CN103674865A - 一种利用苯酚-硫酸测定多糖的方法 - Google Patents

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李冬
张翠丹
梁瑜海
曾辉平
张�杰
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本发明属于城市生活污水处理与再生领域，具体涉及一种利用苯酚-硫酸测定多糖的方法。本发明是多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，用分光光度计在λ=490nm测定吸光度；最后经空白校正后，从标准曲线上查得相应的多糖的含量。本发明较之前的方法，其平行性更好，能够准确地测定出多糖的含量，适用于多糖的定量分析；操作简单、易行；本发明的显色灵敏、稳定，颜色与浓度成正比，测定速度快。

Description

一种利用苯酚-硫酸测定多糖的方法
技术领域
本发明属于城市生活污水处理与再生领域，具体涉及污泥中多糖的测定方法。
背景技术
水是社会和经济可持续发展的基础，随着我国工业化进程的加快，自然环境尤其是水环境遭到了较严重的破坏，江河及湖库水环境质量日趋恶化。从上世纪八十年代开始，国家加快了对水环境治理的步伐，污水处理率有了较大提高，然而缓流水体富营养化问题不仅没有解决，而且有日趋严重的趋势。
近些年来，人们为了进一步提高污水生物处理，已开始尝试对污泥结构的特性进行研究。其中，胞外聚合物(EPS)是分布于细胞表面的高分子物质，是细胞荚膜和细胞周围粘液物质的主要成分，它能够表示其表面的物理-化学特性，比如荷电性、疏水性及其他的特性，有利于微生物细胞凝聚，在形成稳定生物膜和颗粒污泥中起重要作用，是微生物聚集体的重要组成部分。EPS通常是由胞外蛋白质(PN)、胞外多糖(PN)、DNA、脂类、腐殖酸。糖醛酸、氨基酸以及一些无机成分组成。不过大部分研究表明污泥EPS组分以PN、PS为主，其含量达污泥EPS总TOC的75%-89%。并且EPS对于污泥絮体、生物膜或者颗粒污泥的结构稳定性有重要的作用，这是由于产生EPS的微生物表具有粘附性。此外，EPS能抵御细胞在有害环境中受到的侵害。EPS的主要有机组分可以改变微生物细胞表面特性，影响着处理工艺的运行参数，且EPS的可生化性与颗粒污泥聚集体的构造、组成及性能有重要的联系。所以EPS对细胞絮凝作用和污泥颗粒化都发挥着核心作用。
因此，对EPS组分的深入研究有助于我们更全面地理解好氧颗粒污泥形成机理，所以EPS的测定成为研究颗粒污泥形成的关键因素。
发明内容
本发明目的在于提供一种多糖的测定方法。
本发明是多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。所述方法包括以下步骤：
1.一种利用苯酚-硫酸测定多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)多糖标准曲线的测定：称取0.1g的葡萄糖溶于蒸馏水中，并移至100mL的容量瓶中，配置100μg/L的葡萄糖标准液溶液；在螺口试管中分别加入0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL葡萄糖溶液，加水稀释到2mL；添加质量百分比浓度为98%的浓硫酸5.0ml，加盖，震荡5-10次，冷却至常温；去盖，添加质量百分比浓度为5%的苯酚溶液1ml，立即漩涡振荡器摇匀，加盖后于100℃加热15min；冷却至常温，然后空显色5-8min；用分光光度计在λ=490nm测定吸光度；从测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，获得校正吸光度，绘制以多糖含量为校正吸光度的标准曲线；
2)污泥的预处理：取10ml-50ml污泥样品于离心管中；配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min；倒掉上清液，加入磷酸盐缓冲溶液，其中磷酸缓冲液为0.05mol/L Na3PO4和0.15mol/L NaCl，pH=7，将污泥稀释至原体积，之后将污泥摇散后超声处理3min；
3)多糖的提取：将预处理的污泥放在80℃水浴30min，每隔10min将污泥摇匀一次；冷却至常温后配平，最后在5000-8000r/min离心机离心15min，取上清液测定；
4)多糖的测定：取一定体积待测溶液于螺口试管中，加水使成2ml；添加质量百分比浓度为98%的浓硫酸5.0ml，加盖，震荡5-10次，冷却至常温；去盖，添加质量百分比浓度为5%苯酚溶液1ml，加盖立即漩涡振荡器摇匀，然后于100℃加热15min；冷却至常温，最后显色5-8min；另取2ml蒸馏水同法操作加入试剂做空白对照；用分光光度计在λ=490nm测定吸光度；最后经空白校正后，从标准曲线上查得相应的多糖的含量。
与现有多糖的测定方法相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明较之前的方法，其平行性更好，能够准确地测定出多糖的含量，适用于多糖的定量分析；
2)本发明方法操作简单、易行；
3)本发明的显色灵敏、稳定，颜色与浓度成正比，测定速度快。
附图说明
图1为多糖的标准曲线。
图2为亚硝化颗粒污泥多糖的平行样。
图3为MBR污泥多糖的平行样。
图4本发明测定的MBR污泥的多糖含量图。
图5现有技术测定的MBR的多糖含量图。
具体实施方式
实施例1:
污泥的预处理：分别取10ml第1天和第8天的亚硝化颗粒污泥和10mL第1天和第8天的MBR污泥样品于离心管中；配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min；倒掉上清液，加入适量磷酸盐缓冲溶液。将污泥稀释至原体积，之后将污泥摇散后超声处理3min。
多糖的提取：将预处理的亚硝化颗粒污泥和MBR污泥放在80℃水浴30min。每隔10min左右将污泥摇匀一次；冷却至常温后配平，最后在8000r/min离心机离心15min，取上清液测定。
多糖的测定：分别取0.2mL的亚硝化颗粒污泥的样品和0.5mL的MBR污泥的样品于螺口试管中，加水使成2ml，并且每个样品做三个平行样，其中；添加质量百分比为98%的浓硫酸5.0ml，加盖，震荡10次，冷却2min至常温；去盖，添加质量百分比为5%苯酚试剂1ml，立即漩涡振荡器摇匀，加盖后于100℃加热15min；冷却2min至常温，然后显色5min；另取2ml蒸馏水同法操作加入试剂做空白对照；用分光光度计在λ=490nm测定吸光度；最后经空白校正后，从标准曲线上查得相应的多糖的含量。
其中亚硝化颗粒污泥的多糖含量如图2，利用之前的方法测定的亚硝化颗粒污泥的多糖含量如图3；MBR污泥的多糖含量如图4，利用之前的方法测定的MBR的多糖含量如图5。通过对比能够更加清晰地说明本方法的平行性好，能够准确测定多糖的含量。

