KR101966360B1 - 입자의 단백질 고정화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 입자의 단백질 고정화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 자성입자에 항체를 고정화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 입자의 단백질 고정화 방법은 단백질-단백질간 및 단백질-입자들간의 비특이적 결합에 의해 엉겨 붙지 않아 상대적으로 적은 양의 단백질을 입자에 고정화시킬 수 있는 것이 특징이다.

Description

입자의 단백질 고정화 방법 {METHOD OF FIXING A PROTEIN ON THE PARTICLES}
본 발명은 입자의 단백질 고정화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 자성입자에 항체를 고정화하는 방법에 관한 것이다.
면역 크로마토그래피 분석으로 사용되는 단백질이 고정된 입자는 보건 의료분야에서 질병을 확인하거나 변화를 파악하기 위해 사용되며 식품 및 생물 공정 분야, 환경 분야 등 다양한 분야에서도 미량의 분석 물질을 검사하는 간편한 방법으로 활용되고 있다. 특히, 보건 의료 분야에서는 임신, 배란, 전염성 질병, 약물 남용, 급성 심근경색, 암 등에 응용범위가 확장되고 있으며, 일례로 혈액 속 질병 인자(marker) 분리에도 활용될 수 있다.
입자 중에서도 자성입자(magnetic particles)는 용이한 제어, 높은 생체 적합성 및 높은 감지능과 같은 장점으로 인하여 결합 에세이의 표지물질로 주목을 받고 있다. 일례로 대한민국 공개특허 제2014-0106268호에서는 자성입자를 이용한 생체분자의 검출방법을 개시하고 있다.
한편, 입자에 단백질을 고정화 하는 방법은 입자 표면에 카르복실기(-COOH)가 고정되도록 입자 표면을 개질한 후 단백질의 아미노기(-NH2)와 아마이드 결합으로 고정시키는 방법이 사용되고 있다. 상기 방법의 대표적인 예로서 Thermo사의 Magnabind를 사용한 입자의 단백질 고정화 방법과 Lifetechnology사의 Dynabeads MyoneTM을 사용한 입자의 단백질 고정화 방법이 알려져 있다. 그러나, Thermo사 및 Lifetechnology사의 단백질 고정화 방법의 경우에는 단백질-단백질간 또는 단백질-입자들간의 비특이적 결합에 의해 엉겨붙는 문제점이 있으며, Lifetechnology사의 방법의 경우 공정 시간이 길어지는 단점이 있는 등이 있다. 따라서, 이러한 단점을 보완한 입자의 단백질 고정화 방법이 계속해서 요구되고 있다.
대한민국 공개특허 제2014-0106268호
종래 기술의 문제점으로서 단백질-단백질간 및 단백질-입자들간의 비특이적 결합에 의해 엉겨붙는 것과 공정시간이 긴 것을 해결하면서, 상대적으로 적은 양의 단백질로도 고정화시킬 수 있는 입자의 단백질 고정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 입자 표면에 카르복실기(-COOH)가 고정된 것으로 입자 표면을 개질하는 단계; 상기 개질된 입자에 단백질을 첨가한 후 초음파처리하는 단계; 및 상기 초음파처리하는 단계 후, 입자 표면에 고정된 카르복실기와 단백질의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합을 촉진하는 촉매를 첨가하여 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계를 포함하며, 상기 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 초음파처리를 병행하여 단백질-단백질 또는 단백질-자성입자간의 비특이적 흡착을 방지하는 것을 특징으로 하는, 입자의 단백질 고정화 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 구현예는 개질하는 단계 후, 및 단백질을 첨가한 후 초음파처리하는 단계 전에 개질된 입자에 초음파처리를 하는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 아마이드 결합을 촉진하는 촉매와 함께 계면활성제를 첨가하는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 입자가 자성입자인 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 입자의 크기가 100 nm 내지 3um 인 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 단백질이 항체이며, 입자 표면에 고정된 카르복실기와 항체의 중쇄(heavy chain) 불변 영역의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합으로 인해 입자에 항체가 고정되는 것일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 아마이드 결합을 촉진하는 촉매가 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), CDI(N,N'-carbonyldiimidazole) 및 DOC(dicyclohexylcarbodiimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 입자의 단백질 고정화 방법은 단백질-단백질간 및 단백질-입자들간의 비특이적 결합에 의해 엉겨 붙지 않아 상대적으로 적은 양의 단백질을 입자에 고정화시킬 수 있는 것이 특징이다.
