号公報）とを組み合わせることにより、ＧＡＬＰ
に対して極めて高感度なサンドイッチ−免疫測定法を与
えることが明らかとなった。本発明により、ＧＡＬＰを
簡便にかつ高感度に測定することが可能となり、血液、
脳脊髄液および尿などの生体成分中のＧＡＬＰの変動を
測定することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体の生理
機能の解明に大いに役立つ。
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、［Ｃｙｓ43］
ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）を免疫原として、モノ
クローナル抗体を複数作製し、これらを組み合わせるこ
とにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体を高感度にかつ特
異的に検出し得る免疫測定法を開発した。即ち、keyhol
e limpet hemocyanin（キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン、以下ＫＬＨと記載する。）と［Ｃｙｓ43］ラ
ット型ＧＡＬＰ（４３−６０）との複合体を免疫原とし
てＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端部の部分ペプチドを
認識するモノクローナル抗体（例、ＧＲ−１Ｃａ）を得
た。これらの抗体は、パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
化した［Ｃｙｓ43］ラット型（４３−６０）を用いる競
合法免疫測定法では、ＧＡＬＰに対して極めて高い親和
性を示した。さらに、この抗体と、すでに開発したＧＡ
ＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的
に反応する抗体ＧＲ２−１Ｎａ（特開２０００−１５７
２７３号公報）とを組み合わせることにより、ＧＡＬＰ
に対して極めて高感度なサンドイッチ−免疫測定法を与
えることが明らかとなった。本発明により、ＧＡＬＰを
簡便にかつ高感度に測定することが可能となり、血液、
脳脊髄液および尿などの生体成分中のＧＡＬＰの変動を
測定することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導体の生理
機能の解明に大いに役立つ。
【０００５】本発明は、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ
端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましく
は、モノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞、該抗体およびハイブリドー
マ細胞の製造法、すでに開発したＧＡＬＰまたはその誘
導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体
（ＧＲ２−１Ｎa）と組み合わせたサンドイッチ法等に
よるＧＡＬＰおよびその誘導体の免疫測定法等を提供す
る。
端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましく
は、モノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞、該抗体およびハイブリドー
マ細胞の製造法、すでに開発したＧＡＬＰまたはその誘
導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体
（ＧＲ２−１Ｎa）と組み合わせたサンドイッチ法等に
よるＧＡＬＰおよびその誘導体の免疫測定法等を提供す
る。
【０００６】即ち、本発明は、(１）配列番号：１、配
列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部分
ペプチドに特異的に反応する抗体、(２）Ｃ端側の部分
ペプチドが、配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列の第４４番目〜第５３番
目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）記
載の抗体、(３）Ｃ端側の部分ペプチドが、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ
酸配列の第４０番目〜第６０番目、第４１番目〜第６０
番目、第４２番目〜第６０番目、第４３番目〜第６０番
目、第４４番目〜第６０番目、第４５番目〜第６０番
目、第４６番目〜第６０番目、第４７番目〜第６０番
目、第４８番目〜第６０番目、第４９番目〜第６０番
目、第５０番目〜第６０番目、第４４番目〜第５４番
目、第４５番目〜第５４番目、第４６番目〜第５４番
目、第４７番目〜第５４番目、第４８番目〜第５４番
目、第４９番目〜第５４番目または第５０番目〜第５４
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記
（１）記載の抗体、(４）標識化された上記（１）記載
の抗体、(５）モノクローナル抗体である上記（１）記
載の抗体、(６）ＧＲ−１Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８
２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る
ＧＲ−１Ｃａで標示される上記（５）記載のモノクロー
ナル抗体、(７）上記（５）記載のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞、(８）ＧＲ−１Ｃ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７６８２）で標示される上記（７）記載
のハイブリドーマ細胞、(９）上記（７）記載のハイブ
リドーマ細胞を生体内または生体外で培養し、その体液
または培養物から上記（５）記載のモノクローナル抗体
を採取することを特徴とする上記（５）記載のモノクロ
ーナル抗体の製造法、(１０）上記（１）記載の抗体を
含有してなる医薬、(１１）上記（１）記載の抗体を含
有してなる診断薬、(１２）上記（１）記載の抗体を用
いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２また
は配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドまたはその誘導体の定量法、(１３）上記（１）
記載の抗体と配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドま
たはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応
する抗体とを用いることを特徴とする被検液中の配列番
号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定
量法、(１４）（１）（i）担体上に不溶化した上記
（１）記載の抗体、（ii）標識化された配列番号：１、
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部
分ペプチドに特異的に反応する抗体、および（iii）被
検液を反応させた後、または（２）（i）担体上に不溶
化した配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそ
の誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗
体、（ii）標識化された上記（１）記載の抗体、および
（iii）被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤
の活性を測定する、被検液中の配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチまたはその誘導体の定量法、(１５）
（１）（i）担体上に不溶化した上記（６）記載のモノ
クローナル抗体、（ii）標識化されたＧＲ２−１Ｎ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示されるハイブリドーマ
細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで標示されるモノ
クローナル抗体および（iii）被検液を反応させた後、
または（２）（i）担体上に不溶化したＧＲ２−１Ｎ
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示されるハイブリド
ーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで標示される
モノクローナル抗体、（ii）標識化された上記（６）記
載のモノクローナル抗体、および（iii）被検液を反応
させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定する上記
（１４）記載の定量法、(１６）上記（１）記載の抗
体、被検液および標識化された配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはその誘導体とを競合的に反応さ
せ、該抗体に結合した標識化された配列番号：１、配列
番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはその誘導体の割合を測定する
ことを特徴とする、被検液中の配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、(１７）
上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番
号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体が関
与する疾患の診断法、(１８)上記（１）記載の抗体を用
いることを特徴とする肥満症、不妊症、膠原病またはリ
ウマチ性疾患の診断法などに関する。
列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部分
ペプチドに特異的に反応する抗体、(２）Ｃ端側の部分
ペプチドが、配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列の第４４番目〜第５３番
目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記（１）記
載の抗体、(３）Ｃ端側の部分ペプチドが、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ
酸配列の第４０番目〜第６０番目、第４１番目〜第６０
番目、第４２番目〜第６０番目、第４３番目〜第６０番
目、第４４番目〜第６０番目、第４５番目〜第６０番
目、第４６番目〜第６０番目、第４７番目〜第６０番
目、第４８番目〜第６０番目、第４９番目〜第６０番
目、第５０番目〜第６０番目、第４４番目〜第５４番
目、第４５番目〜第５４番目、第４６番目〜第５４番
目、第４７番目〜第５４番目、第４８番目〜第５４番
目、第４９番目〜第５４番目または第５０番目〜第５４
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記
（１）記載の抗体、(４）標識化された上記（１）記載
の抗体、(５）モノクローナル抗体である上記（１）記
載の抗体、(６）ＧＲ−１Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８
２）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る
ＧＲ−１Ｃａで標示される上記（５）記載のモノクロー
ナル抗体、(７）上記（５）記載のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞、(８）ＧＲ−１Ｃ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７６８２）で標示される上記（７）記載
のハイブリドーマ細胞、(９）上記（７）記載のハイブ
リドーマ細胞を生体内または生体外で培養し、その体液
または培養物から上記（５）記載のモノクローナル抗体
を採取することを特徴とする上記（５）記載のモノクロ
ーナル抗体の製造法、(１０）上記（１）記載の抗体を
含有してなる医薬、(１１）上記（１）記載の抗体を含
有してなる診断薬、(１２）上記（１）記載の抗体を用
いることを特徴とする配列番号：１、配列番号：２また
は配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドまたはその誘導体の定量法、(１３）上記（１）
記載の抗体と配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドま
たはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応
する抗体とを用いることを特徴とする被検液中の配列番
号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の定
量法、(１４）（１）（i）担体上に不溶化した上記
（１）記載の抗体、（ii）標識化された配列番号：１、
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部
分ペプチドに特異的に反応する抗体、および（iii）被
検液を反応させた後、または（２）（i）担体上に不溶
化した配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそ
の誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗
体、（ii）標識化された上記（１）記載の抗体、および
（iii）被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤
の活性を測定する、被検液中の配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチまたはその誘導体の定量法、(１５）
（１）（i）担体上に不溶化した上記（６）記載のモノ
クローナル抗体、（ii）標識化されたＧＲ２−１Ｎ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示されるハイブリドーマ
細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで標示されるモノ
クローナル抗体および（iii）被検液を反応させた後、
または（２）（i）担体上に不溶化したＧＲ２−１Ｎ
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示されるハイブリド
ーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで標示される
モノクローナル抗体、（ii）標識化された上記（６）記
載のモノクローナル抗体、および（iii）被検液を反応
させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定する上記
（１４）記載の定量法、(１６）上記（１）記載の抗
体、被検液および標識化された配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはその誘導体とを競合的に反応さ
せ、該抗体に結合した標識化された配列番号：１、配列
番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはその誘導体の割合を測定する
ことを特徴とする、被検液中の配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはその誘導体の定量法、(１７）
上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番
号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体が関
与する疾患の診断法、(１８)上記（１）記載の抗体を用
いることを特徴とする肥満症、不妊症、膠原病またはリ
ウマチ性疾患の診断法などに関する。
【０００７】本明細書におけるタンパク質（ポリペプチ
ド）は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端
（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で
ある。配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをはじ
めとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端が
カルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエス
テルの何れであってもよい。配列番号：１、配列番号：
２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド（以下、ＧＡＬＰと称することもある。）
としては、アミノ酸６０残基からなるラット型、ヒト
型、ブタ型のポリペプチドなどが挙げられる（以下、本
発明のペプチドと称することもある）。
ド）は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端
（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で
ある。配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをはじ
めとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端が
カルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエス
テルの何れであってもよい。配列番号：１、配列番号：
２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド（以下、ＧＡＬＰと称することもある。）
としては、アミノ酸６０残基からなるラット型、ヒト
型、ブタ型のポリペプチドなどが挙げられる（以下、本
発明のペプチドと称することもある）。
【０００８】本発明で用いられるＧＡＬＰの誘導体とし
ては、例えば、配列番号：１、配列番号：２または配列
番号：３で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基
が、置換可能な基によって置換されたもの、アミノ酸残
基の一部が欠失したもの、アミノ酸残基などが付加・挿
入されたものなどが挙げられる。配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドの誘導体の例としては、上記アミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個
程度、さらに好ましくは数個（１〜５個）、より好まし
くは、１、２または３個）のアミノ酸が欠失したもの、
上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、
１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さら
に好ましくは数個（１〜５個）、さらに好ましくは、
１、２または３個）のアミノ酸が付加したもの、上記
アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数個（１〜５個）、さらに好ましくは、１、２ま
たは３個）のアミノ酸が挿入されたもの、または上記
アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜
１０個程度、より好ましくは数個（１〜５個）、さらに
好ましくは、１、２または３個）のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されたものが挙げられる。
ては、例えば、配列番号：１、配列番号：２または配列
番号：３で表されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基
が、置換可能な基によって置換されたもの、アミノ酸残
基の一部が欠失したもの、アミノ酸残基などが付加・挿
入されたものなどが挙げられる。配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドの誘導体の例としては、上記アミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個
程度、さらに好ましくは数個（１〜５個）、より好まし
くは、１、２または３個）のアミノ酸が欠失したもの、
上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、
１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さら
に好ましくは数個（１〜５個）、さらに好ましくは、
１、２または３個）のアミノ酸が付加したもの、上記
アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数個（１〜５個）、さらに好ましくは、１、２ま
たは３個）のアミノ酸が挿入されたもの、または上記
アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜
１０個程度、より好ましくは数個（１〜５個）、さらに
好ましくは、１、２または３個）のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されたものが挙げられる。
【０００９】本発明で用いられるＧＡＬＰまたはその誘
導体のＮ端側の部分ペプチドまたはＣ端側の部分ペプチ
ドとしては、配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに
おいて、その一部のアミノ酸残基が欠失したもの、一部
のアミノ酸残基が置換可能な基（例、Ｃｙｓ、水酸基な
ど）によって置換されたもの、その一部のアミノ酸残基
が欠失し、かつ一部のアミノ酸残基が置換可能な基
（例、Ｃｙｓ、水酸基など）によって置換されたものな
ども挙げられる。
導体のＮ端側の部分ペプチドまたはＣ端側の部分ペプチ
ドとしては、配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに
おいて、その一部のアミノ酸残基が欠失したもの、一部
のアミノ酸残基が置換可能な基（例、Ｃｙｓ、水酸基な
ど）によって置換されたもの、その一部のアミノ酸残基
が欠失し、かつ一部のアミノ酸残基が置換可能な基
（例、Ｃｙｓ、水酸基など）によって置換されたものな
ども挙げられる。
【００１０】ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分
ペプチドの例としては、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ
端側の約４２〜５４残基が欠失したものが挙げられる。
より具体的には、該Ｃ端側の部分ペプチドとしては、配
列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表され
るアミノ酸配列の（i）第４０番目〜第６０番目のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）第４１番目〜第
６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ii
i）第４２番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、（iv）第４３番目〜第６０番目のアミノ酸
配列を有するポリペプチド、（v）第４４番目〜第６０
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（vi）第４
５番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、（vii）第４６番目〜第６０番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチド、（viii）第４７番目〜第６０番目
のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ix）第４８番
目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第４９番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、（xi）第５０番目〜第６０番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（xii）第４４番目〜第
５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xii
i）第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、（xiv）第４６番目〜第５４番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（xv）第４７番目〜第５
４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xvi）
第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、（xvii）第４９番目〜第５４番目のアミノ酸配
列を有するポリペプチド、（xviii）第５０番目〜第５
４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（xix）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基
（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものな
どが挙げられる。
ペプチドの例としては、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ
端側の約４２〜５４残基が欠失したものが挙げられる。
より具体的には、該Ｃ端側の部分ペプチドとしては、配
列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表され
るアミノ酸配列の（i）第４０番目〜第６０番目のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）第４１番目〜第
６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ii
i）第４２番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、（iv）第４３番目〜第６０番目のアミノ酸
配列を有するポリペプチド、（v）第４４番目〜第６０
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（vi）第４
５番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、（vii）第４６番目〜第６０番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチド、（viii）第４７番目〜第６０番目
のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ix）第４８番
目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第４９番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、（xi）第５０番目〜第６０番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（xii）第４４番目〜第
５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xii
i）第４５番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、（xiv）第４６番目〜第５４番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（xv）第４７番目〜第５
４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xvi）
第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、（xvii）第４９番目〜第５４番目のアミノ酸配
列を有するポリペプチド、（xviii）第５０番目〜第５
４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（xix）これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基
（例、１個）が置換可能な基によって置換されたものな
どが挙げられる。
【００１１】ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分
ペプチドの例としては、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ
端側の約４０〜５０残基が欠失したものが挙げられる。
Ｎ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の
（i）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、（ii）第１番目〜第５番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチド、（iii）第１番目〜第６番目のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第１番目〜第
７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（v）第
１番目〜第８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、（vi）第１番目〜第９番目のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、および（vii）これらのポリペプチドの
一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によっ
て置換されたものなどが挙げられる。
ペプチドの例としては、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ
端側の約４０〜５０残基が欠失したものが挙げられる。
Ｎ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の
（i）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、（ii）第１番目〜第５番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチド、（iii）第１番目〜第６番目のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第１番目〜第
７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（v）第
１番目〜第８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、（vi）第１番目〜第９番目のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、および（vii）これらのポリペプチドの
一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によっ
て置換されたものなどが挙げられる。
【００１２】本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、ＧＡＬＰ
またはその誘導体のＣ端側の部分ペプチド（好ましく
は、配列番号：２で表されるペプチドのＣ端側の部分ペ
プチド）に特異的に反応するものであればよい。このよ
うな抗体としては、配列番号：１、配列番号：２または
配列番号：３で表されるアミノ酸配列の（i）第４０番
目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第４１番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、（iii）第４２番目〜第６０番目のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第４３番目〜第
６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（v）
第４４番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、（vi）第４５番目〜第６０番目のアミノ酸配列
を有するポリペプチド、（vii）第４６番目〜第６０番
目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（viii）第４
７番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、（ix）第４８番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（x）第４９番目〜第６０番目のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、（xi）第５０番目〜
第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xi
i）第４４番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、（xiii）第４５番目〜第５４番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（xiv）第４６番目〜第
５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xv）
第４７番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、（xvi）第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配
列を有するポリペプチド、（xvii）第４９番目〜第５４
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xviii）
第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、および（xix）これらのポリペプチドの一部の
アミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換
されたものなどに特異的に反応する抗体が挙げられる。
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、ＧＡＬＰ
またはその誘導体のＣ端側の部分ペプチド（好ましく
は、配列番号：２で表されるペプチドのＣ端側の部分ペ
プチド）に特異的に反応するものであればよい。このよ
うな抗体としては、配列番号：１、配列番号：２または
配列番号：３で表されるアミノ酸配列の（i）第４０番
目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第４１番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、（iii）第４２番目〜第６０番目のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第４３番目〜第
６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（v）
