CN1257708C - 改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法。该体系的初始乳液由水相和油相组成，其水相为药物的水溶液或缓冲盐溶液，油相为聚合物溶液，凝聚剂或非溶剂为含有一定量的油溶性乳化剂的石油醚或正己烷、正庚烷溶液。制备时将一定量的水相乳化于油相中得到油包水乳液，在搅拌下将一定量的凝聚剂加入到该乳液中得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液加入到一定量的石油醚中，并在室温下磁力搅拌一定时间。待微球完全固化后，离心分离并用石油醚洗涤微球。本发明以含有油溶性乳化剂的石油醚或正己烷、正庚烷溶液为凝聚剂，以相分离法成功制备了载有水溶性药物和疫苗的高分子微球。
Description
技术领域
本发明涉及一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法。尤其是5-氟尿嘧啶、阿霉素、胰岛素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人绒毛膜促性腺激素、破伤风杆菌疫苗等药物微球的制备方法。
背景技术
近年来，药物控释微球在医药领域获得了广泛的应用。第一，作为各种药物的控释及多途径给药制剂，如可用作注射、口服、鼻腔吸入、眼部给药等多途径给药；第二，作为化学栓塞制剂发挥栓塞及控释双重功能；第三，作为激素、疫苗等生理活性物质的载体实现一次给药达到长时间发挥疗效、刺激机体免疫响应的作用。
目前用于制备控释微球的载体材料有多种，按来源可分为(1)天然高分子材料，如纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、蛋白质，海藻酸钠，这类材料大多可降解且具有良好的生物相容性；(2)合成高分子材料，按生物降解特性又可分为：非生物降解型高分子材料，如聚丙烯酸酯及其衍生物，聚醋酸乙烯酯，聚氨酯；生物降解型高分子材料，主要有聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯以及聚膦腈等，其中聚乳酸，聚(丙交酯-共-乙交酯)，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美国FDA批准作为医用材料临床使用。
控释微球制剂中的生理活性物质可以是脂溶性的，也可以是水溶性的。其中载有抗癌药物、多肽蛋白类药物以及疫苗的可降解性微球作为一类新型药物剂型随生物技术和基因工程的快速发展引起人们的高度重视。这种新型的缓释剂型中，有的已经作为上市产品，如醋酸亮丙瑞林、曲谱瑞林缓释微球剂型已用于临床治疗前列腺癌、子宫内膜异位症及子宫平滑肌瘤等疾病；有的微球制剂正在进行临床试验，如抗神经胶质瘤的5-氟尿嘧啶/聚(丙交酯-共-乙交酯)微球已在法国一个研究小组进行临床试验，用于治疗激素依赖型侏儒症和儿童期发育不全的重组人生长激素缓释微球制剂正在美国进行临床试验；有的虽然只是初步的基础研究，但已显示出广泛的应用前景，如口服胰岛素制剂、载有亚单位疫苗或病毒疫苗的缓释制剂。通过制成缓释微球剂型，既可以避免生物活性物质受体内酶的降解和其它物质的破坏失活，又可显著延长药物在体内的释放时间，达到一次给药长期有效的目的。
相分离法或凝聚法是药物微球化的最为常用的方法之一。在该法制备微球过程中，硅油是最为常用的高分子类凝聚剂或非溶剂，尤其是二甲基硅油。使用该类凝聚剂的缺点是：第一，使用该类凝聚剂时，必须很好的控制水油相体积比、聚合物浓度、凝聚剂的体积及其滴加速度以使体系处于‘稳定窗’内，否则在制备过程中微球很容易聚集，且较难得到高包埋率的载药微球。第二，许多研究表明，在微球制备过程中硅油等凝聚剂会被包埋于微球中，在之后的洗涤过程也很难彻底去除。而硅油具有一定的毒性，其在体内不可降解也难以通过代谢排出体外，因而影响最终产品的应用；同时该类物质的存在又会影响微球的理化性能，进而影响药物的释放行为，使得影响微球中药物释放的因素更加复杂化，这对于微球制剂的合理设计增加了困难。第三，该类凝聚剂的使用，导致制备中悬浮液体系的粘度增加很多，这种情况下很难得到小粒径微球，而对于某些给药途径或一些生物活性物质的控释又要求微球具有很小的粒径。这使得传统相分离法的应用受到了一定的限制。第四，使用该类乳化剂时，由于体系较大的粘度使得有机溶剂提取不彻底。而这些有机溶剂往往具有较强的毒性，比如二氯甲烷、氯仿等常用的卤代烃具有致癌性、制畸性、突变性和一定的神经毒性，美国药典和欧洲药典均规定这两种溶剂在微球内的残余量分别要小于500ppm和50ppm。
鉴于以上原因，很多研究小组对传统的相分离法做了改进。Leelarasamee等人使用矿物油代替硅油作为凝聚剂，并使用不同大小口径的注射装置制备不同粒径的微球。该法的局限性是要求有特殊的装置，同时矿物油在微球中也有一定的残留量。McGee等人将卵白蛋白和聚合物形成的乳液加入到含有一定乳化剂的硅油溶液中，得到了粒径很小的微球。但该法的缺点是由于使用了大量体积的硅油，因而蛋白的损失量大，这对于价格昂贵的多肽、蛋白类药物或疫苗的包埋是不适用的。为了减少最后微球中溶剂残留量，Lewis等人采用较小的溶剂/凝聚剂比来制备载有组氨瑞林的PLGA微球，他们也建议使用芝麻油作为新的凝聚剂。Lawter等人以易于挥发的六二甲基硅烷为凝聚剂来制备曲谱瑞林微球。
尽管现有的研究对传统的相分离法做了不小的改进，但仍然存在不少问题，比如难挥发性凝聚剂的使用、粒径的控制及有机溶剂的残留。具有不同沸程的石油醚是一类易于挥发的有机溶剂，同时该类溶剂也被国际协调委员会(ICH)划分为三级溶剂，即被允许在药剂工业中使用的低毒性溶剂。司盘类或磷脂类油溶性乳化剂是经常用于制剂中的物质，其体内使用的安全性早已被证明。我们使用含有一定量司盘类或磷脂类油溶性乳化剂的石油醚或正己烷、正庚烷溶液代替常用的硅油作为凝聚剂来制备水溶性小分子药物、多肽蛋白类药物和疫苗的高分子微球。该法既可以得到高包埋率的小粒径微球，甚至纳米球，又可减少微球中有机溶剂的残留量。而这方面的工作至今也未见于文献报道中。