Claims (1)

1.一种利用苯酚-硫酸测定多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)多糖标准曲线的测定：称取0.1g的葡萄糖溶于蒸馏水中，并移至100mL的容量瓶中，配置100μg/L的葡萄糖标准液溶液；在螺口试管中分别加入0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL葡萄糖溶液，加水稀释到2mL；添加质量百分比浓度为98%的浓硫酸5.0ml，加盖，震荡5-10次，冷却至常温；去盖，添加质量百分比浓度为5%的苯酚溶液1ml，立即漩涡振荡器摇匀，加盖后于100℃加热15min；冷却至常温，然后空显色5-8min；用分光光度计在λ=490nm测定吸光度；从测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，获得校正吸光度，绘制以多糖含量为校正吸光度的标准曲线；
2)污泥的预处理：取10ml-50ml污泥样品于离心管中；配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min；倒掉上清液，加入磷酸盐缓冲溶液，其中磷酸缓冲液为0.05mol/L Na3PO4和0.15mol/L NaCl，pH=7，将污泥稀释至原体积，之后将污泥摇散后超声处理3min；
3)多糖的提取：将预处理的污泥放在80℃水浴30min，每隔10min将污泥摇匀一次；冷却至常温后配平，最后在5000-8000r/min离心机离心15min，取上清液测定；
4)多糖的测定：取一定体积待测溶液于螺口试管中，加水使成2ml；添加质量百分比浓度为98%的浓硫酸5.0ml，加盖，震荡5-10次，冷却至常温；去盖，添加质量百分比浓度为5%苯酚溶液1ml，加盖立即漩涡振荡器摇匀，然后于100℃加热15min；冷却至常温，最后显色5-8min；另取2ml蒸馏水同法操作加入试剂做空白对照；用分光光度计在λ=490nm测定吸光度；最后经空白校正后，从标准曲线上查得相应的多糖的含量。
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