CN116650442B - 载米托蒽醌的仿生纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载米托蒽醌的仿生纳米颗粒及其制备方法和应用。所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒由载药纳米颗粒和红细胞膜制备而成；所述载药纳米颗粒由包括如下组分的原料制备而成：米托蒽醌、全氟烷烃、聚磷酸酯；所述聚磷酸酯包载所述米托蒽醌和全氟烷烃；所述红细胞膜包覆所述载药纳米颗粒；所述聚磷酸酯含有硫醚侧基；所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒载有氧气。该载米托蒽醌的仿生纳米颗粒能够通过长循环有效富集在肿瘤部位，并且可以同步实现化疗、PTT和PDT的联合治疗，从而大大提高了化疗药物米托蒽醌的抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物技术领域，特别是涉及一种载米托蒽醌的仿生纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
目前，传统的肿瘤治疗手段主要包括手术切除、放射治疗和化学治疗，新兴治疗手段主要包括光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)等，许多研究已经开发出联合治疗肿瘤的策略。比如，利用高分子纳米载体共同包载化疗药物，光热试剂或光敏剂实现联合化疗、PTT或PDT增强抗肿瘤效果。尽管这些策略显示出有希望的治疗效果，但这些光热试剂和光敏剂尚未获得临床批准，因此在临床上对肿瘤患者的治疗应用有限。
发明内容
基于此，本发明基于临床批准的化疗药物米托蒽醌提供了一种载米托蒽醌的仿生纳米颗粒及其制备方法和应用。该载米托蒽醌的仿生纳米颗粒能够通过长循环有效富集在肿瘤部位，并且可以同步实现化疗、PTT和PDT的联合治疗，从而可以大大提高化疗药物米托蒽醌的抗肿瘤效果。
一方面，本发明提供了一种载米托蒽醌的仿生纳米颗粒，其由载药纳米颗粒和红细胞膜制备而成；
所述载药纳米颗粒由包括如下组分的原料制备而成：米托蒽醌、全氟烷烃、聚磷酸酯；
所述聚磷酸酯包载所述米托蒽醌和全氟烷烃；
所述红细胞膜包覆所述载药纳米颗粒；
所述聚磷酸酯中含有硫醚侧基；
所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒载有氧气。
另一方面，本发明还提供了所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、将溶于有机溶剂的聚磷酸酯溶液与溶于有机溶剂的米托蒽醌溶液混合，得混合溶液；将所述混合溶液加入水中，再向其中加入全氟烷烃，超声处理，除去有机溶剂，离心，即得所述载药纳米颗粒的悬浮液；
S2、将所述载药纳米颗粒的悬浮液与分散于PBS的红细胞膜悬浮液混合，超声处理，除去游离的红细胞膜，向所得悬浮液中通入氧气，即得所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒。
第三个方面，本发明还提供了所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌和黑色素瘤等。
本发明的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒及其制备方法和应用至少具有如下有益效果：
本发明合成了活性氧敏感的聚磷酸酯，并利用其与疏水性抗肿瘤药物米托蒽醌的疏水相互作用有效封装米托蒽醌和全氟烷烃并形成载药纳米颗粒，然后将红细胞膜包覆在载药纳米颗粒的亲水层表面，并通入氧气，最终获得活性氧敏感的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒。该载米托蒽醌的仿生纳米颗粒在红细胞膜的作用下能够通过长循环有效富集在肿瘤部位，其中的米托蒽醌在660nm光照条件下可以产生高热和活性氧，并且全氟烷烃携载的氧气可以进一步促进米托蒽醌产生更多活性氧，从而实现良好的光热治疗和光动力治疗效果；此外，活性氧进一步触发米托蒽醌从活性氧敏感的聚磷酸酯的疏水内核自加速释放，从而同步实现化疗。该仿生纳米颗粒介导的光热/光动力/化疗三者联合治疗能够大大增强米托蒽醌的抗肿瘤效果，为化疗药物米托蒽醌治疗肿瘤提供了一种方便有效的新策略及新方向，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为实施例1的RBC@PPEMTO/PFA的制备及自加速药物释放示意图。
图2为本发明实施例中所用聚磷酸酯(PPE)的化学结构及核磁氢谱(1HNMR)。
图3为RBC@PPEMTO在不同投料比例下的载药和粒径。
图4为对比例1的RBC@PPEMTO的粒径，电势和透射电镜图。
