ES2235479T3 - Analisis inmunologico de la cromogranina a (cga) humana, anticuerpos, reactivos y kits para dicho analisis. - Google Patents
Analisis inmunologico de la cromogranina a (cga) humana, anticuerpos, reactivos y kits para dicho analisis.Info
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Abstract
Procedimiento de análisis inmunológico de la cromogranina A humana (CgA) presente en una muestra utilizando al menos un anticuerpo monoclonal o policlonal que se una específicamente a un epítopo situado sobre la secuencia de aminoácidos comprendida entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido nº 234 a partir del extremo N-terminal de laCgA humana.
Description
Análisis inmunológico de la cromogranina a (CGA)
humana, anticuerpos, reactivos y kits para dicho análisis.
La presente invención tiene por objeto un
procedimiento para el análisis inmunológico de la cromogranina A
humana, con el que es posible en particular analizar no sólo la
cromogranina A en forma intacta, sino también los principales
fragmentos de esta cromogranina A.
Tal análisis puede utilizarse en particular para
el diagnóstico y seguimiento de patologías tales como, por ejemplo,
el feocromocitoma y los carcinoides intestinales.
La cromogranina A (CgA) es una proteína con un
peso molecular de 48 kDa, un pI de 4,9, cuya forma humana consta de
439 aminoácidos tal y como describen Konecki et al., 1987, en
la referencia [1]. Pertenece a la familia de las graninas, con las
que comparte similitudes estructurales y fisiológicas. La CgA, al
igual que la cromogranina B, presenta una notable conservación
interespecie que presupone una función principal. La CgA se
encuentra ampliamente representada en los secretagogos de las
células endocrinas y neuroendocrinas de las que forma, junto con las
demás graninas, uno de los componentes principales. De igual modo,
actúa a este nivel como elemento regulador de la cosecreción de
otras entidades, como las catecolaminas en la glándula
suprarrenal.
La CgA también juega un papel fundamental como
prohormona mediante la liberación de péptidos activos, tras la
degradación proteolítica intragranular y extramatricial.
En la figura 1 adjunta, se representa la
secuencia nº 1 de los 439 aminoácidos descritos por Konecki et
al., correspondiente a la cromogranina A humana.
En la figura 2 se representa esta secuencia de
forma simplificada, identificando sobre esta figura algunos de los
péptidos susceptibles de ser liberados dentro del hombre, es decir,
los péptidos: vasostatina/\beta granina, cromostatina,
pancreastatina, parastatina y procromacina. La proteolisis afecta a
los sitios dibásicos numerados y denotados por un asterisco en la
figura 2, que se encuentran distribuidos a lo largo de la secuencia
de la CgA y aparecen en un número de 10 en la CgA humana. Esta
proteolisis se ha descrito como un fenómeno recurrente en ambos
extremos de la proteína y se ha demostrado que es específica de los
tejidos y que conduce a unas diferencias sustanciales en la
distribución tisular de los péptidos producidos. Por tanto, el grado
de intensidad y el tipo de proteolisis pueden ser responsables de la
gran variabilidad de los fragmentos encontrados en los tejidos, en
la circulación sanguínea y en la orina.
Los trabajos recientes de Corti et al. en
la referencia [2], han confirmado esta diversidad demostrando que en
pacientes que padecen feocromocitoma existen formas circulantes de
distinta conformación y en proporciones variables de una persona a
otra. Del mismo modo, se ha demostrado, mediante la investigación
del péptido WE-14, que la CgA se proteoliza de
distintas formas en los tejidos normales y en los tejidos
neoplásicos del tracto gastroenteropancreático.
Además de su detección en los tejidos normales y
en las neoplasias correspondientes, numerosos estudios atribuyen un
interés diagnóstico al análisis de la CgA. Los niveles de CgA
circulante resultan significativamente elevados en los casos de
feocromocitoma, carcinoide y tumor pancreático endocrino. Estos
datos se han confirmado y se han hecho extensibles a otras
patologías: neuroblastoma, tumores del tracto gastrointestinal,
hipertensión esencial. La presencia de CgA ha quedado demostrada en
un gran número de patologías neurodegenerativas, incluyendo el
Alzheimer (véase la referencia Munoz, Lab. Invest., 1991, vol. 64,
páginas 826-832 [15]). Algunos autores también han
demostrado que la presencia de la CgA en los cánceres de próstata
podría constituir un signo de un desarrollo desfavorable, como en el
caso del cáncer de riñón. Por consiguiente, el análisis de la CgA
ofrece una gran ventaja.
Degorce et al. en la referencia [16]
indican, sobre la base de un estudio destinado a seleccionar
combinaciones de anticuerpos monoclonales para medir la CgA humana
mediante un análisis inmunológico, que éste engloba tres grupos
principales de epítopos: un grupo mediano comprendido entre el
aminoácido nº 136 y el aminoácido nº 340, un grupo intermedio
comprendido entre el aminoácido nº 340 y el aminoácido nº 394 y un
grupo C-terminal comprendido entre el aminoácido 394
y el aminoácido nº 439.
El documento
US-A-4 758 522 [3] describe un
análisis inmunológico de la CgA en el que la CgA se mide mediante un
análisis competitivo con la CgA radiomarcada por los sitios de un
anticuerpo anti CgA humana.
Syversen et al. en la referencia [4], han
descrito un análisis de la cromogranina A con la técnica ELISA
empleando un anticuerpo dirigido contra un fragmento
C-terminal de la CgA correspondiente a la secuencia
de los aminoácidos nº 210 a 439 y un análisis radioinmunológico de
la pancreastatina.
Corti et al., en la referencia [2], han
descrito igualmente dos análisis de la CgA empleando anticuerpos
monoclonales dirigidos contra la secuencia de los aminoácidos nº 81
a 90 y 68 a 70 de la CgA humana.
Por tanto, estos análisis toman en consideración
algunos fragmentos de la CgA, pero no permiten una diferenciación
del tipo de patología a partir de los resultados del análisis.
En efecto, la proteolisis de la molécula y la
multiplicidad de los fragmentos circulantes requieren una
configuración de análisis que sea capaz de detectar la mayor parte
de estas entidades.
El propósito de la presente invención consiste
precisamente en un procedimiento de análisis inmunológico de la CgA
que mida los niveles de CgA intacta y los niveles de los principales
fragmentos que se encuentran en la sangre circulante.
Según la invención, el procedimiento de análisis
inmunológico de la cromogranina A humana (CgA) presente en una
muestra comprende el uso de al menos un anticuerpo monoclonal o
policlonal que se una específicamente a un epítopo situado sobre la
secuencia de aminoácidos nº 2 comprendida entre el aminoácido nº 145
y el aminoácido nº 234 a partir del extremo
N-terminal de la CgA humana.
