MXPA98004368A - Inmunoensayo de topiramato, asi como analogos y anticuerpos - Google Patents
Inmunoensayo de topiramato, asi como analogos y anticuerposInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un inmunoensayo de topiramato y reactivos para su uso en el inmunoensayo;en particular, el topiramato es derivado en la porción sulfamato o en el grupo metilo del carbono 9 o carbono 10 del topiramato para agregar una marca unida directamente o mediante un grupo de enlace, para utilizarse como un rastreador (análogo competitivo de analitos) o para agregar un grupo de enlace unido a un vehículo para su uso como un inmunógeno, para inducir anticuerpos anti-topiramato;también se proveen métodos y equipos para el inmunoensayo.
Description
INMUNOENSAYO DE TOPIRAMATQ . ASI COMO ANÁLOGOS Y ANTICUERPOS
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a i nmunoanál i s s para topirarnato y a análogos de topiramato útiles como inmunógenos y rastreadores y a anticuerpos anti-topiramato útiles en el inmunoanál si s.
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El topiramato (sulfamato de 2» 3:4» 5-bis-Q-d-meti let 1 den)-ß-D-fructopi ranosa) es un fármaco ant epi 1 óptico recién desarrollado» que ha demostrado ser útil en el tratamiento de alteraciones convulsivas. Vigilar los niveles en sangre de fármacos terapéuticos es una práctica rutinaria para seguir la terapia y garantizar la seguridad en los pacientes. La cuanti icación de los fármacos en los tejidos o_ fluidos del cuerpo también es importante en los estudios farmacocinéticos y en la vigilancia del cumplimiento de los pacientes. Adí pues, hay necesidad de un método analítico para determinar la concentración de topiramato en muestras de pacientes» part cularmente en plasma y suero. En la actualidad hay dos métodos analíticos disponibles para medi el topiramato. Ambos utilizan la cromatografía de gas. El primero emplea cromatografía de gas acoplada con detección de ionización en llama» el segundo» cromatografía de gas con espectroscopia de masa. Estos métodos son tardados» requieren equipo especializado» analistas sumamente entrenados y preparación Intensiva de la muestra y son costosos. Los métodos requieren también de volúmenes de muestra que son demasiado grandes para ser usados en la prueba pediátrica» a menos que las concentraciones de topiramato sean anormalmente altas. En pocas palabras» los métodos existentes para el topiramato no son adecuados para el uso rutinario en un laboratorio químico clínico típico ni en un laboratorio de hospital . Se ha utilizando los i munoanál sis durante más de 20 años para vigilar los niveles en suero o en plasma de fármacos terapéuticos» en el laboratorio clínico y en el hospital. Algunas ventajas de los munoanál sis son que dichos análisis son precisos» sensibles y en muchos formatos de análisis comercial» fáciles de usar. Un i nmunoanál sis para medir el topiramato aseguraría la disponib l dad de un método analítico que pudiera usarse rutinariamente para medir los niveles de fármaco en muestras de pacientes. Sin embargo» puede ser difícil o imposible construir un análogo de fármaco adecuado para conjugarlo con una molécula grande (tal como una proteína) para desarrollar un inmunógeno que induzca a un anticuerpo a reacción con el fármaco. Frecuentemente la formación de derivado necesaria para crear un inmunógeno altera lo suficiente el fármaco» de manera que los anticuerpos resultantes reconocen el análogo pero no el fármaco. Por lo tanto» la preparación de análogos que sean adecuados para la conjugación a una pro eína e induzcan anticuerpos que reconozcan tanto el análogo como el fármaco, es necesaria para desarrollar un i munoanál isis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención provee un análogo de topiramato que se forma a derivado para incluir un grupo enlazador. En una modalidad» se conjuga el análogo de topiramato con un marcador para formar un análogo de topiramato que actúe como un rastreador. En otra modalidad» el análogo de topiramato es conjugado a un portador para formar un análogo de topiramato que actúa como un inmunógeno. En una modalidad» el análogo de topiramato tiene la fórmula:
En la fórmula» uno de Rx y R2 es H. El otro es R-Y. R es un grupo enlazador y Y es un portador o marcador. Cuando R1 es H»
X es H. Cuando R. no es H» X es H o un grupo alquilo. En otra modalidad» el análogo de topiramato tiene la formula;
En la formula» R.:i, es R'—Y. R ' es un grupo enlazador que incluye un grupo de an llo heterocíclico en donde el N del grupo sulfamato o topiramato es un miembro del anillo. Y es un portador o un marcador. La invención provee también anticuerpos topiramato inducidos utilizando un inmunógeno de esta invención. Un método de i munoanál isis para topiramato» de esta invención» se basa en la competencia entre el topiramato presente en la muestra y un rastreador de esta invención» para anticuerpos anti-topiramato . En una modalidad» el nmunoanál si s es un inmunoanál isis con polarización de fluorescencia. También se provee los equipos de i munoanál sis.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención provee análogos novedosos de topiramato. En una modalidad» se forma el análogo de topiramato para incluir un grupo enlazador que facilite la conjugación con un portador o un marcador» para formar análogos de top?ramato que pueden ser usados como munogenos y como rastreadores, respecti amente. Los análogos de topiramato que incluyen un portador inducen anticuerpos que reaccionan con el análogo y con el topiramato. Los análogos de topiramato que incluyen un marcador pueden ser usados como rastreador en un formato de in unoanál s s competitivo. Los anticuerpos ant — topira ato y los inmunoanál isis para topiramato que utilizan los reactivos de esta invención también están provistos.
LOS AN LOGOS DE TOPIRAMATO
Un análogo de topiramato de esta invención es un derivado de topiramato que incluye una porción química que fac lita la unión de un portador o un marcador al análogo de topiramato. Los análogos de topiramato de esta invención también son formados como derivados en la porción sulfamato o en el grupo metilo del carbono 9 o en el grupo metilo funcionalmente equivalente» del carbono ÍO del topiramato. (La estructura de topiramato que muestra la numeración de carbonos y la ubicación de la porción sulfa ato, puede ser encontrada más adelante en el cuadro 1). Por conveniencia» en lo sucesivo» se entenderá la discusión del grupo de carbono 9 del topiramato refiriéndose también a la posición del carbono 10 del equivalente. La formación de derivados de la porción sulfamato, en lugar del grupo metilo del carbono 9, puede ser ventajosa debido a que la porción del análogo de topiramato disponible para la inducción del anticuerpo y su reconocimiento es la región que difiere en el metabolito 9-hidroxi-topiramato del topiramato (mostrado en el cuadro 1). Así pues» la conjugación de un portador a través de un grupo enlazador por medio de la porción sulfamato del topiramato» produce un inmunógeno que puede desatar la formación de anticuerpos con reactividad cruzada mínima con el 9-hidroxi-top ramato. La derivación de topiramato en la porción sulfamato o en el grupo metilo del carbono 9 provee un análogo de topira ato que es suf cientemente similar en sentido inmunológico al topiramato» para que los anticuerpos inducidos por el análogo reaccionen tanto con el análogo como con el topiramato. Por cons guiente» los análogos de topiramato de esta invención pueden incluir un portador que sea capaz de inducir anticuerpos anti—topi ramato . Ad c onal mente » los análogos de topiramatos pueden ser marcados para usarlos como rastreadores en un inmunoanál si » tal como se describe más completamente después. Dos fórmulas generales para análogos de topiramato de esta invención están mostradas a cont uación.
En la fórmula» uno de R1 y R.-, es H. El otro es un grupo enlazador. Cuando Rx es H » X es H . Cuando Rx no es H » X es H o un grupo alquilo.
En la formula» R3 es un grupo enlazador que incluye un grupo heterocíclico en el cual el N del grupo sulfamato del topiramato es un miembro de an llo. Como es bien sabido» los fármacos u otros haptenos pueden ser formados a derivados para incluir un grupo enlazador con una porción química que facilita la unión del hapteno a un portador o a un marcador. Los grupos enlazadores para preparar inmunógenos y/o rastreadores a partir de haptenos son bien conocidos y están descritos» por ejemplo» en la patente estadounidense No. 5,051»3S1 (expedida el 24 de septiembre de 1991 a Stenglein y co ventores) y en Wong. S. Chemistry of Protein Con ugation and Cross-LinKing , CRC Press» Inc., Boca Ratón» Florida (1991). Las porciones químicas adecuadas en los grupos enlazadores para la conjugación incluyen los grupos carboxi» amino» imino» amido» carbonilo» nonoxocarboni lo » azido, fosfonio, tio» hidroxi» alcoxi» halógeno» sulfoniloxi» hidrox en lo» imidazol lo» mal eimi do» así como otros grupos B
saturados o insaturados. Dichos grupos enlazadores son bien conocidos» al igual que las diversas químicas para sintetizar los análogos de hapteno que lleven dichos grupos enlazadores. En algunas modalidades, se puede hacer reaccionar el grupo enlazador con un precursor de topiramato» de manera que el topiramato (en ausencia de uno o más hidrógenos) se forme unido al grupo enlazador» tal como se describe más completamente después . Los grupos enlazadores pueden incluir hasta 30 átomos de carbono y de O a 10 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre» nitrógeno y halógenos. En general» el grupo enlazador tiene de 1 a 15 átomos diferentes de hidrógeno» más usualmente» de l a 10 átomos diferentes de hidrógeno. Puede utilizarse brazos enlazadores más largos» cuando sea conveniente» para unir el marcador o portador a una distancia mayor de la molécula de topiramato. Cuando X es un grupo alquilo» el grupo alquilo hab tualmente tiene de l a 5, mejor aún» de 1 a 3» más preferido de 1 a 2 átomos de carbono. Para producir análogos de topiramato en los cuales X es un grupo alqu lo» convenientemente se ut liza un precursor de topiramato. En particular el precursor de cloruro de ácido del topiramato (cl orosulfato de di isoprop 1 i den— ructopi anosa) » puede ser preparado como se describió en Maryanoff y coautores» J. Med. Chem. 30-B80-BB7 (1987) y se hace reaccionar con una alquila ina para formar el análogo de N-al qu 1-topiramato.
Brevemente» se puede preparar el cloruro de acido de la siguiente manera. Se añade a gotas una solución de 93 ml » 1.15 moles» de cloruro de sulfurilo» en 100 mi de cloruro de metileno» a una solución enfriada a —35°C» a 150 g» 0.58 mol» de diacetona—fructosa en 400 ml de cloruro de metileno y 150 ml de piridina. para formar una mezcla de reacción. Se agita la mezcla de reacción y se deja calentar hasta la temperatura ambiente. Se agita la mezcla de reacción durante otras dos horas. Se elimina los solventes al vacío para formar el precursor de cloruro de áci o— opi ramato. Luego se puede hacer reaccionar el precursor de cloruro de ácido con una alqui lamina para producir un análogo de topiramato en el cual X es un grupo alquilo. Más específico» el precursor de cloruro de ácido puede hacerse reaccionar con una al qui lamina» tal como metilamina» ácido 6— a nocaproico» N-meti 1-gl i ciña o N—eti 1-gl ci a para producir un análogo de topiramato en el cual X es un grupo alquilo. Por ejemplo, el precursor de cloruro de ácido de topiramato puede hacerse reaccionar con metilamina. tal como se describió en Maryanoff y coautores» J. Med. Chem. 30:880-887 (1987) para formar N-meti 1-topiramato. Se disuelve 35 g» 0.20 mol» del cloruro de ácido de topiramato precursor preparado como se describió anteriormente» en 150 ml de acetonitrilo anhidro y se añade metilamina. Se tapa per ectamente la mezcla de reacción durante 3 días y luego se elimina el solvente al vacío. Se somete el jarabe resultante a cromatogra ía de líquido (columna lO
seca de gel de sílice» acetato de et lo/hexano, 4:4) para dar 4.1 g, 12%. de un jarabe amarillo claro, que es homogéneo mediante cromatografía de capa delgada y RMN con 3H. Se puede utilizar métodos similares con otras alqu laminas para formar otros análogos de N—al qui 1—topi ramato. El grupo enlazador puede incluir un grupo heterocícl co en el cual N del grupo sulfamato del topiramato es un miembro del anillo. Un grupo heterocíclico es una estructura anular cerrada» habitualmente de cinco o seis miembros» en donde uno o más átomos del anillo es un elemento diferente del carbono. Un grupo heterocícl co ejemplar adecuado, por ejemplo, es pirrolidina» piperidina» piperazina o morfol i a. Para formar el grupo heterocícl co generalmente se utiliza un precursor de topiramato. En particular» se puede hacer reaccionar el precursor de cloruro de ácido de topiramato con un heterociclo para formar un análogo de topiramato heteroc cl co. El grupo enlazador análogo de topiramato puede incluir un grupo sustituible. El grupo sustituible es una porción química que es activa para conjugar el análogo de topiramato a un marcador o un portador. Como parte del proceso de conjugación» se desprende uno o más átomos del grupo sustituible. Ad c onalmente» la conjugación de un marcador o de un portador generalmente da por resultado la conjugación del grupo sustituible» de manera que el grupo enlazador en el conjugado incluye el residuo que queda de dicha modif cación. Por conveniencia en la presente» el término "grupo enla?ador" se referirá al grupo enlazador unido al topiramato para formar un análogo de topiramato y el residuo del grupo enlazador después de la conjugación a un marcador o a un portador. En varias modalidades ejemplif cadas aquí» se deriva el top ramato con un grupo enlazador que incluye un grupo carboxi'lo que es usado para unir los análogos a un marcador o a un portador. En un proceso de conjugación ejemplar» el grupo carboxilo en el análogo de topiramato es reaccionado con N— hidrox succini ida (NHS) para formar un éster activo. Ese éster activo reacciona con los grupos amino para formar los conjugados de análogos de topiramato. Pueden estar presentes grupos amino en pequeñas moléculas, tales como derivados de fluoresceína o de biotina o macromoléculas» tales como proteínas tales como albúmina de suero bovino o fosfatasa alcalina. Cuando el conjugado contiene un portador o un marcador, se puede usar el análogo de topiramato como un inmunógeno o como un rastreador» respectivamente. Si bien los análogos de topiramato descritos aquí son ejempl ficados con un grupo carboxilo que participa en el proceso de conjugación» otras porciones químicas que pueden participar en la conjugación son bien conocidas y también están disponibles. Por ejemplo» los derivados de apiina o los derivados tiol de topiramato pueden ser acoplados a marcadores o portadores utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Los análogos de topiramato ejemplares están mencionados a continuación» en el cuadro 1» seguidos por las estructuras para los compuestos. El compuesto No. 5. 9-hidroxi-topira ato» es un metabolito de topiramato conocido.
