CN113950623A - 发色团标记的寡糖标志物及其使用方法 - Google Patents

发色团标记的寡糖标志物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于分析和鉴定富含多糖的草药，例如铁皮石斛、黄芪、当归和相关草药产品的组合物和方法。

Description

发色团标记的寡糖标志物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年5月14日提交的美国临时专利申请62/847,912；于2019年7月8提交的美国临时专利申请62/871,205；和于2020年5月11日提交的美国非临时专利申请16/871,188的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及衍生自铁皮石斛、黄芪、当归中多糖的部分酸水解的一系列标记的寡糖标志物，以及这些标志物在定性和定量鉴别铁皮石斛、黄芪、当归等草药中的应用。本文所述的方法也可应用于其它天然材料和相关产品中多糖的定性和定量分析。
背景技术
由于天然存在的多糖的复杂性和多样性以及可用于大分子量分析物的有限数量的分析方法，草药和中药制剂中多糖的定性和定量分析仍然是一个挑战。
目前，多糖的分析通常使用多糖标志物的单糖组成分析或高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析。对于单糖组成，其主要基于多糖的酸水解，从而获得单糖残基及其比例。然而，该方法缺乏特异性，因为在不同的多糖中可以发现类似的单糖组合物。对于基于多糖标志物的方法，虽然它对某些草药有效，但是其它草药在其HPGPC色谱中不含有这种对称的和分离良好的多糖标志物峰。而且，一旦草药混合在制剂中，这些多糖就会重叠在一起，因此导致特异性丧失。因此，研究人员集中注意力于开发通过多糖的水解产生的寡糖作为质量控制策略，因为所产生的寡糖能够保留原始多糖的部分结构信息，并且当与单糖分析相比时它们更具特异性。然而，由于寡糖不吸收紫外波长(这会使检测变得复杂)并且具有相似的极性和色谱行为，在检测和分离寡糖方面存在巨大的困难。因此，诸如硅胶色谱，反相色谱和凝胶渗透色谱的普通分离技术不能容易地或直接地应用。
铁皮石斛、黄芪、当归是许多中药制剂中的草药。多糖是主要成分。目前药理研究表明，这两种中药的多糖具有广泛的生物活性，包括免疫调节，抗肿瘤，抗糖尿病等。
然而，迄今为止，草药多糖的质量控制仍然是阻碍基于多糖的产品的研究和开发的困难。由于大的分子量，结构多样性和复杂性，很难从完整的多糖中获得信息。甲基化分析、NMR分析和苯酚-硫酸法通常用于多糖的定性和定量分析，但是它们都不能测定草药混合物中的特定多糖。
因此，仍然需要改进草药如铁皮石斛、黄芪和当归中多糖的质量控制和鉴别方法。
发明内容
本文通过用多功能标志物(例如2-氨基苯甲酰胺(2-AB)，2-氨基吡啶(2-AP)，PMP和4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE))衍生多糖水解产物，克服了分离和检测草药和草药产品中多糖的挑战，这不仅使标记的寡糖标志物可紫外检测，而且改善了标记的寡糖标志物的分离。
本发明提供了用于定性和定量分析铁皮石斛、黄芪和当归以及其它草药或草药混合物中的多糖的ABEE标记的寡糖及其使用方法。
本公开的另一个目的是提供由铁皮石斛多糖(DOP)、黄芪多糖(RAP)和当归多糖(ASP)的部分酸水解产生的ABEE标记的寡糖标志物，其可用于通过使用寡糖标志物对草药制剂中的DOP、RAP、ASP进行定性和定量分析。
在第一方面，本发明提供了分析包含至少一种草药的测试样品中多糖含量的方法，该方法包括：提供包含寡糖和单糖的糖样品，所述寡糖和单糖通过测试样品中多糖的部分酸水解获得；使所述糖样品与4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)或其类似物和还原剂接触，从而形成包含一种或多种ABEE标记的糖的ABEE标记的糖样品；以及使用至少一种分析方法分析ABEE标记的糖样品，从而提供与测试样品多糖含量相关的数据。
在第一方面的第一实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其中所述至少一种草药选自铁皮石斛、黄芪和当归。
在第一方面的第二实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其进一步包括以下步骤：将测试样品多糖含量相关数据与通过使用标准样品中的一种或多种ABEE标记的糖类的已知浓度之间的相互关系而制得的一条或多条校准曲线进行比较；以及测定测试样品中至少一种多糖的浓度。
在第一方面的第三实施方案中，本文提供的是第一方面的方法，其中多糖含量相关数据用于至少一种草药的质量鉴定或定性分析。
在第一方面的第四实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其中至少一种分析方法选自高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)高效凝胶渗透色谱(HPGPC)。
在第一方面的第五实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其中ABEE的类似物具有以下结构：
Figure GDA0003420505130000031
其中R1为氢或烷基；R2为氢、烷基、氰基、烷氧基、羟基、二烷基胺、酯、酰胺、脲；且R3为氢、烷基、环烷基、杂环烷基芳基、杂芳基、胺、酰胺、脲或CO2R4，其中R4为氢、烷基、环烷基、杂环烷基芳基或杂芳基。
在第一方面的第六实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其中一种或多种ABEE标记的糖类选自：ABEE标记的半乳糖醛酸(ABEE-GalA)；ABEE标记的葡糖醛酸(ABEE-GluA)；ABEE标记的半乳糖(ABEE-Gal)；ABEE标记的甘露糖(ABEE-Man)；ABEE标记的葡萄糖(ABEE-Glc)；ABEE标记的阿拉伯糖(ABEE-Ara)；ABEE标记的鼠李糖(ABEE-Rha)；ABEE标记的木糖(ABEE-Xyl)；ABEE标记的岩藻糖(ABEE-Fuc)；
Figure GDA0003420505130000032
其中m是选自0-10的整数；
Figure GDA0003420505130000033
其中n是选自0-10的整数；以及
Figure GDA0003420505130000041
其中p是选自0-10的整数。
在第一方面的第七实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其中一种或多种ABEE标记的糖类选自：
Figure GDA0003420505130000042
其中m是选自3-9的整数；
Figure GDA0003420505130000043
其中n是1、2或7；以及
Figure GDA0003420505130000044
在第一方面的第八实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其中所述至少一种草药是铁皮石斛，并且所述一种或多种ABEE标记的糖类是：
Figure GDA0003420505130000045
其中m是选自3或4的整数；或者所述至少一种草药选自黄芪、当归及其组合；并且所述一种或多种ABEE标记的糖类选自：
Figure GDA0003420505130000051
其中n是7；以及
Figure GDA0003420505130000052
在第一方面的第九实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其中还原剂是NaBH4、NaBH3CN或NaBH(OAC)3。
在第一方面的第十实施方案中，本文提供了第一方面的方法，其进一步包括使测试样品与溶剂接触从而形成多糖样品的步骤。
在第一方面的第十一实施方案中，本文提供了第一方面的第十实施方案的方法，其中所述溶剂包括水。
在第一方面的第十二实施方案中，本文提供的是第一方面的第十实施方案的方法，其进一步包括使多糖样品与酸和水接触从而形成多糖样品的步骤。
在第一方面的第十三实施方案中，本文提供了第一方面的第十二实施方案的方法，其中酸是三氟乙酸。
在第一方面的第十四实施方案中，本文提供了第一方面的第十三实施方案的方法，其中测试样品中至少10％的多糖被部分水解。
在第二方面，本发明提供了分析测试样品中多糖含量的方法，所述测试样品包含选自铁皮石斛、黄芪和当归中的至少一种草药，所述方法包括：将测试样品与包含水的溶剂接触，从而形成多糖样品；使多糖样品与三氟乙酸和水接触，从而形成包含寡糖和单糖的糖样品；使糖样品与4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)和选自NaBH4和NaBH3CN的还原剂接触从而形成包含一种或多种选自以下的ABEE标记的糖类的ABEE标记的糖样品：
Figure GDA0003420505130000061
其中n是7；
Figure GDA0003420505130000062
其中m是选自3或4的整数；以及使用选自LC-MS和HPGPC的至少一种分析方法分析ABEE标记的糖样品，从而提供测试样品多糖含量相关数据。
在第二方面的第一实施方案中，本文提供了第二方面的方法，其中所述至少一种草药是铁皮石斛，并且所述一种或多种ABEE标记的糖类是：
Figure GDA0003420505130000063
其中m是选自3或4的整数；或者所述至少一种草药选自黄芪、当归及其组合；并且所述一种或多种ABEE标记的糖类选自：
Figure GDA0003420505130000064
其中n是7；以及
Figure GDA0003420505130000071
在第二方面的第二实施方案中，本文提供了第二方面的方法，其进一步包括以下步骤：将测试样品多糖含量相关数据与通过使用标准样品中的一种或多种ABEE标记的糖类的已知浓度之间的相互关系而制得的一条或多条校准曲线进行比较；以及测定测试样品中至少一种多糖的浓度。
在第二方面的第三实施方案中，本文提供了第二方面的方法，其中多糖含量相关数据用于至少一种草药的质量鉴定或定性。
本文还提供了一系列标记的寡糖标志物和这些标记的寡糖标志物在本文所述方法中的用途。这些寡糖可由黄芪和当归中的糖和寡糖经部分酸水解和ABEE(或其类似物)标记衍生化后制备，包括：根据分子量分布模式分离样品中碳水化合物的共同和主要组分。所述样品具有多种多糖，其中主要多糖组分是所述样品中具有最大量多糖的样品的组分；用酸温和水解主要多糖组分，释放出寡糖/单糖；和用标志物如ABEE标记水解产物；和分离代表性的寡糖标志物；以及阐明结构。