Según la invención, el término análisis
inmunológico abarca todos los tipos de análisis inmunológico, en
fase homogénea o en fase heterogénea, tales como por ejemplo los
análisis competitivo, los análisis por el procedimiento del
emparedado, los análisis ELISA, RIA, y cualquier otro tipo de
análisis que implique una reacción
antígeno-anticuerpo.
Según un primer modo de realización de la
invención, el análisis inmunológico es un análisis competitivo entre
la cromogranina A de la muestra y una cantidad dada de la
cromogranina A humana (hCgA) marcada, por los sitios de dichos
anticuerpos.
Para llevar a cabo este análisis, se añade a la
muestra a analizar una cantidad de CgA humana marcada y el
anticuerpo que se une específicamente a un epítopo situado sobre la
secuencia nº 2 de la CgA, y posteriormente se deja incubar. De este
modo, se establecen unas condiciones competitivas entre la CgA de la
muestra y la CgA marcada por los sitios de este anticuerpo. Cuando
el análisis se realiza en fase heterogénea, empleando un
radioelemento como marcador, es posible separar los complejos
anticuerpo-hCgA formados mediante
inmunoprecipitación con ayuda de un anticuerpo apropiado. Mediante
la determinación entonces de la radioactividad de los complejos
formados, es posible establecer la concentración de CgA de la
muestra con referencia a una curva patrón obtenida partiendo de
muestras patrón con concentraciones de CgA conocidas.
Asimismo, resulta posible realizar el análisis en
fase homogénea, empleando por ejemplo hCgA marcada y un anticuerpo
capaz de modificar la señal emitida por la hCgA marcada.
En este análisis, se utiliza ventajosamente el
anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la secuencia de
aminoácidos nº 3 comprendida entre el aminoácido nº 219 y el
aminoácido nº 234 de la CgA humana, o el anticuerpo específico de un
epítopo situado sobre la secuencia de aminoácidos nº 4 comprendida
entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido nº 197 de la CgA humana.
Preferiblemente, estos anticuerpos son anticuerpos
monoclona-
les.
les.
Para llevar a cabo este análisis, la preparación
de las muestras patrón y de la CgA marcada puede emplear CgA humana
purificada procedente de células endocrinas o neuroendocrinas de
origen humano, o preferiblemente CgA humana recombinante.
De acuerdo con un segundo modo de realización de
la invención, el análisis inmunológico es un análisis tipo
emparedado que utiliza un primer anticuerpo monoclonal o policlonal
que se une específicamente a un primer epítopo de la CgA humana, y
un segundo anticuerpo monoclonal o policlonal que se une
específicamente a un segundo epítopo de la CgA humana diferente del
primero, estando situado al menos uno de los epítopos sobre la
secuencia nº 2 de aminoácidos de la CgA humana y estando marcado uno
de los dos anticuerpos.
En este segundo modo de realización de la
invención, se utilizan dos anticuerpos específicos de epítopos
distintos, estando situado al menos uno sobre la secuencia nº 2 de
la CgA. Este análisis se puede realizar en fase heterogénea
inmovilizando el primer anticuerpo sobre una fase sólida y
utilizando un segundo anticuerpo marcado.
Igualmente, este análisis se puede realizar en
fase homogénea, empleando por un primer anticuerpo marcado y un
segundo anticuerpo capaz de modificar la señal emitida por el primer
anticuerpo marcado.
El primer y el segundo anticuerpos pueden
elegirse entre los anticuerpos específicos de los epítopos situados
sobre la secuencia de los aminoácidos nº 145 a 197 (secuencia 4) y/o
nº 219 a 234 (secuencia 3) de la CgA humana.
A modo de ejemplo, el primer anticuerpo puede ser
específico de un epítopo situado sobre la secuencia de los
aminoácidos nº 145 a nº 197 (secuencia nº 4) y el segundo
anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la secuencia de
los aminoácidos nº 219 a 234 (secuencia nº 3) de la CgA.
Asimismo, es posible utilizar en este análisis un
primer anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la
secuencia de los aminoácidos nº 219 a 234 (secuencia nº 3) y un
segundo anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la
secuencia de los aminoácidos nº 145 a 197 (secuencia nº 4) de la CgA
humana.
De igual modo, es posible utilizar un primer
anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la secuencia de
los aminoácidos nº 145 a 197 (secuencia nº 4) o sobre la secuencia
de los aminoácidos nº 219 a 234 (secuencia nº 3) de la CgA humana, y
un segundo anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la
secuencia de los aminoácidos nº 250 a 301 (secuencia nº 5) de la CgA
humana.
De acuerdo con un tercer modo de realización de
la invención, el análisis inmunológico es un análisis tipo
emparedado que utiliza un primer anticuerpo monoclonal o policlonal
que se une específicamente a un epítopo situado sobre la secuencia
nº 2 de la CgA humana y un segundo anticuerpo monoclonal o
policlonal que se une específicamente a un segundo epítopo situado
sobre la secuencia nº 5 de la CgA humana comprendida entre el
aminoácido nº 250 y el aminoácido nº 301, estando marcado uno de los
dos anticuerpos.
En este modo de realización, el análisis se puede
realizar en fase heterogénea utilizando un primer anticuerpo
inmovilizado sobre una fase sólida y un segundo anticuerpo marcado,
o a la inversa. También es posible realizar este análisis en fase
homogénea, empleando por un primer anticuerpo marcado y un segundo
anticuerpo capaz de modificar la señal emitida por el primer
anticuerpo marcado, o a la inversa.
Como primer anticuerpo, se utiliza ventajosamente
un anticuerpo específico de la secuencia de los aminoácidos nº 145 a
197 (secuencia nº 4) o un anticuerpo específico de la secuencia de
los aminoácidos nº 219 a 234 (secuencia nº 3) de la CgA humana.
El procedimiento de la invención resulta
particularmente ventajoso para el diagnóstico y seguimiento de
patologías tales como el feocromocitoma o los tumores carcinoides,
dado que permite la discriminación positiva entre los sueros
procedentes de pacientes que padecen feocromocitoma o tumores
carcinoides y los sueros normales.
Para poner en práctica el procedimiento de la
invención, se pueden utilizar los procedimientos de análisis
inmunológico convencional en fase heterogénea, que permiten la
separación de los complejos CgA-anticuerpo del
exceso de anticuerpo marcado.
También resulta posible, en el procedimiento de
la invención, utilizar procedimientos de análisis en fase homogénea
que no comprendan tal separación.
Los procedimientos de análisis en fase homogénea
están basados en la utilización de un par
anticuerpo-antígeno o un par de dos anticuerpos que,
cuando se encuentren cerca el uno del otro, emitan una señal
distinta de la que emiten por separado.