CUADRO 1 EL TOPIRAMATO Y SUS ANÁLOGOS
1.- SULFAMATO DE 2» 3:4>5-BIS-0-(l-METILETILIDEN)-B-D- FRUCTOPIRANOSA (TQPIRAMATO)
.- MONOHIDRATO DE LA SAL DE SODIO DE N-CARBQXIMETIL-TOPIRAMATO (denominado también el análogo de glicina de topiramato de TGA)
LA SAL DE SODIO DE N-(5-CARB0XIPENTIL ) TOPIRAMATO (denominada también el análogo de ácido caproico de topiramato» sal de sodio o TCA)
4.- 9—CARBOXIMETIL—TOPIRAMATO (también denominado el análogo de cetal de ácido topiramato levulínico o 9—CMT)
.- 9-HIDROXI-TOPIRAMATO (9-OH-T)
Los análogos de topiramato de esta invención fueron preparados utilizando métodos de síntesis química comunes y corrientes. Los métodos ejemplares para producir los análogos 2—4 están descritos detalladamente en los ejemplos 1—3. La preparación de topiramato y de diversos análogos de topiramato que pueden ser usados como materiales de partida está descrita en Maryanoff y coautores, J. Med. Chem. 30:880-887 (1987). Adicionalmente» se vende topiramato bajo la marca TOPAMAX por Ortho/McNeil Pharmaceuticals. Los análogos de topiramato de esta invención también incluyen el topiramato unido a un portador o a un marcador para formar un inmunógeno o un rastreador» respectivamente. En los inmunógenos de esta invención» un análogo de topiramato que incluye un grupo enlazador» es conjugado con un portador. En los rastreadores de esta invención» un análogo de topiramato que incluye un grupo enlazador es conjugado a un marcador. Estos análogos de topiramato pueden ser representados por las dos fórmulas generales que se muestran más adelante.
En 1 a fórmula» uno de R1 y R2 es H. El otro es R—Y. R es un grupo enlazador e Y es un portador o un marcador. Cuando R es H, X es H. Cuando R no es H» X es H o un grupo alquilo. En otra modalidad, el análogo de topiramato es de la fórmu l a
En la formula. R..,, es Rt—Y. R ' es un grupo enlazador que incluye un grupo de anillo heterocícl ico en donde el N del grupo sulfamato o topiramato es un miembro del anillo. Y es un portador o un marcador.
Un inmunógeno de esta invención es un análogo de topiramato que incluye un portador. El término "portador" es usado en la presente como en la técnica para indicar una sustancia que es in unógena en un animal anfitrión seleccionado. La preparación de inmunógenos por enlazamiento de un na te o a un portador es bien conocida. La selección del portador y la ruta de administración varían» dependiendo del animal anfitrión. Los portadores generalmente son moléculas grandes» habi ualmente polímeros. muy preferible proteínas grandes de una especie muy diferente a la del animal anfitrión. Frecuentemente se utiliza albúmina de suero bovino (BSA) y hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH)» como portadores para inducir anticuerpos en ratones» ratas, cabras, conejos» pollos y ovejas. Las preparaciones ejemplares de análogos de topiramato inmunógenos para inducir anticuerpos ant -top ra ato ÍS
están descritas en los ejemplos. En esas preparaciones in unógenas ejemplares» R-Y es ( CH.^)„CO-NH-( portador ) » en donde n es de 1 a 9. Más específ camente» hay ejemplos en donde n es 1 o 5 y BSA es el portador ejemplar. El término "rastreador" es usado en la presente como en la técnica para hacer referencia a un análogo de anal íto marcado» utilizado en un formato de inmunoanál sis competitivo. Un marcador de esta invención es un análogo de topiramato que incluye una etiqueta que está unida al topiramato por medio de un grupo enlazador. El término "etiqueta" se usa para hacer referencia a sustancias que pueden ser detectadas directa o indirectamente. Las etiquetas que pueden ser detectadas directamente incluyen» por ejemplo» una radionuclida o un fluorocromo. Las etiquetas también pueden ser detectadas indirectamente por medio de una o más reacciones. Dichas etiquetas incluyen las enzimas que son detectadas por producción de un producto de color. Dichos marcadores de enzima y sus sistemas de desarrollo de color son bien conocidos. Otras etiquetas incluyen el uso de un miembro de un par de unión específico. tal como biotina/avid na . Los marcadores adecuados . para uso en los procedimientos de inmunpanál s s son bien conocidos e incluyen. por ejemplo» enzimas» radionucl idas , f luorocro os . biotina y similares, convenientemente» la etiqueta es un fluorocromo. Los fluorocromos adecuados incluyen rodamina (por ejemplo» isotiocianato de tetramet 1-rodami na (TRITC)» ficoeritrina (PE), al oficocianina (APC)» Texas Red (Molecular Probes» Eugene OR) y de preferencia, fluoresceína. Aunque son fluorocro os adecuados» la al oficocianína y la ficoeritri a» no pueden ser usados para inmunoanál sis con polarización de fluorescencia» debido a que son demasiado grandes. Las fluoresceínas adecuadas incluyen isotioc anato de fluoresceína (FITO» 2-(aminoeti 1 )tioureido-f luoresceína (FTED)» tiosemicarbazida de fluoresceína (FTSC), ( 2-aminoeti 1 )ureido-f luoresceína (FAMCO-E). eritroci -( tetra-yodo-fluoresceína) y f1 uoresceinamina (FAñ). El fluorocromo puede ser unido al grupo enlazador por medio de una posición disponible en el núcleo de fluorocromo. Las etiquetas de fluoresceína que consisten del grupo enlazador unido en las posiciones 5» S» 4T y 5*» son las preferidas. Las etiquetas unidas por medio de 1 a posición 5 y/6 6 son las más preferidas. (Véase, por ejemplo» el cuadro 2» los rastreadores 4-10 ) . Por conveniencia, los rastreadores que tienen un residuo de fluoresceína conectado al grupo enlazador por medio de la posición 5 de la porción de fluoresceína» están designados como isómero I. Los rastreadores que tienen un residuo de fluoresceína conectado al grupo enlazador a través de la posición S de la fluoresceína» están designados como isómeros II. A menos que se especifique de otra manera, no se hará distinción ninguna entre los isómeros o entre una mezcla de isómeros. Para los rastreadores marcados con fluoresceína y con rodamina» existe poco o nada de la forma lactona durante las mediciones de fluoresceína y existen las formas pol carboxi ladas primariamente como sales. El fluorocromo puede ser una composición homogénea o una mezcla de isómeros. Adicionalmente, el fluorocromo puede ser usado en su forma lactona o como una sal biológicamente aceptable (por ejemplo» las sales de sodio» de potasio» de amonio y similares), de manera que el fluorocromo pueda existir en su estado ionizado en el i munoanál isis . El cuadro 2 que viene más adelante tiene una lista de inmunógenos y rastreadores de análogo de top?rarnato que puede ser preparado co o se describe en los ejemplos; éstos fueron derivados de análogos de topira ato ejemplares mencionados en el cuadro 1. En la preparación de los inmunógenos y los rastreadores» los análogos de topiramato del cuadro 1 fueron activados por procedimientos comunes y corrientes para formar el éster N— idrox i succ nimida del grupo ácido carboxílico. A su vez» el éster activo se hizo reaccionar con una amina primaria en el portador o en la etiqueta para formar una amida. Alternati amente» se puede condensar los ácidos carboxílicos con aminas utilizando otros métodos conocidos en la técnica. Los métodos de síntesis para la formación de las amidas de ácidos carboxílicos son bien conocidos y están descritos» por ejemplo» en la patente estadoun dense NO. 5,051.361 (de Stenglein y co nventores. expedida el 24 de septiembre de 1991). Los métodos para hacer conjugados inmunógenos también están descritos en Methods in Im unology and Immunochem stry , (Cur s A. W ll ams y Merri 1 W. Chase, editores» Volumen 1» 1967). Esas referencias quedan incorporadas aquí mediante esta referencia en su totalidad. Adicionalmente, los métodos ejemplares para producir análogos de topiramato ejemplares» útiles como rastreadores o co o inmunógenos» están descritos detalladamente en los ejemplos. Los análogos de topiramato ejemplares útiles como inmunógenos y rastreadores están mencionados en la lista que sigue del cuadro 2» y van seguidos por las estructuras de esos compuestos.
CUADRO 2 CONJUGADOS TOPIRAMATO
TGA . BSA 9 -CMT - BSA
TCA-BSA
TGA.FTED
GA.FTSC
TOA-FAMCO-E
TGA:Gly-FAM
TCA.FTED
TCA-FAMCO-E CA:FAMCO-E tracer, isomer II
. 9-CMT-FAMCO-E
. TGA-R:bi?tÍn LOS ANTICUERPOS ANTI-TOPIRAMATO
Los anticuerpos anti-topiramato de esta invención reaccionan con el topiramato y con el análogo de topiramato usado para inducir los anticuerpos. Se puede inducir los anticuerpos anti-topiramato utilizando un inmunógeno de esta invención formulado en una solución acuosa, tal como agua, salina normal» salina regulada con fosfato y similares» o se puede proveer en un adyuvante o en una composición sim lar. Se puede probar los anticuerpos inducidos para determinar si la composición es específica para el topiramato. Si una composición de anticuerpo anti-topiramato policlonal no provee la especif cidad deseada (por ejemplo, tiene niveles inaceptables de reactividad cruzada con los metabol tos de topiramato para muestras con elevados niveles de metabol tos)» se puede utilizar anticuerpos para muestras de análisis con bajos niveles de metabolitos o se puede usar en procedimientos en donde la reactividad cruzada con metabolitos no es preocupante» tal como se describe más completamente después. También se puede preparar los anticuerpos anti— topiramato monoclonales mediante métodos convencionales. Se puede inyectar un ratón con una composición que contiene un inmunógeno de esta invención y se puede obtener células de bazo. Estas células de bazo pueden ser fundidas con un partícipe de fusión para preparar hibridomas. Los anticuerpos secretados por los hibridomas pueden ser depurados para que seleccionen un hibridoma en el cual los anticuerpos reaccionan con el topi ramato _ Conven entemente» se puede depurar los anticuerpos para que exhiban reacción mínima con metabolitos de topiramato, tales como 9—hidroxi—topiramato. Los hibridomas que producen anticuerpos de la especif cidad deseada son cultivados mediante técnicas comunes y corrientes. Las técnicas de preparación de hibridoma y los métodos son bien conocidos y no constituyen parte de la presente invención. Las preparaciones ejemplares de anticuerpos anti— topiramato monoclonales y policlonales son descritos en estos ejemplos. Se debe notar que» en 1 a mayoría de las muestras de pacientes. está presente un solo metabolito de topiramato en una fracción pequeña (habitualmente menos del 4 por ciento) de la concentración de topiramato en la muestra. Sin embargo» pueden existir varios metabolitos y en conjunto pueden representar hasta el 20% de la dosis de fármaco en pacientes normales y hasta 50% ocas onalmente» en pacientes con metabolismo incrementado o con problemas médicos» tales como fallas renales, por ejemplo. Si bien la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-topiramato con los metabolitos tiene poca consecuencia para obtener un valor de inmunoanál sis preciso» en muestras que tienen cantidades pequeñas de metabolitos de top?ramato» de preferencia los anticuerpos anti-topiramato no reaccionan cruzadamente en forma sustancial con los metabolitos de 2S
topiramato. Por "no reaccionan cruzadamente de manera sustancial" « se quiere decir que. cuando los anticuerpos son usados en un formato de inmunoanál isis competitivo, se requiere por lo menos aproximadamente 5 veces más 9-hidroxi-topiramato para obtener la misma cantidad de inhibición de anticuerpo que con el topiramato.