도 1은 일반적으로 표현되는 입자의 항체 고정화 방법 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 6mg을 혈액 샘플에 첨가하였을 경우의 위상차 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 4mg을 혈액 샘플에 첨가하였을 경우의 위상차 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 6mg을 혈액 샘플에 첨가한 후 자석을 이용하여 적혈구를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 4mg을 혈액 샘플에 첨가한 후 자석을 이용하여 적혈구를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1의 단백질이 고정된 입자 1mg을 혈액 샘플에 첨가하였을 경우의 위상차 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 1의 단백질이 고정된 입자 1mg을 혈액 샘플에 첨가한 후의 사진(왼쪽) 및 자석을 이용하여 적혈구를 분리한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
본 발명은 입자의 단백질 고정화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 자성입자에 항체를 고정화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 초음파처리(sonification) 및 계면활성제를 사용하여 단백질-단백질간 및 단백질-입자들간의 비특이적 결합에 의해 엉겨 붙지 않아 상대적으로 적은 양의 단백질을 입자에 고정화시킬 수 있는 것이 특징이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 입자 표면에 카르복실기(-COOH)가 고정된 것으로 입자 표면을 개질하는 단계; 상기 개질된 입자에 초음파처리(sonication)하고, 상기 입자에 단백질을 첨가한 후 다시 초음파처리하는 단계; 및 상기 초음파처리하는 단계 후, 입자 표면에 고정된 카르복실기와 단백질의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합을 촉진하는 촉매를 첨가하여 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계를 포함하며, 상기 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 초음파처리를 병행하여 단백질-단백질 또는 단백질-자성입자간의 비특이적 흡착을 방지하는 것을 특징으로 하는, 입자의 단백질 고정화 방법을 제공한다.
상기 초음파처리로 인해 단백질-단백질간 및 단백질-입자간의 비특이적 흡착이 방지되며, 또한 입자에 단백질이 고르게 고정화된다. 초음파처리는 입자 표면을 개질한 후, 단백질을 첨가한 후 및 촉매를 첨가하여 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 수행되며, 각 단계에서의 초음파처리 회수는 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 촉매를 첨가하여 입자 표면에 단백질 고정하는 단계에서의 초음파처리는 5분마다 7번 수행될 수 있다.
상기 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 아마이드 결합을 촉진하는 촉매와 함께 계면활성제(Detergent)를 첨가할 수 있다. 상기 계면활성제는 단백질들끼리의 정전기적 결합 및 단백질-자성입자간의 비특이적 결합을 방지하는 역할을 한다. 상기 계면활성제는 상기 비특이적 결합을 방지할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 음이온성, 양이온성, 양쪽 이온성 및 비이온성 계면 활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 예컨대, 계면활성제로서 T-20이 사용될 수 있으며, 또한 SDS도 사용될 수 있다. 또한, 상기 계면활성제는 입자 표면에 카르복실기(-COOH)가 고정된 것으로 입자 표면을 개질하는 단계에서도 사용될 수 있다.
상기 입자는 자성입자일 수 있다. 본 발명에서 기재하고 있는 자성입자는 종래 기술에 의한 자기 영동에 적용할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 바람직하게는 Fe2O3 또는 Fe3O4를 포함하는 자성입자일 수 있다. 상기 입자의 크기는 바람직하게 100 nm 내지 3um, 가장 바람직하게는 100 내지 400 nm일 수 있다.