在某些实施方案中，提供一般化学分子量分布图的步骤包括通过与带电气溶胶检测器耦合的高效凝胶渗透色谱(HPGPC-CAD)进行尺寸排阻色谱。
在某些实施方案中，主要多糖的分离仅通过使用10-90％v/v乙醇的一步沉淀进行，得到粗多糖。
在某些实施方案中，用温和的酸水解分离的多糖，释放游离的寡糖，释放的寡糖用ABEE或其类似物标记，得到稳定的标记的寡糖。
在某些实施方案中，用于部分酸水解的酸是三氟乙酸(TFA)。
在某些实施方案中，使用C18制备型/半制备型柱分离代表性标记的寡糖标志物。
在某些实施方案中，分离的标志物的结构通过MS、单糖组成、甲基化和NMR的组合分析来阐明。
本领域的技术人员将认识到，本文所述的本发明易于进行不同于具体描述的变化和修改。
本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括在说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤和特征，以及任何和所有的组合或任何两个或更多的步骤或特征。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”之类的变体将被理解为意味着包括所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。还注意到，在本公开中，特别是在权利要求书和/或段落中，术语包含(comprises)”或诸如“包含(comprised)”或“包含(comprising)”等可以具有在美国专利法规中赋予它的含义；例如，它们可以意味着“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；而术语“基本上由…组成(consisting essentiallyof)”和“基本上由…组成(consists essentially of)”具有美国专利法规中对它们的定义，例如，它们允许没有明确列举的要素，但是排除了在现有技术中发现的或者影响本发明的基本特征或新特征的要素。
此外，在整个本说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，术语“包括(include)”或诸如“包括(includes)”或“包括(including)”之类的变体将被理解为意味着包括所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
本文使用的所选术语的其它定义可以在本发明的详细描述中找到并贯穿本发明。除非另有定义，本文所用的所有其它技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
通过阅读随后的描述，本发明的其它方面和优点对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
结合附图，本公开的上述和其它目的和特征将从以下对本发明的描述中变得显而易见，其中：
图1显示了来自铁皮石斛多糖的荧光标记的寡糖标志物用于测定含有铁皮石斛的草药制剂中铁皮石斛多糖的含量的流程图。
图2A显示了不同批次的铁皮石斛水提取物和铁皮石斛多糖标准品(DOP std)的高度一致的HPGPC色谱图。
图2B显示了部分酸水解和ABEE衍生化后不同批次铁皮石斛水提取物的高度一致的UHPLC-qTOF-MS-DAD色谱指纹图谱。
图3显示了ABEE标记的寡糖的UHPLC-qTOF-MS-DAD色谱图。1.Man；2.Glc；3.Di-Man-ABEE；4.Tri-Man-ABEE；5.Te-Man-ABEE；6.Pen-Man-ABEE；7.Hex-Man-ABEE；8.Hept-Man-ABEE；9.Oct-Man-ABEE；10.Nona-Man-ABEE；11.Deca-Man ABEE。#Man、Glc、Di、Tri、Te、Pen、Hex、Hept、Oct、Nona和Deca分别是甘露糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、九糖和十糖的缩写。HDOP是指铁皮石斛多糖部分水解产生的水解产物。
图4显示了提出的ABEE标记的寡糖标志物的化学结构。i代表末端，ii代表与末端相连的糖残基，而r代表与ABEE(a)相连的还原端，即Te-Man-ABEE，n＝1；Pen-Man-ABEE，n＝2；Hex-Man-ABEE，n＝3；Hept-Man-ABEE，n＝4；Oct-Man-ABEE，n＝5；Nona-Man-ABEE，n＝6；Deca-Man-ABEE，n＝7。
图5显示了ABEE标记的寡糖标志物(负离子模式)的质谱。每个寡糖中的主要信号分别标记为[M-H]-和[M-H+HCOO]-。MS条件：雾化气体(N2)流速，8.0L/min；雾化气体温度300℃；毛细管，3500V；裂解电压150V，干燥温度设定为180℃。
图6显示了ABEE标记的寡糖标志物(100MHz，于D2O中)的13C NMR谱。使用四甲基硅烷(TMS)作为内参。
图7显示了ABEE标记的寡糖标志物(400MHz，于D2O中)的H1 NMR谱。使用四甲基硅烷(TMS)作为内参。
图8A显示了ABEE标记的Di-Man-ABEE的异核单量子相干(HSQC)和异核多键相关(HMBC)谱图。实例标示i-1/ii-4显示了质子i-1和碳ii-4之间的HMBC相关性。
图8B显示了ABEE标记的Tri-Man-ABEE的HSQC和HMBC谱图。实例标示i-1/ii-4显示了质子i-1和碳ii-4之间的HMBC相关性。
图8C显示了ABEE标记的Te-Man-ABEE的HSQC和HMBC谱图。实例标示i-1/ii-4显示了质子i-1和碳ii-4之间的HMBC相关性。
图8D显示了ABEE标记的Pen-Man-ABEE的HSQC和HMBC谱图。实例标示i-1/ii-4显示了质子i-1和碳ii-4之间的HMBC相关性。
图8E显示了用ABEE标记的Hex-Man-ABEE的HSQC和HMBC谱图。实例标示i-1/ii-4显示了质子i-1和碳ii-4之间的HMBC相关性。
图8F显示了ABEE标记的Hept-Man-ABEE的HSQC和HMBC谱图。实例标示i-1/ii-4显示了质子i-1和碳ii-4之间的HMBC相关性。
图8G显示了ABEE标记的Oct-Man-ABEE的HSQC和HMBC谱图。实例标示i-1/ii-4显示了质子i-1和碳ii-4之间的HMBC相关性。
图9A示出了ABEE标记的寡糖标志物Di-Man-ABEE的HSQC谱。
图9B示出了ABEE标记的寡糖标志物Tri-Man-ABEE的HSQC谱。
图9C示出了ABEE标记的寡糖标志物Te-Man-ABEE的HSQC谱。
图9D示出了ABEE标记的寡糖标志物Pen-Man-ABEE的HSQC谱。
图9E示出了ABEE标记的寡糖标志物Hex-Man-ABEE的HSQC谱。
图9F示出了ABEE标记的寡糖标志物Hept-Man-ABEE的HSQC谱。
图9G示出了ABEE标记的寡糖标志物Oct-Man-ABEE的HSQC谱。
图10说明了部分水解的ABEE标记的寡糖标志物在用ABEE重新标记前后的水解产物谱的比较。下方的线显示了每个部分水解的ABEE标记的寡糖标志物的图谱；上方的线表示部分水解后随后的ABEE重新标记的结果。A：Di-Man-ABEE，B：Tri-Man-ABEE，C：Te-Man-ABEE，D：Pen-Man-ABEE，E：Hex-Man-ABEE，F：Hept-Man-ABEE，G：Oct-Man-ABEE，H：Nona-Man-ABEE，I：Deca-Man-ABEE。例如，在I：Deca-Man-ABEE的情况下，观察到重新标记后几种水解产物的强度显著增加，这表明Deca-Man-ABEE的部分水解含有这些片段。特别地，Nona-man-ABEE(用星号强调)的产生指示母样品至少含有Nona-Man片段。
图11A示出了部分水解的草药水提取物成分的水解产物图谱的比较，采用UHPLC-qTOF-MS测定(g)仙草益元膏(Tonic Vitality Confection)中的(a)：铁皮石斛；(b)：西洋参；(c)：麦冬；(d)薏苡仁；(e)：黄精；(f)：芦根和(h)石斛颗粒(Granule Dendrobii)中的(a):铁皮石斛；(b)：西洋参。ABEE标记的寡糖标志物Te-Man-ABEE的提取离子流色谱(EIC)为m/z：814.2974。
图11B示出了部分水解的草药成分水提取物的水解产物谱的比较，采用UHPLC-qTOF-MS测定(g)仙草益元膏中的(a)：铁皮石斛；(b)：西洋参；(c)：麦冬；(d)薏苡仁；(e)：黄精；(f)：芦根和(h)石斛颗粒中的(a)：铁皮石斛；(b)：西洋参。ABEE标记的寡糖标志物Pen-Man-ABEE的提取离子流色谱(EIC)为m/z：976.3607。
图12A显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过将标准多糖的含量对ABEE标记的寡糖标志物的峰面积作图获得校准曲线。DOP对Te-Man-ABEE；
图12B显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过将标准多糖的含量对ABEE标记的寡糖标志物的峰面积作图获得校准曲线。DOP对Pen-Man-ABEE。
图13A示出了通过所建立的方法对DOP的定量。六批铁皮石斛的水提取物。
图13B示出了通过所建立的方法对DOP的定量。四批仙草益元膏(TVC)和一批石斛颗粒(GD)的水提取物。
图14示出了显示通过使用寡糖标志物定性和定量分析单个草药和相关制剂中的特定多糖的过程的流程图。
图15A显示了分离的Rm-1的标记的寡糖的结构。
图15B显示了分离的Rm-2的标记的寡糖的结构。
图15C显示了分离的Rm-3的标记的寡糖的结构。
图15D显示了分离的Am-1的标记的寡糖的结构。
图15E显示了分离的Am-2的标记的寡糖的结构。
图16显示了Rm-1、Rm-2和Rm-3，Am-1和Am-2的单糖组成。混合标准物包含以下ABEE标记的糖类：半乳糖醛酸(ABEE-GalA)，葡糖醛酸(ABEE-GluA)，半乳糖(ABEE-Gal)，甘露糖(ABEE-Man)，葡萄糖(ABEE-Glc)，阿拉伯糖(ABEE-Ara)，鼠李糖(ABEE-Rha)，木糖(ABEE-Xyl)和岩藻糖(ABEE-Fuc)。