EL INMUNOANALISIS
Se conoce numerosos formatos de i munoanál sis cuantitativo para detectar un hapteno, tal como un fármaco u otra molécula pequeña en un fluido corporal. Un método de análisis para el topiramato tiene los siguientes elementos. El método incluye combinar la muestra con un anticuerpo anti— topiramato y detectar la cantidad del complejo anticuerpo anti— topiramato—topiramato como indicativo de la cantidad de topiramato presente en la muestra. La manera particular en que se detecta el topiramato no tiene importancia para los propósitos de esta invención, siempre y cuando el método provea el grado deseado de sensibil dad y con abilidad. Diversos métodos para llevar a cabo inmunoanál sis están descritos en Tijssen» P.< Practice and Theory of Enzyme I munoassays , (R.H. Burdon y P.H. van Kniffenberg editores» volumen 15» 1985); y en The Immunoassay Handbook » (David W ld editor» 1994). La muestra para un inmunoanál sis de topiramato es un fluido del cuerpo» generalmente sangre» mejor aún. suero o plasma. Sin embargo» el uso de otros fluidos del cuerpo, tales como orina o saliva, también están contemplado. Se conoce bien diversos tipos de inmunoanál sis que utilizan una variedad de protocolos y de etiquetas. Las condiciones de análisis y de reactivos pueden ser cualquiera de una variedad que se encuentra en la técnica anterior. El análisis puede ser heterogéneo u homogéneo y convenientemente es un anál sis competit vo. Como se indica por la inducción de anticuerpos que reconocen los análogos de topira ato, derivados en la porción sulfamato del topiramato o en el grupo metilo del carbono 9 de topiramato» el topiramato tiene por lo menos dos epítopes diferentes que son capaces de reconocim ento para anticuerpo. Sin embargo, como con otras moléculas pequeñas» cuando un anticuerpo se une al topiramato o a un análogo de topiramato» el reconocimiento del topiramato por un segundo anticuerpo es bloqueado» lo que previene el uso de los inmunoanál sis convencionales del tipo emparedado» en donde dos anticuerpos se unen a dos epítopes del analito. Un inmunoanál is s de topiramato emplea anticuerpos anti—topiramato que pueden ser policlonales o snocl onales . Convenientemente» se puede basar el análisis sobre la competencia» en donde el topiramato presente en la muestra compite con una cantidad fija de rastreador de topiramato de esta invención. La cantidad de rastreador necesaria para cualquier análisis competitivo varía» dependiendo de muchos factores bien conocidos. Por ejemplo» cuando se marca el rastreador con un clorocromo, la cantidad de rastreador necesaria para el análisis es determinada empíricamente. La cantidad de rastreador usada debe proveer una señal apropiada para el detector usado con relación con la señal de fondo y debe proveer una cantidad de rastreador de tal manera que la afinidad de los anticuerpos anti—topiramato para el rastreador y para la escala de topiramato que puede estar presente en la muestra provea la sensibilidad deseada. En los i munoanál sis compet ivos» la preparación de anticuerpo usada es inducida por un inmunógeno que incluye un análogo de top ramato formado a derivado en la misma posición que el análogo de topiramato usado como rastreador. Es decir, el inmunógeno usado para inducir la composición de anticuerpo y el rastreador incluyen ambos el análogo de topiramato derivado ya sea en la porción sulfamato o en el grupo metilo de carbono 9 del topiramato. La unión entre los anticuerpos y el topiramato en la muestra se puede determinar de numerosas maneras. Por ejemplo» cualquier topiramato presente en la muestra puede competir con una cantidad fija» predeterm nada, de análogo de topiramato marcado (rastreador) por los sitios de unión de anticuerpo anti-topiramato. La cantidad de rastreador fijado a la fase sólida o que quede en solución se puede determinar. En una modalidad» un rastreador marcado con biotina es fijado a la fase sol da uniendo a la avidina fijada en fase sólida. El top ra ato presente en la muestra compite con el rastreador de topiramato fijado a fase solida por los anticuerpos anti-topiramato. Los anticuerpos anti—topiramato marcados» fijados en la fase sólida o que quedan en la solución pueden ser detectados. Se puede marcar directamente los anticuerpos anti— topiramato o pueden ser detectados utilizando un segundo anticuerpo marcado» específico para la especie de los anticuerpos anti-topiramato. Se puede usar otros numerosos formatos. Por ejemplo, se puede fijar en fase sólida los anticuerpos anti-topiramato. Una cantidad fija de rastreador de topiramato puede competir con el topiramato presente en la muestra por la unión al anticuerpo. La cantidad de rastreador fijado en fase sólida o el rastreador que queda en solución se determina. El rastreador puede tener una etiqueta que es detectada directamente» como con una radionucl ida , un fluorocromo o similares, o bien directamente, con una enzima. Alternat vamente, se puede marcar el rastreador de topiramato con biotina y se puede detectar con avid?na marcada con enzima o con anticuerpos marcados con avidina. Esos anticuerpos marcados con avid a pueden ser marcados directamente o pueden ser detectados con un segundo anticuerpo marcado. En otra modal dad, el i munoanál i sis es un inmunoanál isis con polarización de fluorescencia, que mide el topiramato en muestras de pacientes. Convenientemente» el inmunoanál i sis con polarización de fluorescencia puede ser usado en un sistema automático, tal como los analizadores TDxR y TDxFlxR (obtenibles comercialmente de Abbott Laboratories) diseñados para vigilar un fármaco en 1 aboratorios químicos clínicos y en hospitales. Un inmunoanál isis con polarización de luorescenc a utiliza un rastreador marcado de manera fluorescente que tiene un peso molecular pequeño (típicamente menor que 5000). Se coloca el rastreador en un rayo incidente de l z en plano polarizado. Se absorbe la luz y se puede reemitir como fluorescencia. Debido al movimiento browniano de las moléculas pequeñas, se despolariza la fluorescencia emitida. Un incremento grande en el tamaño del rastreador aumenta en gran medida su tiempo de rotación, lo que da por resultado la luz fluorescente emitida que queda polarizada. La unión de anticuerpos a un rastreador marcado con luoresceína» produce así la polarización de la luz emitida. El analito presente en la muestra compite con el rastreador por la unión de anticuerpo y, de tal manera» aumenta la despolarización de la fluorescencia. El grado de polarización depende de la concentración del analito presente en la muestra. Así pues» una curva de norma para el inmunoanál isis competitivo» en donde la cantidad de despolarización de la fluorescencia se correlaciona con la concentración del analito en aumento, puede ser preparada. Se puede empacar en equipos o estuches» convenientemente, los reactivos para analizar el topiramato. Un equipo de nmunoanál isis para analizar el topiramato puede incluir un anticuerpo anti-top ramato y un rastreador de análogo de topiramato de esta invención. Esta invención está ilustrada ad cionalmente mediante los siguientes ejemplos específicos, pero no limitativos. Las temperaturas están dadas en grados centígrados y las concentraciones como porcentaje en peso» a menos que se especifique de otra manera. Los procedimientos que son reducidos constructivamente a la práctica están descritos en el presente, y los procedimientos que han sido llevados a la práctica en el laboratorio, están expuestos en pasado. Todas las citas en la descripción anterior y en los ejemplos que siguen quedan incorporados aquí mediante esta referencia en su total i dad.
EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE N-CARBQXIMETIL-TOPIRAMATO
En un procedimiento ejemplar, se preparó N— carboximeti 1—topiramato (análogo de glicina de topiramato o TGA)» tal como se describe más adelante, a partir de topiramato (Maryanoff y coautores, J. Med. Chem, 30:880-887 (1987)). Se añadió 33.9 g (0.1 mol) de topiramato» 16.1 g (0.1 mol) de hexametil isilazano y alrededor de 1 ml de clorotrimeti Isi 1 ano a 150 ml de tetrahidrofurano» para formar una solución. Se dejó al reflujo la solución durante 5 horas y se enfrió a la temperatura ambiente. Con agitación se añadió 3.0 g (0.1 mol ) de NaH al 80%, en porciones, durante aproximadamente 10 minutos para formar una mezcla de reacción. Se volvió muy espesa la mezcla de reacción y se añadió 20 ml de dimet lformamida y 100 ml de tetrahidrofurano para disolver el precipitado presente en la mezcla de reacción» y la mezcla de reacción se volvió una solución homogénea. A continuación se añadió a gotas 19.5 g (0.1 mol) de bromoacetato de butilo terciario, durante 30 minutos, a la mezcla de reacción. Se agitó la mezcla de reacción durante la noche. Se diluyó la mezcla de reacción con 500 ml de acetato de etilo y se lavó con 2 x lOO ml de agua» luego con 100 ml de solución saturada de salmuera (NaCl saturado en agua), se secó usando sulfato de magnesio y se eliminó el solvente al vacío para producir el análogo de glicinato de terbutilo crudo, como un sólido blanco, pegajoso. El sólido crudo que contenía el análogo de glicinato de ter—butilo fue cromatografi ado en gel de sílice usando 18% de acetato de etilo/hexano (en volumen/volumen) como eluyente para producir 17.2 g (rendimiento de 38%) del análogo de glicinato de ter—butilo» como un sólido blanco. Se añadió en porciones aproximadamente 9.0 g (19.9 mmoles) de análogo de glicinato de tet—butilo a 90 ml de ácido trifluoroacét co, mientras se agitaba a la temperatura ambiente» para formar una mezcla de reacción. Después de 10 minutos se filtró la mezcla de reacción para eliminar una cantidad pequeña de material no disuelto» y se eliminó al vacío el solvente para producir el análogo de glicina crudo, como un aceite espeso. Se disolvió el aceite en 150 ml de NaOH 1N y se lavó con 2 x 50 ml de éter dietílico. Se acidificó la capa acuosa a pH 3 ut lizando HCl 3N y se extrajo con 3 x 100 ml de cloruro de metileno. Se concentró los extractos orgánicos combinados al vacío para producir 6.68 g, (84% de rendimiento) del análogo de glicina» co o una espuma blanca. Se disolvió 6. O g, 15.5 mmoles, del análogo de gl cina en 13.6 ml de NaOH 1.0 N. Se el minó al vacío el agua y se secó azeotrópica ente el residuo resultante utilizando tolueno para producir el 4-glicinato de sodio crudo» como un sólido blanco. Se trituró el sólido blanco con 2 x 50 ml de éter dietílico y se aisló el sólido resultante mediante filtración al vacío para producir 5.3 g (80% de rendimiento) del hidrato de glicinato de sodio ( —carboximeti 1—topiramato) . El punto de fusión del N-carboximet 1—topiramato fue de 169.0— 170.00C. El análisis elemental calculado para el N— carboximeti 1-topiramato (C-L^H=,:=.N0-LOSNa-H.-:0 ) es C» 38.44; H, 5.53; N, 3.20; S, 5.26 y Na, 5.2S. El análisis elemental determinado para el análogo de N-carboximet 1—top ra ato fue C» 38.27; H, 5.59? Ni 3.08; S, 5.50 y Na, 5.50. %H_.0 ( KF ) ; 4.12% (KF indica que el contenido de agua fue determinado el método de Karl Fischer y está informado como % en peso/peso). Se obtuvo el N-carboximeti 1-topi ramato (TGA) como el monohidrato de la sal de sodio» para preparar inmunógenos» rastreadores y conjugados de biotina en los siguientes ejempl os .
EJEMPLO 2 PREPARACIÓN DE N-(5-CARB0XIPENTIL ) TOPIRAMATQ (TCA)
En un procedimiento ejemplar, se preparó N—(5— carboxipenti 1 ) topiramato (análogo de ácido topiramato caproico. o TCA) a partir de clorosulfato de 2»3:4»5-bis-0-(l-meti let 1 i den)—ß—D—fructopi anosa) Maryanoff y coautores, J . Med. Chem. 30:880-887 (1987), tal como se describe a conti uac ón. Se añadió a gotas una solución de 35.8 g» O.10 mol» de clorosulfato de 2.3:4,5-bis-0-( 1-meti leti 1 den)-ß-D-fructopiranosa) en 200 ml de metano!» a una solución de 26.2 g» 0.20 mol, de ácido 6—am nocaproico y 7.91 g, 0.10 mol, de piridina en 300 ml de metano!» lentamente, durante un periodo de 2.25 horas, para formar una mezcla. Se calentó al reflujo la mezcla durante 2.5 horas, luego se concentró a presión reducida para dar un aceite rojo-naranja. Se disolvió el aceite en 300 ml de agua destilada y 200 ml de acetato de etilo, luego se hizo básica con solución 4 M de NaOH hasta pH 10-12. Se separó las capas y se extrajo repet amente la capa acuosa con 12-200 ml de acetato de etilo, hasta que se eliminó el subproducto diacetona—fructosa. A continuación se acidificó la capa acuosa con HCl concentrado a pH 5.0 y se extrajo con 4 x 150 ml de acetato de etilo. Se combinó los extractos orgánicos, se los secó sobre sulfato de magnesio, se filtró» se filtró y se concentro para dar el derivado de acido caproico, como un aceite en un rendimiento de 19.5% crudo. Se disolvió el aceite en 230 ml de 2-propanol y se trató con 13 ml de una solución 4 M de NaOH para formar una mezcla de reacción. Se concentró la mezcla de reacción y se suspendió el sólido resultante durante la noche a la temperatura ambiente en ISOPAR E (un hidrocarburo de elevado punto de ebullición obtenible de EXXON Corporation). Se filtró la suspensión y el sól do recuperado fue lavado con ISOPAR E. El secado al aire produjo 23.64 g (97.5% de rendimiento) del análogo de caproato de sodio ( N-(5-carboxipent 1 ) topiramato ) » como un sólido blanco que tenía un punto de fusión de 197.0- 202.0°C. El análisis elemental calculado para C?aHaoN0 oSNa es
C» 45.475 H, 6.36; N» 2.95; S» 6.74 y Na» 4.83. El análisis elemental determinado para el análogo fue C» 44.87; H» 6.31; N»
2.89; S, 6.44 y Na, 5.08. Se usó el N-( 5—carboxipenti 1 ) topi ramato (TCA) como la sal de sodio para preparar inmunógenos y rastreadores en los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 3 PREPARACIÓN DE 9-CARBOXIMETIL-TOPIRAMATO (9-CMT)
En un proced miento ejemplar se preparó 9— carboximeti 1-topiramato (9-CMT) (el análogo de cetal del ácido levul ínico)» como se describe a continuación.