상기 단백질은 항체일 수 있다. 본 발명에서의 "항체"란, 당해 분야에서 공지된 용어로서, 특정 항원 또는 그의 에피토프 부위와 특이적으로 반응하여 결합할 수 있는 특이적인 단백질 분자를 의미하는데, 항원과 결합능력을 가지는 면역글로불린 분자(예를 들어, 단일클론 항체, 다클론 항체 등), 상기 면역글로불린 분자의 단편(예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG, 단일 사슬 Fv 단편(scFv) 등) 등을 포함한다. 특히, 상기 면역글로불린 분자는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 부위 및 가변 부위 (상기 부위는 "도메인"으로 또한 알려져 있음)를 포함하고, 상기 경쇄 및 중쇄의 가변 부위는, 항원의 에피토프(epitope)에 결합할 수 있는, 3개의 다변가능한 영역인 "상보성 결정 영역(complementarity-determining resion, CDR)"; 및 4개의 "구조 영역(framework region, FR)"을 포함한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
다음으로, 항체의 형태적인 측면에서 볼 때, 상기 항체는 바람직하게는 상기 항원에 특이적인 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, 단일쇄 항체 등의 천연형 항체; 상기 천연형 항체의 일부를 포함하도록 구성된 재조합 항체; 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키거나, 체내에서 항체에 대한 거부반응을 감소시키거나 또는 항체의 안정성을 증대시키기 위하여 천연형 항체의 일부를 변이시킨 형태의 변이항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 IgG 등의 천연항체, 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키도록 변이된 변이항체, 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 포함하는 재조합 항체 또는 이들의 단편이 될 수 있다.
상기 입자의 항체 고정화는 입자 표면에 고정된 카르복실기와 항체의 중쇄(heavy chain) 불변 영역(예컨대, 라이신)의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합으로 인해 이루어질 수 있다.
상기 입자의 단백질 고정화 방법에 있어서, 입자 표면에 카르복실기가 고정된 것으로 입자 표면을 개질하는데, 이는 아미드기를 가진 항체와 아마이드 결합으로 고정시키기 위해 수행된다. 상기 입자 표면의 개질은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예컨대 시트르산 나트륨만을 입자 표면에 적용하거나, 입자를 실리카 코팅한 후 APTES(aminopropyl triethoxysilane)를 처리하여 말단 아미노기를 Glutaring anhydride로 처리하여 카복실기를 고정할 수 있다. 상기 입자 표면의 개질은 단백질의 변성을 방지하기 위해 40℃를 넘지 않는 조건에서 수행되어야 하며, 바람직하게는 실온에서 수행되는 것일 수 있다. 또한, 반응시간을 30분으로하여 5분 간격으로 초음파를 수초씩 적용하여 수행될 수 있다.
상기 아마이드 결합을 촉진하는 촉매를 초음파처리하는 단계 후에 첨가하는데, 상기 촉매는 입자 표면에 고정된 카르복실기와 단백질의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합을 촉진하는 역할을 한다. 따라서, 상기 촉매는 아마이드 결합을 촉진하는 역할을 하는 것이라면 특별히 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 촉매는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), CDI(N,N'-carbonyldiimidazole) 및 DOC(dicyclohexylcarbodiimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 아마이드 결합을 촉진하는 촉매를 적정량으로 첨가한 후 실온에서 5 내지 60분 동안 섞어주어 입자 표면에 단백질을 고정시킬 수 있으며, 앞서 기술한 바와 같이 초음파 처리를 병행하여 단백질-단백질 또는 단백질-자성입자간의 비특이적 흡착을 방지할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 단백질이 고정된 입자는 식품 및 생물 공정분야, 환경분야, 보건 의료분야 등에서 사용될 수 있다. 특히, 자성입자의 경우 자석에 끌리는 성질을 가지고 있어 외부의 자기장을 인가하는 방향에 따라 움직이므로, 자성입자에 항체가 고정된 경우 이를 원하는 위치로 유인하여 반응시킬 수 있어, 보건 의료분야에 있어서 생체분자 등을 빠르게 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
실시예 1. 단백질이 고정된 입자의 제조
20 mg/ml 농도의 자성입자(상품명: AMO-Mag, 입수처: AMOGREENTECH) 1 ml를 준비하여 PBS (Potassium buffered saline) 1~5 ml로 3회 세척(washing)하였다. 이후 225ul PBS와 225ul 혼합용액(pH 4.7 0.1M의 MES+0.9% NaCl+0.02% T-20; 단백질들끼리의 정전기적 결합 및 단백질들과 자성입자간의 비특이적 결합으로 서로 엉겨붙는 것을 방지하기 위해 계면활성제인 T-20을 첨가함)을 첨가한 후 초음파처리를 충분히 해주었고, 1mg 또는 2mg의 IgG(immunoglobulin G, 면역글로불린 G)으로서 Anti-RBC(redbloodcell) antibody(fitzerald社)를 첨가한 후 다시 초음파처리하였다.