Para este fin, es posible utilizar en particular
un anticuerpo acoplado a un compuesto luminiscente receptor de
energía y un anticuerpo acoplado a un compuesto luminiscente donante
de energía.
A modo de ejemplo, el compuesto luminiscente
receptor de energía puede ser la aloficocianina y el compuesto
luminiscente donante de energía puede ser un criptato de europio tal
como los descritos en el documento
EP-A-0 321 353 [11].
Un procedimiento de análisis de fase homogénea de
particular interés es el método TRACE® descrito en la referencia
[14].
Con respecto a los análisis en fase heterogénea,
se utiliza una fase sólida sobre la que se inmoviliza el anticuerpo
no marcado utilizado para el análisis.
Las fases sólidas susceptibles de ser utilizadas
pueden ser de distintos tipos. Por ejemplo, pueden utilizarse fases
sólidas macroscópicas formadas por tubos, perlas o aletas preparadas
con polímeros u otros materiales.
Los polímeros que pueden utilizarse son por
ejemplo el poliestireno, las poliamidas, el polipropileno, los
polioximetilenos y los copolímeros de estireno.
También es posible utilizar fases sólidas
microscópicas finamente divididas, por ejemplo polvos y agregados de
polímeros, proteínas u otros materiales.
En la invención, el término "marcado"
aplicado a la CgA humana en el primer modo de realización de la
invención o a los distintos anticuerpos del segundo modo de
realización, significa que la CgA o los anticuerpos han sido
modificados mediante un elemento marcador que puede ser, por
ejemplo, un radioelemento, un elemento fluorescente, un elemento
luminiscente, una enzima, un cromóforo fluorescente, un cromóforo
absorbente de la luz o cualquier otro ligando que permita una
medición cuantitativa directa o indirecta.
La invención concierne igualmente a los
anticuerpos monoclonales específicos de un epítopo situado sobre la
secuencia nº 4 de los aminoácidos nº 145 a 197 o sobre la secuencia
nº 3 de los aminoácidos nº 219 a 234 de la cromogranina A humana, y
a los reactivos inmunológicos que contienen uno de los anticuerpos
unidos a un marcador detectable o fijo sobre una fase sólida.
Estos anticuerpos son particularmente
interesantes dado que resultan adecuados para todos los tipos de
análisis. En efecto, proporcionan buenos resultados no sólo en los
análisis realizados con marcadores convencionales (radioelementos,
etc.) sino también en los análisis realizados con marcadores
fluorescentes de tipo criptato y aloficocianina que por lo general
sólo pueden emplearse con ciertos anticuerpos.
La invención también concierne a los kits de
análisis inmunológico para la CgA humana que contienen los
anticuerpos monoclonales citados anteriormente.
También concierne a un kit de análisis
inmunológico para la CgA humana que contiene:
- un primer anticuerpo, y
- un segundo anticuerpo,
siendo al menos uno de los dos
anticuerpos un anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la
secuencia nº 2 de los aminoácidos nº 145 a 234 a partir del extremo
N-terminal de la CgA
humana.
Según un primer modo de realización del kit, el
primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se eligen entre los
anticuerpos específicos de los epítopos situados sobre la secuencia
de los aminoácidos nº 145 a 197 (secuencia nº 4) y/o nº 219 a 234
(secuencia nº 3) de la CgA humana.
Según un segundo modo de realización del kit, uno
de los anticuerpos es específico de un epítopo situado sobre la
secuencia de los aminoácidos nº 145 a 197 (secuencia nº 4) o sobre
la secuencia de los aminoácidos nº 219 a 234 (secuencia nº 3), y el
otro anticuerpo es específico de un epítopo situado sobre la
secuencia de los aminoácidos nº 250 a 301 (secuencia nº 5) de la CgA
humana.
Preferiblemente, cuando el kit está destinado a
un análisis en fase heterogénea, uno de los anticuerpos está
inmovilizado sobre una fase sólida y el otro anticuerpo está
acoplado a un marcador detectable.
El marcador detectable es, por ejemplo, el yodo
125.
Preferiblemente, cuando el kit está destinado a
un análisis en fase heterogénea, uno de los anticuerpos está
acoplado a un compuesto luminiscente donante de energía y el otro
anticuerpo está acoplado a un compuesto luminiscente receptor de
energía.
Ventajosamente, el compuesto luminiscente donante
de energía es un criptato de europio y el compuesto luminiscente
receptor de energía es una aloficocianina.
Asimismo, concierne a un kit de análisis
inmunológico competitivo que contiene un anticuerpo específico de un
epítopo situado sobre la secuencia nº 2 de los aminoácidos nº 145 a
234 de la CgA humana.
En este kit, el anticuerpo es preferiblemente
específico de un epítopo situado sobre la secuencia nº 3 de los
aminoácidos nº 219 a 234 o sobre la secuencia nº 4 de los
aminoácidos nº 143 a 197 de la CgA humana.
Según la invención, los anticuerpos utilizados
para el análisis pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos
monoclonales.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse a
partir de fragmentos peptídicos de cromogranina A humana obtenidos
mediante proteolisis de CgA humana o mediante síntesis peptídica,
por inmunización in vivo o in vitro. En este caso, es
necesario acoplar el fragmento peptídico a una proteína de
transporte tal como la hemocianina de la lapa californiana (KLH)
para obtener anticuerpos en animales.
Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse a
partir de hibridomas empleando la técnica descrita por H. Kohler y
C. Milstein descrita en Nature, 1975, 256, páginas
495-497. En este caso, se realizan una o más
inmunizaciones de ratones con la cromogranina A o con fragmentos
peptídicos correspondientes a los epítopos deseados, asociados con
una proteína portadora, seguidamente se retira el bazo de los
animales y se realiza una fusión celular entre los esplenocitos y
las células de mieloma. A continuación, los hibridomas producidos se
criban con objeto de seleccionar los clones que producen los
anticuerpos específicos de los epítopos de la CgA humana.
Preferiblemente, según la invención, se utilizan
anticuerpos monoclonales.
Otras características y ventajas de la invención
se entenderán con mayor claridad tras la lectura de la siguiente
descripción de ejemplos de realización, presentados evidentemente
con propósitos ilustrativos y no restrictivos con referencia a los
dibujos adjuntos.
La figura 1 ilustra la secuencia nº 1 de los 439
aminoácidos de la CgA humana madura.
La figura 2 ilustra, de forma simplificada, la
secuencia de aminoácidos de la CgA humana con los fragmentos
obtenidos por proteolisis y su situación sobre esta proteína. Los
asteriscos y números asociados a ésta indican los sitios de corte
dibásicos. Los anticuerpos dirigidos contra algunos epítopos se
relacionan debajo.