图5为实施例1的RBC@PPEMTO/PFA的产热和活性氧的能力。
图6为RBC@PPEMTO/PFA的体外抗肿瘤效果。
图7为RBC@PPEMTO/PFA的体内抗肿瘤效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
现有技术中一般需要使用化疗药物联合光热试剂或光敏剂实现联合化疗、PTT或PDT以增强抗肿瘤效果，但是由于光热试剂和光敏剂尚未获得临床批准，联合化疗、PTT和PDT以增强抗肿瘤效果的肿瘤治疗策略在临床上难以得到实现。因此，本发明的目的在于在不添加光热试剂或光敏剂的情况下实现联合化疗、PTT和PDT以增强抗肿瘤药物的抗肿瘤效果。
基于上述发明目的，本发明在其一个实施方式中，提供了一种载米托蒽醌的仿生纳米颗粒，其由载药纳米颗粒和红细胞膜制备而成；
所述载药纳米颗粒由包括如下组分的原料制备而成：米托蒽醌、全氟烷烃、聚磷酸酯；
所述聚磷酸酯包载所述米托蒽醌和全氟烷烃；
所述红细胞膜包覆所述载药纳米颗粒；
所述聚磷酸酯中含有硫醚侧基；
所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒载有氧气。
米托蒽醌(MTO)是临床批准的抗肿瘤化疗药物，能够干扰DNA复制从而诱导肿瘤细胞凋亡，同时MTO在600～700nm的近红外(NIR)区域有很强的吸收，本发明尝试探索MTO的光疗潜力，发现在660nm的激光照射下，MTO可以产生高热和活性氧，从而可以实现PTT和PDT。在此基础上，本发明合成了活性氧敏感的聚磷酸酯(PPE)，并利用其与疏水性抗肿瘤药物米托蒽醌的疏水相互作用有效封装MTO和PFA并形成载药纳米颗粒，然后再将红细胞膜包覆在其亲水层表面，并通入氧气，最终获得活性氧敏感的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒。本发明发现以红细胞膜(RBC)包覆的聚磷酸酯纳米载体包载MTO和PFA制备得到的仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO/PFA)可以实现连续的PTT/PDT/化疗效果，能够有效抑制三阴性乳腺癌的生长，其效果显著优于单独游离的米托蒽醌。其中，RBC@PPEMTO/PFA外层包覆的红细胞膜可延长其血液循环，增强RBC@PPEMTO/PFA的肿瘤靶向性，提高药物在肿瘤部位的聚积；随后RBC@PPEMTO/PFA中的MTO在660nm激光照射下，可以产生活性氧和热量，并且PFA携载的氧气有助于促进MTO产生更多的活性氧，从而实现较好的光热治疗和光动力治疗效果；活性氧进一步触发带硫醚的聚磷酸酯(PPE)内核由疏水转变为亲水从而释放MTO，以同步实现化疗，最终实现连续的PTT/PDT/化疗，有效抑制三阴性乳腺癌的生长，有效提高米托蒽醌的抗肿瘤效果(RBC@PPEMTO/PFA的制备及自加速药物释放示意图如图1所示)。该RBC@PPEMTO/PFA纳米颗粒通过纳米技术为临床批准的化疗药物MTO提供了一种方便可用的新策略，并实现连续的PTT/PDT/化疗，具有临床应用价值。
在本发明的一些实施例中，聚磷酸酯的分子量为8000～12000。
在本发明的一些实施例中，所述聚磷酸酯的结构式为：
在本发明的一些实施例中，所述全氟烷烃为全氟-15-冠-5-醚。
在本发明的一些实施例中，所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒载有氧气的含量不小于0.5mg/mg，优选为不小于1mg/mg；例如，可以为1.0mg/mg～3mg/mg，可以为1.20mg/mg～2.6mg/mg，可以为1.30mg/mg～2.0mg/mg，可以为1.40mg/mg～1.8mg/mg等。
在本发明的一些实施例中，所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒载有饱和氧气。所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒中的PFA具有载氧功能，在制备过程中通入足够多的氧气以使纳米颗粒中的氧气达到饱和时，所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒中的氧气可以达到大于1.50mg/mg的含量，例如达到氧气含量为1.60mg/mg及以上。
在本发明的一些实施例中，所述米托蒽醌和全氟烷烃的投料比为1mg:6μL～100μL，优选为1mg:6μL～15μL，优选为1mg:12μL～13μL，更优选为1mg:12.5μL。PFA有助于促进MTO产生更多的活性氧，因此米托蒽醌和全氟烷烃的配比会影响RBC@PPEMTO/PFA的活性氧产生能力，如果全氟烷烃的量过低，会导致MTO产生的活性氧减少，从而会降低RBC@PPEMTO/PFA的抗肿瘤活性；如果全氟烷烃的量过高，会导致纳米颗粒的粒径过大，粒径过大的纳米颗粒受到肿瘤血管的孔径限制不易靶向渗透和滞留于肿瘤细胞，并且容易被网状内皮系统清除，因而会严重影响其在肿瘤的富集及抗肿瘤效果。