第４４番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、（vi）第４５番目〜第６０番目のアミノ酸配列
を有するポリペプチド、（vii）第４６番目〜第６０番
目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（viii）第４
７番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、（ix）第４８番目〜第６０番目のアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（x）第４９番目〜第６０番目のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、（xi）第５０番目〜
第６０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xi
i）第４４番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、（xiii）第４５番目〜第５４番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（xiv）第４６番目〜第
５４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xv）
第４７番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、（xvi）第４８番目〜第５４番目のアミノ酸配
列を有するポリペプチド、（xvii）第４９番目〜第５４
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（xviii）
第５０番目〜第５４番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、および（xix）これらのポリペプチドの一部の
アミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基によって置換
されたものなどに特異的に反応する抗体が挙げられる。
【００１３】本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、モ
ノクローナル抗体がより好ましい。より具体的な本発明
のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに
特異的に反応する抗体としては、［Ｃｙｓ43］ラット型
ＧＡＬＰ（４３−６０）に特異的に反応する抗体などが
挙げられる。なお、［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４
３−６０）は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
第４３番目〜第６０番目までのアミノ酸配列であり、か
つこのアミノ酸配列の第４３番目をＣｙｓに置き換えた
アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このよ
うな抗体としては、さらにＧＡＬＰまたはその誘導体の
Ｃ端側の部分ペプチドに特異的に反応するが、Ｎ端側の
部分ペプチドには反応しない抗体がより好ましい。本発
明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチド
に特異的に反応する抗体の例としては、ＧＲ−１Ｃ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７６８２）で標示されるハイブリドーマ
細胞から産生され得るＧＲ−１Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体が挙げられる。このように、本発明のＧＡ
ＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的
に反応する抗体は、上記したＧＡＬＰまたはその誘導体
のＣ端側の特定のアミノ酸配列を認識することにより、
ＧＡＬＰまたはその誘導体と反応することができる。
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、モ
ノクローナル抗体がより好ましい。より具体的な本発明
のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに
特異的に反応する抗体としては、［Ｃｙｓ43］ラット型
ＧＡＬＰ（４３−６０）に特異的に反応する抗体などが
挙げられる。なお、［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４
３−６０）は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
第４３番目〜第６０番目までのアミノ酸配列であり、か
つこのアミノ酸配列の第４３番目をＣｙｓに置き換えた
アミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このよ
うな抗体としては、さらにＧＡＬＰまたはその誘導体の
Ｃ端側の部分ペプチドに特異的に反応するが、Ｎ端側の
部分ペプチドには反応しない抗体がより好ましい。本発
明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチド
に特異的に反応する抗体の例としては、ＧＲ−１Ｃ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−７６８２）で標示されるハイブリドーマ
細胞から産生され得るＧＲ−１Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体が挙げられる。このように、本発明のＧＡ
ＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的
に反応する抗体は、上記したＧＡＬＰまたはその誘導体
のＣ端側の特定のアミノ酸配列を認識することにより、
ＧＡＬＰまたはその誘導体と反応することができる。
【００１４】ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分
ペプチドに特異的に反応する抗体は、ＧＡＬＰまたはそ
の誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するも
のであればよい。このような抗体としては、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ
酸配列の（i）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ii）第１番目〜第５番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（iii）第１番目〜第６
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第１
番目〜第７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第１番目〜第８番目のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、（vi）第１番目〜第９番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチド、および（vii）これらのポリペプ
チドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基
によって置換されたものなどに特異的に反応する抗体が
挙げられる。本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、モ
ノクローナル抗体がより好ましい。より具体的な抗体と
しては、ラット型ＧＡＬＰ（１−９）（配列番号：１で
表されるアミノ酸配列の第１番目〜第９番目までのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド）に特異的に反応する抗
体が挙げられる。このような抗体としては、さらにＧＡ
ＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的
に反応するが、Ｃ端側の部分ペプチドには反応しない抗
体がより好ましい。ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側
の部分ペプチドに特異的に反応する抗体の例としては、
ＧＲ２−１Ｎ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示され
るハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａ
で標示されるモノクローナル抗体が挙げられる（特開２
０００−１５７２７３）。このように、ＧＡＬＰまたは
その誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する
抗体は、上記したＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の
特定のアミノ酸配列を認識することにより、ＧＡＬＰま
たはその誘導体と反応することができる。
ペプチドに特異的に反応する抗体は、ＧＡＬＰまたはそ
の誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するも
のであればよい。このような抗体としては、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ
酸配列の（i）第１番目〜第４番目のアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ii）第１番目〜第５番目のアミノ
酸配列を有するポリペプチド、（iii）第１番目〜第６
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（iv）第１
番目〜第７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第１番目〜第８番目のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、（vi）第１番目〜第９番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチド、および（vii）これらのポリペプ
チドの一部のアミノ酸残基（例、１個）が置換可能な基
によって置換されたものなどに特異的に反応する抗体が
挙げられる。本発明のＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、モ
ノクローナル抗体がより好ましい。より具体的な抗体と
しては、ラット型ＧＡＬＰ（１−９）（配列番号：１で
表されるアミノ酸配列の第１番目〜第９番目までのアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド）に特異的に反応する抗
体が挙げられる。このような抗体としては、さらにＧＡ
ＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的
に反応するが、Ｃ端側の部分ペプチドには反応しない抗
体がより好ましい。ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側
の部分ペプチドに特異的に反応する抗体の例としては、
ＧＲ２−１Ｎ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示され
るハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａ
で標示されるモノクローナル抗体が挙げられる（特開２
０００−１５７２７３）。このように、ＧＡＬＰまたは
その誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する
抗体は、上記したＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の
特定のアミノ酸配列を認識することにより、ＧＡＬＰま
たはその誘導体と反応することができる。
【００１５】以下に、ＧＡＬＰまたはその誘導体のＣ端
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（以下、本発
明の抗体と称することもある）の抗原の調製法、および
該抗体の製造法について説明する。
側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（以下、本発
明の抗体と称することもある）の抗原の調製法、および
該抗体の製造法について説明する。
【００１６】（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原として
は、例えばＧＡＬＰまたはその誘導体、ＧＡＬＰと同一
の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する合成ペプチ
ドなど何れのものも使用することができる（以下、これ
らを単にＧＡＬＰ抗原と称することもある）。ＧＡＬＰ
またはその誘導体は、（ａ）ヒト、サル、ラット、マウ
ス、ブタなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方
法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプ
チド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成
方法で化学的に合成、あるいは（ｃ）ＧＡＬＰまたはそ
の誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培
養することによって製造することができる。
は、例えばＧＡＬＰまたはその誘導体、ＧＡＬＰと同一
の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する合成ペプチ
ドなど何れのものも使用することができる（以下、これ
らを単にＧＡＬＰ抗原と称することもある）。ＧＡＬＰ
またはその誘導体は、（ａ）ヒト、サル、ラット、マウ
ス、ブタなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方
法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプ
チド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成
方法で化学的に合成、あるいは（ｃ）ＧＡＬＰまたはそ
の誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培
養することによって製造することができる。
【００１７】（ａ）該哺乳動物の組織または細胞からＧ
ＡＬＰ抗原を調製する場合は、その組織または細胞をホ
モジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を
行い、得られた抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラ
フィーを組み合わせることにより精製単離し、ＧＡＬＰ
抗原を調製できる。 （ｂ）ＧＡＬＰ抗原を化学的に合成する場合に用いられ
る、合成ペプチドとしては、例えば天然より精製したＧ
ＡＬＰ抗原と同一の構造を有するものや、ＧＡＬＰなど
のアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上
のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一の
アミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチド
などが挙げられる。 （ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて該ＧＡＬＰ
またはその誘導体を製造する場合、該ＤＮＡは、公知の
クローニング方法（例えば、Molecular Cloning（２nd
ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. P
ress, 1989）に記載の方法など）に従って作成すること
ができる。該クローニング方法とは、（１）ＧＡＬＰま
たはその誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤ
ＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡ
ライブラリーからハイブリダイゼーション法により該Ｇ
ＡＬＰまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を得る方法、または（２）該ＧＡＬＰまたは
その誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡ
プライマーを用い、ＰＣＲ法により該ＧＡＬＰまたはそ
の誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得
る方法などが挙げられる。
ＡＬＰ抗原を調製する場合は、その組織または細胞をホ
モジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を
行い、得られた抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラ
フィーを組み合わせることにより精製単離し、ＧＡＬＰ
抗原を調製できる。 （ｂ）ＧＡＬＰ抗原を化学的に合成する場合に用いられ
る、合成ペプチドとしては、例えば天然より精製したＧ
ＡＬＰ抗原と同一の構造を有するものや、ＧＡＬＰなど
のアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上
のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一の
アミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチド
などが挙げられる。 （ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて該ＧＡＬＰ
またはその誘導体を製造する場合、該ＤＮＡは、公知の
クローニング方法（例えば、Molecular Cloning（２nd
ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. P
ress, 1989）に記載の方法など）に従って作成すること
ができる。該クローニング方法とは、（１）ＧＡＬＰま
たはその誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤ
ＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡ
ライブラリーからハイブリダイゼーション法により該Ｇ
ＡＬＰまたはその誘導体をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を得る方法、または（２）該ＧＡＬＰまたは
その誘導体のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡ
プライマーを用い、ＰＣＲ法により該ＧＡＬＰまたはそ
の誘導体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得
る方法などが挙げられる。
【００１８】ＧＡＬＰ抗原としてのペプチドは、（１）
公知のペプチドの合成法に従って、または（２）配列番
号１：、配列番号：２または配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列を有するペプチドを適当なペプチダーゼで切
断することによって調製することができる。ペプチドの
合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいず
れによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る
部分ペプチド、またはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の
（i）または（ii）に記載された方法等が挙げられる。 （i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シ
ンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publish
ers, New York (1966年) （ii）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Pepti
de), Academic Press, New York (1965年) また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸
留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離す
ることができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体
である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換する
ことができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によ
って遊離体に変換することができる。
公知のペプチドの合成法に従って、または（２）配列番
号１：、配列番号：２または配列番号：３で表されるア
ミノ酸配列を有するペプチドを適当なペプチダーゼで切
断することによって調製することができる。ペプチドの
合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいず
れによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る
部分ペプチド、またはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の
（i）または（ii）に記載された方法等が挙げられる。 （i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シ
ンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publish
ers, New York (1966年) （ii）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Pepti
de), Academic Press, New York (1965年) また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸
留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離す
ることができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体
である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換する
ことができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によ
って遊離体に変換することができる。
【００１９】ペプチドのアミド体は、アミド形成に適し
た市販のペプチド合成用樹脂を用いて得ることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）
フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル
−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げる
られる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官
能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチド
の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮
合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと
同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得す
る。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−
ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護した
ペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目
的のペプチドを得ることもできる。
た市販のペプチド合成用樹脂を用いて得ることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）
フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル
−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げる
られる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官
能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチド
の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮
合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと
同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得す
る。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−
ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護した
ペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目
的のペプチドを得ることもできる。
【００２０】上記した保護されたアミノ酸の縮合に関し
ては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用い
ることができるが、カルボジイミド類が好ましく用いら
れる。このようなカルボジイミド類としてはＤＣＣ、
Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル
−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミ
ドなどが挙げられる。各種活性化試薬による活性化には
ラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔな
ど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加する
かまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるい
はＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミ
ノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができ
る。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用い
られる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうるこ
とが知られている溶媒から適宜選択されうる。そのよう
な溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリ
ドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムな
どのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールな
どのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホ
キシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、
テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリ
ル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、
酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混
合物などが保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合
に用いられる溶媒として用いられる。反応温度はペプチ
ド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲
から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲か
ら適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常
約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン
反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保
護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことによ
り十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることがで
きる。
ては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用い
ることができるが、カルボジイミド類が好ましく用いら
れる。このようなカルボジイミド類としてはＤＣＣ、
Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル
−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミ
ドなどが挙げられる。各種活性化試薬による活性化には
ラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔな
ど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加する
かまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるい
はＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミ
ノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができ
る。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用い
られる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうるこ
とが知られている溶媒から適宜選択されうる。そのよう
な溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリ
ドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムな
どのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールな
どのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホ
キシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、
テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリ
ル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、
酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混
合物などが保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合
に用いられる溶媒として用いられる。反応温度はペプチ
ド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲
から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲か
ら適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常
約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン
反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保
護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことによ
り十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることがで
きる。
【００２１】原料アミノ酸のアミノ基の保護基として
は、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシ
カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メト
キシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、
アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチ
ル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフ
ェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなど
が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たと
えばＣ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ 7-14
アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベン
ジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フ
ェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリ
チルヒドラジドなどが挙げられる。セリンおよびスレオ
ニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化
によって保護することができる。このエステル化に適す
る基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ1-6）ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル
化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。チ
ロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえ
ばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−
Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。ヒスチジン
のイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキ
シ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮ
Ｐ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが
挙げられる。原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］
などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられ
る。
は、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシ
カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メト
キシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、
アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチ
ル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフ
ェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなど
が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たと
えばＣ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ 7-14
アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベン
ジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フ
ェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリ
チルヒドラジドなどが挙げられる。セリンおよびスレオ
ニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化
によって保護することができる。このエステル化に適す
る基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ1-6）ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル
化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。チ
ロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえ
ばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−
Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。ヒスチジン
のイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキ
シ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮ
Ｐ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが
挙げられる。原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］
などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられ
る。
【００２２】保護基の除去（脱離）方法としては、たと
えばＰｄ−黒またはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での
水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メ
タンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリ
フルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理
や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、
ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体
アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。
上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の
温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェ
ノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾ
ール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオー
ル、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤
の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール
保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基は
チオフェノール処理により除去され、トリプトファンの
インドール保護基として用いられるホルミル基は上記の
１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール
などの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナ
トリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっ
ても除去される。原料の反応に関与すべきでない官能基
の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応
に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知
の手段から適宜選択しうる。
えばＰｄ−黒またはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での
水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メ
タンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリ
フルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理
や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、
ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体
アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。
上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の
温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェ
ノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾ
ール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオー
ル、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤
の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール
保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基は
チオフェノール処理により除去され、トリプトファンの
インドール保護基として用いられるホルミル基は上記の
１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール
などの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナ
トリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっ
ても除去される。原料の反応に関与すべきでない官能基
の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応
に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知
の手段から適宜選択しうる。
【００２３】ペプチドのアミド体を得る別の方法として
は、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシ
ル基をアミド化し、その後、アミノ基側にペプチド鎖を
所望の鎖長まで延ばした後に、該ペプチド鎖のＮ末端の
α−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端の
カルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（または
アミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したよう
な混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応
の詳細については上記と同様である。縮合により得られ
た保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての
保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができ
る。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精
製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドの
アミド体を得ることができる。ペプチドのエステル体を
得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基
を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした
後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドの
エステル体を得ることができる。
は、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシ
ル基をアミド化し、その後、アミノ基側にペプチド鎖を
所望の鎖長まで延ばした後に、該ペプチド鎖のＮ末端の
α−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端の
カルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（または
アミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したよう
な混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応
の詳細については上記と同様である。縮合により得られ
た保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての
保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができ
る。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精
製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドの
アミド体を得ることができる。ペプチドのエステル体を
得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基
を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした
後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドの
エステル体を得ることができる。
【００２４】ＧＡＬＰ抗原は、不溶化したものを直接免
疫することもできる。また、ＧＡＬＰ抗原を適当な担体
に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担
体（キャリアー）とＧＡＬＰ抗原（ハプテン）との混合
比は、担体に結合あるいは吸着させたＧＡＬＰ抗原に対
して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのよ
うな比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテ
ンに対する抗体の作製にあたり常用されている高分子担
体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で
使用することができる。このような高分子担体として
は、天然の高分子担体や合成の高分子担体が挙げられ
る。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、
ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウ
サギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウ
サギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、Ｋ
ＨＬヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体
としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポ
リアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの
重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用い
ることができる。また、ハプテンとキャリアーのカプリ
ングには、種々の縮合剤を用いることができる。縮合剤
としては、例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトフ
ァンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニ
ウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビ
トなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイ
ソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール
基同士を架橋するＮ,Ｎ'-ｏ-フェニレンジマレイミドな
どのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋
するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボ
キシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都
合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際に
も、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エ
ステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還
元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基
にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導
入後、両者を反応させることもできる。
疫することもできる。また、ＧＡＬＰ抗原を適当な担体
に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担
体（キャリアー）とＧＡＬＰ抗原（ハプテン）との混合
比は、担体に結合あるいは吸着させたＧＡＬＰ抗原に対
して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのよ
うな比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテ
ンに対する抗体の作製にあたり常用されている高分子担
体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で
使用することができる。このような高分子担体として
は、天然の高分子担体や合成の高分子担体が挙げられ
る。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、
ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウ
サギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウ
サギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、Ｋ
ＨＬヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体
としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポ
リアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの
重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用い
ることができる。また、ハプテンとキャリアーのカプリ
ングには、種々の縮合剤を用いることができる。縮合剤
としては、例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトフ
ァンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニ
ウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビ
トなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイ
ソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール
基同士を架橋するＮ,Ｎ'-ｏ-フェニレンジマレイミドな
どのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋
するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボ
キシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都
合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際に
も、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エ
ステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還
元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基
にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導
入後、両者を反応させることもできる。
【００２５】（２）モノクローナル抗体の作製
ＧＡＬＰ抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注
入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体
産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈
剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高める
ため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイント
アジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週
毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物と
しては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウ
ス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられる
が、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用い
られる。
入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体
産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈
剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高める
ため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイント
アジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週
毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物と
しては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウ
ス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられる
が、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用い
られる。
【００２６】モノクローナル抗体の作製に際しては、Ｇ
ＡＬＰ抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗ＧＡ
ＬＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する
ことができる。血清中の抗ＧＡＬＰ抗体価の測定は、例
えば後記の標識化ＧＡＬＰと抗血清とを反応させた後、
抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなさ
れる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６、４９５
（１９７５）〕に従い実施できる。融合促進剤として
は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられ、好ましくはＰＥＧなどが用いられ
る。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、
ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられ、Ｐ３Ｕ１などが
好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜
２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１００
０〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加
され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通
常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。
ＡＬＰ抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗ＧＡ
ＬＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する
ことができる。血清中の抗ＧＡＬＰ抗体価の測定は、例
えば後記の標識化ＧＡＬＰと抗血清とを反応させた後、
抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなさ
れる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６、４９５
（１９７５）〕に従い実施できる。融合促進剤として
は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられ、好ましくはＰＥＧなどが用いられ
る。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、
ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられ、Ｐ３Ｕ１などが
好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細
胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜
２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１００
０〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加
され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通
常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。
【００２７】抗ＧＡＬＰ抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングには種々の方法が使用できるが、例えばＧＡ
ＬＰまたはその誘導体またはそれらの部分ペプチドを直
接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロ
プレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放
射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合した抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体
を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテイ
ンＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加
し、放射性物質や酵素などで標識したＧＡＬＰを加え、
固相に結合したＧＡＬＰモノクローナル抗体を検出する
方法などが挙げられる。抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体
のスクリーニング、育種は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２
０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１
６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗ＧＡＬＰ抗体価の測定と同様に
して測定できる。
リーニングには種々の方法が使用できるが、例えばＧＡ
ＬＰまたはその誘導体またはそれらの部分ペプチドを直
接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロ
プレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放
射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合した抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体
を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテイ
ンＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加
し、放射性物質や酵素などで標識したＧＡＬＰを加え、
固相に結合したＧＡＬＰモノクローナル抗体を検出する
方法などが挙げられる。抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体
のスクリーニング、育種は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２
０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１
６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗ＧＡＬＰ抗体価の測定と同様に
して測定できる。
【００２８】抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体の分離精製
は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫
グロブリンの分離精製法（例、塩析法、アルコール沈殿
法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、Ｄ
ＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原
結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧな
どの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離さ
せて抗体を得る特異的精製法など）に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生
体内または生体外で培養し、その体液または培養物から
抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造する
ことができる。ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部
分ペプチドに特異的に反応する抗体は、上記の製造法に
準じて製造でき、あるいは、公知の方法、例えば特開２
０００−１５７２７３号公報に記載の方法に従っても製
造できる。
は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫
グロブリンの分離精製法（例、塩析法、アルコール沈殿
法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、Ｄ
ＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原
結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧな
どの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離さ
せて抗体を得る特異的精製法など）に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生
体内または生体外で培養し、その体液または培養物から
抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造する
ことができる。ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部
分ペプチドに特異的に反応する抗体は、上記の製造法に
準じて製造でき、あるいは、公知の方法、例えば特開２
０００−１５７２７３号公報に記載の方法に従っても製
造できる。
【００２９】本発明の抗体は、ヒト型ＧＡＬＰ、ラット
型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬＰまたはそれらの誘導体
を感度良く定量することができる。以下に、ＧＡＬＰま
たはその誘導体の定量法（免疫測定法）など、本発明の
抗体の用途について、詳細に説明する。 （１）ＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法 本発明の抗体を用いることにより、ＧＡＬＰの測定ある
いは組織染色などによる検出を行なうことができる。こ
れらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、ま
た抗体分子のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'あるいはＦａｂ画
分などを用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定法
は、特に制限されるものではなく、被測定液中の抗原量
（例えば、ＧＡＬＰ量）に対応した抗体、抗原もしくは
抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により
検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製
し算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いても
よい。このような測定法としては、例えば、サンドイッ
チ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーな
どが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンド
イッチ法、競合法がより好ましく、特にサンドイッチ法
が好ましい。
型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬＰまたはそれらの誘導体
を感度良く定量することができる。以下に、ＧＡＬＰま
たはその誘導体の定量法（免疫測定法）など、本発明の
抗体の用途について、詳細に説明する。 （１）ＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法 本発明の抗体を用いることにより、ＧＡＬＰの測定ある
いは組織染色などによる検出を行なうことができる。こ
れらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、ま
た抗体分子のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'あるいはＦａｂ画
分などを用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定法
は、特に制限されるものではなく、被測定液中の抗原量
（例えば、ＧＡＬＰ量）に対応した抗体、抗原もしくは
抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により
検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製
し算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いても
よい。このような測定法としては、例えば、サンドイッ
チ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーな
どが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンド
イッチ法、競合法がより好ましく、特にサンドイッチ法
が好ましい。
【００３０】（１）サンドイッチ法
サンドイッチ法は、担体上に不溶化した本発明の抗体、
標識化された本発明の抗体および被検液を反応させた
後、標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧＡ
ＬＰまたはその誘導体を定量する定量法である。サンド
イッチ法として、好ましくは、（i）担体上に不溶化し
たＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに
特異的に反応する抗体、標識化されたＧＡＬＰまたはそ
の誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗
体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定す
ることを特徴とする被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導
体の定量法、（ii）担体上に不溶化したＧＡＬＰまたは
その誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する
抗体、標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側
の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を
反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とす
る被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法などが
挙げられる。さらに好ましいサンドイッチ法として、
（iii）ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプ
チドに特異的に反応する抗体が、ＧＲ２−１Ｎａで標示
されるモノクローナル抗体であり、ＧＡＬＰまたはその
誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体
が、ＧＲ−１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体であ
る上記（i）または（ii）の定量法が挙げられる。
標識化された本発明の抗体および被検液を反応させた
後、標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧＡ
ＬＰまたはその誘導体を定量する定量法である。サンド
イッチ法として、好ましくは、（i）担体上に不溶化し
たＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに
特異的に反応する抗体、標識化されたＧＡＬＰまたはそ
の誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗
体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定す
ることを特徴とする被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導
体の定量法、（ii）担体上に不溶化したＧＡＬＰまたは
その誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する
抗体、標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側
の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を
反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とす
る被検液中のＧＡＬＰまたはその誘導体の定量法などが
挙げられる。さらに好ましいサンドイッチ法として、
（iii）ＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプ
チドに特異的に反応する抗体が、ＧＲ２−１Ｎａで標示
されるモノクローナル抗体であり、ＧＡＬＰまたはその
誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体
が、ＧＲ−１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体であ
る上記（i）または（ii）の定量法が挙げられる。
【００３１】サンドイッチ法においては、不溶化したＧ
ＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異
的に反応する抗体またはＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ
端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体に被検液を
反応（１次反応）させ、さらに標識化されたＧＡＬＰま
たはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応
する抗体またはＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部
分ペプチドに特異的に反応する抗体を反応（２次反応）
させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること
により、被検液中のＧＡＬＰ量を定量することができ
る。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間
をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方
法は、前記のそれらに準じることができる。また、サン
ドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体ある
いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類であ
る必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類
以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法に
よるＧＡＬＰの測定法においては、例えば、１次反応で
用いられる抗体がＧＡＬＰまたたその誘導体のＣ端側の
部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる
抗体はＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｎ端側）を認
識する抗体が好ましく、１次反応で用いられる抗体がＧ
ＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドを認識
する場合は、２次反応で用いられる抗体は、Ｎ端側の部
分ペプチド以外（即ち、Ｃ端側）を認識する抗体が好ま
しく用いられる。このような抗体の具体例としては、
［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）を免疫原
として作製したモノクローナル抗体と、ＧＡＬＰ（１−
９）を免疫原として作製したモノクローナル抗体とが用
いられる。これらの抗体は、西洋ワサビパーオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）で標識化されて用いられることが好まし
い。
ＡＬＰまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異
的に反応する抗体またはＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ
端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体に被検液を
反応（１次反応）させ、さらに標識化されたＧＡＬＰま
たはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応
する抗体またはＧＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部
分ペプチドに特異的に反応する抗体を反応（２次反応）
させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること
により、被検液中のＧＡＬＰ量を定量することができ
る。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間
をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方
法は、前記のそれらに準じることができる。また、サン
ドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体ある
いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類であ
る必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類
以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法に
よるＧＡＬＰの測定法においては、例えば、１次反応で
用いられる抗体がＧＡＬＰまたたその誘導体のＣ端側の
部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる
抗体はＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｎ端側）を認
識する抗体が好ましく、１次反応で用いられる抗体がＧ
ＡＬＰまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドを認識
する場合は、２次反応で用いられる抗体は、Ｎ端側の部
分ペプチド以外（即ち、Ｃ端側）を認識する抗体が好ま
しく用いられる。このような抗体の具体例としては、
［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）を免疫原
として作製したモノクローナル抗体と、ＧＡＬＰ（１−
９）を免疫原として作製したモノクローナル抗体とが用
いられる。これらの抗体は、西洋ワサビパーオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）で標識化されて用いられることが好まし
い。
【００３２】（２）競合法
競合法は、本発明の抗体、被検液および標識化されたＧ
ＡＬＰまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体
に結合した標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体の割
合を測定することにより、被検液中のＧＡＬＰまたはそ
の誘導体を定量する定量法である。競合法による被検液
中のＧＡＬＰまたはその誘導体を定量は、例えば、固相
化法を用いて行うことが好ましい。固相化法の具体例と
しては、抗マウスＩｇＧ抗体（ICN/CAPPEL社製）を固相
化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレート
に、（i）本発明の抗体（例、ＧＲ−１Ｃａ）、（ii）
ＨＲＰで標識化された配列番号：１、配列番号：２また
は配列番号：３で表わされるペプチド、および（iii）
被検液を添加し、反応後、固相に吸着したＨＲＰ活性を
測定し、ＧＡＬＰまたはその誘導体を定量する方法が挙
げられる。
ＡＬＰまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体
に結合した標識化されたＧＡＬＰまたはその誘導体の割
合を測定することにより、被検液中のＧＡＬＰまたはそ
の誘導体を定量する定量法である。競合法による被検液
中のＧＡＬＰまたはその誘導体を定量は、例えば、固相
化法を用いて行うことが好ましい。固相化法の具体例と
しては、抗マウスＩｇＧ抗体（ICN/CAPPEL社製）を固相
化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレート
に、（i）本発明の抗体（例、ＧＲ−１Ｃａ）、（ii）
ＨＲＰで標識化された配列番号：１、配列番号：２また
は配列番号：３で表わされるペプチド、および（iii）
被検液を添加し、反応後、固相に吸着したＨＲＰ活性を
測定し、ＧＡＬＰまたはその誘導体を定量する方法が挙
げられる。
【００３３】（３）イムノメトリック法
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原
とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反
応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中
の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明
の抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。
とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反
応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中
の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明
の抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。
【００３４】（４）ネフロメトリー
ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体
反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検
液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られな
い場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメ
トリーなどが好適に用いられる。
反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検
液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られな
い場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメ
トリーなどが好適に用いられる。
【００３５】上記（１）〜（４）の定量法において、標
識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、特
に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、
蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素
としては、特に限定されるものではないが、例えば［
125Ｉ］、［131Ｉ］、［3Ｈ］、［14Ｃ］などが好まし
い。上記酵素としては、特に限定されるものではない
が、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−
ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素
などが挙げられる。上記蛍光物質としては、特に限定さ
れるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオ
レッセンイソチオシアネートなどが挙げられる。上記発
光物質としては、特に限定されるものではないが、例え
ばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシ
ゲニンなどが挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結
合には、ビオチン−アビジン系の化合物を用いることも
できる。
識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、特
に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、
蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素
としては、特に限定されるものではないが、例えば［
125Ｉ］、［131Ｉ］、［3Ｈ］、［14Ｃ］などが好まし
い。上記酵素としては、特に限定されるものではない
が、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−
ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素
などが挙げられる。上記蛍光物質としては、特に限定さ
れるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオ
レッセンイソチオシアネートなどが挙げられる。上記発
光物質としては、特に限定されるものではないが、例え
ばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシ
ゲニンなどが挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結
合には、ビオチン−アビジン系の化合物を用いることも
できる。
【００３６】抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、
物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例
えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなど
の合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例
えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなど
の合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
【００３７】これら個々の免疫学的測定法を本発明法に
適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必
要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操
作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧＡＬＰまた
はその誘導体の測定系を構築すればよい。これらの一般
的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照
することができる（例えば、入江 寛編「ラジオイムノ
アッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunoc
hemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immuno
chemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immun
ochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immu
nochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay M
ethods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Technique
s(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antib
odies)）（以上、アカデミックプレス社発行）など参
照）。以上のように、本発明の抗体は、ＧＡＬＰまたは
その誘導体を感度良く定量することができ、ＧＡＬＰの
生理機能の解明およびＧＡＬＰが関与する疾患・症状の
予防・治療や診断に有用である。
適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必
要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操
作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧＡＬＰまた
はその誘導体の測定系を構築すればよい。これらの一般
的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照
することができる（例えば、入江 寛編「ラジオイムノ
アッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunoc
hemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immuno
chemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immun
ochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immu
nochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay M
ethods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Technique
s(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antib
odies)）（以上、アカデミックプレス社発行）など参
照）。以上のように、本発明の抗体は、ＧＡＬＰまたは
その誘導体を感度良く定量することができ、ＧＡＬＰの
生理機能の解明およびＧＡＬＰが関与する疾患・症状の
予防・治療や診断に有用である。
【００３８】ＧＡＬＰは、血中ＬＨ濃度の特異的な上昇
作用（ＬＨ分泌促進作用）を有し、その反応性はレプチ
ンレセプターに異常が見られるZucker fattyラットにお
いて亢進する。本発明の抗体を用いて体液中（血液、血
漿、血清、尿など）に含まれるＧＡＬＰまたはその誘導
体の量を測定することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導
体が関与する疾患〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患
（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経
症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全な
ど）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前
立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ
産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、
膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性
硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、
結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性
関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、
血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬
化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病な
ど〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血
症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血
症、代謝性アルカローシスなど）など〕などを診断する
ことができる。また、本発明の抗体は、体液や組織など
の被検体中に存在するＧＡＬＰまたはその誘導体を検出
するためにも使用することができる。また、ＧＡＬＰま
たはその誘導体を精製するために使用する抗体カラムの
作製、精製時の各分画中のＧＡＬＰまたはその誘導体の
検出、被検細胞内におけるＧＡＬＰまたはその誘導体の
挙動の分析などのために使用することもできる。
作用（ＬＨ分泌促進作用）を有し、その反応性はレプチ
ンレセプターに異常が見られるZucker fattyラットにお
いて亢進する。本発明の抗体を用いて体液中（血液、血
漿、血清、尿など）に含まれるＧＡＬＰまたはその誘導
体の量を測定することにより、ＧＡＬＰまたはその誘導
体が関与する疾患〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患
（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経
症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全な
ど）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前
立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ
産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、
膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性
硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、
結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性
関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、
血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬
化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病な
ど〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血
症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血
症、代謝性アルカローシスなど）など〕などを診断する
ことができる。また、本発明の抗体は、体液や組織など
の被検体中に存在するＧＡＬＰまたはその誘導体を検出
するためにも使用することができる。また、ＧＡＬＰま
たはその誘導体を精製するために使用する抗体カラムの
作製、精製時の各分画中のＧＡＬＰまたはその誘導体の
検出、被検細胞内におけるＧＡＬＰまたはその誘導体の
挙動の分析などのために使用することもできる。
【００３９】（２）本発明の抗体を含有してなる医薬
上述のとおり、本発明の抗体は、例えば、ＧＡＬＰまた
はその誘導体が関与する疾患〔例、ＬＨ分泌不全に関係
する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難
症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能
不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺
癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣
癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾
患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症
（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウ
マチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患
（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰
瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎
炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵
抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低
ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、
高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕な
どの予防・治療剤または診断剤などの医薬として使用す
ることができる。
はその誘導体が関与する疾患〔例、ＬＨ分泌不全に関係
する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難
症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能
不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺
癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣
癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾
患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症
（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウ
マチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患
（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰
瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎
炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵
抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低
ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、
高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕な
どの予防・治療剤または診断剤などの医薬として使用す
ることができる。
【００４０】本発明の抗体を含有してなる予防・治療剤
は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤
型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して非経口的または経口的に投与することがで
きる。本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、
または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に
用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびそ
の塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦
形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成
物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供さ
れる。非経口投与のための組成物としては、例えば、注
射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注
射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を
包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従
って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、
上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられ
る無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化
することによって調製できる。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、
アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非
イオン界面活性剤（例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−
５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogen
ated castor oil））等と併用してもよい。油性液とし
ては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助
剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併
用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに
充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤
は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合す
ることによって調製されても良い。
は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤
型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して非経口的または経口的に投与することがで
きる。本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、
または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に
用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびそ
の塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦
形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成
物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供さ
れる。非経口投与のための組成物としては、例えば、注
射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注
射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を
包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従
って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、
上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられ
る無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化
することによって調製できる。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、
アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非
イオン界面活性剤（例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−
５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogen
ated castor oil））等と併用してもよい。油性液とし
ては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助
剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併
用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに
充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤
は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合す
ることによって調製されても良い。
【００４１】経口投与のための組成物としては、固体ま
たは液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコ
ーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル
剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸
濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法に
よって製造され、製剤分野において通常用いられる担
体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤
用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、
蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
たは液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコ
ーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル
剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸
濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法に
よって製造され、製剤分野において通常用いられる担
体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤
用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、
蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００４２】上記の非経口用または経口用医薬組成物
は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形
に調製されることが好都合である。このような投薬単位
の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注
射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量と
しては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、
とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形
では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されている
ことが好ましい。なお前記した各組成物は、上記抗体と
の配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の
活性成分を含有してもよい。
は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形
に調製されることが好都合である。このような投薬単位
の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注
射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量と
しては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、
とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形
では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されている
ことが好ましい。なお前記した各組成物は、上記抗体と
の配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の
活性成分を含有してもよい。
【００４３】本発明の抗体を含有する予防・治療剤また
は診断剤（医薬）の投与量は、投与対象、対象疾患、症
状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人の
肥満症の治療のために使用する場合には、本発明の抗体
を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程
度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さら
に好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１
〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射に
より投与するのが好都合である。他の非経口投与（例、
皮下投与）および経口投与の場合もこれに準ずる量を投
与することができる。症状が特に重い場合には、その症
状に応じて増量してもよい。
は診断剤（医薬）の投与量は、投与対象、対象疾患、症
状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人の
肥満症の治療のために使用する場合には、本発明の抗体
を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程
度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さら
に好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１
〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射に
より投与するのが好都合である。他の非経口投与（例、
皮下投与）および経口投与の場合もこれに準ずる量を投
与することができる。症状が特に重い場合には、その症
状に応じて増量してもよい。
【００４４】本発明の明細書において、アミノ酸等を略
号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemic
al Nomenclature による略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミ
ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しな
ければＬ−体を示すものとする。 ＰＡＭ ：フェニルアセタミドメチル Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｆｍｏｃ ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｂг−Ｚ ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ−Ｂｚｌ：２−クロロ−ベンジル ＯｃＨｅｘ ：シクロヘキシルエステル ＯＢｚｌ ：ベンジルエステル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＨＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミ ド ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３−ヒドロキシ−３,４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベ ンゾトリアジン ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｔｒｔ ：トリチル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＤＭＦ ：Ｎ,Ｎ−ジメチルフォルムアミド ＤＣＭ ：ジクロロメタン ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン ＣＨＯ ：ホルミル Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン
号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemic
al Nomenclature による略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミ
ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しな
ければＬ−体を示すものとする。 ＰＡＭ ：フェニルアセタミドメチル Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｆｍｏｃ ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｂг−Ｚ ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ−Ｂｚｌ：２−クロロ−ベンジル ＯｃＨｅｘ ：シクロヘキシルエステル ＯＢｚｌ ：ベンジルエステル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＨＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミ ド ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３−ヒドロキシ−３,４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベ ンゾトリアジン ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｔｒｔ ：トリチル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＤＭＦ ：Ｎ,Ｎ−ジメチルフォルムアミド ＤＣＭ ：ジクロロメタン ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン ＣＨＯ ：ホルミル Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン
【００４５】本明細書において用いられる配列番号は、
以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。 〔配列番号：１〕ラット型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表
す。 〔配列番号：２〕ヒト型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表
す。 〔配列番号：３〕ブタ型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表
す。 〔配列番号：４〕免疫原ペプチドのアミノ酸配列（ラッ
ト型ＧＡＬＰ（４３−６０）の４３番目のアミノ酸残基
をシステインに変えたもの。［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡ
ＬＰ（４３−６０）とも記載する。）を表す。
以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。 〔配列番号：１〕ラット型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表
す。 〔配列番号：２〕ヒト型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表
す。 〔配列番号：３〕ブタ型ＧＡＬＰのアミノ酸配列を表
す。 〔配列番号：４〕免疫原ペプチドのアミノ酸配列（ラッ
ト型ＧＡＬＰ（４３−６０）の４３番目のアミノ酸残基
をシステインに変えたもの。［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡ
ＬＰ（４３−６０）とも記載する。）を表す。
【００４６】後述の実施例で得られたハイブリドーマ細
胞のうち、ＧＲ−１Ｃは、平成１３（２００１）年７月
３１日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８２として寄託されている。抗
ＧＡＬＰ抗体を産生するハイブリドーマ細胞のうち、Ｇ
Ｒ２−１Ｎは、平成１１（１９９９）年３月１７日か
ら、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２として寄託されてい
る。なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体につ
いては細胞名の後に「ａ」を付けた形で表す。
胞のうち、ＧＲ−１Ｃは、平成１３（２００１）年７月
３１日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８２として寄託されている。抗
ＧＡＬＰ抗体を産生するハイブリドーマ細胞のうち、Ｇ
Ｒ２−１Ｎは、平成１１（１９９９）年３月１７日か
ら、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２として寄託されてい
る。なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体につ
いては細胞名の後に「ａ」を付けた形で表す。
【００４７】
【実施例】以下に、実験例および実施例を示し、本発明
をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定
するものではない。以下の実験例および実施例で、使用
したペプチドである［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４
３−６０）は、アメリカンペプチド社において定法によ
り合成されたものを購入した。ラット型ＧＡＬＰおよび
ブタ型ＧＡＬＰは、既報に基づき、リコンビナントＧＡ
ＬＰを作製した（Journal of The Chemical Society-Pe
rkin Transactions、2000年、1号、〜1335頁）。ヒト型
ＧＡＬＰは、PHOENIX PHARMACEUTICALS,INC社より購入
した。
をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定
するものではない。以下の実験例および実施例で、使用
したペプチドである［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４
３−６０）は、アメリカンペプチド社において定法によ
り合成されたものを購入した。ラット型ＧＡＬＰおよび
ブタ型ＧＡＬＰは、既報に基づき、リコンビナントＧＡ
ＬＰを作製した（Journal of The Chemical Society-Pe
rkin Transactions、2000年、1号、〜1335頁）。ヒト型
ＧＡＬＰは、PHOENIX PHARMACEUTICALS,INC社より購入
した。
【００４８】実験例１
配列番号：４で表されるラット型ＧＡＬＰ（４４−６
０）を含む免疫原［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３
−６０）の作製 [Cys43]ラット型GALP(43-60)とKLHとの複合体を作製
し、免疫原とした。すなわち、KLH 20 mgを、0.1M リン
酸緩衝液（pH6.5）1.4 mlに溶解させ、N-(γ-マレイミ
ドブチリロキシ)サクシニミド（GMBS）2.2 mg（8μmo
l）を含むDMF溶液100μlと混合し、室温で40分反応させ
た。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画した
のち、マレイミド基の導入されたKLH 15 mgと[Cys43]ラ
ット型GALP(43-60) 3.9 mgとを混合し、4℃で1日間反応
させた。反応後、生理食塩水に対し、4℃で2日間透析し
た。
０）を含む免疫原［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３
−６０）の作製 [Cys43]ラット型GALP(43-60)とKLHとの複合体を作製
し、免疫原とした。すなわち、KLH 20 mgを、0.1M リン
酸緩衝液（pH6.5）1.4 mlに溶解させ、N-(γ-マレイミ
ドブチリロキシ)サクシニミド（GMBS）2.2 mg（8μmo
l）を含むDMF溶液100μlと混合し、室温で40分反応させ
た。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画した
のち、マレイミド基の導入されたKLH 15 mgと[Cys43]ラ
ット型GALP(43-60) 3.9 mgとを混合し、4℃で1日間反応
させた。反応後、生理食塩水に対し、4℃で2日間透析し
た。
【００４９】実験例２
免疫
6〜8週令のBALB/C雌マウスに、実験例１で得られた[Cys
43]ラット型GALP（43-60）-KLH複合体を、約60μg/匹と
なるよう、完全フロイントアジュバントとともに皮下免
疫した。以後3週間おきに同量の免疫原を不完全フロイ
ントアジュバントとともに2〜3回追加免疫した。
43]ラット型GALP（43-60）-KLH複合体を、約60μg/匹と
なるよう、完全フロイントアジュバントとともに皮下免
疫した。以後3週間おきに同量の免疫原を不完全フロイ
ントアジュバントとともに2〜3回追加免疫した。
【００５０】実験例３
西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化［Ｃｙｓ
43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）の作製 [Cys43]ラット型GALP(43-60)とHRP（酵素免疫測定法
用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免
疫測定法（EIA）の標識体とした。すなわち、HRP6.7 mg
（168nmol）を0.95 mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）に
溶解させ、GMBS 0.47 mg（1.65μmol）を含むＤＭＦ溶
液50μlと混合し、室温で30分間反応させたのち、セフ
ァデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして
作製した、マレイミド基の導入されたHRP 5.0 mg（117n
mol）と[Cys43]ラット型GALP(43-60)0.74 mg（352nmo
l）とを混合し、4℃で1日反応させた。反応後ウルトロ
ゲルAcA44（LKB-ファルマシア社製）カラムで分画し、H
RP標識化ラット型GALP(43-60)を得た。
43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）の作製 [Cys43]ラット型GALP(43-60)とHRP（酵素免疫測定法
用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免
疫測定法（EIA）の標識体とした。すなわち、HRP6.7 mg
（168nmol）を0.95 mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）に
溶解させ、GMBS 0.47 mg（1.65μmol）を含むＤＭＦ溶
液50μlと混合し、室温で30分間反応させたのち、セフ
ァデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして
作製した、マレイミド基の導入されたHRP 5.0 mg（117n
mol）と[Cys43]ラット型GALP(43-60)0.74 mg（352nmo
l）とを混合し、4℃で1日反応させた。反応後ウルトロ
ゲルAcA44（LKB-ファルマシア社製）カラムで分画し、H
RP標識化ラット型GALP(43-60)を得た。
【００５１】実験例４
［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）−ＫＬＨ
複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 [Cys43]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体を3週間間隔で2
回免疫を行い、その1週間後に眼底採血を行い血液を採
取した。さらに血液を、4℃で12,000rpmで15分遠心した
後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下
記の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗
体結合マイクロプレートを作製するため、まず、抗マウ
スイムノグロブリン抗体（IgG画分、カッペル社製）を1
00μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェル
マイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放
置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PB
S、pH7.4）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位を
ふさぐため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を含む
PBSを300μlずつ分注し、4℃で少なくとも24時間処理し
た。このようにして得られた抗マウスイムノグロブリン
抗体結合マイクロプレートの各ウェルにバッファーＣ
（1％BSA、0.4M NaCl、0.05％ 2mM EDTA・Na（エチレン
ジアミン四酢酸塩二水和物：Ethylenediamine-N,N,N',
N'-tetraacetic acid,disodium salt, dihydrate, DOJI
NDO社）を含む0.02Mリン酸緩衝液、pH7.0）50μl、およ
びバッファーＣで希釈した複合体に対する抗血清100μl
を加え、4℃で16時間反応させた。次に、該プレートをP
BSで洗浄したのち、実験例３で作製したHRP標識化[Cys
43]ラット型GALP(43-60)（バッファーＣで300倍希釈）1
00μlを加え、室温で1日反応させた。次に、該プレート
をPBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性をTMBマイクロ
ウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD&PER
RY LAB, INC、フナコシ薬品取り扱い）100μlを加え室
温で10分間反応させた。反応を1Mリン酸100μlを加え停
止させたのち、450nmの吸収をプレートリーダー（BICHR
OMATIC、大日本製薬社製）で測定した。得られた吸収ス
ペクトルを図１に示す。図１中、（−◇−）は、マウス
Ｎｏ．１（１ａ）、（−□−）は、マウスＮｏ．２（２
ａ）、（−△−）は、マウスＮｏ．３（３ａ）、（−○
−）は、マウスＮｏ．４（４ａ）、（−◆−）は、マウ
スＮｏ．５（５ａ）、（−■−）は、マウスＮｏ．６
（６ａ）、（−▲−）は、マウスＮｏ．７（７ａ）、
（−●−）は、マウスＮｏ．８（８ａ）を表す。１ａ〜
８ａは、８匹のマウス由来の抗体を表す。図１によれ
ば、免疫した８匹のマウスの全ての複合体に対する抗血
清中に［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）に
対する抗体価の上昇が認められたことがわかる。
複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 [Cys43]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体を3週間間隔で2
回免疫を行い、その1週間後に眼底採血を行い血液を採
取した。さらに血液を、4℃で12,000rpmで15分遠心した
後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下
記の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗
体結合マイクロプレートを作製するため、まず、抗マウ
スイムノグロブリン抗体（IgG画分、カッペル社製）を1
00μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェル
マイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放
置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PB
S、pH7.4）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位を
ふさぐため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を含む
PBSを300μlずつ分注し、4℃で少なくとも24時間処理し
た。このようにして得られた抗マウスイムノグロブリン
抗体結合マイクロプレートの各ウェルにバッファーＣ
（1％BSA、0.4M NaCl、0.05％ 2mM EDTA・Na（エチレン
ジアミン四酢酸塩二水和物：Ethylenediamine-N,N,N',
N'-tetraacetic acid,disodium salt, dihydrate, DOJI
NDO社）を含む0.02Mリン酸緩衝液、pH7.0）50μl、およ
びバッファーＣで希釈した複合体に対する抗血清100μl
を加え、4℃で16時間反応させた。次に、該プレートをP
BSで洗浄したのち、実験例３で作製したHRP標識化[Cys
43]ラット型GALP(43-60)（バッファーＣで300倍希釈）1
00μlを加え、室温で1日反応させた。次に、該プレート
をPBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性をTMBマイクロ
ウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD&PER
RY LAB, INC、フナコシ薬品取り扱い）100μlを加え室
温で10分間反応させた。反応を1Mリン酸100μlを加え停
止させたのち、450nmの吸収をプレートリーダー（BICHR
OMATIC、大日本製薬社製）で測定した。得られた吸収ス
ペクトルを図１に示す。図１中、（−◇−）は、マウス
Ｎｏ．１（１ａ）、（−□−）は、マウスＮｏ．２（２
ａ）、（−△−）は、マウスＮｏ．３（３ａ）、（−○
−）は、マウスＮｏ．４（４ａ）、（−◆−）は、マウ
スＮｏ．５（５ａ）、（−■−）は、マウスＮｏ．６
（６ａ）、（−▲−）は、マウスＮｏ．７（７ａ）、
（−●−）は、マウスＮｏ．８（８ａ）を表す。１ａ〜
８ａは、８匹のマウス由来の抗体を表す。図１によれ
ば、免疫した８匹のマウスの全ての複合体に対する抗血
清中に［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）に
対する抗体価の上昇が認められたことがわかる。
【００５２】実施例１
抗［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６０）モノク
ローナル抗体の作製 図１を参照し、[Cys43]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体
を免疫したマウス由来のハイブリドーマの抗体産生細胞
株の選択の例として、抗体6aと抗体7aを与えるマウスN
o.6とNo.7を選択した。抗体6aと抗体7aを与えるマウス
に対して100〜150μgの免疫原を生理食塩水0.1mlに溶解
させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行
なった。最終免疫3〜4日後のマウスから脾臓を摘出し、
ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニ
マム・エッセンシャルメディウム（MEM）に浮遊させ、
脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、
BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3-X63.Ag8.U1（P3U
1）を用いた（Current Topics in Microbiology and Im
nology、81巻、１頁、1978年）。細胞融合は、原法（Na
ture、256巻、495頁、1975年）に準じて行なった。すな
わち、脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ、血清を含有しな
いMEMで3度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5：1にな
るよう混合して、800回転で15分間遠心分離を行ない、
細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽
くほぐし、45％ポリエチレングリコール（PEG）6000
（コッホライト社製）を0.3 ml加え、37℃温水槽中で7
分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分2 ml
の割合でMEMを添加し、合計15 mlのMEMを加えた後600回
転15分間遠心分離して上清を除去した。この細胞沈殿物
を10％牛胎児血清を含有するGITメディウム（和光純
薬）(GIT-10％ FCS）に、P3U1が1ml当り2×105個になる
ように浮遊し、24穴マルチディッシュ（リンブロ社製）
に1ウェルあたり1 mlずつ192ウェルに播種した。播種
後、細胞を37℃、5％炭酸ガスインキュベーター中で培
養した。24時間後、HAT（ヒポキサンチン 1×10-4M、ア
ミノプテリン 4×10-7M、チミジン 1.6×10-3M）を含ん
だGIT-10％ FCS培地（HAT培地）を1ウェル当り1 mlずつ
添加することにより、HAT選択培養を開始した。HAT選択
培養は、培養開始3、6および9日後に旧液を1 ml捨てた
後、1 mlのHAT培地を添加することにより継続した。ハ
イブリドーマの増殖は、細胞融合後9〜14日で認めら
れ、培養液が黄変したとき（約1×106セル/ml）、上清
を採取し、実験例４に記載の方法に従って抗体価を測定
した。抗体6aと抗体7aを与える[Cys43]ラット型GALP(43
-60)-KLH複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマ
が、抗体を産生している状態を図２に示した。得られた
抗体産生ハイブリドーマの中から下記の計５種類のハイ
ブリドーマを選択した（表１）。これらのうちでも、特
に大きな抗体価を与えた（吸光度が大きかった）ハイブ
リードーマNo.1およびNo.2を、それぞれGR-1CおよびGR-
2Cと命名した。
ローナル抗体の作製 図１を参照し、[Cys43]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体
を免疫したマウス由来のハイブリドーマの抗体産生細胞
株の選択の例として、抗体6aと抗体7aを与えるマウスN
o.6とNo.7を選択した。抗体6aと抗体7aを与えるマウス
に対して100〜150μgの免疫原を生理食塩水0.1mlに溶解
させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行
なった。最終免疫3〜4日後のマウスから脾臓を摘出し、
ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニ
マム・エッセンシャルメディウム（MEM）に浮遊させ、
脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、
BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3-X63.Ag8.U1（P3U
1）を用いた（Current Topics in Microbiology and Im
nology、81巻、１頁、1978年）。細胞融合は、原法（Na
ture、256巻、495頁、1975年）に準じて行なった。すな
わち、脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ、血清を含有しな
いMEMで3度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5：1にな
るよう混合して、800回転で15分間遠心分離を行ない、
細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽
くほぐし、45％ポリエチレングリコール（PEG）6000
（コッホライト社製）を0.3 ml加え、37℃温水槽中で7
分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分2 ml
の割合でMEMを添加し、合計15 mlのMEMを加えた後600回
転15分間遠心分離して上清を除去した。この細胞沈殿物
を10％牛胎児血清を含有するGITメディウム（和光純
薬）(GIT-10％ FCS）に、P3U1が1ml当り2×105個になる
ように浮遊し、24穴マルチディッシュ（リンブロ社製）
に1ウェルあたり1 mlずつ192ウェルに播種した。播種
後、細胞を37℃、5％炭酸ガスインキュベーター中で培
養した。24時間後、HAT（ヒポキサンチン 1×10-4M、ア
ミノプテリン 4×10-7M、チミジン 1.6×10-3M）を含ん
だGIT-10％ FCS培地（HAT培地）を1ウェル当り1 mlずつ
添加することにより、HAT選択培養を開始した。HAT選択
培養は、培養開始3、6および9日後に旧液を1 ml捨てた
後、1 mlのHAT培地を添加することにより継続した。ハ
イブリドーマの増殖は、細胞融合後9〜14日で認めら
れ、培養液が黄変したとき（約1×106セル/ml）、上清
を採取し、実験例４に記載の方法に従って抗体価を測定
した。抗体6aと抗体7aを与える[Cys43]ラット型GALP(43
-60)-KLH複合体を免疫したマウス由来のハイブリドーマ
が、抗体を産生している状態を図２に示した。得られた
抗体産生ハイブリドーマの中から下記の計５種類のハイ
ブリドーマを選択した（表１）。これらのうちでも、特
に大きな抗体価を与えた（吸光度が大きかった）ハイブ
リードーマNo.1およびNo.2を、それぞれGR-1CおよびGR-
2Cと命名した。
【００５３】
【表１】
【００５４】次に、これらのハイブリドーマを限界希釈
法によるクローニングに付した。クローニングに際して
は、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞をウ
ェル当り5×105個になるように加えた。クローニング
後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル0.5
mlを腹腔内投与されたマウス（BALB/C）に1〜3×106セル/
匹を腹腔内投与したのち、6〜20日後に抗体含有腹水を
採取した。モノクローナル抗体は、得られた腹水よりプ
ロテイン−Ａカラムにより精製した。即ち、腹水6〜20
mlを等量の結合緩衝液〔3.5M NaCl、0.05％ NaN3を含む
1.5Mグリシン（pH9.0）〕で希釈したのち、あらかじめ
結合緩衝液で平衡化したプロテイン−Ａ−アガロース
（生化学工業社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝
液〔（0.05％ NaN3を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.
