CN110470754A - 一种高效液相色谱法测定虫草中虫草素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及虫草中虫草素含量的检测方法，本检测方法首次应用氯乙醛与虫草样品提取液进行衍生化反应，操作简便，采用高灵敏度及选择性高效液相色谱条件，可将虫草中2’‑脱氧腺苷与虫草素的色谱峰分离开来，准确定量，同时还能够测定其他主要成分的含量，准确度高，检验方法符合含量测定方法学要求，为准确评价虫草质量提供了先进的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及虫草中虫草素含量的检测方法。
背景技术
虫草是指包括冬虫夏草在内的广义的虫草属真菌的总称，虫草真菌属于生物界中真菌界、真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，寄生在昆虫、蛛类、大团囊菌以及麦角菌上并形成子实体，构成了种类繁多的一大类群，在世界范围内分布广泛，已经发现的虫草有400多种，而这些虫草中以冬虫夏草最为广为人知，冬虫夏草是一种名贵中药材，为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的干燥复合体，是我国传统的名贵滋补药材，具有较高的药用价值，由于生长环境要求严苛，加之市场需求巨大，导致野生资源锐减，价格不断飙升，因此近年来市场上人工培养的冬虫夏草替代品如北虫草、蛹虫草、虫草花等虫草甚至一些非虫草也冒充虫草也大量进入市场，导致虫草市场真伪品参杂，极大地损害了消费者的利益，因而市场亟需有效的虫草质量评价手段。虫草素(3’-脱氧腺苷)是核苷中的一种，长久以来，虫草素被认为是冬虫夏草中最重要的生物活性成分之一，并且已有多方研究提出冬虫夏草中的虫草素具有抗癌、抗癌细胞转移的作用，但近年来针对冬虫夏草中是否含有虫草素这一成分颇具争议，有研究人员提出冬虫夏草中还含有2’-脱氧腺苷，与虫草素(3’-脱氧腺苷)互为同分异构体，二者均由腺苷脱氧而来，一般提取虫草素的方法都能一并获得腺苷、2’-脱氧腺苷、虫草素等，已报道的传统提取方法有浸提法、超声法、索氏提取法、回流法、渗漉提取法等，这些提取方法繁琐、操作复杂，同时由于长期以来检测方法的局限性，包括中国药典收载的冬虫夏草的质量检测方法也只能检测总腺苷的含量，可能将2’-脱氧腺苷误认为是虫草素，本发明技术提出了一种灵敏度高、选择性好，能够准确检测冬虫夏草中虫草素含量的新分析方法，该方法可将2’-脱氧腺苷与虫草素分离并定量，虫草的质量评价提供新方法。本发明将该技术用于测定冬虫夏草、北虫草、蛹虫草、虫草花中包括虫草素在内的重要成分含量，能够准确区分测定2’-脱氧腺苷和虫草素，为评价虫草质量提供了依据。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，首次应用氯乙醛与虫草样品提取液进行衍生化反应，该衍生方法和传统提取方法相比便捷、可操作性高，同时采用高灵敏度及选择性高效液相色谱条件，可将2’-脱氧腺苷与虫草素的色谱峰分离开来，准确定量，同时还能够测定其他主要成分的含量，准确度高，检验方法符合含量测定方法学要求，为准确评价虫草质量提供了先进的检测方法。
本发明的技术方案可以通过以下技术措施来实现：
一种高效液相色谱法测定虫草中虫草素的方法，包括制备虫草液相检测样品溶液、制备对照品溶液及高效液相色谱法分析步骤，制备虫草液相检测样品包括以下步骤：先制备虫草样品提取液，再向所得提取液加入氯乙醛进行衍生。
优选地，虫草样品提取液的制备方法为：将虫草干燥、研磨过三号筛得粉末，将粉末溶于体积比为1:1的甲醇和水混合溶液中振荡提取，其中虫草粉与甲醇和水混合溶液的比例为0.5g：20ml，然后离心取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得提取液。
优选地，所述提取液与氯乙醛的比例为：10：1。
优选地，制备对照品溶液包括以下步骤：配制梯度浓度的对照品溶液，将所得对照品溶液采用PBS缓冲液稀释，再加入氯乙醛进行衍生。
优选地，稀释后的对照品溶液与氯乙醛的体积比为10：1。
优选地，加入氯乙醛衍生的方法为：加入氯乙醛后，将所得溶液放入37℃水浴锅衍生化16h-20h。
优选地，37℃水浴锅衍生化时间为16h。
优选地，高效液相色谱法分析的步骤为：分别吸取对照品溶液与虫草液相检测样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，计算，即可得到成分含量，其中实验参数设置如下：
流动相流速：1.0mL/min；
检测器波长：荧光检测的激发和发射波长分别为275nm和411nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶。
