CN104117056A - 载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用。方法步骤：1内水相（含有胎盘生长因子的水溶液）分散在油相（含有聚乳酸聚羟基乙酸共聚物和有机溶剂的有机溶液）中形成初乳；有机溶剂的极性为4.0～6.0；内水相：油相为（1:3）～（1:10）；2初乳在外水相（含HLB值8～18的亲水性非离子表面活性剂的水溶液）中乳化形成复乳；油相：外水相为（1:3）～（1:6）；3复乳与扩散相（水或含有稳定剂的水溶液）混合，去除有机溶剂和稳定剂，冻干；外水相：扩散相为（1:5）～（1:15）。本发明的产品的缓释效果好，制备方法中减少蛋白变性，提高包封率，稳定性较好，有机溶剂可以不为二氯甲烷等溶剂，反应的毒性降低。

Description

载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠状动脉病变引发其部分或完全性闭塞，供血急剧减少或中断，导致心肌因持久而严重的缺血缺氧而坏死的疾病。急性心肌梗死发病急、并发症多、死亡率高，是一种常见的心血管疾病。急性心肌梗死目前主要的治疗方法包括药物治疗、心脏移植、左心室植入式协助等。由于器官捐献配型的局限性，植入左心室辅助装置造价昂贵过程复杂，药物治疗成为主要的治疗方法。一种新型药物治疗方法是在心梗区注射胎盘生长因子（Placental growth factor，PLGF），促进缺血区域血管再生成，改善心肌功能恢复。直接心肌内注射，可以将药物精确传递至心肌梗死区。其局限性是具有侵入性损伤。尽管胎盘生长因子在治疗急性心肌梗死方面表现出良好的应用前景，但其最大的障碍就是活性成分无法长期存留在心梗区域发挥疗效。为了使药物直接作用在心梗区域，外源性胎盘生长因子只能注射给药。目前普遍采用的方式是在术中直视下，向梗死区心外膜下点状注射，但是点状注射的方式加上心肌收缩，容易导致药物流失，同时胎盘生长因子是一种蛋白类药物，容易局部酶解。总之该方法恢复心功能效果不甚理想。

纳米给药系统物理、化学和生物学性能卓越，己经成为药物新剂型研究中非常活跃的领域。它们可改变药物在体内的药动学特征，增加药物在靶器官的分布量，从而提高疗效、减轻毒副作用，同时纳米粒比表面积大，有利于表面功能化修饰；粒径小，有利于更好地渗透于细胞间隙，发挥微观靶向效应。

目前已有Binsalamah等人（Binsalamah,Ziyad Mohammed,et al."Intramyocardial sustained delivery of placental growth factor usingnanoparticles as a vehicle for delivery in the rat infarct model."Internationaljournal of nanomedicine6(2011):2667.）采用静电交联法制备海藻酸盐-壳聚糖纳米粒，用于包载胎盘生长因子，提高了胎盘生长因子的治疗作用。但这种方法采用亲水性载体能够达到较高的包封率，但释药时长短，一般仅为5天左右。

聚乳酸聚羟基乙酸共聚物（poly-lactide-co-glycolic acid，PLGA）是广泛应用于蛋白多肽类药物缓控释体系的一种纳米载体材料。聚乳酸聚羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性、生物可降解性，降解产物安全无毒，是食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准可用于人体的缓释材料。可根据单体比例的不同控制降解速度，为实现药物的缓控释放提供可能。PLGA载体材料多用于包载香豆素-6、紫杉醇等疏水性药物制备纳米粒、微球等达到较好的缓释效果，也有用于胰岛素等亲水性药物，但普遍包封率较低，无法达到很好的药效。

现有技术中尚不存在能同时实现缓释效果好和包封率高的载胎盘生长因子纳米粒的制备方法，该现象极大的制约了胎盘生长因子在治疗急性心肌梗死方面的发展，该现象亟待解决。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中载胎盘生长因子纳米粒的制备方法不能同时实现缓释效果好和包封率高的缺陷，提供一种新的载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用，该载胎盘生长因子纳米粒缓释效果好，包封率高，毒性低，可以向心肌梗死区稳定、持续、有效地递送胎盘生长因子。