0）〕で溶出した。溶出液をPBSに対して4℃、2日間透析
したのち、0.22μmのフィルター（ミリポア社製）によ
り除菌濾過し、4℃あるいは-80℃で保存した。モノクロ
ーナル抗体のクラス・サブクラスの決定に際しては、精
製モノクローナル抗体結合固相を用いる酵素標識免疫測
定法（エンザイム−リンクトイムノソーベントアッセ
イ：ELISA）を行った。すなわち、抗体2μg/mlを含む0.
1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェルマイクロフ゜レートに100μl
ずつ分注し、4℃で24時間放置した。実験例４に記載の
方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエー
スでふさいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mou
se-TyperTM Sub-Isotyping Kit、バイオラッド社製）を
用いるELISAによって固相化抗体のクラス、サブクラス
を調べた。
法によるクローニングに付した。クローニングに際して
は、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞をウ
ェル当り5×105個になるように加えた。クローニング
後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル0.5
mlを腹腔内投与されたマウス（BALB/C）に1〜3×106セル/
匹を腹腔内投与したのち、6〜20日後に抗体含有腹水を
採取した。モノクローナル抗体は、得られた腹水よりプ
ロテイン−Ａカラムにより精製した。即ち、腹水6〜20
mlを等量の結合緩衝液〔3.5M NaCl、0.05％ NaN3を含む
1.5Mグリシン（pH9.0）〕で希釈したのち、あらかじめ
結合緩衝液で平衡化したプロテイン−Ａ−アガロース
（生化学工業社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝
液〔（0.05％ NaN3を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.
0）〕で溶出した。溶出液をPBSに対して4℃、2日間透析
したのち、0.22μmのフィルター（ミリポア社製）によ
り除菌濾過し、4℃あるいは-80℃で保存した。モノクロ
ーナル抗体のクラス・サブクラスの決定に際しては、精
製モノクローナル抗体結合固相を用いる酵素標識免疫測
定法（エンザイム−リンクトイムノソーベントアッセ
イ：ELISA）を行った。すなわち、抗体2μg/mlを含む0.
1M炭酸緩衝液（pH9.6）溶液を96ウェルマイクロフ゜レートに100μl
ずつ分注し、4℃で24時間放置した。実験例４に記載の
方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエー
スでふさいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mou
se-TyperTM Sub-Isotyping Kit、バイオラッド社製）を
用いるELISAによって固相化抗体のクラス、サブクラス
を調べた。
【００５５】実施例２
競合法酵素免疫測定法（競合法−ＥＩＡ）
[Cys43]ラット型GALP(43-60)-KLH複合体を免疫原として
作製したモノクローナル抗体の反応特異性を以下の方法
により調べた。まず、モノクローナル抗体GR-1Caおよび
GR-2Ca溶液の抗体価を実験例４記載の方法により調べ、
競合法-EIAに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が
飽和結合量の約50％となる抗体濃度を決定した。次に、
実験例４記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイ
クロプレートに、（i）80 ng/mlにバッファーＣで希釈
された抗[Cys43]ラット型GALP(43-60)抗体GR-1Ca溶液ま
たはGR-2Ca溶液50 μl、および（ii）実験例３記載HRP
標識[Cys43]ラット型GALP(43-60)をバッファーＣで400
倍希釈した溶液50μlを加えたウェルに、バッファーＣ
で希釈した濃度が10 -6M〜10-10Mのラット型GALP、ヒト
型GALPまたはブタ型GALP溶液50μlを加え、4℃で16時間
反応させた。反応後、PBSで洗浄したのち抗マウスイム
ノグロブリン抗体結合マイクロプレート上の酵素活性
を、実験例４記載の方法により測定した。
作製したモノクローナル抗体の反応特異性を以下の方法
により調べた。まず、モノクローナル抗体GR-1Caおよび
GR-2Ca溶液の抗体価を実験例４記載の方法により調べ、
競合法-EIAに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が
飽和結合量の約50％となる抗体濃度を決定した。次に、
実験例４記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイ
クロプレートに、（i）80 ng/mlにバッファーＣで希釈
された抗[Cys43]ラット型GALP(43-60)抗体GR-1Ca溶液ま
たはGR-2Ca溶液50 μl、および（ii）実験例３記載HRP
標識[Cys43]ラット型GALP(43-60)をバッファーＣで400
倍希釈した溶液50μlを加えたウェルに、バッファーＣ
で希釈した濃度が10 -6M〜10-10Mのラット型GALP、ヒト
型GALPまたはブタ型GALP溶液50μlを加え、4℃で16時間
反応させた。反応後、PBSで洗浄したのち抗マウスイム
ノグロブリン抗体結合マイクロプレート上の酵素活性
を、実験例４記載の方法により測定した。
【００５６】GR-1CaおよびGR-2Caの競合法の結果をそれ
ぞれ図３および図４に示す。図３、図４中、（−●−）
は、ヒト型ＧＡＬＰに対する反応を表し、（−○−）
は、ラット型ＧＡＬＰに対する反応を表し、（−●−）
はブタ型ＧＡＬＰに対する反応を表す。これより、両抗
体とも、ラット型ＧＡＬＰ、ヒト型ＧＡＬＰおよびブタ
型ＧＡＬＰに対して反応性を有することがわかる。GR-1
Caの標準曲線から、（B/B0）=0.5を与えるGALP濃度は、
ラット型GALP：3nM、ヒト型GALP：7nM、ブタ型GALP：8n
Mであることが分かった（図３）。これらの結果から、G
R-1Caは、ラット型、ヒト型およびブタ型のいずれのGAL
Pに対しても、ほぼ同定度の高い反応性を示しているも
のと考えられる。また、GR-2Caの標準曲線から、（B/
B0）=0.5を与えるGALP濃度は、ラット型GALP：10nM、ヒ
ト型GALP：20nM、ブタ型GALP：500nMであることが分か
った（図４）。これらの結果から、GR-2Caは、ラット型
GALPとヒト型GALPに対しての反応性は、ほぼ同程度であ
るが、ブタ型GALPに対しての反応性は弱いものと考えら
れる。
ぞれ図３および図４に示す。図３、図４中、（−●−）
は、ヒト型ＧＡＬＰに対する反応を表し、（−○−）
は、ラット型ＧＡＬＰに対する反応を表し、（−●−）
はブタ型ＧＡＬＰに対する反応を表す。これより、両抗
体とも、ラット型ＧＡＬＰ、ヒト型ＧＡＬＰおよびブタ
型ＧＡＬＰに対して反応性を有することがわかる。GR-1
Caの標準曲線から、（B/B0）=0.5を与えるGALP濃度は、
ラット型GALP：3nM、ヒト型GALP：7nM、ブタ型GALP：8n
Mであることが分かった（図３）。これらの結果から、G
R-1Caは、ラット型、ヒト型およびブタ型のいずれのGAL
Pに対しても、ほぼ同定度の高い反応性を示しているも
のと考えられる。また、GR-2Caの標準曲線から、（B/
B0）=0.5を与えるGALP濃度は、ラット型GALP：10nM、ヒ
ト型GALP：20nM、ブタ型GALP：500nMであることが分か
った（図４）。これらの結果から、GR-2Caは、ラット型
GALPとヒト型GALPに対しての反応性は、ほぼ同程度であ
るが、ブタ型GALPに対しての反応性は弱いものと考えら
れる。
【００５７】実験例５
ＨＲＰ標識化抗ＧＡＬＰモノクローナル抗体（ＧＲ２−
１Ｎａ−ＨＲＰ）の作製 特開2000-157273号公報記載のGALPのN端部（1-9）を認
識するモノクローナル抗体GR2-1N精製画分9.25 mg（61.
7nmol）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に、GMBS 0.74
μmolを含むDMF 50μlを加え、室温で40分反応させた。
反応液をセファデックスＧ−２５カラム（溶離液、0.1M
リン酸緩衝液、pH6.7）で分離し、マレイミド基の導入さ
れた抗体画分7.17 mgを得た。次に、HRP 17.8 mg（445n
mol）を含む0.02Mリン酸緩衝液（0.15M NaClも含む）
（pH6.8）1.4 mlに、N-スクシニミジル-3-(2-ピリミジ
ルジチオ)プロピオネート(SPDP)6.67μmolを含むDMF60
μlを加え、室温で40分反応させた。次に、66μmolのジ
チオスレイトールを含む0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）0.4 m
lを加え、室温で20分反応させた後、セファデックスＧ
−２５カラム（溶離液、2 mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩
衝液、pH6.0）で分離し、SH基の導入されたHRP 9.8 mg
を得た。次に、SH基の導入されたHRP 8 mgとマレイミド
基の導入された抗体画分3 mgとを混合し、コロジオンバ
ッグ（ザルトリウス社製）で約0.5 mlにまで濃縮したの
ち、4℃で16時間放置した。反応液を溶離液に0.1Mリン
酸緩衝液、pH6.5を用いるSephacrylS-300HRカラム（Pha
rmacia社製）に供し、GR2-1Na-HRP複合体画分を精製し
た。
１Ｎａ−ＨＲＰ）の作製 特開2000-157273号公報記載のGALPのN端部（1-9）を認
識するモノクローナル抗体GR2-1N精製画分9.25 mg（61.