La figura 3 muestra el espectro obtenido durante
la cromatografía líquida de alto rendimiento de la CgA humana
recombinante tras la proteolisis con la endoproteasa
Lys-C.
La figura 4 es un diagrama que representa la
distribución de las distintas poblaciones estudiadas mediante un
análisis competitivo (RIA) según la invención. El número de casos
estudiados se indica sobre cada grupo de análisis. Las líneas
indican la mediana para cada grupo de análisis.
La figura 5 es un diagrama que ilustra los
resultados obtenidos con tres análisis de tipo emparedado en
comparación con el análisis competitivo utilizando distintos
anticuerpos. Los resultados se expresan en forma de una proporción
de concentraciones de plasmas patológicos sobre el valor del
percentil 95º de una población normal (n=20). Las líneas indican la
mediana para cada grupo de análisis.
La figura 6 representa la curva obtenida, es
decir, la concentración de CgA humana de una muestra (en ng/ml) en
función de la fluorescencia detectada (F), utilizando un análisis en
fase homogénea conforme a la invención.
La figura 7 es un diagrama que ilustra la
correlación entre los resultados obtenidos con los análisis FIA e
IRMA de la CgA (en ng/ml).
La figura 8 muestra los niveles de CgA (en ng/ml)
obtenidos con muestras normales y muestras patológicas utilizando
los análisis IRMA y FIA de los ejemplos 2 y 3.
La siguiente descripción ilustra la preparación
de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los distintos epítopos
de CgA humana y la selección de anticuerpos adecuados para el
análisis inmunológico de la cromogranina A huma-
na.
na.
Se emplea el procedimiento descrito por O'Connor
et al. en la referencia [6] para purificar la hCgA a partir
de las glándulas suprarrenales humanas de pacientes que sufren
feocromocitoma. La separación final de la proteína se efectúa por
electroforesis sobre un gel 2-D utilizando la
técnica original de O'Farrel descrita en la referencia [7] y
modificada por Bader y Aunis según se describe en la referencia [8].
La CgA se electroeluye a partir de los geles. De igual forma, se
produce CgA humana recombinante (rhCgA) a partir de una cepa de
E. Coli BL21 (DE3) que expresa la rhCgA según describen
Taupenot et al. en la referencia [9].
Las CgA nativa y recombinante se marcan con
Na^{125}I utilizando el procedimiento de la cloramina T de Hunter
y Greenwood a una actividad específica de 1500 kBq \mug^{-1}. El
yodo libre se elimina mediante filtración sobre gel
Sephadex-G25 (Pharmacia Biotech). Las fracciones de
proteína radiomarcada se mezclan y diluyen en PBS, pH 7,2,
conteniendo 45 mmol/l NaN_{3}, 0,5% de seroalbúmina bovina
(BSA).
Se inmunizan ratones Balb/c con edades de 6 a 8
semanas respectivamente por vía intraperitoneal con 10 \mug de
hCgA o rhCgA purificada obtenida previamente en el adyuvante
completo de Freund. Las siguientes dosis intraperitoneales se
efectúan en el adyuvante completo de Freund en intervalos de un mes.
Se realiza el seguimiento de las inmunizaciones de los ratones
mediante valoración del suero por inmunoprecipitación con el
^{125}I-hCgA obtenido previamente.
Seguidamente se inyecta a los ratones por vía
intravenosa 10 \mug de hCgA en una solución de NaCl al 0,9% tres
días antes de la fusión celular. Las células del bazo se aíslan y se
fusionan con células de mieloma
P3-X63-Ag 8.653 en presencia de
polietilenglicol al 37% (peso molecular 1540).
Los clones positivos se identifican mediante
inmunoprecipitación con ^{125}I-hCgA. Los
anticuerpos provenientes de clones positivos se producen a partir de
ascites de ratones y se purifican empleando el gel de
sefarosa-proteína A.
Se realizaron once fusiones con ratones
inmunizados contra la hCgA. Sólo dos de ellas tuvieron éxito y
generaron 8 clones. Las dos fusiones con animales inmunizados frente
a la proteína hCgA recombinante produjeron 16 clones de segunda
generación. En total, se produjeron para su caracterización 17 IgG1,
6 IgG2a y 1 IgG2b con unos niveles comprendidos entre 2 y 3236
ng/ml.
Las distintas familias de epítopos de CgA se
identificaron estudiando las posibles combinaciones de anticuerpos
en el equipo Biacore® siguiendo las instrucciones del fabricante.
Todos los anticuerpos estudiados se diluyen en HEPES a 50 mmol/l,
EDTA 15 mmol/l, NaCl 0,75 M, pH 7,4 y se inyectan en la proporción
de 50 \mug/ml. El mismo tampón se utilizó para la CgA humana
recombinante diluida a 20 \mug/ml.
Este análisis en el Biacore permitió determinar
que los 24 anticuerpos estudiados se dividen en ocho grupos de
epítopos, según se muestra en la tabla 1. Uno de los grupos (grupo
3) puede sin embargo subdividirse de acuerdo con las inhibiciones
parciales existentes entre los anticuerpos de este grupo.
La estequiometría de la reacción anticuerpo
inmovilizado-rhCgA varía entre 0,157 y 0,621 moles
de antígeno/moles de anticuerpo (véase tabla 1).
Los anticuerpos de cada grupo o subgrupo muestran
un reconocimiento a priori de la misma secuencia.
Se dejan digerir 2 nmol de rhCgA durante 2 h a
37ºC con la endoproteinasa Lys-C en una proporción
de proteína/proteinasa de 1000:1 en 100 mmol/l de
TRIS-HCl, pH 8,3.
Los péptidos derivados de la rhCgA producida se
separan entonces mediante HPLC en una columna de gel Macherey, NAGEL
300-5C18 (250 mm x 4 mm). La absorbencia se mide a
214 nm, y se emplea como sistema disolvente ácido trifluoroacético
al 0,1% en agua (disolvente A) y ácido trifluoroacético al 0,1% en
acetonitrilo (disolvente B). Los péptidos se eluyen a una velocidad
de 0,7 ml/min utilizando gradientes sucesivos de disolvente B en
disolvente A de 0 a 25% durante 10 minutos y de 25 a 75% durante 50
minutos. Cada fracción de pico se recoge y se concentra mediante
evaporación, pero no hasta sequedad completa.
La figura 3 ilustra las fracciones recogidas a la
salida de la columna en función del tiempo, que están numeradas de 1
a 6.