Se anadio 24.6 g» 0.166 mol» de ortoformiato de trietilo a una solución agitada que contenía 24.0 g (0.166 mol) de levulinato de etilo, 0.8 ml de ácido sulfúrico y 300 ml de etanol absoluto para formar una mezcla de reacción. Después de agitar la mezcla de reacción durante 30 minutos a la temperatura ambiente, se añadió 16.4 g (0.055 mol, de sulfamato de 2»3-0-(l-meti !eti 1 din)-B-D-fructopiranosa (Maryanoff y coautores, J. Med. Chem. 30:880-887 (1987) y se continuó la agitación durante 16 a 18 horas. Se añadió 80.0 g, 0.75 mol, de carbonato de sodio sólido a la mezcla de reacción» seguido por lOO ml de agua destilada» para formar una mezcla de reacción con un pH de 7.0. Se filtró la mezcla de reacción y se diluyó con alrededor de 500 ml de acetato de etilo. Se separó las capas y se lavó !a capa orgánica con 3 x 200 ml de solución saturada de cloruro de sodio» se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para producir un ace te» como una mezcla de cetal, una pequeña cantidad de diol y levulinato de etilo. Se trituró repetidamente el aceite con hexano hasta que se eliminó el exceso levulí ato de etilo y se disolvió el aceite en 125 ml de metano! para formar una solución metanólica. Se añadió 250-300 ml de NaOH 1N a la solución metanólica y se calentó la mezcla de reacción resultante al reflujo durante aproximadamente 2 horas. Después de enfriar a la temperatura ambiente se extrajo la mezcla de reacción con 3 x 100 ml de acetato de etilo. Se acidificó la capa acuosa a pH 4.0 utilizando HCl 3N y se extrajo con 3 x 100 ml de acetato de etilo. Se combinó los extractos orgánicos, se los secó sobre sulfato de magnesio durante la noche» se filtró y se concentró para dar 15.7 g (rendimiento de 71.8%) del derivado cetal del ácido levul ínico (9-carboximeti 1-topiramato ) . como una espuma frágil. blanca, que tiene un punto de fusión de 42.0-45.0°C. El análisis elemental calculado para Ci?4H23N0;1_oS es C, 42.31; H, 5.83» N, 3.52; S, 8.07. El análisis elemental determinado para el análogo fue C, 42.55; H, 5.B3; N, 3.38; S, 7.57. Se usó el 9—carboximet 1-topiramato (9-CMT) como el ácido libre para preparar los inmunógenos y Tos rastreadores en los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 4 PREPARACIÓN DE INMUNOGENO DE N-CARBOXIMETIL-TOPIRAMATQ: ALBÚMINA DE SUERO BOVINO
Este ejemplo describe la preparación de un inmunógeno ejemplar de la invención» en donde se conjugó N-carbox?meti 1-topi ramato, preparado como se describió en el ejemplo 1, con albúmina de suero bovino (BSA) para formar N-carboximet 1— topiramato: albúm a de suero bovino (TGA: BSA). Se enfrió una solución de 103 mg de N-carboximeti 1-top ramato y 34.9 mg de N—hidroxisucci i i da (NHS) en 1 ml de dimeti 1 acetamida, en un baño de hiél o— etano! y se trató con 100 µ de diciclohexi 1 carbodi imida 3.15 M (en di met.i 1 acetamida ) para formar una mezcla de reacción. Se agitó la mezcla de reacción en el baño de hielo-metano! durante 15 minutos, y se añadió otros 50 µl de solución de diciclohexi Icarbodi mida. Se continuó agitando mientras se llevaba lentamente la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente. Luego se continuó agitando a la temperatura ambiente durante la noche. Después de agitar durante la noche se acopló el éster activo resultante» presente en la mezcla de reacción» con albúmina de suero bovino. Se desalificó la albúmina de suero bovino antes de usar en la conjugación mediante cromatogra ía en columna de 625 SEPHADEX en agua desionizada. Se enfrió una solución de 109 mg de albúmina de suero bovino desalificada previamente en un total de 15 ml de agua» en un baño de hielo-agua. Se añadió a gotas la mezcla de reacción que contenía el éster activo a la solución de albúmina de suero bovino, con agitación» mientras se mantenía el pH entre 8 y 9 añadiendo carbonato de potasio al 5% hasta que se estabilizó el pH (aproximadamente 1 hora). Luego se mantuvo la mezcla de reacción resultante a 4°C durante la noche y se eliminó los sólidos mediante centri ugación. Se filtró el fluido sobrenadante resultante que contenía el conjugado a través de una membrana de policarbonato de 0.8 mieras y se cromatograf ío sobre columna de G-25 SEPHADEX de 2.5 x 41 c , equilibrada y eluida con O.Ol M de fosfato de potasio que contenía 0.15 M de NaC! » pH 7.4, Se obtuvo un total de 97 mg de conjugado (proteína) en un rendimiento ina!. Se almacenó congelado el conjugado.
En este y los siguientes ejemplos, se determinó la concentración de proteína en los inmunógenos utilizando un análisis en bureta comercial o suponiendo que 1 mg/ml de solución de albúmina de suero bovino dio una absorbencia de 0.67 a 280 nm en una celda de trayectoria luminosa en salina regulada con fosfato (PBS) a pH 7.4.
EJEMPLO 5 PREPARACIÓN DE INMUNOGENO DE 9-CARBOXIMETIL-T0PIRAMATQ : ALBÚMINA DE SUERO BOVINO
Este ejemplo describe la preparación de otro inmunógeno ejemplar de esta invención, en el cual se conjugó 9-carboxi et 1-topiramato » preparado como se describió en el ejemplo 3, con albúmina de suero bovino (BSA) para formar 9— carboximet 1-topiramato : al búmina de suero bovino (9—CMT:BSA). Se disolvió 206 mg de 9—carboximet 1—topiramato de 70 mg de N—h droxisuccinimida en 2 ml de dimet laceta ida para formar una mezcla de reacción. Se enfrió la mezcla de reacción en un baño de hielo— etal y luego se añadió 200 µl de diciclohexi Icarbodi imida 3.15 M en dimeti 1 acetamida . Se agitó durante 15 minutos la mezcla de reacción en un baño de hielo-metano! y luego se añadió otros lOO µl de d ciclohexi Icarbodi ida en solución 3.15 M. Se agitó la mezcla de reacción durante otros 10 minutos sobre el baño de hielo-metano! y se añadió 0.025 ml de piridina. Se retiró del baño el recipiente que contema la mezcla de reacción y se agitó durante unos cuantos minutos a la temperatura ambiente» y luego se guardó durante la noche a -10°C. Al día siguiente se añadió a gotas la mezcla de reacción» con agitación» a una solución de 200 mg de albúmina de suero bovino (previamente desalif icada utilizando columna de 6-25 SEPHADEX) en un baño de hielo. Se mantuvo el pH de la mezcla de reacción entre 8 y 9 mediante !a adición de carbonato de potasio al 5% hasta que se estabilizó el pH . Luego se agitó la mezcla de reacción durante la noche a la temperatura ambiente. Al día siguiente se eliminó los sólidos mediante centr ugac ón y se filtró e! sobrenadante a través de un filtro de 0.2 mieras para producir una solución clarificada que se desalificó en una columna de G— 25 SEPHADEX equil brada en regulador fosfato de potasio 10 mM (KPi), pH 7.4, que contenía 0.15 M de NaCl. E! rendimiento de proteína fue de 189 mg . Se almacenó congelado el conjugado de 9-CMT:BSA.
EJEMPLO 6 PREPARACIÓN DE INMUNQGENQ DE N-C5- CARBOXIPENTIDTOPIRAMATO: ALBÚMINA DE SUERO BOVINO
Este ejemplo describe la preparación de otro inmunógeno ejemplar de esta invención» en el cual se conjugó N— (5-carboxipenti 1 )-topiramato» preparado como se describió en el ejemplo 2» con albúmina de suero bovino (BSA) para formar N—(5— carboxipent 1 )—topi ramato: albúmina de suero bovino (TCA:BSA). Se disolvió 250 mg de la sal de sodio de N—(5— carboxipenti 1 )-topiramato en 2 ml de dimeti 1 acetami da . Se añadió 100 mg de la sal de sodio de N— idroxisulfosuccini ida, para formar una reacción y se agitó la mezcla de reacción durante 10 minutos a la temperatura ambiente. Se añadió 200 µl de diciclohex Icarbod ?mida 3.15 M en dimet lacetami da, y se agitó la mezcla de reacción durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Se añadió 50 g de N-hidro succi im da a la mezcla de reacción, seguida por 100 µl de solución 3.15 M de dicicl ohexi 1 carbodi imida . Se agitó la mezcla de reacción durante otros 10 minutos y se añadió 0.025 ml de p i ridi a. Luego se agitó la mezcla de reacción durante la noche a la temperatura ambiente para producir un éster activo. Al día siguiente se añadió a gotas la mezcla de reacción que contenía el éster activo, con agitación a una solución de 200 mg de albúmina de suero bovino ( desal fi cada antes de usarla» med ante cromatograf a de 6-25 SEPHADEX en agua), en un total de 20 ml de agua y en un baño de hielo. Se mantuvo el pH de la mezcla de reacción entre 8 y 9 añadiendo carbonato de potasio a! 5% hasta que se estabilizó el pH (alrededor de 2 horas). Se almacenó la suspensión resultante durante la noche a 4°C. Se eliminó por filtración el material insoluble a través de una membrana de policarbonato de 0.2 mieras para producir una solución clarificada. Se cromatograf ío la solución clarificada en columna de G-25 SEPHADEX, equilibrada en 10 M de KP , pH 7.4, que contenía 0.15 M de NaC! . El rendimiento final de conjugado de TCA:BSA fue de 189 mg. EJEMPLO 7 PREPARACIÓN DE N-CARBOXIMETIL-TOPIRAMATQ : (2-AMIN0ETID- TIQUREIDO-FLUQRESCEINA
Este ejemplo describe la preparación de N-carboximet? 1-topi ramato: (2—a noet 1 )-ti oureído-f luoresceína» que es útil como rastreador (rastreador TGA:FTED) en un inmunoanál isis con polarización de fluorescenc a. Se disolvió ' 22 mg del N-( carboximeti 1 )-topiramato preparado como se describió en el ejemplo 1» en 200 µl de dimet 1 acetamida . Se añadió 20 mg de N—hidroxisuccinimida y lOO µl (100 µmol de dic c! ohex 1 carbodi da 1M (en tetrahidrofurano)» para formar una mezcla de reacción que se agitó a la temperatura ambiente durante 90 minutos para formar el éster act vo (TGA: NOS) . ' Se añadió 2 ml de MeOH y 0.1 ml de NaOH 1N a un tubo de ensayo. Se disolvió 21.6 mg de (2-aminoeti 1 )-tí oureído— fluoresceína (FTED) (preparada como se describió en Pourfarzeneh y colaboradores» CTinical Chemístry, 26:730 (1980)) en la solución metanólica y se añadió subsecuentemente a la mezcla de reacción que contenía el éster activo TGA:N0S. Se formó un precipitado que volvió a ser di suelto al añadir 4 x 50 µl alícuotas de NaOH ÍN. El pH de la mezcla de reacción resultante fue B.5. Luego se agitó la mezcla de reacción durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Se mantuvo el pH entre 7.5 y 8.5 med ante la adición» cuando fue necesario» de más NaOH ÍN hasta que se estab lizó el pH (aproximadamente una hora). Se sacó muestras de la mezcla de reacción para cromatogra ía después de una hora, y hasta las 4 horas. La N_carbo i eti 1—top ramato: (2-a inoet l )-t oureído-fluoresceína resultante fue purificada mediante cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice (SGF-250) en un sistema solvente de cloro ormo/MeOH/agua (4+4+1) seguido por cromatografía sobre placas de capa delgada» de fase inversa (RPF-2505 en un sistema solvente de metanoT/agua/hidróxido de amonio 15M (25/75/2), tal como se describe a continuación. En todos los ejemplos se llevó a cabo la cromatograf a en capa delgada (TLC) utilizando placas de gel de sílice que contenían un indicador fluorescente que absorbe a 254 nm. Las placas tienen un espesor de 250 µm (denominadas SGF—250) o 1,000 µm (denominadas SGF-1O00). Las placas de ge! de sílice de fase inversa C—18 que contenían el indicador fluorescente que absorbe a 254 nm tuvieron un espesor de 250 µm (denominadas RPF—250). Los sistemas solventes para cromatogra ía de capa delgada y síl ce y sistemas solventes para cromatografía en columna de fase inversa, están expresados todos en composición de volumen/volumen. Algunos compuestos fueron visualizados en placas de TLC por su absorbencia (254 n o 366 nm) o util zando diversos indicadores de aspersión.