优选地，所述流动相由体积比为5:95的乙腈和水的混合溶液中加入三乙胺-醋酸缓冲液混合而得，其中，三乙胺-醋酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，乙腈和水的混合溶液：三乙胺-醋酸缓冲液的质量比为95:5。
优选地，所述对照品包括虫草素、腺苷、2’-脱氧腺苷、腺嘌呤。
通过大量试验研究表明，虫草样品与氯乙醛进行衍生化反应时，样品溶液和氯乙醛的体积比为10：1时，衍生化反应的效果最佳，衍生时间可以为16～20h，16h衍生化效果最佳，时间继续延长无明显改变。同时通过精密度、线性关系、回收率、检测线、定量限、系统适用性、标准偏差等方法验证试验表明采用上述方案可以有效的提高虫草中虫草素及其他主要成分分析精度，满足含量检验的方法学要求。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为本发明检测方法下腺嘌呤、腺苷、虫草素、2’-脱氧腺苷对照溶液高相液相色谱图图例；
图2为本发明检测方法下冬虫夏草供试品高相液相色谱图图例；
图3为本发明检测方法下北虫草供试品高相液相色谱图图例；
图4为本发明检测方法下蛹虫草供试品高相液相色谱图图例；
图5为本发明检测方法下虫草花供试品高相液相色谱图图例。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
冬虫夏草中虫草素含量的检测，包含如下步骤：
1、冬虫夏草样品提取液的制备：取冬虫夏草数根，置50℃烘箱干燥12h，然后取出研磨过三号筛得粉末，精密称取粉末约0.5g于锥形瓶中，加入体积比为1:1的甲醇和水混合溶液20ml，振荡提取12h，将液体倒入离心管，6000rpm离心10min，后取上清液，将上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得虫草样品提取液。
2、冬虫夏草待测样品溶液(供试品)的制备：取步骤1制备的提取液500μl，加入50μl氯乙醛，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
3、对照品溶液的制备：取虫草素、腺苷、2’-脱氧腺苷、腺嘌呤对照品加超纯水配置成1.30mg/ml、1.65mg/ml、1.35mg/ml、1.33mg/ml浓度的溶液，再将溶液分别依次稀释104、105、106倍呈梯度浓度，分别取15μl，分加入PBS缓冲液(磷酸氢二钠53.6g，加蒸馏水溶解，加水至1000ml)485μl，分别加氯乙醛(CAA)50μl(体积比为：＜样品溶液+PBS＞：CAA＝10：1)，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
4、采用高效液相色谱法进行分析；
高效液相色谱法进行分析的参数设置如下：
流动相：乙腈：水(体积比为：5：95)为流动相，其中含5％浓度为0.1mol/l的三乙胺-醋酸缓冲液(TEAA)；
流动相流速：1.0mL/min；
检测器波长：荧光检测的激发和发射波长分别为275nm和411nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，计算，即可得到虫草素及腺苷、2’-脱氧腺苷、按峰面积计算得出含量。
对照品色谱液相图(图1)对应的色谱峰为：腺嘌呤(Adenine)、腺苷(Adenosine)、虫草素(Cordycepin)、2’-脱氧腺苷(2’-deoxyadenosine)，各色谱峰的理论塔板数均大于2000，各色谱峰之间的分离度符合要求，其中虫草素和2’-脱氧腺苷色谱峰之间的分离度大于2.0。
冬虫夏草液相色谱图(图2)对应的色谱峰为：峰1：腺苷；峰2：2’-脱氧腺苷；峰3：虫草素，各色谱峰的理论塔板数均大于2000，各色谱峰之间的分离度符合要求，其中虫草素和2’-脱氧腺苷色谱峰之间的分离度大于2.0。
含量测定及标准偏差具体计算结果见表1：
表1冬虫夏草各成分含量及偏差
| 成分 | 虫草素 | 2’-脱氧腺苷 | 腺苷 |
| 含量(mg/g) | 含量极低 | 0.0163 | 0.236 |
| RSD(％) | —— | 0.1 | 0.16 |
实施例2
北虫草中虫草素含量的检测，包含如下步骤：
1、北虫草样品提取液的制备：取北虫草数根，置50℃烘箱干燥12h，然后取出研磨过三号筛得粉末，精密称取粉末约0.5g于锥形瓶中，加入体积比为1:1的甲醇和水混合溶液20ml，振荡提取12h，将液体倒入离心管，6000rpm离心10min，后取上清液，将上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得虫草样品提取液。
2、北虫草待测样品溶液(供试品)的制备：取步骤1制备的提取液500μl，加入50μl氯乙醛，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