在本发明的一些实施例中，所述米托蒽醌和所述聚磷酸酯的投料质量比为1：6～14，优选为1：8～12，更优选为1：10。
在本发明的一些实施例中，所述聚磷酸酯和所述红细胞膜的投料质量比为1：0.2～4，优选为1：0.5～2，更优选为1：0.8～2，更优选为1：0.9～1.2，更优选为1：1。
在本发明的一些实施例中，所述米托蒽醌占所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒质量的4.01～6.23％，优选为4.39～6.10％，更优选为5.65％。
在本发明的一些实施例中，所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的平均粒径为100nm～500nm，优选为130nm～200nm，更优选150nm～175nm。
在本发明的一些实施例中，所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的电势是-17.0mV～-19.6mV。
在本发明的另一个实施方式中，提供了所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、将溶于有机溶剂的聚磷酸酯溶液与溶于有机溶剂的米托蒽醌溶液混合，得混合溶液；将所述混合溶液加入水中，再向其中加入全氟烷烃，超声处理，除去有机溶剂，离心，即得所述载药纳米颗粒的悬浮液；
S2、将所述载药纳米颗粒的悬浮液与分散于PBS的红细胞膜悬浮液混合，超声处理，除去游离的红细胞膜，向所得悬浮液中通入氧气，即得所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒。
在其中一些实施例中，所述通入氧气为通入足够多的氧气至悬浮液中的溶解氧浓度达到饱和。
在本发明的一些实施例中，所述米托蒽醌和聚磷酸酯的质量比为1：6～14，优选为1：8～12，更优选为1：10。
在本发明的一些实施例中，所述聚磷酸酯和所述红细胞膜的质量比为1：0.2～4，优选为1：0.5～2，更优选为1：0.8～2，更优选为1：0.9～1.2，更优选为1：1。
在本发明的一些实施例中，所述米托蒽醌溶液的浓度为2mg/mL～10mg/mL，优选为3mg/mL～8mg/mL，更优选为4mg/mL～6mg/mL，更优选为5mg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述聚磷酸酯溶液的浓度为5mg/mL～20mg/mL，优选为8mg/mL～15mg/mL，更优选为9mg/mL～12mg/mL，更优选为10mg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述载药纳米颗粒的悬浮液的浓度为2mg/mL～10mg/mL；优选为3mg/mL～8mg/mL，更优选为4mg/mL～6mg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述红细胞膜悬浮液的浓度为3mg/mL～10mg/mL，优选为4mg/mL～8mg/mL，更优选为6mg/mL～7mg/mL。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中所述混合溶液与水的体积比为1：2～10，优选为1：3～8，更优选为1：4～6，更优选为1：4～5。混合溶液与水的体积比过大，会导致聚磷酸酯及药物溶解在有机溶剂里，难以形成纳米颗粒，体积比过小，纳米颗粒浓度小，药物浓度低，浓缩耗时。
在本发明的一些实施例，所述有机溶剂选自二氯甲烷和三氯甲烷中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中所述超声处理的条件包括：超声功率为120W～140W，超声处理的总时间为10min～20min，其中，每超声4s～6s停1s～3s。
在本发明的一些实施例中，步骤S1中所述离心的转速为3000～5000转/分，时间为10min～20min。
在本发明的一些实施例中，步骤S2中所述超声处理的条件包括：超声功率为120W～140W，超声处理的总时间为8min～15min，其中，每超声4s～6s停1s～3s。
在本发明的一些实施例中，步骤S2中所述除去游离的红细胞膜的方法为：用200nm聚碳酸酯膜挤压至少10次以除去游离的红细胞膜。
在本发明的另一个实施方式中，提供了所述的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌和黑色素瘤等。
本发明出现的缩写的全称如下表1所示。
表1