7nmol）を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に、GMBS 0.74
μmolを含むDMF 50μlを加え、室温で40分反応させた。
反応液をセファデックスＧ−２５カラム（溶離液、0.1M
リン酸緩衝液、pH6.7）で分離し、マレイミド基の導入さ
れた抗体画分7.17 mgを得た。次に、HRP 17.8 mg（445n
mol）を含む0.02Mリン酸緩衝液（0.15M NaClも含む）
（pH6.8）1.4 mlに、N-スクシニミジル-3-(2-ピリミジ
ルジチオ)プロピオネート(SPDP)6.67μmolを含むDMF60
μlを加え、室温で40分反応させた。次に、66μmolのジ
チオスレイトールを含む0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）0.4 m
lを加え、室温で20分反応させた後、セファデックスＧ
−２５カラム（溶離液、2 mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩
衝液、pH6.0）で分離し、SH基の導入されたHRP 9.8 mg
を得た。次に、SH基の導入されたHRP 8 mgとマレイミド
基の導入された抗体画分3 mgとを混合し、コロジオンバ
ッグ（ザルトリウス社製）で約0.5 mlにまで濃縮したの
ち、4℃で16時間放置した。反応液を溶離液に0.1Mリン
酸緩衝液、pH6.5を用いるSephacrylS-300HRカラム（Pha
rmacia社製）に供し、GR2-1Na-HRP複合体画分を精製し
た。
【００５８】実施例３
サンドイッチ法−ＥＩＡ（サンドイッチ法−ＥＩＡの特
異性と感度） 実施例１で得られた精製したモノクローナル抗体GR-1Ca
を15μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6溶液）を96ウェ
ルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間
放置した。ウェルの余剰の結合部位をPBSで4倍希釈した
ブロックエース400μlを加え不活化した。上記調製済み
プレートに、バッファーＣで希釈したラット型GALP、ヒ
ト型GALPおよびブタ型GALPをそれぞれ100μlずつ加え、
4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、実験例５
で作製したGR2-1Na-HRP（バッファーＣで2,000倍希釈）
100μlを加え、4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄した
のち、実験例４記載の方法によりTMBを用いて固相上の
酵素活性を測定した（酵素反応20分）。結果を図５に示
す。図５中、（−●−）は、ラット型ＧＡＬＰの吸収を
表し、（−■−）は、ヒト型ＧＡＬＰの吸収を表し、
（−▲−）は、ブタ型ＧＡＬＰの吸収を表す。図５か
ら、本サンドイッチ法−ＥＩＡにより、極めて高感度に
ラット型ＧＡＬＰ、ヒト型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬ
Ｐを検出できることがわかった。すなわち、このサンド
イッチ法-EIAは、ラット型GALP、ヒト型GALPおよびブタ
型GALPを0.3fmol/ウェルで検出することが可能である。
したがって、例として、固相抗体としてGR-1Caを用い、
標識体としてGR-1Na-HRPを用いるサント゛イッチ法-EIAは、ラ
ット型GALP、ヒト型GALPおよびブタ型GALPを極めて高感
度にかつ極めて選択的に検出することが可能であること
がわかった。
異性と感度） 実施例１で得られた精製したモノクローナル抗体GR-1Ca
を15μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液（pH9.6溶液）を96ウェ
ルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間
放置した。ウェルの余剰の結合部位をPBSで4倍希釈した
ブロックエース400μlを加え不活化した。上記調製済み
プレートに、バッファーＣで希釈したラット型GALP、ヒ
ト型GALPおよびブタ型GALPをそれぞれ100μlずつ加え、
4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、実験例５
で作製したGR2-1Na-HRP（バッファーＣで2,000倍希釈）
100μlを加え、4℃で24時間反応させた。PBSで洗浄した
のち、実験例４記載の方法によりTMBを用いて固相上の
酵素活性を測定した（酵素反応20分）。結果を図５に示
す。図５中、（−●−）は、ラット型ＧＡＬＰの吸収を
表し、（−■−）は、ヒト型ＧＡＬＰの吸収を表し、
（−▲−）は、ブタ型ＧＡＬＰの吸収を表す。図５か
ら、本サンドイッチ法−ＥＩＡにより、極めて高感度に
ラット型ＧＡＬＰ、ヒト型ＧＡＬＰおよびブタ型ＧＡＬ
Ｐを検出できることがわかった。すなわち、このサンド
イッチ法-EIAは、ラット型GALP、ヒト型GALPおよびブタ
型GALPを0.3fmol/ウェルで検出することが可能である。
したがって、例として、固相抗体としてGR-1Caを用い、
標識体としてGR-1Na-HRPを用いるサント゛イッチ法-EIAは、ラ
ット型GALP、ヒト型GALPおよびブタ型GALPを極めて高感
度にかつ極めて選択的に検出することが可能であること
がわかった。
【００５９】実施例４
血漿中のラット型ＧＡＬＰの定量
ラット血漿を、同量のバッファーＥＣ（0.2％ BSA、0.4
M NaCl、2 mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAP
S、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、p
H7.0）で2倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法-EI
Aによりラット型GALPを定量した。結果を表２に示す。
M NaCl、2 mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAP
S、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、p
H7.0）で2倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法-EI
Aによりラット型GALPを定量した。結果を表２に示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】実施例５
ラット血漿中のＧＡＬＰの逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分画 実施例４に記載の、ラット血漿中に含まれるＧＡＬＰ免
疫活性を同定するため、ラット血漿12 mlにアセトニト
リルを24 ml添加して混和後、遠心分離（2,500rpm，15
分）を行い、タンパク質の除去を行った。上清を凍結乾
燥後、この画分を濃縮後ODS-80TMを用いる逆相HPLCによ
って分画した。 カラム条件： カラム：ODS-80TM（4.6 x 250 mm） 溶離液：Ａ液（0.05％トリフルオロ酢酸含有 5％アセト
ニトリル） Ｂ液（0.05％トリフルオロ酢酸含有 60％アセトニトリ
ル） 溶出方法：アセトニトリル濃度を最初の5分間に5％から
30％まで上昇させ、次に30分間かけて30-50％に直線的
に上昇させた。 流速：1.0 ml/分 分画：0.5 ml/tube 溶出画分を凍結乾燥したのち、250μlのバッファーＣに
溶解させ、実施例３記載のサンドイッチ法-EIAに供し
た。結果を図６に示す。血漿中のラット型GALP免疫活性
は、ほとんどラット型GALPの溶出位置に検出されたこと
から、該サンドイッチ法-EIAが、ラット型GALPを検出し
ていることが確認された。
ィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分画 実施例４に記載の、ラット血漿中に含まれるＧＡＬＰ免
疫活性を同定するため、ラット血漿12 mlにアセトニト
リルを24 ml添加して混和後、遠心分離（2,500rpm，15
分）を行い、タンパク質の除去を行った。上清を凍結乾
燥後、この画分を濃縮後ODS-80TMを用いる逆相HPLCによ
って分画した。 カラム条件： カラム：ODS-80TM（4.6 x 250 mm） 溶離液：Ａ液（0.05％トリフルオロ酢酸含有 5％アセト
ニトリル） Ｂ液（0.05％トリフルオロ酢酸含有 60％アセトニトリ
ル） 溶出方法：アセトニトリル濃度を最初の5分間に5％から
30％まで上昇させ、次に30分間かけて30-50％に直線的
に上昇させた。 流速：1.0 ml/分 分画：0.5 ml/tube 溶出画分を凍結乾燥したのち、250μlのバッファーＣに
溶解させ、実施例３記載のサンドイッチ法-EIAに供し
た。結果を図６に示す。血漿中のラット型GALP免疫活性
は、ほとんどラット型GALPの溶出位置に検出されたこと
から、該サンドイッチ法-EIAが、ラット型GALPを検出し
ていることが確認された。
【００６２】実施例６
血漿中のヒトＧＡＬＰの定量
ヒト血漿を、同量のバッファーＥＣ〔0.2％ BSA、0.4M
NaCl、2 mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAPS、
0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.
0〕で2倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法-EIAに
よりヒト血漿中のGALPを定量した。ヒト血漿は、武田薬
品工業（株）の健常人ボランティアより提供されたもの
を使用し、インフォームドコンセントの確認を得たもの
である。結果を表３に示す。
NaCl、2 mM EDTA・Na、10％ Block Ace、0.05％ CHAPS、
0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.
0〕で2倍希釈し、上記実施例３のサンドイッチ法-EIAに
よりヒト血漿中のGALPを定量した。ヒト血漿は、武田薬
品工業（株）の健常人ボランティアより提供されたもの
を使用し、インフォームドコンセントの確認を得たもの
である。結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】これより、この測定系は、血漿中のGALPの
変動を研究する際の重要な手段となることがわかる。
変動を研究する際の重要な手段となることがわかる。
【００６５】実施例７
慢性炎症モデルであるアジュバンド関節炎ラットでのＧ
ＡＬＰの定量 雄性Lewis ラット（7週齢、日本チャールズリバー）の
左後肢に0.05 mlの流動パラフィンに懸濁した結核死菌
（Mycobacterium tuberculosis (H37 RA, Difco)）250
μgを皮内投与し感作した(A.A.群)。Vehicle群は、流動
パラフィンを0.05ml投与した。実験数はいずれも7例で
行った。投与前および投与15日目にアジュバント感作ラ
ットのアジュバンド非注射側後肢（右後肢）の足容積お
よび非感作ラットの右後肢の足容積を測定した。投与24
時間後および投与14日目にラットを断頭した。得られた
血液より血漿を調製し、ラット血漿を、同量のバッファ
ーＥＣ〔0.2％ BSA、0.4M NaCl、2 mM EDTA・Na、10％
Block Ace、0.05％ CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0〕で２倍希釈し、上記実
施例３のサンドイッチ法−ＥＩＡによりラット型ＧＡＬ
Ｐを定量した。血中ＧＡＬＰ濃度を以下に示す。アジュ
バンド感作24時間後は、vehicle群；10.1 ± 3.1 fmol/
ml、A.A.群；4.5 ± 0.6 fmol/ml、アジュバンド感作14
日後は、vehicle群；15.1 ± 3.5 fmol/ml、A.A.群；3.
4 ± 0.4 fmol/mlであった。アジュバンド感作24時間お
よび14日後のいずれも血中ＧＡＬＰ濃度は、vehicle群
に比較して有意（p<0.05）に低下した。これより、GALP
がアジュバンド関節炎のマーカーとなり得ることがわか
る。さらに、関節炎の発症により血中GALPが消費されて
いることもわかる。また、下垂体を採取し5mlの蒸留水
中にて10分間煮沸後氷中で冷却し、酢酸およびペプスタ
チン（ペプチド研究所）を添加して最終濃度をそれぞれ
１Mおよび10μg/mlとした。ホモジナイザーにて下垂体
を破砕後、溶液中のタンパク濃度をProtein assay kit
(Bio Rad社)にて測定した。下垂体破砕溶液は、12,000
rpmで30分間遠心し、その上清をSep-Pak Plus C18カー
トリッジ265mg（Waters社製）で濃縮・前処理した後、
ラット型GALPを上記実施例３記載サンドイッチ−EIAに
より定量した。下垂体抽出液の前処理方法は、メタノー
ル5 mlおよび0.1％ TFA含有蒸留水5mlを順次ながして活
性化したSep-Pak Plus C18カートリッジに2mlの4％酢酸
を添加した下垂体抽出液を負荷した。添加後、5 mlの0.
1％ TFA含有蒸留水で洗浄後、0.1％ TFA含有60％アセト
ニトリル 3 mlで溶出し、凍結乾燥した。濃縮画分を0.2
5 mlのバッファーＥＣ中で再構成し、上記実施例３のサ
ンドイッチ法-EIAにより定量した。下垂体中のGALP含量
を以下に示す。アジュバンド感作24時間後は、vehicle
群；3.1 ± 0.3 fmol/mg protein、A.A.群；4.9 ± 0.7
fmol/mg protein、アジュバンド感作14日後は、vehicl
e群；1.6 ± 0.2 fmol/mg protein、A.A.群；2.8 ± 0.
3 fmol/mg proteinであった。アジュバンド感作24時間
および14日後のいずれにおいても下垂体GALP含量は、ve
hicle群に比較して有意（p<0.01）に増加した。これよ
り、ＧＡＬＰが関節炎の発症を抑制する目的で、下垂体
での産生が促進されていることがわかる。
ＡＬＰの定量 雄性Lewis ラット（7週齢、日本チャールズリバー）の
左後肢に0.05 mlの流動パラフィンに懸濁した結核死菌
（Mycobacterium tuberculosis (H37 RA, Difco)）250
μgを皮内投与し感作した(A.A.群)。Vehicle群は、流動
パラフィンを0.05ml投与した。実験数はいずれも7例で
行った。投与前および投与15日目にアジュバント感作ラ
ットのアジュバンド非注射側後肢（右後肢）の足容積お
よび非感作ラットの右後肢の足容積を測定した。投与24
時間後および投与14日目にラットを断頭した。得られた
血液より血漿を調製し、ラット血漿を、同量のバッファ
ーＥＣ〔0.2％ BSA、0.4M NaCl、2 mM EDTA・Na、10％
Block Ace、0.05％ CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0〕で２倍希釈し、上記実
施例３のサンドイッチ法−ＥＩＡによりラット型ＧＡＬ
Ｐを定量した。血中ＧＡＬＰ濃度を以下に示す。アジュ
バンド感作24時間後は、vehicle群；10.1 ± 3.1 fmol/
ml、A.A.群；4.5 ± 0.6 fmol/ml、アジュバンド感作14
日後は、vehicle群；15.1 ± 3.5 fmol/ml、A.A.群；3.
4 ± 0.4 fmol/mlであった。アジュバンド感作24時間お
よび14日後のいずれも血中ＧＡＬＰ濃度は、vehicle群
に比較して有意（p<0.05）に低下した。これより、GALP
がアジュバンド関節炎のマーカーとなり得ることがわか
る。さらに、関節炎の発症により血中GALPが消費されて
いることもわかる。また、下垂体を採取し5mlの蒸留水
中にて10分間煮沸後氷中で冷却し、酢酸およびペプスタ
チン（ペプチド研究所）を添加して最終濃度をそれぞれ
１Mおよび10μg/mlとした。ホモジナイザーにて下垂体
を破砕後、溶液中のタンパク濃度をProtein assay kit
(Bio Rad社)にて測定した。下垂体破砕溶液は、12,000
rpmで30分間遠心し、その上清をSep-Pak Plus C18カー
トリッジ265mg（Waters社製）で濃縮・前処理した後、
ラット型GALPを上記実施例３記載サンドイッチ−EIAに
より定量した。下垂体抽出液の前処理方法は、メタノー
ル5 mlおよび0.1％ TFA含有蒸留水5mlを順次ながして活
性化したSep-Pak Plus C18カートリッジに2mlの4％酢酸
を添加した下垂体抽出液を負荷した。添加後、5 mlの0.
1％ TFA含有蒸留水で洗浄後、0.1％ TFA含有60％アセト
ニトリル 3 mlで溶出し、凍結乾燥した。濃縮画分を0.2
5 mlのバッファーＥＣ中で再構成し、上記実施例３のサ
ンドイッチ法-EIAにより定量した。下垂体中のGALP含量
を以下に示す。アジュバンド感作24時間後は、vehicle
群；3.1 ± 0.3 fmol/mg protein、A.A.群；4.9 ± 0.7
fmol/mg protein、アジュバンド感作14日後は、vehicl
e群；1.6 ± 0.2 fmol/mg protein、A.A.群；2.8 ± 0.