本发明的目的之一是，提供一种载胎盘生长因子纳米粒的制备方法，其包括下述步骤：

（1）将内水相分散在油相中形成初乳；其中，所述的内水相为含有胎盘生长因子的水溶液；所述的油相为含有聚乳酸聚羟基乙酸共聚物和有机溶剂的有机溶液；所述的有机溶剂为极性在4.0～6.0之间的半极性有机溶剂；所述的内水相与油相的体积比为（1:3）～（1:10）；

（2）将上述初乳在外水相中乳化，形成复乳；其中，所述的外水相为含有稳定剂的水溶液；所述的稳定剂为HLB值8～18的亲水性非离子表面活性剂；所述的油相与外水相的体积比为（1:3）～（1:6）；

（3）将上述复乳与扩散相混合，去除有机溶剂和稳定剂，得待冻干溶液，冻干，即可；所述的扩散相为水或含有稳定剂的水溶液；所述的外水相与扩散相的体积比为（1:5）～（1:15）。

本发明中，所述的HLB值（Hydrophilic Lipophilic Balance）为表面活性剂的亲水亲油平衡值，用于表示表面活性剂分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度。

步骤（1）中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物为本领域常规的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的粘均分子量较佳的为10,000～100,000，更佳的为60,000。所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物中乳酸、羟基乙酸嵌段比例为（50/50）～（85/15），所述的乳酸、羟基乙酸嵌段比为乳酸嵌段和羟基乙酸嵌段的重量比。

步骤（1）中，内水相中所述的胎盘生长因子的浓度为本领域常规浓度，较佳的为0.15～0.30mg/mL，所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。

较佳的，步骤（1）中，所述的胎盘生长因子为美国R&D公司的重组人源胎盘生长因子。

较佳的，步骤（1）中，所述的胎盘生长因子和聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的质量比为（3:200）～（1:1500）。

较佳的，步骤（1）中，所述的内水相还可以含有亲水性生理相容性高分子。所述的亲水性生理相容性高分子较佳的为含多羟基的能稳定蛋白的多糖类物质、含多羟基的能稳定蛋白的聚氨基酸类物质、聚丙烯酸和聚乙二醇中的一种或多种。所述的含多羟基的能稳定蛋白的多糖类物质较佳的为肝素、壳聚糖和透明质酸中的一种或多种。所述的含多羟基的能稳定蛋白的聚氨基酸类物质较佳的为聚谷氨酸。

内水相中，所述的生理相容性高分子的浓度为本领域常规浓度，较佳的，所述的生理相容性高分子的浓度为1%～5%，所述百分比为生理相容性高分子占内水相的重量百分比。

步骤（1）中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的浓度为本领域常规浓度，较佳的为5～50mg/mL，更佳的为10～40mg/mL，所述的浓度为聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的质量与有机溶液的体积比。

步骤（1）中，所述的有机溶剂较佳的为乙酸乙酯、乙醇和丙酮中的一种或多种。

步骤（1）中所述的分散的方法为本领域常规方法；所述的分散较佳的为机械分散，更佳的为超声分散。较佳的，所述的超声分散的功率为200W，所述的超声分散的时间为1～2min。

步骤（1）中，所述的内水相与油相的体积比较佳的为（1:4）～（1:6），更佳的为1:5。

本发明中，步骤（1）后，制备得到油包水（W1/O）型乳液。

步骤（2）中，所述的稳定剂为本领域常规的稳定剂；所述的稳定剂较佳的为普朗尼克、聚乙烯醇和吐温80中的一种或多种；更佳的，所述的聚乙烯醇的分子量范围为13000～23000。

步骤（2）中，所述的外水相中稳定剂的浓度为本领域常规的浓度，所述的外水相中稳定剂的浓度较佳的为15%～20%，所述百分比为稳定剂占外水相的重量百分比。

步骤（2）中，所述的乳化的方法为本领域常规方法；较佳的，所述的乳化的方法为高速剪切乳化或高压乳匀。所述的高速剪切乳化较佳的使用分散乳化机。所述的高速剪切乳化较佳的在冰浴条件下进行。所述的高速剪切乳化的剪切速度较佳的为10000～30000rpm，更佳的为11000rpm。所述的高速剪切乳化的时间较佳的为0.5～3min。