实施例用到的部分原料如下：
聚磷酸酯(PPE)参照文献合成，具体过程如下：在氮气环境下的手套箱中，将引发剂苯甲醇(0.05g，0.5mmol)，磷酸酯单体MSPEP(10.2g，48.3mmol)和催化剂Sn(Oct)2(150mg)依次加入到无水THF(10mL)中。45℃条件下，搅拌反应10小时。通过在冷的混合溶剂(100mL，乙醚/甲醇，10/1，v/v)中沉淀两次，将得到的白色沉淀物在室温下减压干燥过夜，得到白色粉末状产物。将10mg产物溶于0.6mL氘代氯仿中，进行核磁表征。产物结构及核磁氢谱(1HNMR)如图2所示，分析得到链节数约为48，分子量约为10340。
其中，磷酸酯单体MSPEP的结构式为：合成过程参照文献，主要包括2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane,COP)的合成和2-(3-甲硫基丙氧基)-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(2-(3-methylthiopropayloxy)-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane,MSPEP)的合成。
COP的具体合成过程如下：将2000mL三口烧瓶和500mL恒压滴液漏斗构建成密闭的反应装置，并在真空条件下高温加热氮气回流三次以除去水汽，用玻璃注射器加乙二醇(8.2mol，508.0g)于恒压滴液漏斗中，加三氯化磷(9.0mol，1239.8g)于三口烧瓶中，并用双针头加500mL左右于三口烧瓶中作为溶剂。在常温搅拌条件下，控制乙二醇的滴加速度使其与三氯化磷反应。待滴加完毕，将反应装置转移到低温恒温水浴中，保持反应在低温条件下进行过夜。在真空状态下抽掉三口烧瓶中的二氯甲烷，得到中间产物CDP。将CDP溶于适量苯中，再通入氧气24小时以上。在真空状态下抽掉三口烧瓶中的苯，然后减压蒸馏2次得到纯化后的COP。
通过COP与3-甲硫基丙醇的开环取代反应可制备磷酸酯单体MSPEP，具体合成过程如下：将1000mL三口烧瓶和250mL恒压滴液漏斗构成密闭装置并经三次高温真空干燥，首先用双针头将无水四氢呋喃分别加入三口烧瓶(500mL)和恒压滴液漏斗(100mL)中，然后用玻璃注射器依次加入3-甲硫基丙醇(0.3mol，31.8g)，三乙胺(0.3mol，30.4g)于三口烧瓶，将体系冷却到-5℃左右，最后用玻璃注射器加入COP(0.154mol，21.9g)于恒压滴液漏斗，并在搅拌条件下，缓慢滴加COP的四氢呋喃溶液于三口烧瓶，滴完后保持-5℃左右继续反应24小时以合成单体MSPEP。反应完成后，用高温真空干燥后的密闭过滤装置除去三乙胺盐酸盐白色沉淀，收集滤液并纯化。在真空状态下抽掉滤液中的四氢呋喃溶剂，再在干燥条件下减压蒸馏(200Pa，140℃)两次滤液，就可以得到纯化后的单体MSPEP。
二氯甲烷：购自于上海化学试剂有限公司。
米托蒽醌(MTO)：购自于上海麦克林生物化学有限公司。
全氟烷烃(PFA，全氟-15-冠-5-醚)：购自于上海麦克林生物化学有限公司，其结构式如下。
红细胞膜(RBC)参照文献提取，具体过程如下：收集BALB/c小鼠全血，加入含有肝素钠的磷酸盐缓冲液(PBS，1x)中，3000转/分离心，PBS洗3遍；将红细胞重悬于PBS(0.25x)以诱导膜破裂，然后以12000rpm(4℃)离心3次，去除上清液，获得浅粉红色膜沉淀；将收集的RBC膜重新分散在PBS(0.25×)中，超声处理，并在使用前使用0.45μm过滤器过滤。
其它的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。
试剂配制：
5mg/mL MTO溶液：称取5mg疏水MTO，用二氯甲烷溶解，得到浓度为5mg/mL的MTO溶液。
10mg/mL PPE溶液：称取10mg PPE，用二氯甲烷溶解，得到浓度为10mg/mL的PPE溶液。
6.67mg/mL红细胞膜悬浮液：将13.34mg红细胞膜重悬于PBS(0.25×)中，得到浓度为6.67mg/mL的红细胞膜悬浮液。
以下为具体实施例。
实施例1载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO/PFA)的制备
实施例1提供一种载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO/PFA)，通过如下步骤制备：
S1、取1mLPPE溶液(10mg/mL)与200μL MTO溶液(5mg/mL)混合，加入5mL水中，然后再逐滴加入12.5μL PFA。微波探头超声处理15min，设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W。旋蒸除去有机溶剂，3000rpm离心15min除去游离的MTO，得到载药纳米颗粒的悬浮液(4mg/mL)。