La secuencia de los péptidos purificados se
determina mediante la degradación automática de Edman en un
microsecuenciador 473 A de Applied Biosystems. Las muestras
purificadas mediante HPLC se cargan en filtros de fibra de vidrio
preciclados y tratados con polibreno. Los ácidos
aminofeniltiohidantoína se identifican mediante cromatografía en una
columna C-18 (PTH C-18, 2,1 mm x 200
mm). El análisis mediante espectrometría de masas se lleva a cabo
empleando el procedimiento descrito por Goumon et al. en la
referencia [10].
Estas fracciones se utilizan para identificar los
anticuerpos monoclonales obtenidos previamente. Para este propósito,
se dividen partes alícuotas de las fracciones sobre hojas de
nitrocelulosa. Las membranas se lavan rápidamente con NaCl/Pi (25 mM
de fosfato de sodio, pH 7,5 conteniendo 0,9% de NaCl) y se dejan
incubar durante 2 horas a temperatura ambiente con los anticuerpos
monoclonales diluidos a 1/1000 en NaCl/Pi.
El secundo anticuerpo es una IgG anti ratón
conjugada con fosfatasa alcalina. La reacción enzimática tiene lugar
en 100 mmol/l de TRIS-HCL, pH 8,5, 100 mmol/l de
NaCl, 50 mmol/l de MgCl_{2} conteniendo 0,4 mmol/l de nitroazul de
tetrazolio y 0,38 mmol/l de fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
Se estudia un anticuerpo monoclonal de cada uno
de los grupos de la tabla I, es decir, los anticuerpos CGS04, CGS06,
CGS10, CGS30, CGS17, CGS21 y CGS32 producidos previamente, contra
cada fracción alícuota de los fragmentos de la rhCgA separados
mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
La tabla 2 ilustra la correlación entre las
distintas fracciones y los anticuerpos que reconocen estas
fracciones. La tabla 2 también proporciona la masa de los fragmentos
aislados en cada fracción, su posición desde el extremo
N-terminal de la cromogranina A y su secuencia
N-terminal. Los anticuerpo CGS17 y CGS21 reconocen
el dominio C-terminal de la proteína con alta
especificidad por las regiones 339-355 y
356-400. Los anticuerpos CGS04 y CGS10 se estudian
directamente mediante una transferencia tipo Western y los
fragmentos detectados inmunológicamente se colocan en la región
C-terminal de la CgA (340-394 y
395-439).
Los anticuerpos CGS06, CGS20 y CGS30 son
específicos de la secuencia nº 2 de la proteína y corresponden a los
fragmentos 198-245, 246-303 y
145-197 (secuencia nº 4) respectivamente.
Finalmente, se observa que el anticuerpo CGS32 es fuertemente
reactivo con un importante fragmento que va de 10 a 400. Teniendo en
cuenta el comportamiento de este anticuerpo en asociación con otros
anticuerpos que reconocen distintas regiones de la CgA, parece
reconocer más específicamente la región 145-234
(secuencia nº 2).
Paralelamente, la secuencia del epítopo del
anticuerpo CGS06 ha sido precisada mediante péptidos sintéticos. En
efecto, la secuencia 198-245 muestra una fuerte
proporción de ácidos glutámicos, región que es particularmente
hidrófila y potencialmente inmunógena. En particular, contiene una
primera zona de 9 ácidos glutámicos contiguos
(210-218) y especialmente una secuencia de 3 ácidos
glutámicos flanqueada por dos prolinas (227-232). Se
sintetizaron dos péptidos, biotinilados en la posición
N-terminal correspondiente la las secuencias
207-234 y 219-245. Estos péptidos se
inmovilizaron en tubos revestidos previamente con estreptavidina.
Los anticuerpos radiomarcados CGS30, CGS06 y CGS20 (2 kBq por ml) se
incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación con
cada uno de los péptidos. Tras ello, los tubos se lavaron y se
contaron. Los dos anticuerpos CGS20 y CGS30 no reconocen a ninguno
de los dos péptidos. Por otra parte, CGS06 muestra una fijación
significativa sobre ambas secuencias. La mínima secuencia deducida
corresponde, por tanto, a la secuencia nº 3, es decir a la región
219-234, zona que engloba el sitio
poli-Glu 227-232 mencionado
anteriormente.
Del mismo modo, el epítopo de CGS20 se precisó en
relación con la secuencia de la pancreastatina. En este caso, se
añadió un péptido sintético correspondiente a la pancreastatina
(secuencia nº 5 de los aminoácidos 250-301 de la CgA
humana) en cantidades crecientes en la segunda incubación de los
siguientes análogos inmunoradiométricos: CGS06/CGS30* y
CGS06/CGS20*. En el primer caso, ninguna inhibición de la señal fue
visible, lo que evidenció que ni CGS06 ni CGS30 reconocieron la
secuencia 250-301. Por el contrario, en el caso del
sistema CGS06/CGS20*, se obtuvo una inhibición creciente si se
aumentan las cantidades de péptido añadido (86% de inhibición por
0,5 \mug péptido por tubo). Por consiguiente, CGS20 reconoce bien
la secuencia nº 5 de los aminoácidos 250-301 de la
CgA humana, secuencia correspondiente a la pancreastatina.
La figura 2 muestra la posición de estos
anticuerpos en relación con la molécula completa de cromogranina A y
también indica las secuencias reconocidas por estos anticuerpos.
Según la invención, se ha descubierto que los
anticuerpos CGS06, CGS20 y CGS30 (o CGS33) posibilitaron la
realización de análisis inmunológicos específicos, reproducibles y
precisos. Los anticuerpos CGS30 (o CGS33) y CGS06 pueden utilizarse
en un análisis inmunológico competitivo.
Los anticuerpos CGS06, CGS20 y CGS30 (o CGS33)
pueden acoplarse dos a dos para realizar un ensayo de tipo
emparedado.
Los siguientes ejemplos ilustran los análisis de
este tipo.
En este ejemplo, se utiliza para el análisis el
anticuerpo CGS06 que es específico de la secuencia nº 3, es decir,
la región comprendida entre el aminoácido 219 y el aminoácido 234 de
la cromogranina A. Para realizar este análisis, se preparan muestras
patrón de cromogranina humana recombinante (rhCgA) diluidas en suero
humano normal. Las concentraciones de la rhCgA en las muestras
patrón varían de 0 hasta 1 600 ng/ml.
Asimismo, se utiliza rhCgA marcado con yodo 125
según se ha descrito anteriormente.
Para realizar este análisis, se introducen en un
tubo 50 \mul de la muestra patrón o de la muestra a analizar, 300
\mul de hCgA radiomarcada a razón de 2 kBq por tubo, y 150 \mul
de la solución de anticuerpo CGS06 purificado hasta 80 ng/ml. Se
lleva a cabo una primera incubación durante 24 horas a temperatura
ambiente bajo agitación ligera. A continuación se separan los
complejos unidos durante 20 minutos a temperatura ambiente añadiendo
75 \mul de inmunoglobulinas anti ratón de oveja diluidas a 1/10º
en PBS y 50 ml de suero humano normal. Se añade 1 ml de
polietilenglicol al 6% (peso molecular 6000) y los complejos
precipitados se separan mediante centrifugación a 2000 g durante 15
minutos. Posteriormente se determina su radioactividad en un
contador gamma.