이후 혼합용액(pH 4.7 0.1M의 MES+0.9% NaCl+0.02% T-20)에 녹아져 있는 10mg/ml 농도의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) 50ul을 첨가한 후 실온에서 30분 동안 섞어주었다(시작 시 초음파처리 후 5분마다 초음파 처리를 하였다). 이후 PBS 1m1로 3회 세척하였으며, 최종적으로 PBST(PBS+0.1% T-20)에서 보관하여 단백질이 고정된 입자를 제조하였다.
비교예 1. 단백질이 고정된 입자의 제조 ( Thermo 사의 제조방법)
20 mg/ml 농도의 자성입자(상품명: Magnabind, 입수처: Thermo사) 1 ml를 준비하여 PBS 1 ml로 3회 세척하였다. 이 후 5~10mg의 IgG를 pH 4.7의 0.1M MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)와 0.9% NaCl이 섞인 반응 용액과 함께 세척된 20mg의 상기 자성입자에 첨가하였으며, 10mg/ml 농도의 EDC 100ul를 첨가하여 실온에서 30분간 섞어주었다. 이후 PBS 1ml로 3회 세척 후 단백질이 고정된 입자를 제조하였다.
비교예 2. 단백질이 고정된 입자의 제조 ( Lifetechnology 사의 제조방법)
10 mg/ml 농도의 자성입자(상품명: Dynabeads Myone, 입수처: Lifetechnology社 ) 100 ul를 준비하여 pH 6.0의 15mM MES에 첨가한 후, 10mg/ml 농도의 EDC 10ul를 첨가하여 실온에서 30분간 섞어주었다. 이후 자석 포집 후 상층액을 제거하였고, 200~500ul의 pH 6.0 15 mM MES에 0.4mg IgG을 첨가한 후 실온에서 하룻밤 섞어주었다. 이후 1ml PBST(PBS+0.1% T-20)로 3회 세척하였고, 최종적으로 PBSTB(PBS+0.1% T-20+0.1% BSA)에서 보관하여 단백질이 고정된 입자를 제조하였다.
실험예 1. 단백질이 고정된 입자를 이용한 적혈구 분리 실험
상기 실시예 1(단백질이 고정된 입자 1mg 적용) 및 비교예 1(단백질이 고정된 입자 4mg 또는 6mg 적용)의 단백질이 고정된 입자(50ul)를 혈액 샘플 50 ul에 첨가한 후 실온에서 진행하였으며, 시간은 5분 정도 반응시켰고, 그 결과를 도 2 내지 도 7에 나타내었다.
