CN1460468A - 改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法。该方法采用水包油包水技术，其内水相为药物的水溶液或缓冲盐溶液，中油相为聚合物溶液，外水相为含有或不含水溶性盐或多元醇(或糖、多糖)的吐温类乳化剂的水溶液。制备时将一定量的内水相乳化于中油相中得到油包水乳液，该初乳再乳化于外水相中得到水包油包水复乳液。该复乳在室温搅拌下挥发中油相溶剂，待微球硬化后，离心分离，双蒸水洗涤，冷冻干燥。本发明使用吐温类乳化剂，以水包油包水复乳溶剂挥发法成功制备了包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球。微球收率80－100％，药物包埋率达到60－100％。药物在体外释放时间超过30天，且微球粒径可在0.5－200μm之间调控以满足不同的使用要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法。尤其是胰岛素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人绒毛膜促性腺激素、神经生长因子、破伤风杆菌疫苗等药物微球的制备方法。
背景技术
近十年来，药物控释微球在医药领域获得了越来越多的应用。第一，作为各种药物的控释及多途径给药制剂，如可用作注射、口服、鼻腔吸入、眼部给药等多途径使用；第二，作为各种化学栓塞制剂发挥栓塞及控释双重功能；第三，作为激素、疫苗等药物的载体实现一次给药达到长时间发挥疗效、引发机体免疫应答的作用。目前用于控释微球的载体材料有多种，按来源可分为(1)天然高分子材料，如纤维素、壳聚糖、蛋白质，海藻酸钠，这类材料大多可降解且有良好的生物相容性；(2)合成高分子材料，按生物降解特性又可分为：非生物降解型高分子材料，如聚丙烯酸酯及其衍生物，聚醋酸乙烯酯；生物降解型高分子材料，如聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯等，其中聚乳酸，聚(丙交酯-共-乙交酯)，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美国FDA批准作为医用材料临床使用。
控释微球中生理活性物质可以是脂溶性的，也可以是水溶性的。其中载有多肽蛋白类药物、疫苗的可降解性微球作为一类新型药物剂型随生物技术和基因工程的快速发展引起人们的高度重视。这种新型的缓释剂型中，有的已经作为上市产品，如醋酸亮丙瑞林、曲谱瑞林缓释微球剂型已用于临床治疗前列腺癌、子宫内膜异位症及子宫平滑肌瘤等疾病；有的微球制剂正在进行临床试验，如用于治疗激素依赖型侏儒症和儿童期发育不全的重组人生长激素缓释制剂正在美国进行临床试验；有的虽然只是初步的基础研究，但已显示出广泛的应用前景，如口服胰岛素制剂、载有亚单位疫苗或病毒疫苗的缓释制剂。通过制成缓释微球剂型，既可以避免生物活性物质受体内酶的降解和其它物质的破坏失活，又可显著延长药物在体内的释放时间，达到一次给药长期有效的目的。
水包油包水乳液-溶剂挥发法是药物微球化的最为常用的方法。在该复乳法制备微球过程中，聚乙烯醇是最常使用的非离子型表面活性剂。许多研究表明，聚乙烯醇往往吸附在所得微球表面而难以通过洗涤彻底去除。同时，聚乙烯醇又是一种潜在的致癌物质，它在体内难以降解或代谢。Yamaoka等人的研究表明，静注后聚乙烯醇在体内的生物半衰期随分子量的增大而增大，而作为乳化剂使用的聚乙烯醇一般具有较高的分子量。因此，聚乙烯醇长期体内使用的安全性仍是值得怀疑的。吐温类物质是另一类广泛应用于医药工业的非离子型表面活性剂，该类乳化剂在注射剂中也常使用。以该类物质为乳化剂，用复乳法制备包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球尚未见诸于报道。
复乳法制备微球时，所得微球的成球性、微球收率、药物包埋率、微球表面形态、微球粒径等特性受很多制备因素如内水相粘度、第一次乳化速度、聚合物种类、外水相的组成、二次乳化速度的影响。尽管这方面的研究已有很多文献报道，但对外水相组成的专门研究报道极少。Pistel和Kissel以聚乙烯醇为乳化剂，研究了外水相添加氯化钠对微球形态、药物包埋率等的影响。尽管外水相中添加氯化钠是一种得到具有较好特性的微球的简单易行的办法。但由于有些多肽蛋白类药物对盐类电解质特别敏感，往往在这些物质存在下变性失活。例如，Péan和Venier-Julience报道以复乳法制备神经生长因子/聚(丙交酯-共-乙交酯)微球，当外水相中有氯化钠存在时会导致包入的神经生长因子失活。多元醇、糖和多糖如甘露醇、葡萄糖、乳糖等经常用作蛋白类药物和疫苗的稳定剂，在复乳法制备微球过程中，外水相中引入该类物质将不会存在导致活性物质失活的问题，而这方面的工作至今也未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法。
它首先将药物溶解在水溶液或缓冲盐溶液中得到内水相，可降解性聚合物溶解在二氯甲烷或氯仿中得到中油相，吐温类乳化剂或吐温类乳化剂与水溶性盐或多元醇或糖或多糖组成的水溶液作为外水相，然后在冰浴中和以每分钟2000-40000转高速搅拌下或超声波作用下乳化于中油相中形成油包水初乳，该初乳在300-3000转/分搅拌下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，所得复乳在室温下电磁搅拌以挥发去除中油相的有机溶剂，待微球硬化后，离心分离，用双蒸水洗涤，冷冻干燥。