本发明中，步骤（2）后，制备得到水包油包水（W1/O/W2）型复乳。

较佳的，步骤（3）中，所述的含有稳定剂的水溶液中的稳定剂的浓度为2%以下，但不为0，所述百分比为稳定剂占扩散相的重量百分比。

步骤（3）中，所述的有机溶剂的去除方法为本领域常规方法；较佳的，所述的有机溶剂的去除方法为磁力搅拌挥干或真空旋转蒸发。所述的磁力搅拌挥干的转速较佳的为100rpm～500rpm，所述的磁力搅拌挥干的时间较佳的为6h～12h。所述的真空旋转蒸发的时间较佳的为3h～6h。

步骤（3）中，所述的稳定剂的去除方法为本领域常规方法，较佳的，所述的稳定剂的去除方法为高速离心。所述的离心的速度较佳的为3000～8000rpm，更佳的为6000rpm；所述的离心的时间较佳的为3～10min，更佳的为8min。

步骤（3）中，所述的冻干的方法为本领域常规方法，较佳的，所述的冻干的方法为直接冻干或与支架剂混合后冻干。

本发明中，所述的支架剂为一种药物辅料，所述的支架剂为本领域常规的支架剂，较佳的，所述的支架剂为甘露醇、葡聚糖、乳糖和右旋糖苷中的一种或多种。所述的支架剂的浓度为本领域常规浓度，较佳的为20～50mg/mL，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比。

本发明的目的之二是，提供由上述载胎盘生长因子纳米粒的制备方法制得的载胎盘生长因子纳米粒。

较佳的，所述的载胎盘生长因子纳米粒的粒径为100～500nm。

较佳的，所述的载胎盘生长因子纳米粒的包封率为30%～50%。

本发明中，所述的包封率的计算公式为：

本发明的目的之三是，提供如上所述的载胎盘生长因子纳米粒在制备用于急性心肌梗死的药物中的应用。较佳的，所述的载胎盘生长因子纳米粒的使用方法为：将载胎盘生长因子纳米粒采用生理盐水混悬后，向梗死区心外膜下点状注射。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明的载胎盘生长因子纳米粒的缓释效果好，延长了PLGF的作用时间至15天，可以向心肌梗死区稳定、持续、有效地递送胎盘生长因子，克服术中直视下梗死区心外膜下点状注射外源PLGF恢复心功能效果不甚理想的问题。

2、本发明的制备方法采用改良的复乳溶剂挥发法，使用的半极性有机溶剂，和水有互溶性，扩散相的加入使纳米粒在扩散的同时迅速固化成型，减少了蛋白在非极性有机溶剂中的变性，大大提高了包封率。并且，胎盘生长因子包覆在聚乳酸聚羟基乙酸共聚物中，在实际使用过程中胎盘生长因子不易蛋白质变性，稳定性较好。

3、本发明制备方法中所采用的有机溶剂可以不为二氯甲烷等溶剂，使反应的毒性大大降低。

附图说明

图1为载胎盘生长因子纳米粒的透射电镜图。

图2为载胎盘生长因子纳米粒的粒径分布图。

图3为实施例1的第一批载胎盘生长因子纳米粒体外释放曲线。

图4为实施例1的第二批载胎盘生长因子纳米粒体外释放曲线。

图5为实施例1的第三批载胎盘生长因子纳米粒体外释放曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

（1）内水相的制备：配制0.15mg/mL的PLGF水溶液，取100μL（0.1mL）作为内水相（W1），所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。

（2）油相的制备：取10mg的PLGA（粘均分子量60000，乳酸、羟基乙酸嵌段比例50:50）溶于0.5mL的乙酸乙酯，配制成20mg/mL的溶液，作为油相（O）；所述的百分比为PLGA的质量与乙酸乙酯的体积比。

（3）将W1滴加到O中，超声分散，超声分散的功率为200w，时间为2min，形成油包水（W1/O）型乳液。

（4）将步骤（3）中的（W1/O）型乳液加入到2mL的19%的普朗尼克F-68水溶液（即外水相）中，所述百分比为普朗尼克F-68占外水相的重量百分比；在冰浴条件下使用分散乳化机高速剪切乳化，高速剪切的速度为11000rpm，所述的高速剪切的时间为1min，形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳。

（5）将复乳溶于20mL去离子水（作为扩散相，有利于纳米粒固化）中，可明显看到乳光现象，室温真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯4h，高速离心（6000rpm,8min），用蒸馏水清洗三次，洗净纳米粒表面的普朗尼克F-68以及游离的PLGF，得到纳米粒混悬液。