图17A显示了Rm-1的1H-NMR、13C-NMR和DEPT135。
图17B显示了Rm-1的MS和HSQC。
图17C显示了Rm-1的1H-1H COSY。
图17D显示了Rm-1的HMBC。
图17E显示了Rm-2的1H-NMR、13C-NMR和DEPT135。
图17F显示了Rm-2的MS和HSQC。
图17G显示了Rm-2的1H-1H COSY。
图17H显示了Rm-2的HMBC。
图17I显示了Rm-3的1H-NMR、13C-NMR和DEPT135。
图17J显示了Rm-3的MS和HSQC。
图17K显示了Rm-3的1H-1H COSY。
图17L显示了Rm-3的HMBC。
图17M显示了Am-1的1H-NMR、13C-NMR和DEPT135。
图17N显示了Am-1的MS和HSQC。
图17O显示了Am-1的1H-1H COSY。
图17P显示了Am-1的HMBC。
图17Q显示了Am-2的1H-NMR、13C-NMR和DEPT135。
图17R显示了Am-2的MS和HSQC。
图17S显示了Am-2的1H-1H COSY。
图17T显示了Am-2的HMBC。
图18A显示了黄芪和当归(n＝6)的水提取物的HPGPC色谱图。
图18B显示了黄芪多糖和当归多糖(n＝6)的水提取物的HPGPC色谱图。
图19A显示了来自黄芪的多糖在部分酸水解后的标记的寡糖谱。所鉴定的寡糖标志物为Rm-1，Rm-2和Rm-3。
图19B显示了当归多糖在部分酸水解后的标记的寡糖谱。所鉴定的寡糖标志物为Am-1和Am-2。
图20A显示了所选择的ABEE标记的寡糖标志物Rm-3的特异性。ABEE标记的寡糖片段的UV色谱图(λ＝305nm)：通过RAP的部分水解产生的寡糖。所选择的标志物由色谱图中的箭头标示。
图20B显示了所选择的ABEE标记的寡糖标志物Am-2的特异性。ABEE标记的寡糖片段的UV色谱图(λ＝305nm)：通过ASP的部分水解产生的寡糖。所选择的标志物由色谱图中的箭头标示。
图20C显示了负离子模式下Rm-3m/z 1462.5179±0.050(保留时间＝8.23min)的ESI质谱。
图20D显示了负离子模式下Am-2m/z 680.2459±0.050(保持时间＝11.03min)的ESI质谱。
图20E显示了Rm-3在水解的RAP、ASP和没有RAP和ASP的DBT的提取离子流色谱(EIC)。
图20F显示了在Am2在水解的RAP、ASP和没有RAP和ASP的DBT的提取离子流色谱(EIC)。
图21A显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过标志物浓度对峰面积，多糖量对标志物量，以及多糖量对Rm标志物的峰面积(线性范围为1.0至32.0μg/ml)获得校准曲线。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图21B显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过标志物浓度对峰面积，多糖量对标志物量，以及多糖量对RAP的标志物量的峰面积对Rm-3量得到校准曲线。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图21C显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过标志物浓度对峰面积，多糖量对标志物量，以及多糖量对RAP标志物量的峰面积对Rm-3峰面积得到校准曲线。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图21D显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过标志物浓度对峰面积，多糖量对标志物量，以及多糖量对Am-2标志物的峰面积(线性范围0.05-1.6μg/ml)获得校准曲线。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图21E显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过标志物浓度对峰面积，多糖量对标志物量，以及多糖量对ASP标志物量的峰面积对Am-2量得到校准曲线。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图21F显示了标准多糖和ABEE标记的寡糖标志物之间的线性关系。通过标志物浓度对峰面积，多糖量对标志物量，以及多糖量对ASP标志物量的峰面积对Am-2峰面积的得到校准曲线。RAP和ASP的线性范围为0.63-7.92mg和0.58-11.94mg。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图22A显示了通过建立的方法用六批黄芪水提取物(RAW-1～RAW-6)对RAP的定量；
图22B显示了通过建立的方法用六批当归(ASW-1～ASW-6)对ASP的定量；以及
图22C显示了DBT中的RAP和ASP含量。DBT由重量比为5：1、3：1、1：1、1：3、1：5的黄芪和当归制成。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图23显示了表1，其示出了基于糖组成分析和HPGPC分析的所研究铁皮石斛样品(mg/g)中碳水化合物组分的定量结果。注：a分子量使用建立的分子量-保留时间校准曲线通过HPGPC-CAD测定；b糖含量通过苯酚-硫酸法测定；cDOP含量由HPGPC-CAD通过DOP标准校准曲线测定。
图24显示了表2，其列出了寡糖标记的分子量、DP值、单糖组成和糖苷键。
图25显示了表3，其列出了基于HSQC、1H-1H COSY和HMBC谱图的所有寡糖标志物的1H-NMR和13C-NMR谱的化学位移分配。
图26显示了表4，其列出了Te-Man和Pen-Man的线性范围和线性系数
图27显示了表5，其列出了铁皮石斛水提取物、仙草益元膏(TVC)和石斛颗粒(GD)的重复性和准确性。
图28显示了表6，其列出了铁皮石斛水提取物、仙草益元膏(TVC)和石斛颗粒(GD)中DOP(mg/g)的含量。％DOP的含量＝样品中DOP的浓度/10×100％。
图29显示了表7，其示出了基于HSQC、1H-1H COSY、DEPT-135和HMBC谱图的Rm-1、Rm-2和Rm-3，Am-1和Am-2的1H-NMR和13C-NMR谱的化学位移分配。
图30显示了表8，其示出了通过甲基化和GC-MS对Rm-3进行的连接方式分析。注：a残基的摩尔比是通过积分它们在总离子色谱图中的峰面积来估算的。
图31显示了表9，其示出了标准多糖的基本化学特性。注：该数据是通过测定由单个草药制备的三批标准多糖而获得的。数据显示为平均值±SD(n＝3)。注：a使用建立的分子量-保留时间校准曲线通过HPGPC-CAD测定分子量；b通过苯酚-硫酸法测定糖含量；c糖醛酸含量通过M-苯基苯酚法(M-phenyl phenol method)测定；d蛋白质含量通过BCA方法获得；e对氨基苯甲酸乙酯(ABEE)衍生化后测定单糖组成；根据峰面积百分比计算比例。
图32显示了表10，其示出了建立的定量分析方法学的验证结果。注：a黄芪水提取物(RAW)、b当归水提取物(ASW)和c当归补血汤(DBT)(1：1)用于方法验证。d在本条件下，Rm和Am的检测极限(LOD)和定量限(LOQ)在约3和10的S/N(信噪比)测定。
图33显示了表11，其示出了基于保留时间和质荷比的寡糖标志物选择。注：1)RAP：黄芪多糖；ASP：当归多糖；DBT：当归补血汤(黄芪：当归＝5:1)，没有RAP和ASP；H：用1.0mol/L TFA在80℃催化部分酸水解2小时；2)将样品中检测到的ABEE标记的寡糖标记为“+”，否则标记为“-”；3)可用于区分DBT中RAP和ASP的ABEE标记的寡糖为粗体；4)用于RAP和ASP的最终标记分别用星号(*)和散列符号(#)标记。
具体实施方式
与现有的分析方法相比，本文所述的方法具有几个优点。首先，本文所述的标记的寡糖和糖是草药，例如DOP，RAP和ASP的独特化学标志物，它们不是天然存在的，而是基于多糖本身产生的。因此，它们能够在定性分析和定量分析中表示DOP、RAP和ASP的特性。其次，标记可提供UV吸收并增加寡糖标志物链之间的极性差异。这样可以提高分离效率以获得标志物。第三，标记后的寡糖和糖类可以提高质谱检测器中的离子化效率。因此，可以大大提高定量检测限。
本公开提供了用于分析草药中多糖的一般方法。虽然本文所述的方法是使用模型草药铁皮石斛、黄芪、当归及其组合举例说明的，但是本发明的公开内容考虑将本文所述的方法应用于所有含多糖的草药。
本发明提供了分析包含至少一种草药的测试样品中多糖含量的方法，所述方法包括：提供包含寡糖和单糖的糖样品，所述寡糖和单糖通过测试样品中多糖的部分酸水解获得；使所述糖样品与4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)或其类似物和还原剂接触，从而形成包含一种或多种ABEE标记的糖的ABEE标记的糖样品；以及使用至少一种分析方法分析ABEE标记的糖样品，从而提供与测试样品多糖含量相关的数据。
本文所提供的方法产生多糖含量相关数据，所述数据可直接或间接地提供例如，至少下列之一：鉴定草药中存在的一种或多种多糖、草药中存在的一种或多种多糖的浓度、草药的鉴定、草药的品质、草药产品中一种或多种草药的鉴定、草药产品中一种或多种草药的浓度、草药产品的品质。
本文提供的方法可应用于包含一种或多种多糖的任何草药。在某些实施方案中，所述至少一种草药选自铁皮石斛、黄芪、当归，其组合和相关草药产品。相关草药产品可以包括由黄芪和当归混合制成的当归补血汤(DBT)。
可以通过提取制备包含至少一种草药的测试样品以得到多糖样品，然后可以将所述多糖样品以部分酸水解处理以得到糖样品。
包含至少一种草药的测试样品的提取可以使用任何存在于测试样品中的多糖至少部分可溶的溶剂来完成。在某些实施方案中，用于提取的溶剂是水、醇、醚或其组合。可用于提取存在于测试样品中的多糖的示例性溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、甘油、乙二醇、乙二醇二甲醚、二甘醇二甲醚、聚乙二醇、聚乙二醇二甲醚及其组合。在某些实施方案中，提取溶剂是水。
测试样品的提取可在20℃至120℃的温度进行。在某些实施方案中，提取在20℃至100℃；50℃至100℃；70℃至100℃；80℃至100℃；或90℃至100℃的温度进行。