3、对照品溶液的制备：取虫草素、腺苷、2’-脱氧腺苷、腺嘌呤对照品加超纯水配置成1.30mg/ml、1.65mg/ml、1.35mg/ml、1.33mg/ml浓度的溶液，再将溶液分别依次稀释104、105、106倍呈梯度浓度，分别取15μl，分别加入PBS缓冲液(磷酸氢二钠53.6g，加蒸馏水溶解，加水至1000ml)485μl，分别加氯乙醛(CAA)50μl(体积比为：＜样品溶液+PBS＞：CAA＝10：1)，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
4、采用高效液相色谱法进行分析；
高效液相色谱法进行分析的参数设置如下：
流动相：乙腈：水(体积比为：5：95)为流动相，其中含5％浓度为0.1mol/l的三乙胺-醋酸缓冲液(TEAA)；
流动相流速：1.0mL/min；
检测器波长：荧光检测的激发和发射波长分别为275nm和411nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，计算，即可得到虫草素及腺苷、2’-脱氧腺苷、按峰面积计算得出含量。
北虫草液相色谱图(图3)对应的色谱峰为：峰1：腺苷；峰2：2’-脱氧腺苷；峰3：虫草素，各色谱峰的理论塔板数均大于2000，各色谱峰之间的分离度符合要求，其中虫草素和2’-脱氧腺苷色谱峰之间的分离度大于2.0。
含量测定及标准偏差具体计算结果见表2：
表2北虫草各成分含量及偏差
| 成分 | 虫草素 | 2’-脱氧腺苷 | 腺苷 |
| 含量(mg/g) | 0.902 | 0.0196 | 0.779 |
| RSD(％) | 0.11 | 0.12 | 0.13 |
实施例3
蛹虫草中虫草素含量的检测，包含如下步骤：
1、蛹虫草样品提取液的制备：取蛹虫草数根，置50℃烘箱干燥12h，然后取出研磨过三号筛得粉末，精密称取粉末约0.5g于锥形瓶中，加入体积比为1:1的甲醇和水混合溶液20ml，振荡提取12h，将液体倒入离心管，6000rpm离心10min，后取上清液，将上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得虫草样品提取液。
2、蛹虫草待测样品溶液(供试品)的制备：取步骤1制备的提取液500μl，加入50μl氯乙醛，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
3、对照品溶液的制备：取虫草素、腺苷、2’-脱氧腺苷、腺嘌呤对照品加超纯水配置成1.30mg/ml、1.65mg/ml、1.35mg/ml、1.33mg/ml浓度的溶液，再将溶液分别依次稀释104、105、106倍呈梯度浓度，分别取15μl，分别加入PBS缓冲液(磷酸氢二钠53.6g，加蒸馏水溶解，加水至1000ml)485μl，分别加氯乙醛(CAA)50μl(体积比为：＜样品溶液+PBS＞：CAA＝10：1)，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
4、采用高效液相色谱法进行分析；
高效液相色谱法进行分析的参数设置如下：
流动相：乙腈：水(体积比为：5：95)为流动相，其中含5％浓度为0.1mol/l的三乙胺-醋酸缓冲液(TEAA)；
流动相流速：1.0mL/min；
检测器波长：荧光检测的激发和发射波长分别为275nm和411nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，计算，即可得到虫草素及腺苷、2’-脱氧腺苷、按峰面积计算得出含量。
蛹虫草液相色谱图(图4)对应的色谱峰为：峰1：腺苷；峰2：2’-脱氧腺苷；峰3：虫草素，各色谱峰的理论塔板数均大于2000，各色谱峰之间的分离度符合要求，其中虫草素和2’-脱氧腺苷色谱峰之间的分离度大于2.0。
含量测定及标准偏差具体计算结果见表3：
表3蛹虫草各成分含量及偏差
| 成分 | 虫草素 | 2’-脱氧腺苷 | 腺苷 |
| 含量(mg/g) | 0.735 | 含量极低 | 0.133 |
| RSD(％) | 0.14 | —— | 0.2 |
实施例4
虫草花中虫草素含量的检测，包含如下步骤：
1、虫草花样品提取液的制备：取蛹虫草数根，置50℃烘箱干燥12h，然后取出研磨过三号筛得粉末，精密称取粉末约0.5g于锥形瓶中，加入体积比为1:1的甲醇和水混合溶液20ml，振荡提取12h，将液体倒入离心管，6000rpm离心10min，后取上清液，将上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得虫草样品提取液。
2、虫草花待测样品溶液(供试品)的制备：取步骤1制备的提取液500μl，加入50μl氯乙醛，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