（6）将收集到的纳米粒混悬液定容，得待冻干溶液，按50mg/mL的浓度加入支架剂甘露醇，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比；冷冻干燥得到纳米粒成品。

收集离心所得上清液，用试剂盒酶标仪法测药物浓度，结合投药量计算包封率为43.5%。Nicomp380粒径分析仪测量载胎盘生长因子纳米粒的粒径分布，结果如图2所示，测得平均粒径233.9nm。

透视电子显微镜观察载胎盘生长因子纳米粒，得到如图1所示的载胎盘生长因子纳米粒的透射电镜图。

实施例2

（1）内水相的制备：配制0.15mg/mL PLGF水溶液，取100μL作为内水相（W1），所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。

（2）油相的制备：取5mg的PLGA（粘均分子量60000，乳酸、羟基乙酸嵌段比例50:50）溶于0.5mL的乙酸乙酯中，配制成10mg/mL的溶液，作为油相（O）；所述的百分比为PLGA的质量与乙酸乙酯的体积比。

（3）将W1缓慢滴加到O中，超声分散，超声分散的功率为200w，时间为1min，形成油包水（W1/O）型乳液。

（4）将步骤（3）中的（W1/O）型乳液加入到2mL的15%普朗尼克F-68水溶液（即外水相）中，所述百分比为普朗尼克F-68占外水相的重量百分比；在冰浴条件下分散乳化机高速剪切乳化，高速剪切的速度为11000rpm，所述的高速剪切的时间为2min，形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳。

（5）将复乳迅速加入15mL去离子水（作为扩散相，有利于纳米粒固化）中，可明显看到乳光现象，室温真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯4h，高速离心（5000rpm,10min），用蒸馏水清洗三次洗净纳米粒表面的普朗尼克F-68稳定剂以及游离的PLGF。

（6）将收集到的纳米粒混悬液定容，得待冻干溶液，按20mg/mL的浓度加入支架剂葡聚糖，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比；冷冻干燥得到纳米粒成品。

收集离心所得上清液，用试剂盒酶标仪法测药物浓度，结合投药量计算包封率为32.8%。Nicomp380粒径分析仪测得平均粒径为378.8nm。

实施例3

（1）内水相的制备：配制0.20mg/mLPLGF水溶液，取100μL作为内水相（W1），所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。

（2）油相的制备：取10mg的PLGA（粘均分子量60000，乳酸、羟基乙酸嵌段比例50:50）溶于0.5mL的乙酸乙酯中，配制成20mg/mL的溶液，作为油相（O）；所述的百分比为PLGA的质量与乙酸乙酯的体积比。

（3）将W1缓慢滴加到O中，超声分散，超声分散的功率为200w，时间为1min，形成油包水（W1/O）型乳液。

（4）将步骤（3）中的（W1/O）型乳液加入到3mL的10%普朗尼克F-68水溶液（即外水相）中，所述百分比为普朗尼克F-68占外水相的重量百分比；在冰浴条件下分散乳化机高速剪切乳化，高速剪切的速度为20000rpm，所述的高速剪切的时间为1min，形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳。

（5）将复乳迅速加入20mL去离子水（作为扩散相，有利于纳米粒固化）中，可明显看到乳光现象，室温真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯6h，高速离心（6000rpm,8min），用蒸馏水清洗三次洗净纳米粒表面的普朗尼克F-68稳定剂以及游离的PLGF。

（6）将收集到的纳米粒混悬液定容，得待冻干溶液，按20mg/mL的浓度加入支架剂乳糖，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比；冷冻干燥得到纳米粒成品。

收集离心所得上清液，用试剂盒酶标仪法测药物浓度，结合投药量计算包封率38.9%。Nicomp380粒径分析仪测得平均粒径321.7nm。

实施例4

（1）内水相的制备：配制0.30mg/mLPLGF水溶液，取100μL作为内水相（W1），所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。

（2）油相的制备：取12mg的PLGA（粘均分子量100000，乳酸、羟基乙酸嵌段比例75:25）溶于0.3mL的乙酸乙酯中，配制成40mg/mL的溶液，作为油相（O）；所述的百分比为PLGA的质量与乙酸乙酯的体积比。