用于多糖样品的部分酸水解的酸不限于任何特定类型的酸。合适的酸可以包括相对非反应性的阴离子(例如，不是强氧化剂和/或亲核试剂的阴离子)。示例性的酸包括但不限于HCl、H2SO4、HSO4 -、H3PO4、H2PO4 -、MeSO2OH、CF3SO2OH、PHSO2OH、TolSO2OH、TFA、富马酸、马来酸、琥珀酸、苯甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸及其组合。
多糖样品的部分酸水解可以在任何溶剂中进行。在某些实施方案中，部分酸水解在极性质子溶剂如水、醇、醚或其组合中进行。示例性溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、甘油、乙二醇、乙二醇二甲醚、二甘醇二甲醚、聚乙二醇、聚乙二醇二甲醚及其组合。
在某些实施方案中，多糖样品的部分酸水解在包含醇和水的溶剂中进行。醇和水可以任何比例存在。在某些实施方案中，醇以10％至99％、20％至99％、30％至99％、40％至99％、50％至99％、50％至90％、50％至80％、50％至70％或55％至65％的浓度与水一起存在。在某些实施方案中，多糖样品的部分酸水解在包含以50％至70％的浓度和水一起存在的甲醇的溶剂中进行。
多糖样品的部分酸水解可以在20℃至120℃的温度进行。在某些实施方案中，多糖的部分酸水解在20℃至100℃；50℃至100℃；60℃至100℃；60℃至90℃；65℃至85℃；或70℃至85℃的温度进行。
多糖样品可在10分钟至3小时之间进行部分酸水解。在某些实施方案中，多糖样品在0.5-3小时；1-3小时；或2-3小时之间进行部分酸水解。
多糖样品的部分酸水解产生至少一些分子量降低的寡糖，所述分子量降低是在多糖样品中存在的多糖的水解过程中由于链断裂而引起的。在某些实施方案中，多糖样品的部分酸水解导致至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的多糖的部分水解转化为寡糖或单糖。
为了改善糖样品中寡糖和单糖的可视化和色谱分离，通过还原胺化反应将4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)或其类似物共价结合到糖样品中的寡糖和单糖上。
适用于本文所述方法的ABEE类似物可由以下结构表示：
Figure GDA0003420505130000171
其中R1为氢或烷基；R2为氢、烷基、氰基、烷氧基、羟基、二烷基胺、酯、酰胺、脲；且R3为氢、烷基、环烷基、杂环烷基芳基、杂芳基、胺、酰胺、脲或CO2R4，其中R4为氢、烷基、环烷基、杂环烷基芳基或杂芳基。
在某些实施方案中，R1为氢，甲基或乙基。在某些实施方案中，R2为氢或烷基。在某些实施方案中，R3为CO2R4，其中R4是烷基。在某些实施方案中，R1为氢；R2为氢或烷基；和R3为CO2R4，其中R4为烷基。
当糖样品与ABEE或其类似物和还原剂接触时，可发生还原偶联反应，导致ABEE或其类似物与糖样品中存在的寡糖和糖共价偶联，从而产生ABEE标记的糖样品，其包含一种或多种ABEE标记的糖类。
用于完成还原胺化反应的许多方法是本领域已知的。虽然硼氢化物还原性胺化在此被举例说明，但是本公开涉及用于实现还原性胺化的任何合适的方法，包括金属催化的、金属介导的和其它非金属催化的方法。选择合适的还原胺化方法在本领域普通技术人员的技术范围内。
在某些实施方案中，使用选自NaBH4、NaBH3CN和NaBH(OAC)3的还原剂实现还原胺化。在某些实施方案中，还原剂是NaBH4或NaBH3CN。
还原胺化可以在任何溶剂中发生。在某些实施方案中，溶剂是水、醇、醚或其组合。示例性溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、甘油、乙二醇、乙二醇二甲醚、二甘醇二甲醚、聚乙二醇、聚乙二醇二甲醚、四氢呋喃、二噁烷、四氢吡喃及其组合。
还原胺化可在20℃至120℃的温度进行。在某些实施方案中，糖的还原胺化在20℃至100℃；50℃至100℃；50℃至90℃；50℃至80℃；50℃至70℃；或60℃至70℃的温度进行。
还原性胺化反应的一种或多种ABEE(或其类似物)标记的糖产物可以包含共价结合到寡糖或糖的还原端的C1碳上的ABEE标志物(或其类似物)，如下所示：
Figure GDA0003420505130000181
ABEE(或其类似物)标记的糖样品可包含一种或多种ABEE(或其类似物)标记的糖，所述糖由存在于草药中的任何天然存在的多糖的寡糖或单糖部分水解产物的还原胺化产生。
ABEE(或其类似物)标记的糖样品可以包括一种或多种ABEE(或其类似物)标记的单糖和/或一种或多种ABEE(或其类似物)标记的寡糖。
所述一种或多种ABEE标记的糖可选自：ABEE标记的半乳糖醛酸(ABEE-GalA)；ABEE标记的葡糖醛酸(ABEE-GluA)；ABEE标记的半乳糖(ABEE-Gal)；ABEE标记的甘露糖(ABEE-Man)；ABEE标记的葡萄糖(ABEE-Glc)；ABEE标记的阿拉伯糖(ABEE-Ara)；ABEE标记的鼠李糖(ABEE-Rha)；ABEE标记的木糖(ABEE-Xyl)；ABEE标记的岩藻糖(ABEE-Fuc)；
Figure GDA0003420505130000182
其中m是选自0-10、1-10、2-10、3-10或3-9的整数；
Figure GDA0003420505130000183
其中n是选自0-10、1-10、1-9、1-8、1-7、2-7或1-2的整数；以及
Figure GDA0003420505130000184
其中p是选自0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2或0-1的整数。
在某些实施方案中，一种或多种ABEE标记的糖类选自：
Figure GDA0003420505130000191
其中m是选自3-9的整数；
Figure GDA0003420505130000192
其中n是1、2或7；以及
Figure GDA0003420505130000193
然后可以使用至少一种分析方法分析所得的ABEE标记的糖样品，从而提供与测试样品多糖含量相关的数据。
测试样品多糖含量相关数据可以包括以下参数中的一个或多个：液相色谱保留时间、液相色谱峰面积、质量碎片(质量、裂解方式和质量峰强度)、光学吸收(例如UV吸收)。
任何分析方法均可用于分析ABEE标记的糖类样品。在某些实施方案中，所述至少一种分析方法选自显微镜、宏观镜、光谱测定法、光谱学，色谱法及其组合。示例性的分析方法包括，但不限于，质谱分析、高效薄层色谱、傅立叶变换红外光谱、紫外-可见光谱、薄层色谱、气液色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、核磁共振(NMR)、抗体检测方法、拉曼光谱、毛细管电泳、液相色谱、凝胶渗透色谱、离子色谱及其组合。在某些实施方案中，所述至少一种分析方法选自HPLC、LC-MS和HPGPC。在ABEE标记的糖样品包括ABEE标记的糖的混合物的情况下，分析方法可以包括能够物理分离混合物的组分的一种或多种分析方法，例如包括色谱法的分析方法。
在所述方法用于定量存在于所述至少一种草药中的一种或多种多糖的浓度的情况下，该方法还可以包括将测试样品多糖含量相关数据与一条或多条校准曲线进行比较，所述校准曲线是通过使用标准样品中一种或多种ABEE标记的糖类的已知浓度之间的相互关系而制得的；以及测定测试样品中至少一种多糖的浓度。
以铁皮石斛为例，阐明了如何利用DOP产生的寡糖标志物开发出一种对市售产品和中药煎液中DOP进行定性和定量分析的质量控制方法。本方法可包括几个步骤。如图1所示，开始时，DOP可以进行部分酸水解，从而产生寡糖标志物。然后可以用ABEE标记寡糖标志物，使得它们可以通过UHPLC-qTOF-MS-DAD进行分析，并通过制备型HPLC-DAD进行分离。然后，通过方法验证，可以建立寡糖标志物与DOP之间的线性关系。因此，为了确保分析结果的准确性，该方法已经被验证。
本公开提供了鉴定含有铁皮石斛的草药样品的方法，其包括：经部分酸水解提供样品中多糖的寡糖片段的化学指纹；鉴定一种或多种主要寡糖标志物，其通过用荧光标记ABEE标记多糖(DOP)的部分酸水解以便于分析UHPLC-qTOF-MS-DAD；用制备型HPLC分离寡糖标志物；使用所述寡糖标志物鉴定所述草药样品。
LC-MS结果可以提供基于保留时间和质谱的寡糖标志物的鉴定。
本文公开的方法能够使用一种或多种寡糖标志物鉴定测试样品中的草药，其通过分析样品的部分水解并用ABEE标记，随后进行LC-MS检测来进行。
本发明提供了一种方法，其中标记的寡糖标志物的分离优先包括多糖(DOP)的沉淀和过滤。
本发明提供了一种方法，其中过滤通过超离心过滤进行，而沉淀通过使用60％(v/v)乙醇进行。
本发明提供了一种制备用于定性和定量鉴定来自铁皮石斛的草药样品的寡糖标志物的方法，其包括：基于部分酸水解提供样品中碳水化合物的化学指纹；鉴定样品中的一种或多种寡糖标志物，其中所述一种或多种寡糖标志物表示样品中特定多糖的存在；在所述样品的定性和定量鉴定中分析寡糖标志物。
材料和化学品
六批经认证的铁皮石斛样品购自不同公司的认证产区，并来自中国内地的不同省(表1，图23)。证据标本保藏在中国香港，香港浸会大学中医药学院。四个膏方样品(仙草益元膏，TVC)从云南斛哥庄园有限公司(Hogor Zhuangyuan Co.,Ltd.，中国云南)收集，一种颗粒样品(石斛颗粒，GD)从浙江天皇药业有限公司(Zhejiang Tianhuang PharmaceuticalCo.,Ltd.，中国浙江)购买。
D-葡萄糖(Glc)和D-甘露糖(Man)的标准品购自Sigma(St.Louis,USA)。所有这些化合物在使用前都通过其MS谱进行了确认。用于寡糖衍生化的对氨基苯甲酸乙酯(ABEE)和氰基硼氢化钠购自Sigma(St.Louis,Mo.,USA)。三氟乙酸(TFA)、冰醋酸和甲酸(分析级)也获自Sigma(St.Louis,USA)。甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)、乙醚(HPLC级)购自RCI LabscanLtd.(Bangkok，Thailand)，乙醇(ACS级)购自Merck(Darmstadt,Germany)。去离子水由Millipore Milli Q-Plus Systems(Millipore,Bedford,MA,USA)制备。