Muchos de los derivados fluorescentes y de los compuestos de color fueron visibles sin ningún tratamiento. Las concentraciones aproximadas de rastreadores purificados ( N-ac lamidof 1 uoresceínas ) fueron determinadas suponiendo un coeficiente de extinción molar de 67» OOO a la longitud de onda que exhibe la máxima absorbencia (490—500 nm)> establecida por exploración) para una solución diluida en regulador carbonato 0.05 M» pH 9.6 y leída en una trayectoria de luz de 1 cm. En todos Tos ejemplos se determinó las mediciones de pH en solventes orgánicos utilizando pape! de pH humedecido con agua.
EJEMPLO B PREPARACIÓN DE N-CARBOXIMETIL-TOPIRAMAT?:FLUORESCEINA- TIOSEMICARBAZIDA
Este ejemplo describe la preparación de N-carbox eti !-top ramato :fluoresceína-tiose icarbazida que es útil como rastreador (rastreador T6A:TFSC) en un inmunoanál isis con polarización de fluorescenc a. Se disolvió 22.8 mg de N—carbo eti 1 -top i ramato , preparado como se describió en e! ejemplo 1, en 0.25 ml de imet lace am da . Se añadió 14.8 mg de N-h drox succ n m da, y luego 0.1 ml de diciclohexi Icarbodi imida 1 ñ (en tetrah ro urano) para formar una mezcla de reacción. Se agitó durante la noche la mezcla de reacción, a la temperatura ambiente, para formar el éster activo. Se disolvió 10 mg de f 1 uoresceína—tiosemi carbazida
(obtenida de Sigma Chemical Company) en 0.1 ml de MeOH +no.05 ml de NaOH ÍN) se añadió a la mezcla de reacción que contenía el éster activo del N—carboximet 1-topiramato. Se agitó la mezcla de reacción durante 15 minutos» y en ese tiempo de añadió 0.05 mi de trietilamina al 10% (en MeOH) y se continuó agitando durante otras dos horas a la temperatura ambiente, para ormar N-carboxi et 1—top ramato :fluoresceína—t osemicat— bazida» que se purificó mediante pasos sucesivos de cromatografía en capa delgada sobre placas de gel de sílice
(SGF-250) en el solvente MeOH/clorofor o/agua (4/4/1) y luego sobre placas de fase inversa (RPF-250) en el sistema solvente
MeOH/agua/triet lamina (20/80/1).
EJEMPLO 9 PREPARACIÓN DE (2-AMINOETIL )-UREIDQ-FLUQRESCEINA
Este ejemplo describe la preparación de (2— aminoet 1 )ureído-fluoresceína (FAMCO-E) que fue conjugada a análogos de topiramato, tal como se describe en los siguientes ejemplos. Para preparar FAMCO-E se disolvió 3.25 g del isómero
I de f 1 uoresce am? na en 17.5 ml de di et 1 acetamida y 2.5 g de 1,1 '-carboni Idi imidazol para formar una mezcla de reacción.
Los isómeros I y II de los derivados de fluoresceína son definidos por tener sust tuyentes en las posiciones 5 o 6 del núcleo de fluoresceína, respectivamente. A menos que se anote de otra manea, todos los derivados de fluoresceína descritos son derivados del isómero I. Sin embargo» se puede usar el isómero II o mezclas de I y II para preparar los reactivos adecuados). Se agita la mezcla de reacción durante tres horas a la temperatura ambiente. Se añade 5 ml de eti 1 end amina a 500 ml de cloruro de metileno en un matraz de 1 l tro para formar una solución de eti 1 endia ina y se enfrió esta solución en un baño de hielo— etanol . Luego se añadió a gotas la mezcla de reacción de 1 »1'—carboni 1 d imidazol/f luoresce am a con agitación vigorosa, a la solución de eti lend a na enfriada. Se formó un precipitado naranja. Se agitó durante la noche la mezcla de reacción a la temperatura ambiente. Se recogió el precipitado naranja en un embudo de Buchner y se lavó extensamente en sucesión con cloruro e metileno, con cloruro de met leno/acetona/MeOH (ÍOO/IO/I en volumen/volumen) y con cloruro de metileno. Se secó el producto precipitado lavado, luego se suspendió en acetona» se filtró y se lavó con éter de petróleo. Se dejó secar al aire el polvo crudo. Se añadió 5 ml de MeOH y 0.15 ! de róx do de amonio 15M a 0.5042 g del polvo crudo seco, para producir una solución clara, de color rojo intenso. Se añadió esta solución a gotas, con agitación» a 200 volúmenes de MeOH/agua/ácido acético (10/90/1 en volumen/ volumen). Ocurrió cierta precipitación. Se recogió el material insoluble» se disolvió en MeOH/hidróxido de amonio 15M (100/2 en volumen/volumen) y nuevamente se a adió a gotas» con agitación» a 200 volúmenes de MeOH/agua/ác do acético (10/90/1 en volumen/volumen). Se recogió el precipitado y se desechó. Se filtró las soluciones reunidas de MeOH/agua/ácido acético para clari cación y se Tas sometió a cromatogra ía de fase inversa C18» a baja presión» en una columna equilibrada con MeOH/agua/ácido acético ClO/90/1). Se unió el FAMCO-E a !a columna, y se eluyó con MeOH/agua/ácido acético (15/85/1). Se concentró el FAMCO-E eluido mediante reci rculación en la columna C18 bajo las mismas condiciones» excepto que se efectuó un paso de lavado con 7.5% de metanol (para eliminar el ácido acético) antes de la elución» y se logró la elución con metanol (100%). Se reunió las fracciones eluidas que contenían el FAMCO-E y se añadió suficiente tr eti lamina para dar un pH entre 8 y 9. Se almacenó e! FAMCO-E purificado como una solución en metanol a —10°C.
EJEMPLO 10 PREPARACIÓN DE N-CARBOXIMETIL-TQPIRAMATQ: ( 2-AMINQETIL )-UREID0- FLUQRESCEINA
Este ejemplo describe la .preparación de N-carboximeti 1 -topi ramato : (2—ami noet 1 )-ureído-f 1 uoresceína» que es útil como rastreador (rastreador TGA: FAMCO-E) en un inmunoanál sis con polarización de fluorescencia. Se disolvió en 0.2 ml de dimeti 1 aceta da 10 mg de N— carboximeti 1-topira ato preparado co o se describió en e! ejemplo 1 y 5 mg de N-hidroxisuccinimida. Se añadió 0.05 ml de d c clohexi Icarbodi m da 1 M ( en tetrahidrofurano) y se agitó la mezcla de reacción resultante durante 2.5 horas para producir un éster activo. Se añadió 0.1 ! de la mezcla de reacción que contiene el éster activo a 0.5 ml de una solución de (2-aminoeti 1 )-ureído- luoresceína (FAMCO-E) » preparada como se describió en el ejemplo 9. Después de 15 minutos se añadió 5 µl de trietilamina para mantener el pH entre 8 y 9. Se incubó la mezcla de reacción durante 60 minutos a la temperatura ambiente. Luego se purificó el N-carboximeti 1— topiramato: ( 2—aminoeti 1 )-ure ido—fl oresceína en pasos sucesivos de cromatografía de capa delgada sobre gel de sílice (SGF-250) en el sistema solvente cloro ormo/MeOH/agua (4/4/1) y cromatogra ía de capa delgada en fase inversa» en el sistema solvente MeOH/agua/h?dróxido de amonio 15M (20/B0/2).
EJEMPLO 11 PREPARACIÓN DE N-CARBOXIMETIL-TOPIRAMAT?:GLICIL- ft FLUORESCEINAMINA
Este ejemplo describe la preparación de N-carboxi et 1-topiramato : gl c 1— 1 uorescei a ina que es útil como un rastreador (rastreador TGA:Gly—FAM) en un inmunoanál isis con polarización de luorescenc a. Se disolvió 5 mg de am noacetam do—fl uoresceína (Molecular Probes» Inc.» Eugene» Oregon» E. U. A.) en O.l m! de dimeti 1 acetamida . Se añadió O.15 mi de un éster activo de N— carboximeti 1—topiramato , preparado como se describió en el ejemplo ÍO, y se' dejó que la reacción resultante procediera durante una hora a la temperatura ambiente. Se mantuvo el pH entre 6.5 y 8» añadiendo pequeños volúmenes de trietilamina. Se purificó la N—carboximeti 1-topiramato : gl ici 1-fl uoresceinamina resultante en pasos sucesivos de cromatografía de capa delgada en gel de síl ce ( SGF—250 ) en el sistema solvente clorofor o/MeOH/agua (4/4/1) y cromatografía de fase inversa (RPF—250) en el sistema solvente MeOH/agua/hidróxido de amonio 15M (20/80/2).
EJEMPLO 12 PREPARACIÓN DE N-(5-CARB0XIPENTIL )-TQPIRAMATO : (2-AMIN0ETID- TIOUREIDO-FLUQRESCEINA
Este ejemplo describe la preparación de N—(5— carbo i penti 1 )-top ramato: (2-am oet 1 )-t oureído-f luoresceína, que es útil como rastreador (rastreador TCA:FTED) en un i munoanál sis con polarización de fluorescenc a. Se añadió 250 mg de la sal de sodio de N-(5-carboxipenti 1 )—topi amato , preparada como se describió en el ejemplo 2, a 2 ml de dimet laceta ida . Se añadió 0.1 g de la sal de sodio de N- i dro i sul osuccinimida » se agitó la mezcla de reacción resultante y se agitó durante 10 minutos la mezcla de reacción resultante y se añadió 0.2 ml de d c clohexi Icarbod imida 3.15 M (en dimeti 1 acetamida ) . Se agitó la mezcla de reacción durante 30 minutos y se añadió en sucesión 0.05 g de N-h dro succ n mida y O.l ml de diciclohexi Icarbod imida 3.15 M (en dimeti laceta ida) . Después de agitar otros 10 minutos» se añadió 0.025 ml de piridina y se agitó durante la noche la mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante la noche» para formar el éster activo. Se añadió un exceso de (2-aminoet 1 )-tioureído— fluoresceína (en metano! hecho alcalino con hidróxido de sodio) a 0.5 ml de la mezcla de reacción que contenía el éster activo. Se dejó proceder la reacción durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Se purificó la N-(5—carboxipent 1 )— topiramato :( 2-aminoeti 1 ) tioureído-f luoresceína resultante en pasos sucesivos de cromatografía de capa delgada sobre ge! de sílice (SGF-250) en el sistema solvente cl oroformo/ eQH/agua (4/4/1) y de fase inversa (placas RPF-250) en sistema solvente MeOH/agua/h dró ido de amonio 15 M (27.5/72.5/2).
EJEMPLO 13 PREPARACIÓN DE N-C5-CARB0XIPE TIL )-TOPIRAMATQ : ( 2-AMINOETIL )- UREIDO-FLUORESCEINA
Este ejemplo describe la preparación de N—(5— carboxipenti 1 )—topiramato: ( 2-ami oeti 1 )—ureido—fluoresceína » que es út l como rastreador (rastreador ( TCA: FAMCO-E ) en un n unoanál sis con polarización de fluorescenc a. Se añadió 473 mg de la sal de sodio de N—(5— carboxipenti 1 )—topiramato» preparada como se describió en el ejemplo 2 a 5 ml de dimet 1 acetam da para formar una mezcla de reacción. Se añadió 399 mg de N-hidroxisuccinimi da y se agitó la mezcla de reacción durante 5 minutos a la temperatura ambiente y luego se enfrió agitando durante 5 minutos en un baño de hielo. Se añadió 1 ml de dic c 1 ohe i Idicar odi imida 1 M (en tetrahidrofurano) y se agitó la mezcla de reacción durante 15 minutos en un baño de hielo y 1 uego durante la noche a la temperatura ambiente. Se añadió a la mezcla de reacción 20 ml de MEOH que contenía 0.108 o! d FAMCO-E, preparada como se describió en el ejemplo 9. Se mantuvo el pH entre 8 y 9 añadiendo volúmenes pequeños de trietilamina. Se dejó proceder la reacción durante dos horas a la temperatura ambiente» para producir el rastreador TCA:FAMCO-E> luego se diluyó la mezcla de reacción con 9 volúmenes de hidróxido de amonio al 0.5% (0.075 M) y se aplicó a una columna sorbente de HPLC C18 a baja presión (20 g) equilibrada en MeOH/agua/hidróxido de amonio 15M (10/90/0.5). Se lavó la columna con aproximadamente 10 volúmenes de columna de MeOH/gua/hidróxido de amonio (10/90/0.5) para eliminar los contaminante, luego se eluyó e! rastreador TCA:FAMC0—E con MeOH/agua/hidróxido de amonio 15 M (15/B5/0.5). Se concentró el rastreador TCA: FAMCO-E mediante cromatogra ía en C1B bajo condiciones similares» pero se efectuó la elución con metano!/ tri eti lamí na (10/0.04 en volumen/ olumen) . A continuación se purificó el rastreador TCA."FAMC0~£ mediante cromatografía en capa delgada sobre placas de gel de sílice (SGF-1000) en el sistema solvente MeOH/cloroformo/agua (4/4/1). en donde el rastreador exhibió una R,r de alrededor de 0.6. Se eluyó la banda rastreadora de las placas de sílice con metanol/triet lamina (10/0.04), se ajustó el pH de la solución a entre 8 y 9, con trietilamina. y se guardó el rastreador a -10°C.