S2、将步骤S1得到的载药纳米颗粒的悬浮液与红细胞膜悬浮液(6.67mg/mL)按照PPE与红细胞膜的质量比为1：1混合并超声处理10min(设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W)，用200nm聚碳酸酯膜挤压至少10次除去游离的红细胞膜，得到表面包覆红细胞膜的载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO的悬浮液(浓度为6mg/mL)，同时用溶解氧分析仪(JB-607A，戚薇，中国)测得RBC@PPEMTO悬浮液的溶解氧浓度为5.98mg/mL；向所述RBC@PPEMTO悬浮液中通入足够多的氧气，同时实时检测悬浮液中的溶解氧浓度直至氧气饱和，测得饱和时的溶解氧浓度为15.6mg/mL，进一步得到载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA的悬浮液。
为了评估RBC@PPEMTO/PFA的载氧能力，设定计算公式：①纳米颗粒的载氧量＝(通氧后纳米颗粒悬浮液的氧含量-通氧前纳米颗粒悬浮液的氧含量)/纳米颗粒的质量；②纳米颗粒的载氧效率＝(通氧后纳米颗粒悬浮液的氧含量-通氧前纳米颗粒悬浮液的氧含量)/通氧前纳米颗粒悬浮液的氧含量。根据公式计算得到每毫克RBC@PPEMTO/PFA能载氧气1.60mg，RBC@PPEMTO/PFA的载氧能力比RBC@PPEMTO增加1.61倍。
对比例1载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)的制备
对比例1提供一种载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)，其制备方法同实施例1的步骤，其与实施例1的区别在于，对比例1中不通氧气，制备步骤如下：
S1、取1mLPPE溶液(10mg/mL)与200μL MTO溶液(5mg/mL)混合，加入5mL水中，然后再逐滴加入12.5μL PFA。微波探头超声处理15min，设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W。旋蒸除去有机溶剂，3000rpm离心15min除去游离的MTO，得到载药纳米颗粒的悬浮液(4mg/mL)。
S2、将步骤S1得到的载药纳米颗粒的悬浮液与红细胞膜悬浮液(6.67mg/mL)按照PPE与红细胞膜的质量比为1：1混合并超声处理10min(设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W)，用200nm聚碳酸酯膜挤压至少10次除去游离的红细胞膜，得到表面包覆红细胞膜的载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO的悬浮液(浓度为6mg/mL)。
对比例2载药纳米颗粒(PPEMTO)的制备
对比例2提供一种载药纳米颗粒(PPEMTO)，其制备方法同对比例1的步骤S1，即其与对比例1的区别在于，对比例2中不加入红细胞膜。
对比例3载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)的制备
对比例3提供一种载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)，通过如下步骤制备：
S1、分别取1mLPPE溶液(10mg/mL)与不同体积(120μL、160μL、200μL、240μL、280μL)的MTO溶液(5mg/mL)混合，加入5mL水中，然后再逐滴加入12.5μL PFA。微波探头超声处理15min，设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W。旋蒸除去有机溶剂，3000rpm离心15min除去游离的MTO，得到不同投料比的载药纳米颗粒的悬浮液(2.5～5mg/mL)。
S2、将步骤S1得到的载药纳米颗粒的悬浮液与红细胞膜悬浮液(6.67mg/mL)按照PPE与红细胞膜的质量比为1：1混合并超声处理10min(设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W)，用200nm聚碳酸酯膜挤压至少10次除去游离的红细胞膜，得到表面包覆红细胞膜的载药仿生纳米颗粒RBC@PPE MTO的悬浮液(浓度为4～8mg/mL)。
对比例4载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)的制备
对比例4提供一种载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)，通过如下步骤制备：