将干条(1.5g)或鲜条(3g)用10ml去离子水在100℃处理2小时并过滤。合并的提取物以4000rpm离心10分钟，得到上清液。然后将它们在旋转蒸发器上在55℃减压浓缩。然后，在剧烈搅拌下，使用60％乙醇水溶液沉淀浓缩溶液。使溶液在4℃保持过夜，并通过在4000rpm离心10分钟获得沉淀。然后用在水中的80％乙醇洗涤沉淀物以除去任何杂质。最后，将沉淀物置于真空干燥器中以除去溶剂。
部分酸水解和ABEE衍生化：
然后通过以下步骤使水提取和乙醇沉淀得到的沉淀物进行部分酸水解：将所有从提取步骤产生的沉淀物溶解在2ml 1M TFA水溶液中，并在75℃热水浴中放置2小时。然后在甲醇的辅助下通过旋转蒸发器从水解样品中除去TFA。
ABEE标记通过以下步骤进行：将在部分水解步骤中收集的所有产物溶解在1mL去离子水中。将200μL溶液转移到2mL离心管中，然后加入80μL乙酸、80μL1.4M氰基硼氢化钠(NaBH3CN)水溶液和400μL在甲醇中的0.6M ABEE。然后将溶液置于65℃热水浴中2小时。之后，加入300μL去离子水以沉淀过量的ABEE试剂。然后用700μL乙醚萃取混合物5次，弃去上层以除去过量的ABEE试剂。最后，使用真空干燥器干燥水层。然后将干燥的固体再溶解在300μL于水中的60％甲醇中，并进行UPLC-qTOF-MS-DAD分析。
UHPLC-Q-TOF-MS-DAD分析
分离酸水解产物并在超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术上检测。UHPLC数据在Agilent 1290UHPLC系统(Agilent Technologies,Santa Clara,USA)上产生，该系统配备有二元泵、恒温柱室，自动取样器、脱气器和二极管阵列检测器(DAD)。该系统由MassHunter B.06软件控制。使用色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)，并用于水中的0.1％甲酸(A)和于乙腈中的0.1％甲酸(B)梯度洗脱0-5分钟：90％A；5-18min：90-82％A；18-23min：82-75％A；23-26min：75-0％A；26-29min：0％A；29-29.1min：0-90％A；29.1-34min：90％A。流速为0.3mL/min。温度为30℃。注射体积为2μL。MS条件为负离子模式。负离子模式的优化操作参数如下：雾化气体(N2)流速，8.0L/min；雾化气体温度300℃；射流气流，8L/min；鞘气温度，350℃；喷雾器，45psi；毛细管，3500V；撇渣器，65V；OctRFV，600V；裂解电压150V。干燥温度设定为180℃。将四极离子能量以及碰撞单元碰撞能量设置为3eV。该分析还通过DAD在波长305nm监测。
通过制备型HPLC C18-UV分级分离寡糖标志物：
为了从部分酸水解产生的水解产物混合物中分离目标寡糖，使用制备型HPLC将水解产物分离成三个组分。该分离在装有自动取样器和2489TUV检测器的Waters 2545四元梯度模块上实现。通过GROM Saphir 110C18柱(300×40mm，12μm)(Grace,Columbia,Maryland,USA)分级样品。流动相由水(A)和乙腈(B)组成，梯度为0-30min，85％A；30-50min，85％A-80％A；50-60min，80％A-70％A；60-80min，70％A-0％A；80-100min，0％A。为了便于目标寡糖标志物的分离和纯化，色谱被分成三个部分。
寡糖标志物的纯化：
分级的HDOP将通过HPLC-DAD系统进一步纯化。纯化通过Agilent 1100系列HPLC系统(Agilent,Palo Alto,CA,USA)实现，该系统配备有二元泵、恒温柱室、自动取样器、脱气器和二极管阵列检测器(DAD)。每次40mg/mL浓度的样品通过Alltima C18柱(240×10mm，10μm)(Grace,Columbia,Maryland,USA)纯化。流动相由水与0.1％甲酸(A)和乙腈(B)组成，以2.3mL/min的流速等度洗脱。柱温设定为30℃。在波长为305nm的UV检测器下监测纯化过程。
寡糖标志物的序列测定
在分离和纯化寡糖标志物之后，将对它们进行序列测定以揭示糖单元的键合。在测定中，需要约1mg标记的寡糖标志物进行部分酸水解。详细地说，加入1mL 1M TFA，并与样品充分混合。然后，将反应混合物放入100℃的干浴加热器中2小时。冷却至室温后，在甲醇的帮助下使用旋转蒸发器除去TFA。然后，将反应混合物再溶解在200μL于水中的60％甲醇中，并通过UHPLC-qTOF-MS进行分析。对于第一个分析，寡糖标志物的还原端上的糖单元可以解释为只有还原端附着有ABEE标志物，而在UPLC-MS色谱中不能观察到解离部分。为了识别解离部分，溶液将按照上述方法再次用ABEE试剂重新标记，并再次用UHPLC-qTOF-MS分析。在UHPLC-qTOF-MS之后，当与第一色谱图比较时，将出现一些新的峰。通过与已知序列比对，能够参照保留时间和质谱确定未知的解离部分序列。该测序分析必须从较低聚合度的标志物到较高聚合度的标志物进行，以便建立关于保留时间和质谱信息的寡糖数据库的图谱。
通过甲基化反应和GC-MS分析糖苷键
为了研究寡糖标志物的糖苷键合，需要甲基化反应。在该研究中，甲基化方法参考Needs和Selvendran等在1993年发表的方法并进行了一些修改。通常，干燥的样品(约3-4mg)完全溶解于
Figure GDA0003420505130000231
分子筛干燥的DMSO(2mL)并与NaOH干燥细粉(20mg)一起温育1小时。随后，将0.8mL碘甲烷缓慢加入到放置在冰浴中的样品中。加入碘甲烷后，使反应混合物静置30min。然后通过加入1mL去离子水使反应猝灭。过量的碘甲烷通过旋转蒸发除去，然后在烘箱中用4mL 2M TFA在水中的溶液在110℃水解甲基化物2小时。在酸水解后，除去酸，并通过加入30mg NaBH4使水解产物进行还原反应3小时。然后，通过加入3mL乙酸酐在100℃使反应混合物乙酰化1.5小时，然后用甲苯蒸发以除去过量的反应试剂。最后，用去离子水-氯仿(1：1，v/v)分配样品，丢弃水层，然后用GC-MS分析有机层的含量。
核磁共振(NMR)光谱
样品的NMR光谱通过以下制得：将约15-20mg分离的寡糖溶解在0.5mL D2O中并转移到常规的5nm NMR管中。这些纯化的寡糖的1H和13C NMR光谱通过Bruker Avance 400光谱仪(Bruker Co.,Germany)在25℃，分别在400和100MHz获得。进行水抑制实验。化学位移以ppm表示，并通过参比位移校准：0ppm对应于13C NMR(TMS)而4.80ppm对应于1HNMR(HDO)。所有数据由MestReNova分析。2D 1H-1H相关NMR光谱(COSY)、2D1H-13C异核多键NMR谱(HMBC)和2D 1H-13C异核单量子相干光谱(HSQC)也按照标准Bruker脉冲序列进行。
UHPLC-qTOF-MS定量分析方法学验证：
用于定量分析分离的寡糖标志物的UHPLC-qTOF-MS方法以及它们的含量与多糖含量的关系在线性关系、灵敏度、精密度、准确度和稳定性方面进行验证。用60％甲醇将每种寡糖标志物的水性储备溶液稀释到合适的浓度，以建立校准曲线。以一式三份分析六个浓度的标志物溶液，并以仪器响应信号对分析物浓度作图来构建校准曲线。线性关系由校准曲线的回归系数(R)或测定系数(R2)评价。通过评估日内和日间的变化来确定分析方法的精密度。分析在同一日以及另外在连续三天重复6次，以分别定义日内精度和日间精密度。变化用相对标准偏差(RSD)＝(标准偏差/平均值)×100％表示。稳定性试验通过在0、4、16、24、36、48小时内分析铁皮石斛水提取物样品(HGR-D1)和中药制剂样品(TVC-2和GD)进行，并基于响应信号的RSD进行测量。准确度由在80％、100％和120％水平进行的加样回收率(spike recoveries)确定。通过在已知DOP含量的HGR-D1、TVC-1和GD中加入三种不同浓度水平(高，中和低水平)的DOP标准物来完成回收率试验。然后，样品进行部分酸水解和ABEE衍生化。最后，通过测定寡糖标志物，可以计算样品中DOP的加标含量。在每一水平上以一式三份分析加样回收率测试。加样回收率由以下等式计算：加样回收率(％)＝(检测到的寡糖标志物总量-初始转化的寡糖标志物量)/转化的加标寡糖标志物量×100％。
结果
铁皮石斛多糖的结构特征：
图1说明了利用寡糖标志物测定DOP含量的方案，包括DOP的制备、部分酸水解、ABEE衍生化、DOP水解产物的分离、寡糖标志物含量与样品中DOP含量的关系建立及方法验证。对于DOP水解产物与DOP之间关系的建立，必须首先确定铁皮石斛水提取物中DOP的基本结构特征。图2A和2B以及表1(图23)给出了关于水提取物的HPGPC色谱图、DOP水解物的UHPLC-qTOF-MS-DAD色谱图、分子量和糖含量的信息。如图2A和2B所示，HPGPC色谱图和UHPLC-qTOF-MS-DAD色谱图中的样品都是相似的，这意味着六批经认证的铁皮石斛样品的品质一致。这两种色谱图可作为药材水提取物和中药制剂中铁皮石斛定性鉴别的指纹图谱。根据HPGPC给出的结果，六批样品在约22.5min的保留时间具有主要峰。发现重均分子量约为770kDa，而平均糖含量约为72％。为了在定量分析中获得多糖与寡糖标志物之间稳定的线性关系，记录了包括分子量和总糖含量的参数。
DOP水解产物(HDOP)的分离和纯化。
对于HDOP的分离和纯化，由于碳水化合物缺少UV吸收基团，在寡糖的还原端添加ABEE大大提高了分离效率。通过制备型HPLC和HPLC-DAD系统，得到9种寡糖标志物(每一DP值中最丰富的寡糖)并示于图3中，即DP值为2-10的Di-Man-ABEE、Tri-Man-ABEE、Te-Man-ABEE、Pen-Man-ABEE、Hex-Man-ABEE、Hept-Man-ABEE、Oct-Man-ABEE、Nona-Man-ABEE和Deca-Man-ABEE。
寡糖标志物的序列测定：
使用建立的UHPLC-qTOF-MS方法，通过部分酸水解和再衍生化来确定每个寡糖标志物的序列。每个标志物的典型色谱图和它们各自的MS光谱总结在图5和10中。通过比较部分水解的用ABEE标记的寡糖标志物与ABEE重新标记前后的水解产物谱，可以确定包含在寡糖标志物中的糖单元的数量和每个寡糖标志物中的相应序列。根据图10，Di-Man-ABEE在部分水解和重新标记的色谱图中都包含Man-ABEE和Di-Man-ABEE峰。Man-ABEE峰的存在表明Di-Man-ABEE的还原端是甘露糖。而且，重新标记后Man-ABEE强度的显著增加表明Di-Man-ABEE仅含有甘露糖残基。因此，Tri-Man-ABEE在部分水解和重新标记的色谱图中都含有Di-Man-ABEE和Man-ABEE的峰。重新标记后两个峰的强度显著增加表明Tri-Man-ABEE的部分水解含有这些片段。因此，这些片段应当是Tri-Man-ABEE序列的一部分。因此，Te-Man-ABEE由4个甘露糖残基组成；Pen-Man-ABEE由5个甘露糖残基组成；Hex-Man-ABEE由6个甘露糖残基组成；Hept-Man-ABEE由7个甘露糖残基组成；Oct-Man-ABEE由8个甘露糖残基组成，Nona-Man-ABEE由9个甘露糖残基组成；Deca-Man-ABEE由10个甘露糖残基组成。