EJEMPLO 14 PREPARACIÓN DE N-(5-CARBQXIPENTIL) TOPIRAMATO : (2-AMIN0ETIL )- UREIDO-FLUORESCEINA. ISÓMERO II
Este ejemplo describe la preparación de N—
(Scarboxipent 1 )-topiramato : (2-a oet 1 )-ure ído-f luoresceína. isómero II, que es útil como rastreador (rastreador TCA:FAMC0—E isómero II) en un nmunoanál sis con polarización de f1 uorescencia. Se sintetizó el FAMCO—E , isómero II usado en este ejemplo y se lo purificó usando los métodos descritos para preparar FAMCO—E, isómero I. en el ejemplo 9, excepto que se usó la f luoresceinam? a » isómero II (6—am nofl uoresceína ) en la síntesis» en lugar del isómero I de f luoresceina ina (5— aminof luoresceína) y se purificó el polvo crudo usando cromatografía en capa delgada en las placas de fase inversa, utilizando e! sistema solvente metanol/agua/hidrox do de amonio 15M (10/90/2). Se guardó e! FAMCO-E a -10°C como una solución en metano! . Se añadió 25 mg de la sal de sodio de N-(S-carboxipenti 1 )—topi ramato » preparada como se describió en el ejemplo 2, a 0.25 ml de dimet 1 acetamida para formar una mezcla de reacción. Se añadió 10 mg de N— idroxisucci im da. Se agitó la reacción y se enfrió en un baño de hielo; y luego se añadió 0.05 ml de dicicl ohex Icarbodi mida 1M (en tetrahidrofurano9. Se agitó la mezcla de reacción durante 30 minutos más en un baño de hielo y a continuación durante 2 horas a la temperatura ambiente. Se añadió un exceso de solución de FAMCO—E (isómero II) y se dejó que la reacción procediera durante una hora a la temperatura ambiente, manteniéndose el pH por encima de 7 mediante la adición de trieti 1 ami na» cuando fue necesario. Se incubó la mezcla de reacción durante una hora a la temperatura ambiente para producir el rastreador TCA : FAMCO—E, isómero II. Luego se purificó el rastreador mediante cromatografía de capa delgada sobre placas de fase inversa ( RPF—250 ) » en el sistema solvente MeOH/agua/hidróxído de amonio 15M (25/75/2).
EJEMPLO 15 PREPARACIÓN DE 9-CARBQXIMETIL-TQPIRAMATQ- (2-AMINQET L )-UREIDO- FLUORESCEINA
Este ejemplo describe la preparación de 9-carboxi et 1 -topi ramato : (2—am oet ! )-ureído-f 1 uoresceína » que es útil como rastreador (rastreador 9—CMT : FAMCO-E) en un inmunoanál sis con polarización de fluorescencia. Se añadió 12.4 mg de 9-carboximeti 1-topi ramato » preparado como se describió en el ejemplo 3» a 0.20 ml de dimeti 1 acetamida. Se añadió 12.9 mg de N— idroxisucci imida » seguidos por 0.05 ml de dici clohe? i Icarbodi im da 1M (en tetrah drofurano) y se incubó la mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante 2.5 horas. Se añadió un exceso de FAMCO-E (en metanol) seguidos por la adición de 9 µl de triet 1 am na » para ajustar e! pH a 8.5. Se agitó la mezcla de reacción durante 60 minutos a la temperatura ambiente y luego se añadió 0.05 ml de NaOH 1N> y se mezcló la mezcla de reacción mediante sacudimiento. Después de otros 15 minutos de incubación a la temperatura ambiente» se añadió 0.05 ml de HC! ÍN para dar un pH final de 8.5» para producir el rastreador 9— CMT:FAMC0-E. Se purificó el rastreador mediante cromatogra ía de capa delgada en gel de sílice ( SGF—250) en el sistema solvente cl oroformo/MeOH/agua (50/50/2.5).
EJEMPLO 16 PREPARACIÓN DE N-CARBOXIMETIL-TOPIRAMATO :5-( ( (N- ( BIOTINOIL)AMINO)HEXANOIL)AMINO)PENTILAMINA
Este ejemplo describe la preparación del conjugado N— carbo eti 1—top ramato :5—( ( (N—( biot no 1 )—am no )-hexano 1 ) amino)pent lamina ( TGA— :biot n) que es útil como rastreador en un inmunoanál isis a base de biotina—av dina . Se combinó 9 mg de N—carbox i meti 1 -topi ramato (preparado como se describió en el ejemplo 1). 3.3 mg de N— hidroxisuccinimida y 8.4 mg de 5—( ( (N-( b ot o 1 )ami o )— hexanoi 1 )amino )pent lamina (Molecular Probes» Eugene» Oregon» E.U.A.) en 0.3 ml de dimet lacetamida para formar una mezcla de reacción. Se enfrió la mezcla de reacción en un baño de hielo/metano! y se añadió 0.025 ml de diciclohex 1 carbod mida 1 M (en tetrah drofurano). Se agitó la mezcla de reacción unos cuantos minutos en e! baño de hielo/metano!, y luego se añadió 0.05 m! de metano!. Se incubó la mezcla de reacción durante la noche a la temperatura ambiente. Al enfriar se formaron cristales. Se colocó !a mezcla de reacción a -20°C durante una hora» y se eliminó el materia! insoluble mediante centrifugación. Se purificó el N-carboximet 1-topiramato: derivado de biotina de la fracción soluble mediante cromatografía en capa delgada sobre gel de sílice (SGF-250) util zando el sistema solvente MeOH/clorofor o/agua (20/80/1). Se visualizó el producto rociando una pequeña porción de la placa de TLC con una solución de 0.2% de K nO^ en acido sulfúrico 1N. Se raspó la banda apropiada de! resto de la placa (no rociada para visual zación) y se eluyó de la sílice con metano!. Se usó un análisis con polarización de fluorescencia de avidina-biotina, competitivo, para estimar la concentrac ón de biotina (como conjugado de topiramato) en la preparación. Se estimó que la concentración ea aproximadamente 12 M. Se almacenó el conjugado TGA:R-biotin como una solución maestra en metano! a —10°C.
EJEMPLO 17 INMUNOANALISIS ELISA UTILIZANDO CONJUGADO DE N-CARBOXIMETIL- TQPIRAMAT0;5-( ( (N-(BIOTINOIL) AMINQ )HEXANQIL) AMINQ )PENTILAMINA
Este ejemplo describe un nmunoanal isis ELISA ejemplar para topiramato, utilizando el conjugado N— carbox i et 1—top ramato :5— < ( (N— ( bi otina 1 ) a o ) he a o 1 ) a i o ) penti lami na ( TGA:R— iotin) . Se produjo una línea de células de hibridoma designada 7B10 que produce el anticuerpo anti-topiramato monoclona!» a partir de células de bazo de ratón hembra Balb/c. inmunizado con N—carboxi eti 1—topiramato : BSA (TGA:BSA), preparado como se describió en e! ejemplo 4. Se inmunizó el animal una vez i ntraperi toneal ente con 50 µg de TGA:BSA emulsificado en adyuvante completo de Freund. Posteriormente se inyectó el animal intraper tonealmente cada 3 a 5 semanas con 50 µg de TGA:BSA, emulsificado en adyuvante incompleto de Freund» en un total de 5 inmun zac ones. Luego se potencia el animal una vez con 50 µg de N—í 5-carboxipenti 1 )-topiramato : BSA (preparado como se describió en el ejemplo 6) intraper toneal— mente. Se usó células de bazo para preparar líneas de células de hibridoma utilizando la línea de mieloma de ratón NSl como partícipe de la fusión. Se depuró el medio de cultivo de hibridoma en cuanto a la presencia de anticuerpos de topiramato» utilizando el procedimiento ELISA descrito a cont nuac ón. Los anticuerpos que se unen a TGA:R-biot n se inmovil zaron sobre estreptavidina, pero no se escogió la estreptavidina sola para caracterización adicional. Se seleccionó la línea de células 7B10 para clonar con base en los resultados de discriminación y se estableció y criopreservó el subclón 7B10.2 y un clon de este último, 7B10.2.1. Se preparó una solución de 0.1 µg/ml de estreptavidina (Molecular Probes, Eugene, Oregon» E.U.A.), en PBS (0.01 M de regulador fosfato de potasio, pH 7.4, que contenía 0.15 M de NaCl y 0.01% de timersol ) y 0.1 ml de la solución de estreptavidina fue pipeteado a cada una de Tas concavidades de una placa Pierce IMMUNOWARE de poliestireno» de múltiples concavidades. Se incubó la solución de estreptavidina sobre la placa durante la noche a 4°C. Se efectuó todos los demás pasos a la temperatura ambiente. Se lavó 4 veces las concavidades con PBS que contenía
0.1% (en volumen/volumen) de TWEEN 20 (en lo sucesivo PBS/tween), y se sacude por golpe para eliminar todos el fluido suelto. Se diluyó una solución maestra de TGA: R—b otin» preparada como se describió en el ejemplo 16 (aproximadamente 1.2 mM en metanol), a 1/5000 en PBS/tween y se añadió a todas las concavidades O.l ml de solución diluida de TGA: R— iotin. Después de 3 horas a la temperatura ambiente se aspiró la solución de TGA:R-biotin y se lavó 4 veces la placa con PBS/tween. Se preparó soluciones maestras de topiramato en PBS/tween para dar normas de topiramato que tenían concentraciones de 20, 200 y 2000 ng/ml. Se añadió 0.05 ml de normas de topiramato a las concavidades para dar concentraciones finales de 0, 10, 100 y 1000 ng/ml . Se añadió metabol to de topiramato 9-hidroxi-top ramato ( Ortho/McNei 1 Pharmaceuticals, No. de catálogo RJW-3S214-000) en una serie de concavidades para dar concentraciones finales de 100, 10OO y 10,000 ng/ml . Se diluyó el medio de cultivo de célula procedente de la línea de células de hibridoma 7B10, a 1/128 en PBS/tween y se añadió 0.05 ml a cada concavidad (dilución final de anticuerpo 1/256). Se incubó la placa durante dos horas a la temperatura ambiente. Luego se lavó la placa cuatro veces con PBS/tween. Se diluyó a 1/500 el conjugado de IgG anti-ratón de ch? vo-pero dasa de rábano picante (CALTAG Laborator es, South San Francisco, CA, E.U.A.) en PBS/tween y se añadió 0.1 ml de a cada concavidad. Después de 2 horas a la temperatura ambiente se lavó 4 veces la placa con PBS/tween y se analizó la actividad de peroxidasa añadiendo 0.1 ml de 0.31 mg/ml de tretramet 1 benc di na que contenía 2.6 mM de peróxido de hidrógeno en 0.125 M de acetato de sodio/O.075 M de regulador ácido cítrico, pH 4.0. Después de 4 minutos se detuvo la reacción añadiendo 0.1 ml de ácido sulfúrico 1 M a cada concavidad. Se leyó el producto amarillo en un lector de placas Dynatech MR5000» a 450 n . Los resultados del análisis están ilustrados a continuación en el cuadro 3. En el cuadro» B/B0 es la razón de! valor de absorbencia a 450 nm para la muestra de prueba (B5 dividido entre el valor de absorbencia obtenido en ausencia de! analito competidor (B(:, ).
CUADRO 3
Analito (ng/ml Topiramato A?ßo nn? B/Ba 0 0.696 1.00
0.599 O .86
100 0.247 O .35 1,000 0.028 0.04
, 000 ND* ND 9— idroxi— to ramato O O .659 1.00 10 ND ND lOO 0.663 1. Ol 1,000 0.651 0.99
,000 0.466 0.71
*ND = no determinado Tal como se muestra en el cuadro 3» el topiramato inhibió la unión de anticuerpo en más del 50% a menos de 100 ng/ml» mientras que se observó una inhibición de menos de 50% con 10,000 ng/ml del metabolito 9- droxi-topi rarnato . El análisis demostró que la reactividad cruzada del anticuerpo monoclonal 7B10 para el producto de metabolito de topiramato 9-hidroxi—topi ramato » fue menor que 1%.
EJEMPLO IB
INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA USANDO N- CARBOXIMETIL-TOPIRAMATO: ( 2-AMINOETIL )-TIOUREIDO-FLUQRESCEINA
Este ejemplo describe un i munoanál is s con polarización de fluorescencia (FPIA) ejemplar para el top ramato » ut 1 izando N-carbo met 1-top amato : ( 2—aminoet ! )— tioureído—fluoresceína como un rastreador (rastreador TGA:FTED). Un sistema nmunoanál isis con polarización de fluorescencia» automático» utilizado en éste y en los siguientes ejemplos, se describe a continuación, seguido por una descripción de la preparación de los anticuerpos usados en los ejemplos.
INMUNQANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA AUTOMÁTICO
Se llevó a cabo el inmunoanál isis con polarización de fluorescencia utilizando un analizador de polarización TDx<R> automático (Abbott Laboratories de Irving» Texas), utilizando un formato de inmunoanál s s competitivo. Los reactivos para efectuar el análisis automático incluían el anticuerpo anti— analito (anticuerpo anti—topiramato ) o "A", un conjugado de fluoresceína:análogo de topiramato (rastreador o "T"), y un regulador de pretratamiento o "B" . Se obtiene la calibración del análisis automático descrito en los ejemplos con una serie de seis calibradores que incluyen las concentrac ones especificadas de topiramato picadas en suero humano. El análisis automático está descrito detalladamente en la literatura disponible de Abbott Laboratories, Irving, Texas, E.U.A. Todos los ejemplos descritos aquí utilizaron la secuencia de pipeteado en "modo 1" en el instrumento. Se coloca las muestras de paciente (suero simple o plasma) en vasos de muestra de plástico en un carrusel circular diseñado para el instrumento TDx<Ft>. Se coloca el carrusel en el instrumento junto con el estuche de reactivos que contienen los A» T y B, En el primer cic!o del análisis se efectúa una predilución de la muestra de paciente con regulador TDx Systems<R> en una segunda concavidad del vaso de muestra, y se coloca la mitad del volumen total de la muestra (muestra de paciente diluida en regulador) en la cubeta de muestra (un total de alrededor de 1 ml ) , junto con 0.025 sal de regulador B de pretratamiento, procedente del estuche de reactivo. Se toma una lectura de fluorescencia en blanco. En el segundo ciclo de pipeteado, se añade un segundo volumen de la muestra de paciente diluida, junto con 0.025 ml de rastre-ador (típicamente 0.5-10 icomo! por tubo) y 0.025 ml de anticuerpo en un volumen tota! aproximado de 2 ml en la cubeta. Después que se ha completado !a reacción, el analizador lee la polarización de la fluorescencia en la cubeta de vidrio y compara ese valor con una curva de calibración establecida midiendo seis concentraciones de fármaco formulado en suero humano (calibradores). El equivalente de 0.5 a 5 mierolitros de suero o plasma de paciente es el tamaño típico de la muestra (añadida a 2 ml de volumen de muestra total) en el análisis automático. Se informa la polarización de la fluorescenc a en unidades de mi 1 ipolarización (mP). El analizador TDx calcula automáticamente la concentración de analito en la muestra mediante comparación con la curva de calibración. En Tos ejemplos se describe las diluciones de anticuerpo anti—topiramato tanto para el reactivo de anticuerpo en el equipo de nmunoanál si s (una solución maestra de 80x ) y la dilución final en la cubeta de vidrio. Los diluyentes de rastreador y los reguladores de pretratam ento (B) están descritos en los ejemplos como soluciones de almacén a SOx de los reactivos presentes en el equipo de inmunoanál sis .
ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI-TOPIRAMATO DE OVEJA
Se preparó todos los inmunógenos como emulsiones en el adyuvante completo de Freund para la primera inyección, y en el adyuvante incompleto de Freund para las inyecciones subsecuentes. Se inmunizó los animales subcutáneamente con 1 mg de inmunógeno (como proteína) o directamente en el nodo l nfático con 50 µg de inmunógeno. Se inyectó típicamente los animales cada 3 semanas. Se discriminó Tos sueros usando ELISA como se describió para la preparación monoclonal de ratón anterior, excepto que se detecto l s anticuerpos de oveja que se unieron a TGA:R~biot n inmovilizado sobre estreptavidina en placas de microt? tulación, utilizando un conjugado de IgG ant?-oveja de conejo—peroxidasa de rábano picante (Chemicon International, Te ecula, California, E.U.A.). Se utilizó antisueros de 3 ovejas en los ejemplos. Las ovejas fueron inmunizadas como se describe más adelante.
Oveja No, Inmunogeno Ruta de inmunización
787 TGA: BSA nodo 1 i nfático 662 9CMT:BSA subcutánea 650 TCA: BSA subcutánea
Se utilizó en los ejemplos tres preparaciones de anticuerpo der adas de la oveja No. 787. Estas preparaciones están codificadas como 787-1, 787-2 y 787-3. El TGA:BSA usado para inmunizar la oveja 787 fue preparado como se describió en el ejemplo 4. El 9-CMT:BSA usado para inmunizar !a oveja 662 fue preparado como se describió en el ejemplo 5. El TCA: BSA usado para inmunizar la oveja 650 fue preparado como se describió en el ejemplo 6. En un inmunoanál sis con polarización de fluorescencia usando el rastreador TGA:FTED» se preparó una curva de calibración usando el anticuerpo No. 787-1 de oveja, preparado como se describe arriba y se diluyó a 1/24 (dilución final 1/1920) en el regulador TDx Systems<p" (0.1 M de KPi, pH 7.5» que contenía 0.1% de azida de sodio y 0.01 mg/m! de gamma-globulina bovina» pH 7.0-7.5). Se usó como rastreador el rastreador TGA:FTED» preparado como se describió en el ejemplo 7 y se diluyó en 0.01 M de KP » 0.15 M de NaC! , 0.1% en peso/volumen de az?da de sodio» 1 mg/ml» de gamma-globulina bovina» pH 7.4—7.5. E! regulador de pretratamiento fue el regulador TDx Systems <R>. El volumen de muestra para los calibradores fue 1 µl . El cuadro 4 muestra los valores de polarización que fueron obtenidos usando seis calibradores de topiramato. En éste y en los siguientes cuadros» se da los valores de polarización en unidades de mi 1 polarización.
CUADRO 4 Topiramato (ug/ml) Polarización O 235.09 2.5 222.06 5. O 208.12 10.0 184.83 25. O 141.89 50.0 110.42 EJEMPLO 19 INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA USANDO N- CARBOXIMETIL-TOPIRAMATOZFLUORESCEINA-TIOSEMICARBAZIDA
Este ejemplo describe un inmunoanál isis con polarización de fluorescencia» ejemplar, para topiramato, utilizando N—carboximet 1—topiramato : fl uoresceína— tiose icarbazida , preparado como se describió en e! ejemplo 8, como rastreador (rastreador TGA:FTSC),. Se efectuó el inmunoanál sis con polarización de fluorescencia utilizando un analizador de polarización TDx<R> automático, para preparar una curva de calibración usando el rastreador TGA:FTSC como se describió en el ejemplo 18» con las siguientes excepciones: En este ejemplo» el anticuerpo fue anticuerpo de oveja No. 787-1. preparado como se describió en el ejemplo 18 y se diluyó a 1/24 (dilución fina! de anticuerpo 1/1920). El diluyente del rastreador fue e! regulador TDx Systems (R). E! volumen de muestra para los calibradores fue 1.3 µl . Los resultados de! análisis están ilustrados a continuación en el cuadro 5.
CUADRO 5
Topiramato (ug/ml) Polarización O 224.54 2.5 212.83 5.0 198.29 10. O 178.85 25.0 , 145.09 50.0 122.07
EJEMPLO 20 INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA UTILIZANDO N- CARBQXIMETIL-TOPIRAMATO : ( 2-AMINOETIL )-UREIDQ-FLUORESCEINA
Este ejemplo describe un inmunoanál isis con polarización de fluorescencia» ejemplar» para topiramato. que uti 1 iza N-carboximeti 1 -top ramato: (2-ami oet l ) -ureído-fluoresceína. preparado como se describió en el ejemplo 10» como rastreador (rastreador TGA:FAMCO—E) . Se llevó a cabo el inmunoanál sis con polarización de fluorescencia utilizando un analizador de polarización automático TDx<R> para preparar una curva de calibración usando rastreador TGA:FAMCO-E como se describió en el ejemplo 18» con las siguientes excepciones: En este ejemplo» el anticuerpo fue el anticuerpo No. 787.2» preparado como se describió en el ejemplo 18 y se diluyo a l/SO (dilución final de anticuerpo 1/6400 ) . Los resultados del análisis están ilustrados más adelante en el cuadro 6.
CUADRO 6
Topiramato (ug/ l ) Polar zación o 223-68 2.5 194.69 5.0 173.33 10.0 145.51 25.0 109.34 50. O 86.36
EJEMPLO 21 INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA UTILIZANDO N- CARBOXIMETIL-TOPIRAMATO:GLICIL-FLUQRESCEINAMINA
Este ejemplo describe un inmunoanal isis con polarización de fluorescencia, ejemplar» para topiramato» que uti 1 iza N-carbo meti l-top ramato:gl ic l-f1 uoresce namina, como se describió en el ejemplo 11» como rastreador (rastreador
• TGA:G!y—FA ) . Se efectuó el nmunoanál sis con polarización de fluorescencia utilizando un analizador de polarización automático TDx<R> para preparar una curva de calibración utilizando el rastreador TGA:Gly—FAM como se describió en el ejemplo 18, con las siguientes excepciones: En este ejemplo» el anticuerpo fue el anticuerpo No. 787-2, preparado como se describió en el ejemplo 18, y diluido a 1/SO (dilución final, 1/6400). Los resultados de! análisis están ilustrados a continuación en el cuadro 7.
CUADRO 7
Topiramato (µg/ptl) Polarización o 193.28 2.5 180.25 5.0 162.38 10.0 141.51 25. O 109.17 50. O 89. ÍO
EJEMPLO 22 INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA UTILIZANDO N- (5-CARB0XIPENTID-T0PIRAMAT0: ( 2-AMINQETIL )-TIOUREIDO- FLUORESCEINA
Este ejemplo describe un munoanal sis con polarización de fluorescencia, ejemplar, para topira ato, que uti 1 iza N—( 5—carboxipent 1 )—topiramato : ( —aminoet 1 )—t oure do— fluoresceína, preparado como se describió en el ejemplo 12, como un rastreador (rastreador TCA:FTED). Se llevó a cabo el inmunoanál isis con polarización de fluorescenc a util zando un analizador de polarización automático TDx<R> para preparar una curva de calibración usando el rastreador TCA:FTED como se describió en el ejemplo 18, con las siguientes excepciones. En este ejemplo el anticuerpo es el anticuerpo No. 787-2, preparado como se describió en el ejemplo IB, y diluido a 1/10O (dilución final 1/8000). Se diluyó el rastreador en O.01 M de KPi, pH 7.5» 0.1% en peso volumen de azida de sodio, 1 mg/ml de gamma-globul na bovina Los resultados están ilustrados a continuación en el cuadro 8.
CUADRO 8
Topiramato (ug/ml) Polarización O 245.72 2.5 200.79 5.0 172.41 10.0 139.21 25.0 97.70 50. O 75.50
EJEMPLO 23 INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA UTILIZANDO N- ( 5-CARBOXIPENTIL )-TQPIRAMATO : ( 2-AM NOETIL )-UREIDQ-FLUQRESCEINA
Este ejemplo describe un inmunoanál isis con polarización de fluorescencia para topiramato, que utiliza N— (5—carboxipent 1 )—topi amato : ( 2—a oe 1 )—ureído—flúo esce ina , preparado como se describió en el ejemplo 13, como rastreador (rastreador TCA : FAMCO-E ) . Se efectuó el nmunoanál isis con polarización de fluorescencia usando un analizador de polarización TDx<R> automático para preparar una curva de calibración usando el rastreador TCA:FAMCO—E como se describió en el ejemplo 18, con las siguientes excepciones. En este ejemplo, e! anticuerpo fue el anticuerpo No. 787—2, preparado co o se describió en el ejemplo 18 y diluido a 1/90 (dilución final 1/7200) . E! diluyente para e! rastreador fue el regulador TDx Systems (R). El volumen de muestra para los cal bradores fue 0.7 µl . Los resultados están ilustrados más adelante en el cuadro 9.
CUADRO 9
Topiramato (ug/ml) Polarización O 240.92 2.5 204.13 5.0 130.44 10. O 150.23 25. O 109. 6 50.0 87.83 EJEMPLO 24 INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA USANDO N-(5- CARBOXIPENTIL ) TOPIRAMATO : ( 2-AMINOETIL )-UREIDO-FLUORESCEINA , ISÓMERO II
Este ejemplo describe un inmunoanál isis con polarización de luorescencia» ejemplar» para topiramato ut 1 izando N—(5—carbox penti 1 )—top ramato: ( 2—aminoet 1 )—ureído— fluoresceína, isómero II, preparado como se describió en el ejemplo 14, como rastreador (rastreador TCA: FAMCO-E, isómero II). Se efectuó el munoanál isis con polarización de fluorescencia utilizando un analizador de polarización automático TDx<R> para preparar una curva de calibración usando el rastreador TCA:FAMCO-E» isómero II» como se describió en el ejemplo 18, con las siguientes excepciones: En este ejemplo» el anticuerpo es anticuerpo No. 787-3» preparado como se describió en el ejemplo 18 y diluido a 1/68 (dilución fina! 15440) en KPi O.l M, 0.1% de azi da de sodio» pH 7.4-7.6. El diluyente de rastreador fue 0.1 M de KPi, 0.005% de sulfusuccinato de dioctilsodio (DOOS)» 0.1% en peso/volumen de azida de sodio» 1 mg/ml de gamma-globul na bovina. El regulador de pretratamiento fue 20 M de KPi» pH 4.0» 0.1% de DOSS. El volumen de muestra para los calibradores fue 1.4 µl . Los resultados del análisis están ilustrados a continuación en el cuadro 10.