S1、分别取1mLPPE溶液(10mg/mL)与200μLMTO溶液(5mg/mL)混合，加入5mL水中，然后再分别逐滴加入不同体积(6.25μL、12.5μL、25μL、50μL、100μL)的PFA。微波探头超声处理15min，设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W。旋蒸除去有机溶剂，3000rpm离心15min除去游离的MTO，得到不同投料比的载药纳米颗粒的悬浮液(2.5～5mg/mL)。
S2、将步骤S1得到的载药纳米颗粒的悬浮液与红细胞膜悬浮液(6.67mg/mL)按照PPE与红细胞膜的质量比为1：1混合并超声处理10min(设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W)，用200nm聚碳酸酯膜挤压至少10次除去游离的红细胞膜，得到表面包覆红细胞膜的载药仿生纳米颗粒RBC@PPE MTO的悬浮液(浓度为4～8mg/mL)。
对比例5载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)的制备
对比例5提供一种载药仿生纳米颗粒(RBC@PPEMTO)，通过如下步骤制备：
S1、取1mLPPE溶液(10mg/mL)与200μL MTO溶液(5mg/mL)混合，加入5mL水中，然后再逐滴加入12.5μL PFA。微波探头超声处理15min，设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W。旋蒸除去有机溶剂，3000rpm离心15min除去游离的MTO，得到载药纳米颗粒的悬浮液(4mg/mL)。
S2、将步骤S1得到的载药纳米颗粒的悬浮液与红细胞膜悬浮液(6.67mg/mL)以PPE与红细胞膜按照不同质量比(1：10、1：4、1：2、1：1、1：0.5)混合并超声处理10min(设定超声条件：超声5s停2s，输出功率为130W)，用200nm聚碳酸酯膜挤压至少10次除去游离的红细胞膜，得到表面包覆不同配比红细胞膜的载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO的悬浮液(浓度为4～8mg/mL)。
实施例2性能测试
鉴定实施例1、对比例1-5分别制备的RBC@PPEMTO/PFA、RBC@PPEMTO和PPEMTO的理化性质。
1、原料投料比对所得纳米颗粒药物包封率、载药量和粒径的影响。
按对比例3-5分别调整MTO和PPE，PFA和PPE及RBC和PPE的投料比例后，通过紫外可见光(UV-Vis)分光光度计检测660nm波长处的吸收计算MTO的载药量(DLE)和包封率(EE)，通过将纳米颗粒RBC@PPEMTO悬浮在超纯水中(1mg/mL)，使用动态光散射仪ZetasizerNanoZSE(Malvern，UK)检测纳米颗粒的尺寸。
结果如图3所示：MTO的EE随着PPE的添加比例增大先急剧增大后趋向平稳，DLE则反之(如图3中的a所示)；当PPE：PFA的质量体积比为10mg：6.25μL和10mg：12.5μL时，所得RBC@PPEMTO的粒径最理想，PFA的含量过多则会使颗粒粒径过大(如图3中的b所示)；当PPE：RBC的质量比为1：2或1：1时，所得RBC@PPEMTO的粒径最理想，分别约为135nm和172nm，RBC的含量过多也会使颗粒粒径过大(如图3中的c所示)。另外，在粒径相近的情况下，PFA含量高更利于携载氧气，RBC用量少可节约制备成本，在此基础上，仿生纳米颗粒的投料比例优选为MTO：PPE质量比为1：10，PPE：PFA的质量体积比为10mg：12.5μL，PPE：RBC的质量比为1：1。以下实施例3和4中，所用纳米颗粒RBC@PPEMTO和纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA均按此优选的投料比制备。
2、检测仿生纳米颗粒的基本特性。
将对比例1制备的纳米颗粒RBC@PPEMTO和对比例2制备的PPEMTO悬浮在超纯水中(1mg/mL)，使用动态光散射仪ZetasizerNano ZSE(Malvern，UK)检测纳米颗粒的尺寸及表面电势；使用透射电子显微镜TEM观察RBC@PPEMTO和PPEMTO的形态；通过紫外可见光(UV-Vis)分光光度计检测660nm波长处的吸收以计算MTO的载药量(DLC)。
结果如图4所示：PPEMTO的粒径为147.3±0.5nm，RBC@PPEMTO的粒径增加到164.5±7.6nm(如图4中的a所示)，同时PPEMTO的表面电势为0.5±0.8mV，RBC@PPEMTO的表面电势与红细胞膜接近，变为-18.3±1.3mV(如图4中的b所示)。使用透射电子显微镜TEM进一步观察到类似尺寸的RBC@PPEMTO和PPEMTO呈球形，而且RBC@PPEMTO外围有一层厚度约12.1nm的红细胞膜(如图4中的c所示)。