3、对照品溶液的制备：取虫草素、腺苷、2’-脱氧腺苷、腺嘌呤对照品加超纯水配置成1.30mg/ml、1.65mg/ml、1.35mg/ml、1.33mg/ml浓度的溶液，再将溶液分别依次稀释104、105、106倍呈梯度浓度，分别取15μl，分别加入PBS缓冲液(磷酸氢二钠53.6g，加蒸馏水溶解，加水至1000ml)485μl，分别加氯乙醛(CAA)50μl(体积比为：＜样品溶液+PBS＞：CAA＝10：1)，放入37℃水浴锅衍生化16h，即得。
4、采用高效液相色谱法进行分析；
高效液相色谱法进行分析的参数设置如下：
流动相：乙腈：水(体积比为：5：95)为流动相，其中含5％浓度为0.1mol/l的三乙胺-醋酸缓冲液(TEAA)；
流动相流速：1.0mL/min；
检测器波长：荧光检测的激发和发射波长分别为275nm和411nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，计算，即可得到虫草素及腺苷、2’-脱氧腺苷、按峰面积计算得出含量。
虫草花液相色谱图(图5)对应的色谱峰为：峰1：腺苷；峰2：2’-脱氧腺苷；峰3：虫草素，各色谱峰的理论塔板数均大于2000，各色谱峰之间的分离度符合要求，其中虫草素和2’-脱氧腺苷色谱峰之间的分离度大于2.0。
含量测定及标准偏差具体计算结果见表4：
表4虫草花各成分含量及偏差
| 成分 | 虫草素 | 2’-脱氧腺苷 | 腺苷 |
| 含量(mg/g) | 0.314 | 0.0227 | 0.510 |
| RSD(％) | 0.17 | 0.18 | 0.19 |
鉴于虫草类产品的特性，一般有效成分均为虫草素、腺苷、2’-脱氧腺苷，本发明也选用其他虫草按照本发明所述试验方法进行质量检测，均能够有效检出个主要成分含量，鉴于篇幅有限不再列举，本发明所述的试验方法可以作为虫草类产品就检测的通用方法。以上对本发明进行了详细介绍，文中应用具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高效液相色谱法测定虫草中虫草素的方法，包括制备虫草液相检测样品溶液、制备对照品溶液及高效液相色谱法分析步骤，其特征在于，制备虫草液相检测样品包括以下步骤：先制备虫草样品提取液，再向所得提取液加入氯乙醛进行衍生。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，虫草样品提取液的制备方法为：将虫草干燥、研磨过三号筛得粉末，将粉末溶于体积比为1:1的甲醇和水混合溶液中振荡提取，其中虫草粉与甲醇和水混合溶液的比例为0.5g：20ml，然后离心取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得提取液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取液与氯乙醛的比例为：10：1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备对照品溶液包括以下步骤：配制梯度浓度的对照品溶液，将所得对照品溶液采用PBS缓冲液稀释，再加入氯乙醛进行衍生。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：稀释后的对照品溶液与氯乙醛的体积比为10：1。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，加入氯乙醛衍生的方法为：加入氯乙醛后，将所得溶液放入37℃水浴锅衍生化16h-20h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，37℃水浴锅衍生化时间为16h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高效液相色谱法分析的步骤为：分别吸取对照品溶液与虫草液相检测样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，计算，即可得到成分含量，其中实验参数设置如下：
流动相流速：1.0mL/min；
检测器波长：荧光检测的激发和发射波长分别为275nm和411nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述流动相由体积比为5:95的乙腈和水的混合溶液中加入三乙胺-醋酸缓冲液混合而得，其中，三乙胺-醋酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，乙腈和水的混合溶液：三乙胺-醋酸缓冲液的质量比为95:5。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液包括虫草素、腺苷、2’-脱氧腺苷、腺嘌呤溶液。
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