（3）将W1缓慢滴加到O中，超声分散，超声分散的功率为200w，时间为1min，形成油包水（W1/O）型乳液。

（4）将步骤（3）中的（W1/O）型乳液加入到1.5mL的10%的聚乙烯醇1788水溶液（即外水相）中，所述百分比为聚乙烯醇1788占外水相的重量百分比；在冰浴条件下分散乳化机高速剪切乳化，高速剪切的速度为30000rpm，所述的高速剪切的时间为0.5min，形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳。

（5）将复乳迅速加入20mL去离子水（作为扩散相，有利于纳米粒固化）中，可明显看到乳光现象。真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯。真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯。以100rpm的转速在室温下磁力搅拌6h挥发乙酸乙酯,至完全挥干，高速离心（5000rpm,10min），用蒸馏水清洗三次洗净纳米粒表面的聚乙烯醇稳定剂以及游离的PLGF。

（6）将收集到的纳米粒混悬液定容，得待冻干溶液，按20mg/mL的浓度加入支架剂乳糖，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比；冷冻干燥得到纳米粒成品。

收集离心所得上清液，用试剂盒酶标仪法测药物浓度，结合投药量计算包封率35.1%。Nicomp380粒径分析仪测得平均粒径279.6nm。

实施例5

（1）内水相的制备：配制0.20mg/mLPLGF水溶液，取100μL作为内水相（W1），所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。

（2）油相的制备：取30mg的PLGA（粘均分子量100000，乳酸、羟基乙酸嵌段比例75:25）溶于1mL的乙醇中，配制成30mg/mL的溶液，作为油相（O）；所述的百分比为PLGA的质量与乙醇的体积比。

（3）将W1缓慢滴加到O中，超声分散，超声分散的功率为200w，时间为2min，形成油包水（W1/O）型乳液。

（4）将步骤（3）中的（W1/O）型乳液加入到3mL的10%普朗尼克F-68水溶液（即外水相）中，所述百分比为普朗尼克F-68占外水相的重量百分比；在冰浴条件下分散乳化机高速剪切乳化，高速剪切的速度为20000rpm，所述的高速剪切的时间为1min，形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳。

（5）将复乳迅速加入25mL去离子水（作为扩散相，有利于纳米粒固化）中，可明显看到乳光现象。真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯。真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯。以200rpm的转速在室温下磁力搅拌7h挥发乙酸乙酯，至完全挥干，高速离心（8000rpm,5min），用蒸馏水清洗三次洗净纳米粒表面的普朗尼克F-68稳定剂以及游离的PLGF。

（6）将收集到的纳米粒混悬液定容，得待冻干溶液，按30mg/mL的浓度加入支架剂右旋糖酐，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比；冷冻干燥得到纳米粒成品。

收集离心所得上清液，用试剂盒酶标仪法测药物浓度，结合投药量计算包封率42.1%。Nicomp380粒径分析仪测得平均粒径419.6nm。

实施例6

（1）内水相的制备：配制0.15mg/mL的PLGF水溶液，取100μL（0.1mL）作为内水相（W1），所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。

（2）油相的制备：取10mg的PLGA（粘均分子量60000，乳酸、羟基乙酸嵌段比例50:50）溶于0.5mL的乙酸乙酯，配制成20mg/mL的溶液，作为油相（O）；所述的百分比为PLGA的质量与乙酸乙酯的体积比。

（3）将W1滴加到O中，超声分散，超声分散的功率为200w，时间为2min，形成油包水（W1/O）型乳液。

（4）将步骤（3）中的（W1/O）型乳液加入到2mL的19%的普朗尼克F-68水溶液（即外水相）中，所述百分比为普朗尼克F-68占外水相的重量百分比；在冰浴条件下使用分散乳化机高速剪切乳化，高速剪切的速度为11000rpm，所述的高速剪切的时间为1min，形成水包油包水（W1/O/W2）型复乳。

（5）将复乳溶于20mL含有2%普朗尼克F-68的水溶液中（作为扩散相，有利于纳米粒固化）中，可明显看到乳光现象，所述百分比为普朗尼克F-68占扩散相的重量百分比，室温真空旋转蒸发挥发乙酸乙酯4h，高速离心（6000rpm,8min），用蒸馏水清洗三次，洗净纳米粒表面的普朗尼克F-68以及游离的PLGF，得到纳米粒混悬液。