CUADRO 10
-. t Topiramato (ug/ml) Polarización O 227.24 2 184.65 4 157.73 8 128.78 16 100.50 32 76.86
EJEMPLO 25 INMUNOANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA USANDO 9- CARBOXIMETIL-TQPIRAMATO : ( 2-AMINOETIL )UREIDO-FLUORESCEINA
Este ejemplo describe un inmunoanal isis con polarización de luorescencia» ejemplar, para topira ato» que uti 1 iza 9-carboximet 1—topi ramato : ( 2—ami noet 1 )—ureído-fluoresceína» preparado como se describió en el ejemplo 15. como rastreador (rastreador 9— MT : FAMCO-E ) . Se efectuó el inmuno—anal isis con polarización de fluoresceína usando un analizador de polarización automático TDxR para preparar una curva de cal bración util zando el rastreador 9—CMT : FAMCO—E como se describió en el ejemplo 18. con las siguientes excepciones. En este ejemplo el anticuerpo fue anticuerpo de oveja No. 662» preparado como se describió en e! ejemplo 18 y diluido a 1/10 (dilución final 1/800). El diluyente de rastreador fue el regulador TDx Systems<F". El volumen de muestra para los calibradores fue 5 µl . Los resultados del análisis están ilustrados a continuación en el cuadro 11.
CUADRO 11
To i amato (ug/rol ) Polar zac ón o 202.90 4.0 185.60 8.0 174.58 16.0 159.91 32.0 143.77 64.0 124.42
EJEMPLO 26 INMUNQANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA UTILIZANDO N- CARBOXIMETIL-TOPIRAMATO : ( 2-AMINQETIL )-UREIDQ-FLUORESCEINA
Este ejemplo describe un i munoanal isis con polarización de fluorescencia» ejemplar» para topiramato, ut 1 zando N-carboxi eti 1-top ramato: < 2-aminoeti 1 )-ureído-fl uoresceína , preparado como se describió en el ejemplo 10» como rastreador (rastreador TGA: FAMCO-E ) . >e efectuó el inmunoanal isis con polarización de fluorescencia utilizando un analizador de polarización automático TDxR que utiliza el rastreador TGA:FAMCO—E para preparar una curva de calibración co o se describió en el ejemplo 18» con las siguientes excepciones: En este ejemplo» e! anticuerpo fue anticuerpo de oveja No. 650» preparado como se describió en el ejemplo 18» y diluido a I/IO (dilución final 1/800). El diluyente para rastreador fue el regulador TDx Systems<R' . El volumen de la muestra para los calibradores fue de 2 µl . Los resultados del análisis están ilustrados más adelante en el cuadro 12.
CUADRO 12 Topiramato (ug/ml) Polar zación O 77Q *•?*"» 2 213.93 4 203.44 8 186.89 16 167.79 32 145.54
EJEMPLO 27 COMPARACIÓN DE INMUNQANALISIS CON POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA Y ANÁLISIS CROMATOGRAFICO EN GAS DE TOPIRAMATQ
Este ejemplo describe una comparación de los resultados de un nmunoanál s s con polarización de fluorescencia, ejemplar, para topira ato. con análisis de cromatografía gaseosa, que utiliza 117 muestras de plasma obtenidas de pacientes que están sometidos a terapia con topiramato. El inmunoanál isis con polarización de fluorescencia usó N-(5-carboxipenti ! )-top i amato: £2-aminoetil )-ureído-fluoresceína (rastreador TCA:FAMCO-E) diluido en 0.1 M de KPi, pH 7.4-7.6, 0.005% de sulfosuccinato de dioctilsodio (DOSS), 0.í% en peso/volumen de azida de sodio, 1 mg/ml de gamma-globulina bovina. El anticuerpo usado fue anticuerpo de oveja No. 787-3, preparado como se describió en el ejemplo 18 y diluido a 1/68 (dilución final 1/5440) en O.l M de KPi, pH 7.4-7.6, que contenía 0.1% en peso/volumen de azida de sodio. El regulador de pretratamiento fue 20 mM de KPi, pH 4.0, que contenía Q.1% de sulfosuccinato de d?octilsodio (DOSS). El volumen de la muestra fue 1.4 µl . Se estableció una curva de calibración en el analizador TDx(R) utilizando el análisis automático descrito en el ejemplo 18. Los seis calibradores fueron O, 2. 4, 8, 16 y 32 µg/ml de topiramato en suero humano. Se analizó las muestras por duplicado y se utilizó los valores promedio para el método de comparación. El método de cromatografía de gas con detección de nitrógeno y fósforo, fue efectuado como se describió en Cooper» JM, Stubbs, RJ y Palmer, ME, Phar aceu cal Research 8 ( ÍO suppl. )S19 (1991). Este método es de acuerdo con la demanda técnica y se encontró que era sensible, preciso y específico. Una comparación directa de los dos métodos fue efectuada utilizando calibración en una escala de 2-32 µg/ml de topiramato para Tas muestras. Una comparación de los resultados del i nmunoana! isis con polarización de luorescencia (FPIA) , con la cromatografía de gas en las muestras de 117 pacientes, demostró que la relación (valor FPAIA) = -0.147 + 0.985 (valor para CG) r = 0.9935. Como se demuestra en este ejemplo, el método de inmunoanál isis con polarización de fluorescencia, utilizando reactivos ejemplares de esta invención» proporcionaron una excelente correlación del método de cromatografía de gas para e! análisis de topiramato.
EJEMPLO 28 DETERMINACIÓN DE LA REACTIVIDAD CRUZADA DEL ANTICUERPO
Este ejemplo describe una determinación de la cantidad de reactividad cruzada de composiciones de anticuerpo policlonal y monoclonal con el metabolito de topiramato 9— hi droxi—top i ramato . Se preparó dos preparaciones de anticuerpo policlonal hechas en oveja (anticuerpos de oveja ' o. 662 y 787-3), tal como se describió en el ejemplo 18. La preparación de una curva de norma utilizando el anticuerpo de oveja No. 662 y el rastreador 9—carbo eti 1-topi ramato : (2-aminoet 1 )ureído-fluoresceína (rastreador 9—CMT : FAMCO—E ) está descrita en el ejemplo 25. Se anal zó las cantidades conocidas de 9-hidroxi— topiramato en suero humano utilizando esa curva de calibración. La preparación de curvas de norma para el anticuerpo de oveja No. 787-3 y el rastreador TO-(5—carboxipenti 1 )— top ramato :( 2-aminoet 1 )—ureído f1 uoresceí a (rastreador TCA:FAMC0-E) se efectuó como se describió en el ejemplo 27. Se analizó cantidades conocidas de 9-h droxi— opiramato en suero humano util zando esas curvas de calibración. Se usó la concentración observada de topiramato para calcular la cantidad de reactividad cruzada de las preparaciones de anticuerpo con 9- idrox?-topi ramato, de la siguiente manera. E! (% de reactividad cruzada) es igual a (100 veces la concentración observada de ispiramato en µg/ml) dividida entre (la concentración de S-hidroxi-topiramato añadido en µg/ml ) . Los resultados de esos análisis están ilustrados a continuación en el cuadro 13.
CUADRO 13* Anticuer- 9-hidroxi- Reactividad cru-po NÚm .— topiramato top ramato zada (%)
662 3.1 2.6 83 6.2 5-2 83 12.5 9.9 79 25.0 16.3 63 50.0 26.5 53 7B7-3 4 0.51 12.8 8 0.84 10.5 32 2.18 6. 8
* En el cuadro, 9— idroxi-topiramato es la concentración de 9—hidroxi-topiramato en la muestra, en µg/ipl . El topiramato es la concentración observada de topiramato en µg/ml.
Este ejemplo demuestra que las preparac ones de anticuerpo policlonal fueron suf cientemente específicas para usarlas en análisis comercial» cuando se utiliza un inmunógeno» en donde se derivó el análogo de topiramato en la porción sulfamato de topiramato. El antisuero preparado usando el inmunógeno en donde se derivó el análogo de topiramato en el grupo metilo del carbono 9» proporcionó anticuerpos útiles para los inmunoanál isis, en donde la cantidad de 9-hidroxi-topi amato es relativamente pequeña, en comparación con la cantidad de topiramato de la muestra.
Claims (7)
1.- Un análogo de top ramato de una formula seleccionada de! grupo que consiste de: en donde uno de R y R.-, es H y el otro es R-Y; R es un grupo enlazador e Y es un portador o una etiqueta; cuando Rp es H, X es H, cuando R, no es H, X es H o un grupo alquilo; y en donde R3 es R'-Y» Rt comprende un grupo enlazador heterocíclico en el cual el N del grupo sulfamato de! topiramato es un miembro del anillo e Y es un portador o una etiqueta.
2.- El análogo de topiramato de conformidad con la BO reivindicación 1» caracterizado ademas porque R! esta presente en el análogo e incluye un grupo er-a?ador de anillo heterocíclico, seleccionado del grupo que consiste de pirrolidina» piperidina» piperazina y morfolína.
3.- El análogo de topiramato de conformidad con la re indicación 2, caracterizado además porque R? incluye un grupo enlazador de anillo heterocíclico que tiene un anillo heterocíclico de cinco o seis miembros.
4.- El análogo de topiramato de conformidad con la re i dicac ón 1» caracter zado además porque R—Y o Rt-Y está presente en el análogo.
5.- E! análogo de topiramato de conformidad con la re vindicación 4» caracterizado además porque Y es un portador. 6;- El análogo de topiramato de conformidad con la reivindicación 1» caracter zado además porque R-Y está presente en e! análogo y R-Y e ( CH.^ ) --.CO-NH- (portador), en donde n = 1- 9. 1.- El análogo de topiramato de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque se selecciona el portador del grupo que consiste de albúmina de suero bovino y hemoc aniña de lapa de ojo de cerradura. 3.- El análogo de topiramato de conformidad con la re vindicación 4, caracter zado además porque Y es una etiqueta. 9.- El análogo de topiramato de conformidad con la reivindicación 8» caracterizado además porque uno de R y R2 es < CH2 ) --,-CO-NH- (etiqueta), en donde n = 1-9. 10.- El análogo de topi amato de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque Rz es ( CH2 ) ^-CO-NH- (etiqueta), en donde n = 1—9. 11.- El análogo de topira ato de conformidad con !a re vindicación 8» caracterizado además porque se selecciona la etiqueta del grupo que consiste de un fluorocromo, una enzima y biotina. 12.- El análogo de topiramato de conformidad con la re indicación 9, caracterizado además porque la etiqueta es un luorocromo . 13.- El análogo de topiramato de conformidad con la reivindicación 10» caracterizado además porque e! fluorocromo es fluoresceína. 14.— El análogo de topiramato de conformidad con la re indicac ón 11, caracterizado además porque se selecciona la fluoresceína del grupo que consiste de 2-( ami oet 1 ) tioureído— fluoresceína, fluoresceína-tiosemicarbazida» ( 2—aminoeti ! )— ureído- luoresceína y l uoresce na a. 15.- El análogo de topiramato de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque la etiqueta está unidad directamente al análogo de topiramato. 1
6.- El análogo de topiramato de conformidad con la rei indicación 15» caracterizado además porque la etiqueta es una rad onucl ida . 1
7.- Un anticuerpo anti-top ramato . B IB.- El anticuerpo anti-topíramato de conformidad con la reivindicación 17» caracterizado además porque el anticuerpo es pol i clonal . 19.- El anticuerpo anti-topiramato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el anticuerpo es monoclonal . 20.- El anticuerpo anti-topi ramato de conformidad con la re vindicación 17, caracterizado además porque e! anticuerpo reacciona con un análogo de topiramato derivatizado en la porción sulfamato de topira ato. 21.-Un equipo de inmunoanál isis para analizar topiramato» caracteri ado porque comprende: a) un anticuerpo anti-topiramato; y b) un análogo de topiramato de la fórmula seleccionada del grupo que consiste de: en donde uno de RA y R2 es H y el otro es R—Y; R es un grupo enlazador e Y es una etiqueta; cuando R^ es H , X es H ; cuando Rp no es H, X es H o un grupo alquilo. 22.— El equipo de i nmunoanál i sis de conformidad con la reivi d cac ón 21» caracterizado además porque R2 es R-Y. 23.- El equipo de inmunoanál isis de conformidad con la rei ind cación 21, caracterizado además porque R-Y es (CH--.) C0-NH- (etiqueta), en donde n = 1-9. 24.— El equipo de nmunoanál isis de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque la etiqueta es un fluorocromo. 25.— Un método para analizar topiramato en una muestra» caracterizado porque comprende los pasos de: a) combinar la muestra con un análogo de topiramato y anticuerpos anti-topiramato; b) determinar la cantidad de anticuerpo unido al análogo de topiramato» como una indicación de la cantidad de topiramato presente en la muestra. 26.— El método de conformidad con la re vindicación 25» caracterizado además porque se marca el análogo de topiramato con un fluorocromo.
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