3 fmol/mg proteinであった。アジュバンド感作24時間
および14日後のいずれにおいても下垂体GALP含量は、ve
hicle群に比較して有意（p<0.01）に増加した。これよ
り、ＧＡＬＰが関節炎の発症を抑制する目的で、下垂体
での産生が促進されていることがわかる。
【００６６】実施例８
リポポリサッカリド投与ラットでのＧＡＬＰの定量
雄性Wistatラット（8週齢、日本チャールズリバー）の
腹腔内に生理食塩水に溶解したリポポリサッカライド(L
PS)（和光純薬）を1、3および10 mg/kg投与した（LPS
群, n=5-7）。Vehicle群（n=8）は、生理食塩水を1 ml/
kgで投与した。投与12時間後に断頭採血し得られた血液
より血漿を調製した。血漿を、同量のバッファーＥＣ
〔0.2％ BSA、0.4M NaCl、2mM EDTA・Na、10％ Block A
ce、0.05％CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1M
リン酸緩衝液、pH7.0〕で2倍希釈し、上記実施例３のサ
ンドイッチ法-EIAによりラット型GALPを定量した。血中
ＧＡＬＰ濃度の結果を図７に示す。Vehicle群(12.0 ±
2.0 fmol/ml)に比較してLPS 3 mg/kg投与群で最も高値
（251 ± 181 fmol/ml）を示し、有意な差ではないが高
値を示した。また、下垂体を採取し、上記実施例７と同
様の方法で下垂体中のGALP濃度を測定した。結果を図８
に示す。血中GALP濃度と同様に、LPS 3 mg/kg投与群で
最も高値（8.39 ± 1.37 fmol/mg protein）を示し、ve
hicle群（2.82 ± 0.48 fmol/ mg protein）に比較して
有意に高値（p<0.01）を示した。これより、GALPがエン
ドトキシン刺激によりサイトカイン類と同様にその産生
が亢進される因子であることがわかる。GALPはサイトカ
イン類の産生調節に関する因子であると考えられる。
腹腔内に生理食塩水に溶解したリポポリサッカライド(L
PS)（和光純薬）を1、3および10 mg/kg投与した（LPS
群, n=5-7）。Vehicle群（n=8）は、生理食塩水を1 ml/
kgで投与した。投与12時間後に断頭採血し得られた血液
より血漿を調製した。血漿を、同量のバッファーＥＣ
〔0.2％ BSA、0.4M NaCl、2mM EDTA・Na、10％ Block A
ce、0.05％CHAPS、0.05％アジ化ナトリウムを含む0.1M
リン酸緩衝液、pH7.0〕で2倍希釈し、上記実施例３のサ
ンドイッチ法-EIAによりラット型GALPを定量した。血中
ＧＡＬＰ濃度の結果を図７に示す。Vehicle群(12.0 ±
2.0 fmol/ml)に比較してLPS 3 mg/kg投与群で最も高値
（251 ± 181 fmol/ml）を示し、有意な差ではないが高
値を示した。また、下垂体を採取し、上記実施例７と同
様の方法で下垂体中のGALP濃度を測定した。結果を図８
に示す。血中GALP濃度と同様に、LPS 3 mg/kg投与群で
最も高値（8.39 ± 1.37 fmol/mg protein）を示し、ve
hicle群（2.82 ± 0.48 fmol/ mg protein）に比較して
有意に高値（p<0.01）を示した。これより、GALPがエン
ドトキシン刺激によりサイトカイン類と同様にその産生
が亢進される因子であることがわかる。GALPはサイトカ
イン類の産生調節に関する因子であると考えられる。
【００６７】実施例９
絶水負荷時の下垂体ＧＡＬＰ濃度の定量
雄性Wistatラット（8週齢、日本チャールズリバー）を
絶水条件下で2、4および7日間飼育し、断頭後下垂体後
葉を摘出し、下垂体を採取し、上記実施例７と同様の方
法で下垂体中のGALP濃度を測定した。結果を図９に示
す。絶水４日目（28.7 ± 2.29 fmol/mg protein）およ
び７日目（43.8 ± 10.7 fmol/mg protein）で自由摂水
群（3.93 ± 0.75 fmol/mg protein）に比較して有意に
増加した。これより、臓器中のＧＡＬＰの濃度変動も、
本発明の抗体を用いて高感度に測定できることがわか
る。さらに、GALPは、生体内の水分および浸透圧調節に
関与する因子であることもわかる。
絶水条件下で2、4および7日間飼育し、断頭後下垂体後
葉を摘出し、下垂体を採取し、上記実施例７と同様の方
法で下垂体中のGALP濃度を測定した。結果を図９に示
す。絶水４日目（28.7 ± 2.29 fmol/mg protein）およ
び７日目（43.8 ± 10.7 fmol/mg protein）で自由摂水
群（3.93 ± 0.75 fmol/mg protein）に比較して有意に
増加した。これより、臓器中のＧＡＬＰの濃度変動も、
本発明の抗体を用いて高感度に測定できることがわか
る。さらに、GALPは、生体内の水分および浸透圧調節に
関与する因子であることもわかる。
【００６８】
【発明の効果】本発明の抗体は、ＧＡＬＰまたはその誘
導体が関与する疾患等の治療剤、予防剤、診断剤の開発
に有用である。本発明の抗体を含むハイブリドーマ細胞
を用いることにより、本発明の抗体は工業的に生産する
ことが可能である。また、本発明の抗体を含有してなる
医薬（特に診断薬）は、ＧＡＬＰまたはその誘導体が関
与する疾患・症状〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患
（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経
症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全な
ど）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前
立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ
産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、
膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性
硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、
結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性
関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、
血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬
化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病な
ど〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血
症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血
症、代謝性アルカローシスなど）など〕の診断等に有用
である。また、本発明の抗体を用いることにより、ＧＡ
ＬＰまたはその誘導体の量を高い感度で測定することが
できる。このため、本発明の定量法は、ＧＡＬＰまたは
その誘導体が関与する疾患・症状〔例、ＬＨ分泌不全に
関係する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困
難症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機
能不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立
腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣
癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾
患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症
（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウ
マチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患
（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰
瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎
炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵
抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低
ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、
高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕の
診断、予防または治療に有用である。
導体が関与する疾患等の治療剤、予防剤、診断剤の開発
に有用である。本発明の抗体を含むハイブリドーマ細胞
を用いることにより、本発明の抗体は工業的に生産する
ことが可能である。また、本発明の抗体を含有してなる
医薬（特に診断薬）は、ＧＡＬＰまたはその誘導体が関
与する疾患・症状〔例、ＬＨ分泌不全に関係する疾患
（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困難症、無月経
症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機能不全な
ど）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立腺癌、前
立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣癌、ＬＨ
産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾患〔例、
膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症（全身性
硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、
結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患（例、変形性
関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰瘍性大腸炎、
血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬
化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病な
ど〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低ナトリウム血
症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血
症、代謝性アルカローシスなど）など〕の診断等に有用
である。また、本発明の抗体を用いることにより、ＧＡ
ＬＰまたはその誘導体の量を高い感度で測定することが
できる。このため、本発明の定量法は、ＧＡＬＰまたは
その誘導体が関与する疾患・症状〔例、ＬＨ分泌不全に
関係する疾患（例、肥満症、不妊症、月経不順、月経困
難症、無月経症、月経前症候群、更年期障害、下垂体機
能不全など）、ＬＨ過剰分泌に関係する疾患（例、前立
腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、思春期早発症、卵巣
癌、ＬＨ産生下垂体腫瘍など）、痴呆、糖尿病、免疫疾
患〔例、膠原病（例、全身性エリテマトーデス、強皮症
（全身性硬化症）、皮膚筋炎、慢性関節リウマチ、リウ
マチ熱、結節性多発動脈炎など）、リウマチ性疾患
（例、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風、偽痛風、潰
瘍性大腸炎、血友病）、炎症、重症筋無力症、糸球体腎
炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵
抗性糖尿病など〕、水・電解質代謝異常（例、頻尿、低
ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、
高カリウム血症、代謝性アルカローシスなど）など〕の
診断、予防または治療に有用である。
【００６９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Takada Chemical Industries, Ltd.
<120> Antibody and its use
<130> P02-0112
<150> JP2001-294528
<151> 2001-09-26
<160> 4
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> Rat
<400> 1
Ala Pro Ala His Arg Gly Arg Gly Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Leu Gly Pro Val Leu His Leu Ser Ser Lys Ala Asn Gln Gly
20 25 30
Arg Lys Thr Asp Ser Ala Leu Glu Ile Leu Asp Leu Trp Lys Ala Ile
35 40 45
Asp Gly Leu Pro Tyr Ser Arg Ser Pro Arg Met Thr
50 55 60
<210> 2
<211> 60
<212> PRT
<213> Human
<400> 2
Ala Pro Ala His Arg Gly Arg Gly Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Leu Gly Pro Val Leu His Leu Pro Gln Met Gly Asp Gln Asp
20 25 30
Gly Lys Arg Glu Thr Ala Leu Glu Ile Leu Asp Leu Trp Lys Ala Ile
35 40 45
Asp Gly Leu Pro Tyr Ser His Pro Pro Gln Pro Ser
50 55 60
<210> 3
<211> 60
<212> PRT
<213> Porcine
<400> 3
Ala Pro Val His Arg Gly Arg Gly Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Leu Gly Pro Val Leu His Pro Pro Ser Arg Ala Glu Gly Gly
20 25 30
Gly Lys Gly Lys Thr Ala Leu Gly Ile Leu Asp Leu Trp Lys Ala Ile
35 40 45
Asp Gly Leu Pro Tyr Pro Gln Ser Gln Leu Ala Ser
50 55 60
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> Rat
<400> 4
Cys Leu Trp Lys Ala Ile Asp Gly Leu Pro Tyr Ser Arg Ser Pro Arg
1 5 10 15
Met Thr
【図１】 ［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６
０）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体
価の測定結果を表す。
０）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体
価の測定結果を表す。
【図２】 ［Ｃｙｓ43］ラット型ＧＡＬＰ（４３−６
０）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウス由来のハイブリド
ーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を
表す。
０）−ＫＬＨ複合体を免疫したマウス由来のハイブリド
ーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を
表す。
【図３】 ＧＲ−１Ｃaの競合法−ＥＩＡの結果を表
す。
す。
【図４】 ＧＲ−２Ｃaの競合法−ＥＩＡの結果を表
す。
す。
【図５】 ＧＲ−１Ｃａのサンドイッチ法−ＥＩＡの測
定結果を表す。
定結果を表す。
【図６】 ラット血漿のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定
結果を表す。
結果を表す。
【図７】 実施例８のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結
果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。
果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。
【図８】 実施例８のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結
果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。＊＊；
ｐ＜＝０．０１
果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。＊＊；
ｐ＜＝０．０１
【図９】 実施例９のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定結
果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。＊＊；
ｐ＜＝０．０１
果を表す。縦軸の値は平均値±標準誤差を表す。＊＊；
ｐ＜＝０．０１
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 13/12 Ａ６１Ｐ 21/04
21/04 25/28
25/28 29/00
29/00 １０１
１０１ 37/00
37/00 43/00 １０５
43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/18
Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ１２Ｐ 21/08 33/543 ５１１Ａ
Ｇ０１Ｎ 33/53 ５１５Ａ
33/543 ５１１ 33/577 Ｂ
５１５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ
33/577 5/00 Ｂ
(72)発明者 大瀧 徹也
茨城県つくば市春日１丁目７番地９ 武田
春日ハイツ802号
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA53 DA02 GA03
HA15
4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01
DA13
4B065 AA92X AB05 AC14 BA08
CA25 CA44 CA46
4C085 AA14 BB11 CC23 CC32 EE01
4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40
DA76 EA20 EA22 EA50 FA72
Claims (18)
- 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：２または配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
またはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反
応する抗体。 - 【請求項２】 Ｃ端側の部分ペプチドが、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ
酸配列の第４４番目〜第５３番目のアミノ酸配列を有す
るペプチドである請求項１記載の抗体。 - 【請求項３】 Ｃ端側の部分ペプチドが、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ
酸配列の第４０番目〜第６０番目、第４１番目〜第６０
番目、第４２番目〜第６０番目、第４３番目〜第６０番
目、第４４番目〜第６０番目、第４５番目〜第６０番
目、第４６番目〜第６０番目、第４７番目〜第６０番
目、第４８番目〜第６０番目、第４９番目〜第６０番
目、第５０番目〜第６０番目、第４４番目〜第５４番
目、第４５番目〜第５４番目、第４６番目〜第５４番
目、第４７番目〜第５４番目、第４８番目〜第５４番
目、第４９番目〜第５４番目または第５０番目〜第５４
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項
１記載の抗体。 - 【請求項４】 標識化された請求項１記載の抗体。
- 【請求項５】 モノクローナル抗体である請求項１記載
の抗体。 - 【請求項６】ＧＲ−１Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８２）
で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ
−１Ｃａで標示される請求項５記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項７】請求項５記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞。 - 【請求項８】ＧＲ−１Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８２）
で標示される請求項７記載のハイブリドーマ細胞。 - 【請求項９】 請求項７記載のハイブリドーマ細胞を生
体内または生体外で培養し、その体液または培養物から
請求項５記載のモノクローナル抗体を採取することを特
徴とする請求項５記載のモノクローナル抗体の製造法。 - 【請求項１０】 請求項１記載の抗体を含有してなる医
薬。 - 【請求項１１】 請求項１記載の抗体を含有してなる診
断薬。 - 【請求項１２】 請求項１記載の抗体を用いることを特
徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：
３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは
その誘導体の定量法。 - 【請求項１３】 請求項１記載の抗体と配列番号：１、
配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部
分ペプチドに特異的に反応する抗体とを用いることを特
徴とする被検液中の配列番号：１、配列番号：２または
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドまたはその誘導体の定量法。 - 【請求項１４】 （１）（i）担体上に不溶化した請求
項１記載の抗体、（ii）標識化された配列番号：１、配
列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはその誘導体のＮ端側の部分
ペプチドに特異的に反応する抗体、および（iii）被検
液を反応させた後、または（２）（i）担体上に不溶化
した配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で
表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその
誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗
体、（ii）標識化された請求項１記載の抗体、および
（iii）被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤
の活性を測定する、被検液中の配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチまたはその誘導体の定量法。 - 【請求項１５】 （１）（i）担体上に不溶化した請求
項６記載のモノクローナル抗体、（ii）標識化されたＧ
Ｒ２−１Ｎ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示される
ハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａで
標示されるモノクローナル抗体および（iii）被検液を
反応させた後、または（２）（i）担体上に不溶化した
ＧＲ２−１Ｎ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６８２）で標示され
るハイブリドーマ細胞から産生され得るＧＲ２−１Ｎａ
で標示されるモノクローナル抗体、（ii）標識化された
請求項６記載のモノクローナル抗体、および（iii）被
検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測
定する請求項１４記載の定量法。 - 【請求項１６】 請求項１記載の抗体、被検液および標
識化された配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドま
たはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化された配列番号：１、配列番号：２または配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
またはその誘導体の割合を測定することを特徴とする、
被検液中の配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドま
たはその誘導体の定量法。 - 【請求項１７】 請求項１記載の抗体を用いることを特
徴とする配列番号：１、配列番号：２または配列番号：
３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは
その誘導体が関与する疾患の診断法。 - 【請求項１８】 請求項１記載の抗体を用いることを特
徴とする肥満症、不妊症、膠原病またはリウマチ性疾患
の診断法。
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|---|---|---|---|
| JP2001-294528 | 2001-09-26 | ||
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