（6）将收集到的纳米粒混悬液定容，得待冻干溶液，按50mg/mL的浓度加入支架剂甘露醇，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比；冷冻干燥得到纳米粒成品。

收集离心所得上清液，用试剂盒酶标仪法测药物浓度，结合投药量计算包封率为43.5%。Nicomp380粒径分析仪测得平均粒径233.9nm。

效果实施例1

载胎盘生长因子纳米粒在大鼠心肌梗死重建实验中对左心室收缩功能的改善作用。

实验方法：建立大鼠心肌梗死模型，随机分为四组，每组10只。

假手术组：手术开胸后不解扎，不注射任何药物。

阴性对照组：开胸结扎冠状动脉左前降支，心肌梗死区点状注射生理盐水66μl；

PLGF注射组：开胸结扎冠状动脉左前降支后心肌梗死区点状注射PLGF，给药剂量1μg，给药体积66μl；

PLGF-PLGA组（实施例1）：开胸结扎冠状动脉左前降支后心肌梗死区点状注射PLGF-PLGA纳米粒，经计算给药剂量约为1μg，给药体积约为66μl。

手术5周后，采用多普勒技术结合二维超声心动图测量大鼠心脏的左室射血分数LVEF、收缩期左室前壁厚度LVAW、收缩期左室容积LV。

实验结果：如表1所示。表1为上述四组大鼠的心超检测结果。

表1大鼠心超检测结果

（注：#与正常组对比P＜0.05；&与心梗对照组对比P＜0.05；※与PGF注射组对比P＜0.05）

实验结果表明：与假手术组相比，经过结扎的三组均表现出左心室功能的显著下降。与给生理盐水的阴性对照组相比，PLGF确实表现出对于大鼠左心室功能的改善。与单独注射PLGF相比，注射载胎盘生长因子纳米粒组大鼠的心功能得到显著性恢复。

结论：本发明的载胎盘生长因子纳米粒能显著改善心肌梗死大鼠左心室收缩功能，逆转左心室重构。其效果优于现有技术中的PLGF注射组。

效果实施例2

按照实施例1制备出三批纳米粒，进行体外释放的研究，其结果如图3-5所示，其中，图3为第一批载胎盘生长因子纳米粒体外释放曲线，图4为第二批载胎盘生长因子纳米粒体外释放曲线，图5为第三批载胎盘生长因子纳米粒体外释放曲线。

实验方法：称取载胎盘生长因子纳米粒约10mg，置于透析袋中，加入4mL的pH7.4磷酸盐缓冲液（含0.02wt%叠氮化钠为抑菌剂，0.02wt%F-68为润湿剂）中，封口。置于25mL离心管，加入16mL的pH7.4的聚丁二酸丁二醇酯（PBS）作为释放介质，在37℃100rmp的条件下进行释放试验。在第4h、8h、12h、24h取样，之后每天各取样一次，每次取1mL，同时补充等量新的释放介质。采用酶联免疫法测定上清液中PLGF的浓度。计算纳米粒中蛋白的释放量。

实验结果：如图3-5所示：载胎盘生长因子纳米粒在0～3天表现出明显的突释现象。PLGF水溶性强，附着在纳米粒外表面的PLGF和释放介质接触，形成较大的浓度差，扩散效应明显，释放速度较快形成突释。第4天开始，释放速度开始下降，到第10～15天释放速度基本平稳，保持在2%～3%/2天的释放速度。且三组载胎盘生长因子纳米粒释放结果重复性好，载胎盘生长因子纳米粒性能稳定。

这种多级释放效应说明药物已经被包载在纳米粒内部，随着药物扩散和载体的降解药物被逐步释放出来，形成缓释效果，有利于使半衰期短的药物保持长时间的药效。

Claims (10)

1.一种载胎盘生长因子纳米粒的制备方法，其特征在于：其包括下述步骤：

（1）将内水相分散在油相中形成初乳；其中，所述的内水相为含有胎盘生长因子的水溶液；所述的油相为含有聚乳酸聚羟基乙酸共聚物和有机溶剂的有机溶液；所述的有机溶剂为极性在4.0～6.0之间的半极性有机溶剂；所述的内水相与油相的体积比为（1:3）～（1:10）；