另外，通过紫外可见光(UV-Vis)分光光度计检测660nm波长处的吸收计算MTO的载药量(DLC)，计算得到MTO的载药量约为5.65％。
这些结果表明在成功制备载药纳米颗粒PPEMTO的基础上，将红细胞膜包覆在其表面制备得到了载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO。
3、评估仿生纳米颗粒的产热和活性氧的能力。
通过ABDA探针间接检测ROS的产生。将ABDA溶于二甲基亚砜(DMSO)中，并将50μLABDA(2.4mM)加入1.0mL RBC@PPEMTO或RBC@PPEMTO/PFA，然后对样品进行激光照射(0.6W/cm2；660nm)，并在不同时间点测试混合物在340-400nm的吸收光谱。
结果如图5所示：使用红外相机监测到RBC@PPEMTO在660nm光照条件下能够产生热量，而且产热性能具有浓度/时间依赖性和高度稳定性(如图5中的a和5中的b所示)。如图5中的c所示，RBC@PPEMTO/PFA和RBC@PPEMTO([MTO]＝80μg/mL)在660nm光照条件下显示出了产生活性氧的能力，并且RBC@PPEMTO/PFA具有更高的活性氧产生能力。
实施例3：测试载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA的体外抗肿瘤效果
1、载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA诱导三阴性乳腺癌细胞(4T1)的凋亡效果
以鼠源性4T1细胞作为治疗对象，通过共孵育4T1细胞与不同纳米颗粒(RBC@PPEMTO/PFA和RBC@PPEMTO)并同时调节光照条件，利用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测上述细胞的凋亡程度，以分析载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA在660nm光照条件下诱导4T1细胞凋亡的效果，具体试验过程如下：
将4T1细胞接种到24孔板(1×105细胞/孔)，孵育24h后，吸弃上清，分别加入用1640培养基稀释的RBC@PPEMTO/PFA和RBC@PPEMTO(相应浓度：[MTO]＝0.5μg/mL)孵育4h，并以不添加药物的无血清的RPMI 1640培养基作为PBS组，随后施加660nm光照(15min，0.6W/cm2)。继续培养24h后，利用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒对细胞进行处理，利用流式细胞仪检测细胞凋亡程度。
结果如图6中的a所示，RBC@PPEMTO/PFA在660nm光照条件下(RBC@PPEMTO/PFA(+L))诱导肿瘤细胞早期与晚期凋亡的比例最高，表明RBC@PPEMTO/PFA在660nm光照条件下具有良好的诱导细胞凋亡的效果。
2、载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA对4T1细胞的杀伤效果
随后利用MTT法对上述与不同浓度纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA和RBC@PPEMTO共孵育后的细胞活性进行检测，以分析载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA在660nm光照条件下对4T1细胞的杀伤效果。具体试验过程如下：
将4T1细胞接种到96孔板(8×103细胞/孔)，孵育24h后，吸弃上清，分别加入用无血清的RPMI 1640培养基稀释至不同浓度梯度的纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA和RBC@PPEMTO孵育4h，并以不添加药物的无血清的RPMI1640培养基作为PBS组，随后施加660nm光照(15min，0.6W/cm2)。继续培养24h后，MTT法检测细胞存活情况。
结果如图6中的b所示，RBC@PPEMTO/PFA在660nm光照条件下(RBC@PPEMTO/PFA(+L))对4T1细胞的杀伤强于其他实验组，表明本发明中的载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA介导的光热/光动力/化疗具有良好的杀伤肿瘤细胞的效果。
实施例4、测试载药仿生纳米颗粒RBC@PPEMTO/PFA的体内抗肿瘤效果