A partir de las muestras patrón se obtiene una
curva patrón y se determina la concentración en cromogranina A de la
muestra a analizar localizando el valor encontrado en esta curva
patrón.
El límite de detección determinado por la
repetitividad de la medición al nivel del patrón 0
(Bmáx-2\sigma para n=10 medidas) se ha calculado a
14 ng/mL. El análisis en 10 puntos de 2 sueros de concentraciones
243 y 450 ng/mL permitió evaluar una precisión intraanálisis del
0,9% sobre las dos muestras. En paralelo, la prueba de precisión
interanálisis realizada mediante el análisis de estos mismos sueros
en 3 experimentos distintos muestra un CV de 4,5 y 6,4%
respectivamente.
Este análisis se ha estudiado sobre una serie de
46 plasmas EDTA procedentes de personas sanas y sobre otros 211
plasmas de pacientes aquejados de patología neuroendocrina o de otro
tipo.
La figura 4 muestra los resultados obtenidos con
este análisis sobre distintos plasmas estudiados. En esta figura se
muestra la naturaleza de las patologías y el número de casos en cada
grupo de pacientes.
El análisis de la varianza comparando pares de
población normal y cada una de las demás poblaciones muestra que en
cada caso los niveles de CgA son significativamente superiores en
los plasmas patológicos (p<0,0001). Por otra parte, cuando los
distintos grupos de plasmas se comparan con la serie de plasmas
procedentes de cánceres no neuroendocrinos, el análisis muestra que
los grupos que engloban cánceres de pulmón de células pequeñas
(SCLC) o no de células pequeñas (NSCLC) no son significativamente
distintos de la población de referencia (p=0,2863 y 0,1798
respectivamente). Los demás grupos estudiados muestran unos valores
de CgA que son significativamente más importantes en particular en
lo que respecta a los carcinoides y los feocromocitomas
(p<0,0001) así como a los apudomas y demás tumores
neuroendocrinos (p<0,001).
En este análisis, los niveles de CgA encontrados
fueron los siguientes:
- 40 ng/ml para la mezcla (NP) de plasmas
procedente de individuos sanos,
- 675 ng/ml para la mezcla (PP) de plasmas
procedente de personas aquejadas de feocromocitoma, y
- 1600 ng/ml para la mezcla (CP) de plasmas
procedente de personas aquejadas de tumores carcinoides
intestinales.
Para este análisis se utilizan dos anticuerpos
distintos, el primer anticuerpo es el anticuerpo CGS06 específico de
la secuencia nº 3 de aminoácidos 219-234 y el
segundo anticuerpo es el anticuerpo CGS30 específico de la secuencia
nº 4 de aminoácidos 145 a 197. El primer anticuerpo se lleva a una
concentración de 10 \mug/ml en PBS, pH 7,5 y se revisten tubos de
poliestireno con este anticuerpo.
El segundo anticuerpo CGS30 se etiqueta con yodo
125 mediante Na^{125}I utilizando el procedimiento de la cloramina
T, descrito anteriormente para el marcado de la rhCgA, a una
actividad específica de 400 kBq/\mug. Los patrones son los mismos
que los descritos previamente en el ejemplo 1.
El tampón empleado para el análisis está
constituido por Na_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mmol/l, EDTA 1
mmol/l, NaN_{3} 15 mmol/l, BSA al 1%, pH 7,0.
Para este análisis, se añaden 1 ml de tampón de
análisis y 50 \mul de muestra estándar o de la muestra a analizar
a los tubos revestidos con el anticuerpo CGS06. Se dejan incubar
durante 18 horas a temperatura ambiente. Posteriormente los tubos se
lavan dos veces con 2 ml de solución de Tween 20 al 0,3%. Entonces
se añade 1 ml del anticuerpo CGS30 marcado en cada tubo y se deja
incubar durante 2 horas a temperatura ambiente bajo agitación suave.
Los tubos se lavan nuevamente tal y como se ha descrito previamente
y se determina su radioactividad en un contador gamma.
Al igual que en el ejemplo 1, se obtiene una
curva de calibración a partir de las muestras patrón de
concentraciones conocidas y se determina la concentración en
cromogranina A de la muestra a analizar con referencia a la curva
patrón.
A fin de verificar la especificidad del análisis,
se efectúa el mismo sobre una mezcla normal (NP) y sobre dos mezclas
patológicas obtenidas a partir de plasmas EDTA procedentes
respectivamente de pacientes aquejados de feocromocitoma (PP) o de
carcinoides intestinales (CP).
Esta especificidad se evalúa determinando las
proporciones de concentraciones de CgA entre la mezcla patológica PP
o CP y la mezcla NP.
En el caso de este ejemplo, las proporciones de
concentración de CgA PP/NP y CP/NP son las siguientes:
PP/NP = 9,9
CP/NP = 18,2
En el análisis del ejemplo 1, las proporciones
fueron las siguientes:
PP/NP = 16,9
CP/NP = 40
A título comparativo, el porcentaje de unión
obtenido para la muestra patrón a 1200 ng/ml es de 65,51.
Por consiguiente, esta combinación de anticuerpos
permite obtener una señal elevada y diferenciar entre las dos
mezclas patológicas.
En la tabla 3 adjunta se incluyen los resultados
obtenidos realizando el mismo análisis tipo emparedado con distintos
pares de anticuerpos.
Estos resultados muestran que los dos anticuerpos
CGS06 y CGS30 asociados entre sí o con el anticuerpo CGS20 producen
una señal satisfactoria y posibilitan la discriminación entre las
dos mezclas patológicas.
A título comparativo, se realizó el mismo
análisis utilizando otros anticuerpos de la tabla 2, pero estos no
produjeron unos resultados satisfactorios.
Por tanto, si se utiliza CGS21 o CGS10 como
segundo anticuerpo marcado, resulta imposible discriminar entre la
mezcla patológica PP y la mezcla NP, dado que la proporción PP/NP no
es superior a 2 y es incluso inferior a 1.
Otras combinaciones tales como CGS21/CGS06*,
CGS21/CGS30* o CGS32/CGS06* no resultan interesantes dado que no
permiten diferenciar entre las dos mezclas patológicas, siendo
cercanas las proporciones PP/NP y CP/NP.