（2）将上述初乳在外水相中乳化，形成复乳；其中，所述的外水相为含有稳定剂的水溶液；所述的稳定剂为HLB值8～18的亲水性非离子表面活性剂；所述的油相与外水相的体积比为（1:3）～（1:6）；

（3）将上述复乳与扩散相混合，去除有机溶剂和稳定剂，得待冻干溶液，冻干，即可；所述的扩散相为水或含有稳定剂的水溶液；所述的外水相与扩散相的体积比为（1:5）～（1:15）。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的粘均分子量为10,000～100,000；所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物中乳酸、羟基乙酸嵌段比例为（50/50）～（85/15），所述的乳酸、羟基乙酸嵌段比为乳酸嵌段和羟基乙酸嵌段的重量比；

和/或，步骤（1）中，内水相中所述的胎盘生长因子的浓度为0.15～0.30mg/mL，所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比；

和/或，步骤（1）中，所述的胎盘生长因子和聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的质量比为（3:200）～（1:1500）。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的内水相还含有亲水性生理相容性高分子；

所述的亲水性生理相容性高分子较佳的为含多羟基的能稳定蛋白的多糖类物质、含多羟基的能稳定蛋白的聚氨基酸类物质、聚丙烯酸和聚乙二醇中的一种或多种；所述的含多羟基的能稳定蛋白的多糖类物质较佳的为肝素、壳聚糖和透明质酸中的一种或多种；所述的含多羟基的能稳定蛋白的聚氨基酸类物质较佳的为聚谷氨酸；

内水相中，所述的生理相容性高分子的浓度较佳的为1%～5%，所述百分比为生理相容性高分子占内水相的重量百分比。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的浓度为5～50mg/mL，较佳的为10～40mg/mL，所述的浓度为聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的质量与有机溶液的体积比；

和/或，步骤（1）中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙醇和丙酮中的一种或多种；

和/或，步骤（1）中所述的分散的方法为机械分散，较佳的为超声分散；较佳的，所述的超声分散的功率为200W，所述的超声分散的时间为1～2min；

和/或，步骤（1）中，所述的内水相与油相的体积比为（1:4）～（1:6）。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的稳定剂为普朗尼克、聚乙烯醇和吐温80中的一种或多种；

和/或，步骤（2）中，所述的外水相中稳定剂的浓度为15%～20%，所述百分比为稳定剂占外水相的重量百分比；

和/或，步骤（2）中，所述的乳化为高速剪切乳化或高压乳匀；所述的高速剪切乳化较佳的使用分散乳化机；所述的高速剪切乳化较佳的在冰浴条件下进行；所述的高速剪切乳化的剪切速度较佳的为10000～30000rpm；所述的高速剪切乳化的时间较佳的为0.5～3min。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的含有稳定剂的水溶液中的稳定剂的浓度为2%以下，但不为0，所述百分比为稳定剂占扩散相的重量百分比。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的有机溶剂的去除方法为磁力搅拌挥干或真空旋转蒸发；所述的磁力搅拌挥干的转速较佳的为100rpm～500rpm，所述的磁力搅拌挥干的时间较佳的为6h～12h；所述的真空旋转蒸发的时间较佳的为3h～6h；

和/或，步骤（3）中，所述的稳定剂的去除方法为高速离心；所述的离心的速度较佳的为3000～8000rpm；所述的离心的时间较佳的为3～10min；

和/或，步骤（3）中，所述的冻干的方法为直接冻干或与支架剂混合后冻干；较佳的，所述的支架剂为甘露醇、葡聚糖、乳糖和右旋糖苷中的一种或多种；较佳的，所述的支架剂的浓度为20～50mg/mL，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比。

8.一种由权利要求1-7中任一项所述的载胎盘生长因子纳米粒的制备方法制得的载胎盘生长因子纳米粒。

9.如权利要求8所述的载胎盘生长因子纳米粒，其特征在于：所述的载胎盘生长因子纳米粒的粒径为100～500nm，包封率为30%～50%。

10.如权利要求8或9所述的载胎盘生长因子纳米粒在制备用于急性心肌梗死的药物中的应用；较佳的，所述的载胎盘生长因子纳米粒的使用方法为：载胎盘生长因子纳米粒采用生理盐水混悬后，向梗死区心外膜下点状注射。