本发明的优点是：
1)使用吐温类物质作为乳化剂，由于该类物质具有良好的水溶性，在所得的微球表面基本无乳化剂吸附；
2)外水相加入水溶性盐可明显提高微球的收率(提高到90-100％)；
3)外水相中加入多元醇或糖或多糖，可避免有时因加入水溶性盐而引起的蛋白类药物和疫苗的变性，同时又可提高药物包埋率(70-95％)和微球收率(70-95％)。
具体实施方式
本发明使用吐温类物质替代聚乙烯醇作为乳化剂，同时，外水相中引入水溶性盐、多元醇、糖或多糖。为了提高蛋白的包埋率和微球的收率，本发明采取如下措施。该法内水相为溶解有药物的水溶液或缓冲盐溶液，其中药物浓度为0.01-100mg/ml。中油相为溶解有聚乳酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚碳酸酯的二氯甲烷或氯仿溶液，其中聚合物浓度为1-200mg/ml。外水相为溶解有吐温类乳化剂或吐温类乳化剂与添加剂(水溶性盐或多元醇、糖、多糖)的水溶液，其中吐温类乳化剂的浓度为0.05-20g/100ml，添加剂的浓度为0.0-20g/100ml。在冰浴中和以每分钟2000-40000转高速搅拌下或超声波作用下将内水相乳化于中油相中形成油包水初乳，该初乳在300-3000转搅拌下乳化于外水相中得到水包油包水复乳。将所得复乳在室温下电磁搅拌以挥发去除中油相的有机溶剂，待微球硬化后，离心分离，用双蒸水洗涤，冷冻干燥即可。
下面结合实施例作进一步详细说明。
实施例1
内水相采用0.5ml浓度为10mg/ml的牛胰岛素(Mw＝5800)的磷酸缓冲盐溶液(0.1M，pH7.4)，中油相为5.0ml浓度为50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为75∶25，Mw＝52000)的二氯甲烷溶液，外水相为0.1％(重量/体积)吐温80水溶液，其中含有5％氯化钠，制备时将内水相在2000转/分搅拌下乳化于中油相中，形成的油包水初乳，该初乳在800转/分搅拌下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，该复乳在10℃下电磁搅拌挥发去除中油相溶剂；微球硬化后离心分离并用双蒸水洗涤，冷冻干燥，牛胰岛素包埋率为75.0％，微球收率为100％，微球数均粒径为40μm。
实施例2
内水相采用0.5ml浓度为10mg/ml的牛胰岛素(Mw＝5800)的磷酸缓冲盐溶液(0.1M，pH7.4)，中油相为6.0ml浓度为50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为50∶50，Mw＝50000)的氯仿烷溶液，外水相为0.25％(重量/体积)吐温80水溶液，其中含有7.5％氯化钠，制备时将内水相在4000转/分搅拌下乳化于中油相中，形成的油包水初乳，该初乳在500转/分搅拌下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，该复乳在10℃下电磁搅拌挥发去除中油相溶剂；微球硬化后离心分离并用双蒸水洗涤，冷冻干燥，牛胰岛素包埋率为85.0％，微球收率为90.5％，微球数均粒径为60μm。
实施例3
内水相采用0.5ml浓度为5.0mg/ml的人绒毛膜促性腺激素(HCG，免疫活性为14000IU/mg)的磷酸缓冲盐溶液(0.1M，pH7.4)，中油相为6.0ml浓度为的50mg/ml的聚(丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)(摩尔比为60∶40，Mw＝35000)的二氯甲烷溶液，外水相为0.1％(重量/体积)吐温80水溶液，其中含有15％葡萄糖，其余操作同实施例1，所得微球的HCG包埋率为89.3％，微球收率为95％，微球数均粒径为35μm。
实施例4
内水相采用0.5ml浓度为50mg/ml的牛血清白蛋白(BSA，Mw＝67000)的水溶液，中油相为10.0ml浓度为的40mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为50∶50，Mw＝36000)的二氯甲烷溶液，外水相为0.2％(重量/体积)吐温80水溶液，制备时将内水相超声波作用(200W)下乳化于中油相中，形成的油包水初乳2000转/分匀浆乳化于外水相中得到水包油包水复乳，该复乳在15℃下电磁搅拌挥发去除中油相溶剂；微球硬化后离心分离并用双蒸水洗涤，冷冻干燥，BSA包埋率为99.7％，微球收率为70％，微球数均粒径为4.5μm。
实施例5
内水相采用0.5ml浓度为50mg/ml的人血清白蛋白(HSA)的水溶液，中油相为10ml浓度为的40mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为50∶50，Mw＝36000)的二氯甲烷溶液，外水相为0.1％(重量/体积)吐温80水溶液，其中含有2.5％1，2-丁二醇，制备时将内水相超声波分散(200W)于中油相中，形成的油包水初乳2800转/分匀浆乳化于外水相中得到水包油包水复乳，该复乳在15℃下电磁搅拌蒸发去除中油相溶剂；微球硬化后离心分离并用双蒸水洗涤，冷冻干燥，HSA包埋率为91.7％，微球收率为85％，微球数均粒径为2.5μm。
实施例6