甲基化反应和GC-MS分析
由于UHPLC-qTOF-MS光谱只能提供与糖单元和序列的组成相关的数据，因此没有关于糖苷键的信息。因此，进行甲基化反应。从结果来看，在GC-MS光谱中主要出现两个峰。位于保留时间14.6min的峰值是2,3,4,6-ME4-MANp的信号，其代表末端吡喃甘露糖基残基的存在。另一方面，位于保留时间18.3min的峰值是2,3,6-ME3-MANP的信号，其代表1,4-连接的-吡喃甘露糖基残基的存在。综上所述，所有标志物都含有这两个明显的峰，但是由于1,4-连接的吡喃甘露糖基残基浓度较高，位于18.3min的峰具有较高的峰强度。因此，可以得出结论：所有标志物中的糖苷连接键是β-1-4连接的D-吡喃甘露糖残基。根据表2(图24)，所有寡糖的单糖组成以甘露糖占主导地位，而甲基化GC-MS分析显示所有寡糖标志物主要为1,4-连接的甘露糖基吡喃糖。因此，可以证实所有的寡糖标志物都是聚合度不同的β1-4连接的D-吡喃甘露糖。
NMR光谱
尽管UHPLC-qTOF-MS和甲基化反应几乎测定了所有标志物的结构，但是NMR光谱对于为证明这两种分析方法给出证据是重要的。图6和7示出了所有标志物的13C NMR和1HNMR，表明端基信号区域在1H NMR谱中为4.5-5.0ppm，在13C NMR谱为95-105ppm。由于标志物在还原端的C-1由ABEE经还原胺化衍生，因此首先归属经验证的D-甘露糖和D-葡萄糖的ABEE衍生，以便于归属分离的标志物的信号。从结果可知，与游离β-D-甘露糖的C-1信号相比，经胺化的C-1信号基本上移到了高场(δ48.8)，而C-6信号几乎不变(δ63.8对于标记的，66.1对于标记的)。为了举例说明如何鉴定β(1-4)连接的Man残基，将寡糖标志物的HSQC和HMBC光谱重叠并示于图8A-8G中。例如，Te-Man-ABEE中r-Man的H1C1信号经胺化被移到高场(δ48.8ppm)，而i-Man，ii-Man和iii-Man的H1C1显示为δ4.79/102.82ppm、δ4.73/103.05ppm、δ4.64/103.03ppm。另外，与D-甘露糖(δ69.45ppm)和Man-ABEE(δ72.01ppm)中的C-4信号相比，观察到ii-Man，iii-Man和r-Man中C-4信号的化学位移为δ79.7ppm。2-D HMBC光谱还表明i-Man/ii-Man，ii-Man/iii-Man和iii-Man/r-Man的H1与C4共振之间的相关性。所有结果给出了Te-Man-ABEE是1,4-连接的β-D-四糖的结论。与Te-Man-ABEE的结果相比，Pen-Man-ABEE中ii-Man的H1与C1显示为δ4.74/103.34ppm，其接近其它甘露糖残基。这意味着Pen-Man-ABEE中另外的糖残基是D-甘露糖。Pen-Man-ABEE的2-D HMBC光谱也表明i-Man/ii-Man，ii-Man/iii-Man，iii-Man/iv-Man和iv-Man/r-Man的H1C4共振之间的相关性。所有结果给出了Pen-Man-ABEE是1,4-连接的-D-五糖的结论。对于所有ABEE标记的寡糖的糖残基中碳中质子的共振，它们示于图9A-9G中，而相应的总结于表3(图25)中。所提出的寡糖标志物的结构可参见图4。
UHPLC-qTOF-MS定量分析方法学验证：
由于本发明的第二个目的是利用检测到的分离的寡糖标志物的含量来计算中药制剂中DOP的原始含量，进行关于线性，灵敏度，精密度，准确度和稳定性的定量分析方法学验证，以证明DOP与其转化的寡糖标志物之间的恒定关系。首先，通过对仙草益元膏(TVC)和颗粒石斛(GD)中其它草药成分的寡糖片段使用相同的方法研究标志物的特异性。如上所述，TVC的草药成分包括铁皮石斛、西洋参、麦冬、薏苡仁、黄精和芦根，GD的草药成分包括铁皮石斛和西洋参。如图11A-11B所示，特定的寡糖标志物，Te-Man-ABEE和Pen-Man-ABEE在提取的离子流色谱图(EIC)中与由其它草药成分产生的寡糖没有显示出任何重叠。因此，它们能够被选择作为鉴别中药制剂中DOP的质量控制标志物。
使用Te-Man-ABEE和Pen-Man-ABEE作为实例，将定量结果总结在表4、5和6中(分别为图26、27和28)。如图12A-12B和表4(图26)所示，Te-Man-ABEE和Pen-Man-ABEE的线性校准曲线显示出良好的线性关系，系数(R2)不低于0.997。关于表5(图27)中方法的精密度，所有样品中Te-Man-ABEE的日内和日间精密度的相对标准偏差(RSD)分别低于4.76％和6.67％，而所有样品中Pen-Man-ABEE的日内和日间精密度的相对标准偏差(RSD)均低于3.66％和6.91％。相对于回收率试验，所开发的方法是可再现的，具有在90％-120％范围内的良好准确度。关于由铁皮石斛水提取物、TVC和GD中的所述两种寡糖标志物计算的DOP含量的准确度，两种标志物都显示出近似的结果，RSD分别不超过7.01％，3.72％和1.48％(表6，图28)。
相对于在图13A-13B和表6(图28)中的铁皮石斛水提取物、仙草益元膏(TVC)和颗粒石斛(GD)中检测到的DOP的量，计算样品中DOP的含量百分比。
表明相对于新鲜样品中仅为10.1％，在干条样品中测定的DOP超过19.8％。这可能是由于新鲜样品中的水分含量远高于干条样品中的水分含量。因此，DOP含量在干条样品中更集中。在确定中药制剂中不同类型铁皮石斛的组成时，需要引起注意。参考在实际样品，TVC和GD中发现的DOP的量，发现两个样品都含有DOP。另外，发现除了样品TVC1外，DOP含量在三批TVC中是一致的。TVC中DOP含量约为0.028％，而GD中DOP含量为3.2％。
本公开还提供了基于ABEE标记的寡糖标志物分析和鉴定黄芪、当归及相关制剂中特定多糖的方法。第一部分用于在单个草药中进行鉴定，所述步骤包括：基于来自所述样品的水提取物的分子量分布模式，在不同批次的样品中提供一种或多种多糖的化学图谱；分离样品中碳水化合物的共同和主要组分，样品具有大量多糖，其中主要多糖组分是样品中具有最大量多糖的组分，用酸温和水解主要多糖组分，释放出寡糖/单糖；和用ABEE(或其类似物)标记水解产物；以及开发寡糖色谱图谱以鉴定单个草药多糖；和使用制备的标志物鉴定图谱中的代表性寡糖。
分离的多糖的大分子范围在构成保留时间在25-27min之间的分子量的范围内，其可以对应于分子量为50kDa-400kDa的普鲁兰多糖相关的糖类。
用温和的酸水解分离的多糖，释放出游离的寡糖。释放的寡糖用ABEE或其类似物标记，得到ABEE标记的寡糖。
在某些实施方案中，ABEE标记的寡糖谱的开发通过使用C-18柱进行，由UPLC-DAD-qTOF-MS检测。
鉴定代表性寡糖的步骤包括将图谱中代表性寡糖标志物的保留时间和质量碎片与结构已知的单个多糖衍生的寡糖标志物进行比较。
本文还提供了鉴定相关草药制剂中黄芪多糖(RAP)和当归多糖(ASP)的方法，该步骤包括：选择ABEE(或其类似物)标记的寡糖标志物；用酸直接温和水解草药制剂，释放出寡/单糖；以及用ABEE(或其类似物)标记水解产物；和使用LC-MS分析标记的糖类；将所选择的寡糖标志物在提取离子流色谱图中的保留时间和质量碎片与黄芪多糖和当归多糖的寡糖标志物进行比较。
相关草药产品可以包括由黄芪和当归混合制成的当归补血汤(DBT)。
本文还提供了使用ABEE或ABEE类似物标记的寡糖标志物鉴定草药和相关制剂中的多糖的方法，该方法包括：分离和制备主要多糖作为所述样品的标准多糖；标准多糖的基本质量控制；温和酸水解标准多糖组分，释放出寡糖/单糖；以及用ABEE(或其类似物)标记水解产物；和选择代表性的寡糖标志物；建立标准多糖与代表性的标记的寡糖标志物之间的线性关系；对定量分析方法学进行验证；分析黄芪水提取物、当归水提取物及相关产品中特定多糖的含量。
在某些实施方案中，标准多糖制备步骤通过包括沉淀和过滤的方法进行。沉淀可用10-90％v/v乙醇进行。过滤可以使用3-10kDa截留(cutting-off)的超离心过滤进行。
在某些实施方案中，标准多糖选择标准可包括分子量、总糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量和单糖组成的测定。
在某些实施方案中，标准多糖的选择标准包括：1)多糖在色谱分离中的保留时间在25-27min之间，这进一步对应于50-400kDa的普鲁兰多糖系列；2)糖和糖醛酸的总含量应大于90％；3)蛋白质含量应小于5％；4)单糖组成应是可重复的。
在某些实施方案中，所用的代表性寡糖标志物满足定性分析中提到的条件。此外，所选择的标志物优选具有令人满意的方法验证结果。
在某些实施方案中，通过积分提取物离子色谱图中的峰信号来记录代表性标志物的峰面积。寡糖之间的线性关系的步骤，多糖量对标记的寡糖标志物的峰面积绘制校准曲线。
方法验证可以包括建立该方法的线性、可重复性和准确性。
本发明开发的方法可应用于黄芪及其相关产品的直接多糖定量。相关制剂包括DBT。DBT由黄芪和当归以不同的重量比制备而成。
化学品：普鲁兰多糖系列购自Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis,USA)。包括葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、岩藻糖(Fuc)、葡糖醛酸(GluA)和半乳糖醛酸(GalA)的单糖标准品得自Sigma(St.Louis,MO,United States)。普鲁兰多糖系列来自Sigma。用于蛋白质分析的BCA试剂盒购自Thermo。M-苯基苯酚、硼酸钠、浓硫酸、三氟乙酸(TFA)、ABEE、氰基硼氢化钠和其它相关化学试剂均购自Sigma-AldrichCorp.(St.Louis,USA)。
黄芪和当归多糖的制备：
黄芪和当归购自中国香港本地零售或批发药店。将干燥的黄芪和当归片粉碎，用水提取得到多糖。简而言之，用水提取植物粉末。离心提取的溶液，合并上清液(粗多糖溶液)，浓缩，然后在60％乙醇中沉淀以得到粗多糖沉淀，将其再溶解在水中，并用截留分子量为3kDa的膜离心管进行超滤。保留用60％乙醇沉淀后的上清液和超滤后的滤液用于研究标志物特异性。