用5-6周周龄的BALB/c雌鼠构建4T1肿瘤模，将1х106个4T1细胞注射到BALB/c小鼠右侧乳房垫下，待肿瘤体积生长到50～100mm3时，将所有小鼠随机分为6组，每组5只小鼠，分别尾静脉注射200μL的PBS，Free MTO和各纳米颗粒([MTO]＝3mg/kg)，并在12h后于特定分组的小鼠肿瘤部位施加660nm光照(15min,0.6W/cm2)，设定组别为PBS(G1)、Free MTO(G2)、PPEMTO(G3)、RBC@PPEMTO(G4)，RBC@PPEMTO(+L)(G5)和RBC@PPEMTO/PFA(+L)(G6)。每两天进行1次给药处理，重复3次，同时每两天用游标卡尺测量肿瘤尺寸并计算肿瘤体积(计算公式为：体积(mm3)＝0.5×长×宽2)。待治疗结束，杀死小鼠，称量肿瘤重量。
结果如图7所示，RBC@PPEMTO/PFA抑制肿瘤生长的效果明显优于其他组(图7中的a)，这是因为RBC@PPEMTO/PFA有效富集到肿瘤部位后，MTO在660nm光照条件下不仅能够产热，而且能够产生更多的活性氧，进一步触发MTO释放，同时实现光热/光动力/化疗。肿瘤的重量结果同样证明RBC@PPEMTO/PFA抑制肿瘤生长的效果最好(如图7中的b所示)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种载米托蒽醌的仿生纳米颗粒，其特征在于，其由载药纳米颗粒和红细胞膜制备而成，
所述载药纳米颗粒由包括如下组分的原料制备而成：米托蒽醌、全氟烷烃、聚磷酸酯；
所述聚磷酸酯包载所述米托蒽醌和全氟烷烃；
所述红细胞膜包覆所述载药纳米颗粒；
所述聚磷酸酯含有硫醚侧基；
所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒载有饱和氧气；
所述聚磷酸酯的结构式为：；
所述全氟烷烃为全氟-15-冠-5-醚；
所述米托蒽醌和所述全氟烷烃的投料比为1 mg：12.5µL；
所述米托蒽醌和所述聚磷酸酯的投料质量比为1：10；
所述聚磷酸酯和所述红细胞膜的投料质量比为1：1。
2.根据权利要求1所述的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒，其特征在于，
所述米托蒽醌占所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒质量的5.65%。
3.根据权利要求1-2任一项所述的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的平均粒径为164.5±7.6nm；和/或，
所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的电势是−17.0 mV~−19.6 mV。
4.一种权利要求1-3任一项所述的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将溶于有机溶剂的聚磷酸酯溶液与溶于有机溶剂的米托蒽醌溶液混合，得混合溶液；将所述混合溶液加入水中，再向其中加入全氟烷烃，超声处理，除去有机溶剂，离心，即得所述载药纳米颗粒的悬浮液；
S2、将所述载药纳米颗粒的悬浮液与分散于PBS的红细胞膜悬浮液混合，超声处理，除去游离的红细胞膜，向所得悬浮液中通入氧气，即得所述载米托蒽醌的仿生纳米颗粒；
所述通入氧气为通入足够多的氧气至悬浮液中的溶解氧浓度达到饱和。
5.根据权利要求4所述的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述米托蒽醌溶液的浓度为5mg/mL；和/或，
所述聚磷酸酯溶液的浓度为10mg/mL；和/或，
所述载药纳米颗粒的悬浮液的浓度为4 mg/mL；和/或，
所述红细胞膜悬浮液的浓度为6.67mg/mL；和/或，
步骤S1中所述混合溶液与水的体积比为1：5；和/或，
所述有机溶剂选自二氯甲烷。
6.根据权利要求4或5所述的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述超声处理的条件包括：超声功率为130 W，超声处理的总时间为15min，其中，每超声5s停2s；和/或，
步骤S1中所述离心的转速为3000转/分，时间为15min；和/或，
步骤S2中所述超声处理的条件包括：超声功率为130W，超声处理的总时间为10min，其中，每超声5s停2 s；和/或，
步骤S2中所述除去游离的红细胞膜的方法为：用200 nm聚碳酸酯膜挤压至少10次以除去游离的红细胞膜。
7.权利要求1-3任一项所述的载米托蒽醌的仿生纳米颗粒在制备抗乳腺癌的药物中的应用。
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| 胡健等.聚磷酸酯的合成及在生物医用材料中的应用.《高分子通报》.2015,(第10期),51-52、57. * |
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