内水相采用0.5ml浓度为0.05mg/ml的神经生长因子(NGF)的水溶液，中油相为10ml浓度为的40mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为50∶50，Mw＝36000)的二氯甲烷溶液，外水相为0.2％(重量/体积)吐温80水溶液，其中含有2.5％甘露醇，制备时将内水相超声波作用(200W)下乳化于中油相中，形成的油包水初乳2800转/分匀浆乳化于外水相中得到水包油包水复乳，该复乳在15℃下电磁搅拌蒸发去除中油相溶剂；微球硬化后离心分离并用双蒸水洗涤，冷冻干燥，NGF包埋率为81.7％，微球收率为80％，微球数均粒径为2.0μm。
实施例7
内水相采用0.5m破伤风杆菌疫苗的水溶液(15000IU/ml)，中油相为10ml浓度为的50mg/ml的聚乳酸(重均分子量为36000)的二氯甲烷溶液，外水相为0.2％(重量/体积)吐温80水溶液，其中含有2.5％甘露醇，制备时将内水相在2000转/分搅拌下乳化于中油相中，形成的油包水初乳，形成的油包水初乳1000转/分搅拌下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，该复乳在15℃下电磁搅拌蒸发去除中油相溶剂；微球硬化后离心分离并用双蒸水洗涤，冷冻干燥，破伤风杆菌疫苗的包埋率为75.7％，微球收率为85.6％，微球数均粒径为42.0μm。
Claims (5)
1.一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于：首先将药物溶解在水溶液或缓冲盐溶液中得到内水相，可降解性聚合物溶解在二氯甲烷或氯仿中得到中油相，吐温类乳化剂或吐温类乳化剂与水溶性盐或多元醇或糖或多糖组成的水溶液作为外水相，然后在冰浴中和以每分钟2000-40000转高速搅拌下或超声波作用下乳化于中油相中形成油包水初乳，该初乳在300-3000转/分搅拌下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，所得复乳在室温下电磁搅拌以挥发去除中油相的有机溶剂，待微球硬化后，离心分离，用双蒸水洗涤，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的外水相为吐温类乳化剂的水溶液，吐温类乳化剂的浓度为0.05-20％(g/ml)。
3.根据权利要求1所述的一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的外水相中含有水溶性盐或多元醇或糖或多糖添加剂，添加剂的浓度为0.0-20％(g/ml)。
4.根据权利要求1所述的一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的蛋白类药物和疫苗为胰岛素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人绒毛膜促性腺激素、神经生长因子、破伤风杆菌疫苗。
5.根据权利要求1所述的一种改进的包埋蛋白类药物和疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于制备蛋白类药物和疫苗的高分子微球所用的载体材料为聚乳酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-碳酸酯)生物降解高分子材料。
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|---|---|---|---|---|
| WO2008000137A1 (fr) * | 2006-06-20 | 2008-01-03 | Schweitzer Co., Ltd. | Préparation orale encapsulée destinée à des animaux aquatiques, son procédé de préparation et son utilisation |
| CN100434456C (zh) * | 2006-06-23 | 2008-11-19 | 武汉大学 | 超声辅助制备聚合物纳米/微米球的方法 |
| CN101842088A (zh) * | 2007-09-18 | 2010-09-22 | 法国国家健康医学研究院 | 用于包封亲水性和/或亲油性分子的水性-核脂质纳米胶囊 |
| CN104117056A (zh) * | 2013-04-28 | 2014-10-29 | 上海现代药物制剂工程研究中心有限公司 | 载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用 |
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2003
- 2003-06-05 CN CN03129096A patent/CN1460468A/zh active Pending
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| CN104117056A (zh) * | 2013-04-28 | 2014-10-29 | 上海现代药物制剂工程研究中心有限公司 | 载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用 |
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