黄芪和当归中药样品的制备
水提取物：每批干燥的黄芪或当归样品粉末(1.0g)分别用100℃(20mL×2h×2次)的水进行固-液提取。以3500rpm离心提取的溶液10分钟。然后合并上清液用于进一步分析。
当归补血汤制剂：黄芪和当归的干燥样品粉末按重量比1：0、5：1、3：1、1：1、1：3和1：5混合。混合物(总共1.0g)用与水提取物制备相同的方法提取。然后合并上清液用于进一步分析。
部分酸水解和ABEE标记：将干燥的多糖(0.5-12.0mg)溶解在2ml TFA(1.0mol/L)水溶液中，并分别在80℃部分水解2h。除去TFA后，将水解产物(单/寡糖)再溶解在1.5ml的于水中的60％(v/v)甲醇中，并将该溶液以15,000rpm离心3分钟。收集含有水解样品的上清液用于进一步分析。
将100μL含有水解样品的上清液干燥并再溶解在200μL水中。然后将样品溶液与560μL衍生化试剂(400μL 0.6mol/LABEE，80μL冰醋酸和80μL 1.4mol/L硼氢化钠)混合，并在65℃温育2h。冷却后，向溶液中加入水和乙醚(900μL)，充分混合混合物并以15000rpm离心5min。除去上层(ABEE溶液)并干燥剩余的水相，再溶解在500μL的60％(v/v)甲醇中，最后进行LC-MS分析。
LC-DAD-qTOF-MS条件：分离在Agilent 1290UHPLC系统(Agilent Technologies,Santa Clara,USA)上进行，该系统配备有二元泵、恒温柱室、自动取样器、脱气器和二极管阵列检测器(DAD)。该系统由Mass Hunter B.06软件控制。使用色谱柱ACQUITY UPLC BEHC18(2.1mm×100mm，1.7μm,Waters,Milford,USA)，并用线性梯度的于水中的0.1％甲酸(A)和于乙腈中的0.1％甲酸(B)以0.4mL/min的流速和30℃的温度洗脱。溶剂梯度程序如下：0-5min，10％B；5-18min，10-18％B；18-23min，18-25％B；23-26min，25-100％B；26-29min，100％B；29-29.1min，100-10％B；29.1-34min，10％B。注射体积为1μL。
MS数据从装有四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪和射流(JetStream)电喷雾离子(ESI)源的Agilent 6540Q-TOF质谱仪(Agilent Technologies，SantaClara，USA)收集。数据采集由Mass hunter B.06软件(Agilent Technologies)控制。负离子模式下的优化操作参数如下：雾化气体(N2)流速，7.0L/min；雾化气体温度300℃；射流气流，8L/min；鞘气温度，350℃；喷雾器，40psi；毛细管，3000V；撇渣器，65V；Oct RFV，600V；和裂解电压150V。质量扫描范围设定为质荷比(m/z)100-2000，通过DAD检测设定波长305nm。
寡糖标志物的制备和表征：制备大量黄芪或当归的粗多糖。如上所述，将制备的多糖水解，并用ABEE衍生化水解产物。将制备的冻干水解产物(0.5g/ml)溶解在60％MeOH/水(v/v)溶液中。保留含有ABEE标记的寡糖片段的上清液用于进一步的标志物制备。将ABEE标记的寡糖片段负载到Alitima C18制备柱(22×250mm，10μm)上，并用UV在305nm检测。用10％乙腈(ACN)以8mL/min的流速洗脱RAP的寡糖片段。用含0.1％甲酸的水(A)和含0.1％甲酸的ACN(B)梯度洗脱分离ASP的寡糖片段：0～35min，15～22％B；35～47min，22～50％B，47～52min，50～15％B。收集含有标志物的级分，合并，并在Agilent Eclipse XDB-C18半制备柱(9.4×250mm，5μm)上进行再层析。Rm-1，Rm-2和Rm-3通过用8％ACN洗脱获得，Am-1和Am-2通过用含有0.1％甲酸的15％ACN洗脱来制备。纯度通过LC-MS分析进行监测。冻干纯化的标志物。它们的结构通过单糖分析，连接方式分析和NMR来表征。
定量分析方法学的开发和验证：从线性关系、精密度和准确度方面验证了直接定量分析黄芪、当归水提取物和DBT中多糖的LC-MS方法。
精确称取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10，(12)mg的一系列标准多糖RAP和ASP以构建校准曲线。每种浓度制备一式三份。多糖按照所述步骤进行部分酸水解和ABEE衍生化。对每个样品进行一式两份的分析，基于峰面积与Rm-3(1.0-32.0μg/mL)和Am-2(0.05-1.6μg/mL)的量之间的校准曲线计算得到Rm和Am的量。变量之间的关系通过1)标志物的浓度对标志物的峰面积作图；2)水解多糖中检测到的标志物的量对多糖的量作图，以及3)水解多糖中标志物的峰面积对多糖的量作图而可视化。标志物是指Rm-3或Am-2，多糖是指RAP和ASP。
黄芪的水提取物，当归的水提取物和DBT(1:1)用于以下方法验证。选择日内和日间的变化来确定所开发的测定的精密度。对于日内的变化测试，在一天内分析每个样品的6个拷贝，而对于日间的变化测试；连续三天检查同一样品的副本。Rm和Am的峰面积的变化用RSD表示。
使用加样回收率测试来评估该方法的准确度。称取约25.0mg当归水提取物、50.0mg黄芪水提取物和已知多糖含量的DBT(1:1)，加入不同量(高120％，中100％和低80％，每种浓度n＝3)的标准多糖，然后水解，一式两份衍生和分析。计算加样回收率。
单个草药的水提取物和DBT中的RAP和ASP测定：精确称取黄芪水提取物(50.0mg)，当归水提取物(25.0mg)和50.0mg的DBT，通过所述步骤水解和衍生。记录Rm和Am的峰面积，并根据开发的方法中建立的线性关系计算多糖RAP和ASP的含量。每种样品一式三份进行评估。
ABEE标记的寡糖的结构分析：如图14所示，获得ABEE标记的寡糖。制备了用于RAP和ASP的代表性寡糖标志物，并进行了结构分析。
分离的标记的寡糖的结构(图15A-15E)通过质谱、单糖组成、键合分析和NMR光谱计算出来。根据NMR光谱中的特征信号，基于二维HSQC，HMBC和1H-1H COSY实验，以及与所报道的NMR数据的比较完全分析了13C-NMR和1HNMR谱。
首先，图16显示所有三种寡糖都由葡萄糖组成。结合质谱信息，Rm-1，Rm-2和Rm-3应该分别是二糖、三糖和八糖。NMR数据(图17A-17L和表7(图29))显示Rm-1，Rm-2和Rm-3具有大多数相同结构特征。这些ABEE标记的标志物的特征信号可分为三部分：1)ABEE部分：信号δC 155.8，δC114.9/δH 6.73，δC 134.5/δH 7.82，δC 120.1ppm对应于ABEE的苯酚结构，信号δC 172ppm可归因于羰基，以及信号δC64.4/δH4.30和δC16.5/δH 1.35可分配给-CH2和-CH3基团；2)与ABEE相连的糖：端基信号δC48.4/δH3.36，3.41；3)剩余的糖残基：端基质子信号δH5.13(1H，d，J＝3.8Hz)和约5.36ppm(6H，重叠)，其耦合常数(<4.0Hz)表明α-构型。另外，基于在HSQC中δC80，85/δH3.65，3.90的峰值相关曲线，以及它们与端基信号的显著HMBC相关性，提出了(1→4)-连接的-α-D-吡喃葡萄糖的糖键。对于Rm-3，通过使用GC-MS的甲基化分析进一步确认了链接方式类型，结果列于表8(图30)。
对于Am-1和Am-2(图17M-17T和表7(图29))，它们分别为二糖和三糖。除了ABEE产生的类似信号外，它们还表现出与Rm不同的特征。该信息如下：1)NMR谱显示出105.6-106.3ppm的端基碳信号和4.41ppm和4.51ppm的端基质子信号，其耦合常数为7.8Hz(>6.0)。证明寡糖由β-构型组成；2)在ABEE标记的影响下，端基碳的一般特性消失。取而代之的是与ABEE相连的单元的化学位移已移动向高场δC49.68/δH 3.41；另外，其它糖单位的C1信号通常不受ABEE的影响；3)在δC 63.11/δH 3.51处的强信号归因于-OCH3-基团；4)176ppm的信号被分配给半乳糖醛酸衍生物中的-COOH基团；5)从DEPT 135中，在72.45ppm和74.89ppm处观察到明显的逆信号，表明C-6已被其它糖单元取代；和6)HMBC光谱中的交叉信号显示H-1信号正好与C-6相关，证明糖单元是(1→6)-连接的-β-D-吡喃半乳糖。因此，Am-1和Am-2的化学结构被推断为复杂的二半乳糖和三半乳糖衍生物，如图15A-15E所示。
定性分析：按照图14中的流程图，对所有批次的黄芪和当归样品进行定性分析。首先，使用HPGPC-CAD分析和比较黄芪和当归的水提取物(图18A)。结果显示了极其相似的色谱特征。根据GPC色谱图，基于这些样品的分子分布，可以在这些样品中发现5个峰，并且发现具有最高分子的第一个峰是主要的。当分离出主峰时，多糖(图18B)也显示出高度一致性。所有结果证明六批黄芪和当归样品的品质一致，HPGPC色谱图可用作初步鉴定方法。
此外，温和地水解多糖以释放更多的寡糖。在ABEE标记之后，这些极性化合物变得易于分离和检测。最重要的是糖谱(图19A和19B)显示了具有自编码模式和高度一致性的特殊谱。另外，所制备的代表性标志物与图案中的峰之间的保留时间和质量碎片是相同的。结果表明，本发明的寡糖标志物和图谱可用于部分酸水解和ABEE(或其类似物)衍生化后的黄芪多糖和当归的鉴别。
最后，为了成功地鉴定相关草药制剂中具体的多糖，寡糖标志物应当具有足够的特异性和高度的再现性。高特异性是指：1)该标志物不应天然存在于原水煎液中；2)该标志物不应由其它草药成分的多糖产生。如表9(图30)所示，每种多糖有9个ABEE标记的低聚物，具有4个共同峰。在用水解和ABEE标记并行处理提取物之后，在不含多糖的草药制剂(DBT)中进一步逐个检查那些不常见的峰。三种和五种标记候选物分别用于RAP和ASP。理论上它们都可以用作标志物，但对于RAP和ASP分别最终选择鉴定的标志物Rm-3(Rt为8.23min和m/z 1462.5179)和Am-2(Rt为11.03和m/z 680.2459)。这两种标志物具有高特异性，并与其它峰很好地分离(图20A-20F)。因此，Rm-3和Am-2用于测定单个草药以及相关制剂中的RAP和ASP。