도 2는 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 6mg을 혈액 샘플에 첨가하였을 경우의 위상차 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 4mg을 혈액 샘플에 첨가하였을 경우의 위상차 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 6mg을 혈액 샘플에 첨가한 후 자석을 이용하여 적혈구를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 비교예 1의 단백질이 고정된 입자 4mg을 혈액 샘플에 첨가한 후 자석을 이용하여 적혈구를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1의 단백질이 고정된 입자 1mg을 혈액 샘플에 첨가하였을 경우의 위상차 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 1의 단백질이 고정된 입자 1mg을 혈액 샘플에 첨가한 후의 사진(왼쪽) 및 자석을 이용하여 적혈구를 분리한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 7에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 단백질이 고정된 입자의 경우에는 검은색으로 크게 응집되어 있으며, 단백질이 고정된 입자 6mg 첨가해주어야 겨우 적혈구들이 자성입자에 의해 분리된 반면, 실시예 1의 단백질이 고정된 입자의 경우에는 뭉쳐 있는 입자들이 거의 나타나지 않았으며, 단백질이 고정된 입자의 첨가량도 6mg보다 적은 1mg을 첨가하여도 모든 적혈구들이 분리된 것으로 나타났다. 특히, 도 7에 나타난 바와 같이, 비교예 1과 비교하여 실시예 1의 튜브(Tube) 벽면 색깔이 깨끗한 것으로 보아 입자가 비특이적 흡착 없이 혈액에서 목표한 물질하고 반응함을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 입자의 단백질 고정화 방법에 있어서,
    상기 입자 표면에 카르복실기(-COOH)가 고정된 것으로 입자 표면을 개질하는 단계;
    상기 개질된 입자에 단백질을 첨가한 후 초음파처리하는 단계; 및
    상기 초음파처리하는 단계 후, 입자 표면에 고정된 카르복실기와 단백질의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합을 촉진하는 촉매를 첨가하여 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계를 포함하며,
    상기 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 초음파처리를 병행하여 단백질-단백질 또는 단백질-자성입자간의 비특이적 흡착을 방지하고,
    상기 입자 표면을 개질하는 단계에서 계면활성제를 첨가하고, 상기 입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 아마이드 결합을 촉진하는 촉매와 함께 계면활성제를 첨가하며,
    상기 입자는 자성입자이고,
    상기 입자의 크기는 100 nm 내지 400 nm인 것을 특징으로 하는, 입자의 단백질 고정화 방법으로서,
    상기 방법으로부터 얻어지는 단백질이 고정된 입자는, 혈액 샘플로부터 적혈구를 분리하기 위해 사용되는 것인, 입자의 단백질 고정화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 개질하는 단계 후, 및 단백질을 첨가한 후 초음파처리하는 단계 전에 개질된 입자에 초음파처리를 하는 것을 특징으로 하는, 입자의 단백질 고정화 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 항체이며, 입자 표면에 고정된 카르복실기와 항체의 중쇄(heavy chain) 불변 영역의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합으로 인해 입자에 항체가 고정되는 것을 특징으로 하는, 입자의 단백질 고정화 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 아마이드 결합을 촉진하는 촉매는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), CDI(N,N'-carbonyldiimidazole), 및 DOC(dicyclohexylcarbodiimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 입자의 단백질 고정화 방법.
  8. 자성입자 표면에 카르복실기(-COOH)가 고정된 것으로 입자 표면을 개질하는 단계;
    상기 개질된 자성입자에 단백질을 첨가한 후 초음파처리하는 단계;
    상기 초음파처리하는 단계 후, 자성입자 표면에 고정된 카르복실기와 단백질의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합을 촉진하는 촉매를 첨가하여 자성입자 표면에 단백질을 고정하는 단계;
    단백질이 고정된 자성입자를 혈액 샘플에 첨가하는 단계; 및
    자석을 이용하여 상기 혈액 샘플 내에 포함된 자성입자를 원하는 위치로 유인함으로써 상기 혈액 샘플 내에 포함된 적혈구를 분리하는 단계를 포함하며,
    상기 자성입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 초음파처리를 병행하여 단백질-단백질 또는 단백질-자성입자간의 비특이적 흡착을 방지하고,
    상기 입자 표면을 개질하는 단계에서 계면활성제를 첨가하고, 상기 자성입자 표면에 단백질을 고정하는 단계에서 아마이드 결합을 촉진하는 촉매와 함께 계면활성제를 첨가하며,
    상기 자성입자의 크기는 100 nm 내지 400 nm인 것을 특징으로 하는, 혈액 샘플로부터 적혈구를 분리하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단백질은 항체이며, 입자 표면에 고정된 카르복실기와 항체의 중쇄(heavy chain) 불변 영역의 아미노기(-NH2)의 아마이드 결합으로 인해 입자에 항체가 고정되는 것을 특징으로 하는, 혈액 샘플로부터 적혈구를 분리하는 방법.
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