La figura 5 ilustra los resultados de los
análisis inmunológicos de los ejemplos 1 y 2 según la invención y de
otros dos análisis utilizando el procedimiento de emparedado como en
el ejemplo 2, pero con la combinación de anticuerpos CGS06/CGS29*
marcado y la combinación CGS06/CGS04* marcado. Los dos anticuerpos
CGS29 y CGS04 reconocen la parte C-terminal de la
CgA. El anticuerpo CGS29 comparte el mismo epítopo que el CGS10.
En esta figura, los resultados se expresan en
forma de la proporción de la concentración del plasma patológico y
el valor del percentil 95º de la población normal (n=20). Las rectas
indican la mediana para cada grupo.
Esta figura muestra que se obtienen resultados
equivalentes con los ejemplos 1 y 2. Por otra parte, con el par
CGS06/CGS04* la correlación se deteriora y un cierto número de
muestras poseen un nivel de CgA considerablemente reducido. En el
caso del análisis con CGS06/CGS29*, el fenómeno se amplifica aún
más, con una disminución muy notable de las concentraciones medidas,
siendo indetectable el nivel de CgA en el 50% de la población.
Así pues, los mejores resultados se obtienen con
los anticuerpos de la secuencia nº 2 de los aminoácidos
145-234 de la CgA, según la invención.
Para este análisis se utilizan dos anticuerpos
distintos, el primer anticuerpo es el anticuerpo CGS06 específico de
la secuencia nº 3 de aminoácidos 219-234 y el
segundo anticuerpo es el anticuerpo CGS30 (o CGS33) específico de la
secuencia nº 4 de aminoácidos 145 a 197. El primer anticuerpo CGS06
se conjugó con criptato de europio, que es un compuesto donante de
energía.
El segundo anticuerpo CGS30 (o CGS33) se conjugó
con aloficocianina, que es un compuesto receptor de energía.
El criptato de europio utilizado es el criptato
Eu trisbipiridina diamina (TBP (Eu^{2+}) criptato). Se describe en
el documento EP-A-321 353 [II] y
responde a la fórmula:
El conjugado CGS06-criptato se
prepara empleando el procedimiento descrito por Lopez et al.
en Clin. Chem., 39, 1993, páginas 196-201 [12].
El conjugado CGS30 (o
CGS33)-aloficocianina (APC) se prepara según el
procedimiento descrito en el documento WO92/01225 [13]. Para el
análisis se emplean los siguientes tampones:
- tampón conjugado: PO_{4} 50 mM pH 7,0, BSA
0,1%, EDTA 1,5 mM, inmunoglobulinas de ratón normal 1,5 mM, KF 600
mM, Kathon 0,1%,
- tampón de incubación: PO_{4} 50 mM pH 7,0,
BSA 1%, EDTA 1,5 mM, suero humano normal al 10%, Kathon 0,1%.
A cada pocillo de una microplaca negra de 96
pocillos se añaden, en este orden:
- 100 \mul de conjugado
CGS06-criptato diluido en el tampón conjugado, a una
concentración de 0,5 \mug/ml,
- 100 \mul de conjugado CGS30 (o
CGS33)-APC diluido en el tampón conjugado, a una
concentración de 5 \mug/ml, y
- 100 \mul de calibrador o muestra a analizar
diluido en el tampón de incubación.
Se dejan incubar durante 1 hora a 37ºC, después
se mide la fluorescencia de cada pocillo a 620 y 665 nm en equipos
adecuados, según describe Mathis en Clin. Chem. 39, 1993, páginas
1953-1959 [14].
Los resultados obtenidos se indican en la figura
6, que muestra la concentración de CgA (en ng/ml) en función de la
señal detectada.
La sensibilidad del análisis realizado de este
modo con los anticuerpos CGS06 y CGS30 (o CGS33) es de 1,5 ng/ml, y
los coeficientes de variación intraanálisis son de 2,88% para una
concentración de 15,7 ng/ml de CgA, de 1,5% para una concentración
de 50 ng/ml e inferiores a 1% para cualquier concentración superior
a 50 ng/ml. Los coeficientes de variación interanálisis son de 1,2%
para una concentración de CgA de 70 ng/ml (n=11 análisis), de 1,7%
para una concentración de 409 ng/ml (n=10).
Se realiza un estudio de recuperación
sobrecargando muestras patológicas de suero A a H con una
concentración de CgA conocida con una cantidad definida de CgA
humana libre de fragmentos contaminantes. La tasa de recuperación se
calcula determinando la proporción entre la concentración de CgA
humana medida con este análisis y la concentración teórica de la
mezcla. En la tabla 4 se indican los resultados de este estudio. Los
niveles de recuperación obtenidos se encuentran entre 93,4% y 106%,
lo que indica que los anticuerpos elegidos para este análisis
facilitan una identidad de reconocimiento entre la CgA humana
contenida en las muestras patológicas y la CgA humana recombinante
purificada exenta de fragmentos contaminantes.
Se realizó una correlación entre el análisis IRMA
descrito en el ejemplo 2 (CGS06 y CGS30) y el análisis FIA del
ejemplo 3 utilizando los anticuerpos CGS06 y CGS33, en 100 muestras
normales y 95 muestras de pacientes aquejados de una patología
tumoral de tipo neuroendocrino. En la tabla 7 se presentan los
resultados. La ecuación de la recta obtenida corresponde a y =
0,8964 x = 7,4205 y el coeficiente de determinación obtenido es
0,9776.
El estudio comparativo de las 100 muestras
normales y de las 95 muestras patológicas, cuyos resultados se
incluyen en la figura 8 y en la tabla 5, muestra una buena
discriminación entre estos dos tipos de muestra, así como una gran
concordancia entre el análisis FIA (CGS06/CGS33) descrito en el
ejemplo 3 y el análisis IRMA (CGS06/CGS30) del ejemplo 2. Esta
concordancia confirma la importancia de la utilización de un
anticuerpo dirigido contra la secuencia nº 4 (secuencia
145-197) en asociación con CGS06 dirigido contra la
secuencia nº 3 (219-234).
[1]: Konecki et al., J. Biol.
Chem., 262, 1987, páginas
17026-17030.
[2]: Corti et al., Br. J.
Cancer, 73, 1996, páginas 924-932.
[3]: US-A-4 758
522.
[4]: Syversen et al., Acta
Oncologica, 32, nº 2, 1993, páginas
161-165.
[5]: Kohler y Milstein,
Nature, 1975, 256, páginas
495-497.
[6]: O'Connor et al., New Engl.
J. Med., 1984, 311, páginas 764-770.
[7]: O'Farrel, J. Biol. Chem., 72,
1975, páginas 248-254.
[8]: Bader y Aunis,
Neuroscience, 8, 1983, páginas
165-181.
[9]: Taupenot et al., Regul
Pept., 56, 1995, páginas 71-88.