标准多糖的基本特征：为了进行定量分析，所制备的多糖应标准化，以获得多糖与寡糖标志物之间稳定的线性关系。记录参数，包括分子量、总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量和单糖组成。如表10(图31)所示，这些数据显示标准多糖RAP和ASP的制备是高度可重复的，RSD≤6.0％，并且这些标准多糖满足以下标准：总糖和糖醛酸含量高于90％，蛋白质含量低于5.0％。
定量分析方法学的开发和验证：发明人假设RAP和Rm-3，以及ASP和Am-2之间将存在线性关系，进而使用建立的线性关系，可以计算水提取物和DBT中的RAP和ASP的量。结果显示RAP和ASP与其各自的标志物呈现令人满意的线性关系(r≥0.9987)(图21A-21D)。因此，最后，在该研究中，发明人通过将标志物峰面积对RAP和ASP的量作图，直接进行线性回归。在0.63-7.92mg，0.58-11.94mg的范围内呈线性，相关系数(r)超过0.9961(图21E-21F)。
此外，所建立的方法在精密度、稳定性(日内和日间)、灵敏度和准确度(表示为加样回收率)方面被系统地验证。
如表10(图31)所示，Rm-3在黄芪水提取物中的总日内和日间RSD变化分别为约4.81％和6.79％，在DBT中分别为4.21％和4.74％。Am-2在当归水提取物中的总日内和日间RSD变化(表11，(图32))分别为约5.24％和7.39％，在DBT中分别为5.65％和8.31％。如表11(图32)所示，该方法也显示出可接受的准确度，在不同浓度下，黄芪水提取物中的RAP加样回收率分别为84.9％-96.2％且在DBT(1:1)中为83.3％-87.2％，当归水提取物中的ASP加样回收率分别为79.8％-85.9％且在DBT(1:1)中为81.2％-86.3％。
总之，这些结果显示所建立的方法具有令人满意的特异性、线性关系、精密度和准确度。
在实际样品中的应用：将经证实的方法应用于六批单个草药和DBT中的RAP和ASP的定量分析。定量分析数据示于图22A-22C。RAP的量在34.7-99.2mg/g的黄芪水提取物中占不同百分比。ASP的量在151.02-212.75mg/g的当归水提取物中占相似百分比。
在草药制剂-DBT中，随着黄芪比例的降低，当归比例的增加，DBT中RAP含量从7.79mg/g降低到47.71mg/g，ASP含量也从92.20mg/g提高到164.41mg/g。
结论
以铁皮石斛为模型药材，通过同时定性和定量表征源于多糖本身的首次提出和证明的寡糖标志物，开发了基于UHPLC-qTOF-MS-DAD的新的，准确的方法用于市售产品和中药煎液中药材多糖含量的质量控制。也首次将寡糖标志物的含量与多糖的含量之间的恒定关系用于定量目的。实验结果表明，新建立的方法是更加高效、稳定、开创性的方法，提供了市售产品和中药煎液中铁皮石斛的定性和定量评价。以前，即使对由一种以上的草药组成的中药煎液的评价也不能实现，通过本发明，可以评价以碳水化合物为主的草药材料混合物的含量。尽管铁皮石斛被用作模型草药，但是可以理解，本发明对于其它以糖类为主的草药材料和产品的质量控制也是可行的。
本文还提供了ABEE(或其类似物)标记的寡糖标志物。这些寡糖来自部分酸水解和ABEE(或其类似物)衍生化后的黄芪和当归中的多糖。本公开还提供了用于单个草药以及相关制剂中的特定多糖的定性和定量分析方法学。
总之，本公开涉及质量控制寡糖标志物和使用这些标志物定性和定量鉴定草药材料中多糖的方法。这些标志物是高度特异性的和灵敏的，因为它们来自多糖本身。在本发明中，基于铁皮石斛分离寡糖标志物，并证明它们是可用于区分市售产品和中药煎液中DOP存在的特异性标志物。本文所述的组合物和方法可广泛应用于检验实验室、制药工业和研究机构对铁皮石斛的鉴别。
工业适用性
本公开涉及一系列化学生产的质量控制标志物，其衍生自存在于草药(如DOP、ROP或ASP)中的多糖的部分酸水解，以及使用这些标志物定性和定量鉴定铁皮石斛、黄芪和当归以及相关草药产品的方法。
本领域的技术人员将从上述描述中认识到，实施方案的广泛技术可以以各种形式实现。因此，虽然已经结合具体实施例描述了实施方案，但是实施方案的真实范围不应当受到这样的限制，因为对于本领域技术人员来说，在研究附图、说明书和所附权利要求后，其它修改将变得显而易见。

Claims (19)

1.分析包含至少一种草药的测试样品中多糖含量的方法，所述方法包括：
提供包含寡糖和单糖的糖样品，所述寡糖和单糖通过测试样品中多糖的部分酸水解获得；
使所述糖样品与4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)或其类似物和还原剂反应，从而形成ABEE标记的糖样品，其包含一种或多种ABEE标记的糖；以及
使用至少一种分析方法分析所述ABEE标记的糖样品，从而提供与测试样品多糖含量相关的数据。
2.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种草药选自铁皮石斛、黄芪和当归。
3.权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：将测试样品多糖含量相关数据与通过使用标准样品中的一种或多种ABEE标记的糖类的已知浓度之间的相互关系而制得的一条或多条校准曲线进行比较；以及测定测试样品中至少一种多糖的浓度。
4.权利要求1所述的方法，其中所述多糖含量相关数据用于至少一种草药的质量鉴定或定性分析。
5.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种分析方法选自高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)高效凝胶渗透色谱(HPGPC)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述ABEE的类似物具有以下结构：
Figure FDA0003352495560000011
其中R1为氢或烷基；R2为氢、烷基、氰基、烷氧基、羟基、二烷基胺、酯、酰胺、脲；且R3为氢、烷基、环烷基、杂环烷基芳基、杂芳基、胺、酰胺、脲或CO2R4，其中R4为氢、烷基、环烷基、杂环烷基芳基或杂芳基。
7.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种ABEE标记的糖类选自：ABEE标记的半乳糖醛酸(ABEE-GalA)；ABEE标记的葡糖醛酸(ABEE-GluA)；ABEE标记的半乳糖(ABEE-Gal)；ABEE标记的甘露糖(ABEE-Man)；ABEE标记的葡萄糖(ABEE-Glc)；ABEE标记的阿拉伯糖(ABEE-Ara)；ABEE标记的鼠李糖(ABEE-Rha)；ABEE标记的木糖(ABEE-Xyl)；ABEE标记的岩藻糖(ABEE-Fuc)；
Figure FDA0003352495560000021
其中m是选自0-10的整数；
Figure FDA0003352495560000022
其中n是选自0-10的整数；以及
Figure FDA0003352495560000023
其中p是选自0-10的整数。
8.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种ABEE标记的糖类选自：
Figure FDA0003352495560000024
其中m是选自3-9的整数；
Figure FDA0003352495560000025
其中n是1、2或7；以及
Figure FDA0003352495560000031
9.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种草药是铁皮石斛，并且所述一种或多种ABEE标记的糖类是：
Figure FDA0003352495560000032
其中m是选自3或4的整数；或者所述至少一种草药选自黄芪、当归及其组合；并且所述一种或多种ABEE标记的糖类选自：
Figure FDA0003352495560000033
其中n是7；以及
Figure FDA0003352495560000034
10.权利要求1所述的方法，其中所述还原剂是NaBH4、NaBH3CN或NaBH(OAC)3。
11.权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述测试样品与溶剂接触从而形成多糖样品的步骤。
12.权利要求11所述的方法，其中所述溶剂包括水。
13.权利要求11所述的方法，其进一步包括使所述多糖样品与酸和水接触从而形成所述多糖样品的步骤。
14.权利要求13所述的方法，其中所述酸是三氟乙酸。
15.权利要求14所述的方法，其中所述测试样品中至少10％的所述多糖被部分水解。
16.分析测试样品中多糖含量的方法，所述测试样品包含选自铁皮石斛、黄芪和当归中的至少一种草药，所述方法包括：
将所述测试样品与包含水的溶剂接触，从而形成多糖样品；
使所述多糖样品与三氟乙酸和水接触，从而形成包含寡糖和单糖的糖样品；
使所述糖样品与4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)和选自NaBH4和NaBH3CN的还原剂反应从而形成ABEE标记的糖样品，其包含一种或多种选自以下的ABEE标记的糖类：
Figure FDA0003352495560000041
其中n是7；
Figure FDA0003352495560000042
其中m是选自3或4的整数；以及
使用选自LC-MS和HPGPC的至少一种分析方法分析所述ABEE标记的糖样品，从而提供测试样品多糖含量相关数据。
17.权利要求16所述的方法，其中所述至少一种草药是铁皮石斛，并且所述一种或多种ABEE标记的糖类是：
Figure FDA0003352495560000051
其中m是选自3或4的整数；或者所述至少一种草药选自黄芪、当归及其组合；并且所述一种或多种ABEE标记的糖类选自：
Figure FDA0003352495560000052
其中n是7；以及
Figure FDA0003352495560000053
18.权利要求16所述的方法，其进一步包括以下步骤：将所述测试样品多糖含量相关数据与通过使用标准样品中的一种或多种ABEE标记的糖类的已知浓度之间的相互关系而制得的一条或多条校准曲线进行比较；以及测定所述测试样品中至少一种多糖的浓度。
19.权利要求16所述的方法，其中所述多糖含量相关数据用于至少一种草药的质量鉴定或定性分析。
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