[10]: Goumon et al., Eur. J.
Biochem., 235, páginas 516-525.
[11]: EP-A-0 321
353.
[12]: Lopez et al., Clin.
Chem., 39, 1993, páginas 196-201.
[13]: WO 92/01225.
[14]: Mathis, Clin. Chem., 39,
1993, páginas 1953-1959.
[15]: Munoz, Lab. Invest.,
1991, vol. 64, páginas 826-832.
[16]: Degorce et al, Tumor
Biol., 18, nº supl. 1, 1997, página 112.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ 1) Xaa = aminoácido indeterminado\cr \begin{minipage}[t]{145mm} 2) La secuencia se precisó empleando péptidos sintéticos. Se ha podido mostrar que la secuencia reconocida se limita en realidad a la región 219-234.\end{minipage} \cr \begin{minipage}[t]{145mm} 3) De igual forma, fue posible determinar que el anticuerpo CGS20 reconoce un epítopo más restrictivo correspondiente a la secuencia 250-301 (pancreastatina humana).\end{minipage} \cr}
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Procedimiento de análisis inmunológico de la
cromogranina A humana (CgA) presente en una muestra utilizando al
menos un anticuerpo monoclonal o policlonal que se una
específicamente a un epítopo situado sobre la secuencia de
aminoácidos comprendida entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido
nº 234 a partir del extremo N-terminal de la CgA
humana.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el análisis se realiza en fase homogénea o en fase
heterogénea.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el análisis inmunológico es un análisis competitivo entre
la cromogranina A de la muestra y una cantidad dada de cromogranina
A humana marcada, por los sitios de dicho anticuerpo.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el
que el anticuerpo es específico de un epítopo situado sobre la
secuencia comprendida entre el aminoácido nº 219 y el aminoácido nº
234 de la CgA humana o sobre la secuencia comprendida entre el
aminoácido nº 145 y el aminoácido nº 197 de la CgA humana.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 y 4, en el que la cromogranina A marcada está
marcada con un marcador del grupo que comprende los radioelementos,
los elementos luminiscentes, las enzimas, los cromóforos
fluorescentes, los cromóforos absorbentes de luz y cualquier otro
ligando que permita una medición cuantitativa directa o
indirecta.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el análisis inmunológico es un análisis tipo emparedado
que utiliza un primer anticuerpo monoclonal o policlonal que se une
específicamente a un primer epítopo de la CgA humana, y un segundo
anticuerpo monoclonal o policlonal que se une específicamente a un
segundo epítopo de la CgA humana diferente del primero, estando
situado al menos uno de los epítopos sobre la secuencia comprendida
entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido nº 234 de la CgA humana y
estando marcado uno de los dos anticuerpos.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el primer y el segundo anticuerpos se eligen entre los
anticuerpos específicos de los epítopos situados sobre las
secuencias comprendidas entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido
nº 197 y/o entre el aminoácido nº 219 y el aminoácido nº 234 de la
CgA humana.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el primer anticuerpo es específico de un epítopo situado sobre
la secuencia comprendida entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido
nº 197 de la CgA humana o sobre la secuencia comprendida entre el
aminoácido nº 219 y el aminoácido nº 234 de la CgA humana, y el
segundo anticuerpo es específico de un epítopo situado sobre la
secuencia comprendida entre el aminoácido nº 250 y el aminoácido nº
301 de la CgA humana.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que el anticuerpo marcado está marcado
con un marcador del grupo que comprende los radioelementos, los
elementos luminiscentes, las enzimas, los cromóforos fluorescentes,
los cromóforos absorbentes de luz y cualquier otro ligando que
permita una medición cuantitativa directa o indirecta.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que el anticuerpo marcado está marcado
por un compuesto luminiscente donante de energía y el otro
anticuerpo está acoplado a un compuesto luminiscente receptor de
energía.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el compuesto luminiscente donante de energía es un criptato
de europio y el compuesto luminiscente receptor de energía es una
aloficocianina.
12. Anticuerpo monoclonal capaz de unirse
específicamente a un epítopo situado sobre la secuencia de
aminoácidos comprendida entre el aminoácido nº 219 y el aminoácido
nº 234 a partir del extremo N-terminal de la
cromogranina A humana.
13. Anticuerpo monoclonal capaz de unirse
específicamente a un epítopo situado sobre la secuencia de
aminoácidos comprendida entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido
nº 197 a partir del extremo N-terminal de la
cromogranina A humana.
14. Reactivo inmunológico que contiene al
anticuerpo monoclonal de la reivindicación 12 ó 13 acoplado a un
marcador detectable elegido entre los radioelementos, los compuestos
luminiscentes donantes de energía, los compuestos luminiscentes
receptores de energía, y cualquier otro ligando que permita una
medición cuantitativa directa o indirecta.
15. Kit de análisis inmunológico de la
cromogranina A humana (CgA) que comprende:
- un primer anticuerpo, y
- un segundo anticuerpo,
siendo al menos uno de los dos
anticuerpos un anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la
secuencia de aminoácidos comprendida entre el aminoácido nº 145 y el
aminoácido nº 234 a partir del extremo N-terminal de
la CgA
humana.
16. Kit según la reivindicación 15, en el que el
primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se eligen entre los
anticuerpos específicos de los epítopos situados sobre las
secuencias comprendidas entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido
nº 197 y/o entre el aminoácido nº 219 y el aminoácido nº 234 de la
CgA humana.
17. Kit según la reivindicación 15, en el que uno
de los anticuerpos es específico de un epítopo situado sobre la
secuencia comprendida entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido nº
197 o sobre la secuencia comprendida entre el aminoácido nº 219 y el
aminoácido nº 234, y el otro anticuerpo es específico de un epítopo
situado sobre la secuencia comprendida entre el aminoácido nº 250 y
el aminoácido nº 301 de la CgA humana.
18. Kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que uno de los anticuerpos está
acoplado a un compuesto luminiscente donante de energía y el otro
anticuerpo está acoplado a un compuesto luminiscente receptor de
energía.
19. Kit según la reivindicación 18, en el que el
compuesto luminiscente donante de energía es un criptato de europio
y el compuesto luminiscente receptor de energía es una
aloficocianina.
20. Kit de análisis inmunológico competitivo que
comprende un anticuerpo específico de un epítopo situado sobre la
secuencia comprendida entre el aminoácido nº 145 y el aminoácido nº
234 de la CgA humana.
21. Kit de análisis según la reivindicación 20,
en el que el anticuerpo es específico de un epítopo situado sobre la
secuencia comprendida entre el aminoácido nº 219 y el aminoácido nº
234, o sobre la secuencia comprendida entre el aminoácido nº 145 y
el aminoácido nº 197 de la CgA humana.
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