发明内容
本发明的目的是提供一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法。
首先将水溶性药物或疫苗溶解在水溶液或缓冲盐溶液中得到水相，可降解性高分子聚合物溶解在二氯甲烷或氯仿中得到油相，司盘类或磷脂类乳化剂与石油醚或正己烷、正庚烷组成的溶液作为凝聚剂或非溶剂，然后在冰浴中和以每分钟500-40000转高速搅拌下或超声波作用下将水相乳化于油相中形成油包水乳液，在500-40000转/分搅拌下将凝聚剂或非溶剂滴加于该乳液中得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液加入到石油醚中以完全固化微球，并在室温下磁力搅拌30-60分钟以提取去除油相的有机溶剂，待微球硬化后，离心分离，石油醚或正庚烷洗涤，冷冻干燥，其中，凝聚剂或非溶剂为司盘类或磷脂类乳化剂与石油醚或正己烷、正庚烷组成的溶液，司盘类或磷脂类乳化剂的浓度按重量体积比表示为0.05-20％。
本发明的优点是：
1)使用含有一定量司盘类或磷脂类油溶性乳化剂的石油醚或正己烷、正庚烷溶液代替常用的硅油作为凝聚剂，可以避免所得微球中含有硅油类毒性物质。
2)使用含有一定量司盘类或磷脂类油溶性乳化剂的石油醚或正己烷、正庚烷溶液作为凝聚剂，既可以避免制备过程中微球的团聚或聚集，又可得到很小粒径的微球；采用适当的制备工艺，可以得到纳米球。
3)使用含有一定量司盘类或磷脂类油溶性乳化剂的石油醚或正己烷、正庚烷溶液作为凝聚剂，可以有效的降低(减低10-100倍)微球中毒性有机溶剂的残留量。
4)使用含有一定量司盘类或磷脂类油溶性乳化剂的石油醚或正己烷、正庚烷溶液作为凝聚剂，可以得到高药物包埋率(75-100％)的微球，且微球收率较高(75-95％)。
具体实施方式
本发明使用含有一定量司盘类或磷脂类油溶性乳化剂的石油醚(或正己烷、的残留量，本发明采取如下措施。该法水相为溶解有药物的水溶液或缓冲盐溶液，其中药物浓度为0.01-100mg/ml。油相为溶解有聚乳酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)的二氯甲烷或氯仿溶液，其中聚合物浓度为1-200mg/ml。司盘类或磷脂类乳化剂与石油醚或正己烷、正庚烷组成的溶液作为凝聚剂，其中盘班类或磷脂类乳化剂的浓度为0.05-20％(g/ml)，凝聚剂的体积为油相体积的0.5-5倍，其滴加速度为每分钟0.5-20毫升。固化步骤中使用的石油醚或正己烷、正庚烷的体积为油相体积的1-50倍。在冰浴中和以每分钟500-40000转高速搅拌下或超声波作用下将水相乳化于油相中形成油包水乳液，在500-40000转/分搅拌下将凝聚剂(或非溶剂)滴加于该乳液中得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液加入到一定量的石油醚中，并在室温下磁力搅拌30-60分钟以提取去除油相的有机溶剂，待微球硬化后，离心分离，石油醚或正庚烷洗涤，冷冻干燥即可。
下面结合实施例作进一步详细说明。
实施例1
水相采用0.5ml浓度为50mg/ml的牛血清白蛋白(BSA，分子量为67000)的水溶液，油相为4.0ml浓度为50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为75∶25，重均分子量为45000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为粘度为1000cs的二甲基硅油，制备时将水相在2800转/分搅拌下乳化于油相中，形成的油包水初乳，在相同的搅拌速度下将5.0ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为4.0ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入50ml石油醚(沸程：60-90℃)中以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌30分钟，待微球硬化后，离心分离，石油醚洗涤，冷冻干燥即可。所得微球5-氟尿嘧啶的包埋率为88.7％，微球收率为85％，微球数均粒径为46.0μm。溶剂残留量为4.4μl/mg。
实施例2
水相采用0.5ml浓度为50mg/ml的5-氟尿嘧啶的盐酸溶液(0.1N)，油相为5.0ml浓度为50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为60∶40，重均分子量为35000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有2.5％(重量/体积)司盘20的石油醚(沸程：60-90℃)溶液，制备时将水相在超声波作用(200w，10s)下乳化于油相中，形成的油包水初乳，然后2800转/分搅拌下将10ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为5.0ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入50ml石油醚(沸程：60-90℃)中以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌30分钟，待微球硬化后，离心分离，石油醚洗涤，冷冻干燥即可。所得微球5-氟尿嘧啶包埋率为80.7％，微球收率为90％，微球数均粒径为6.0μm。溶剂残留量为0.4μl/mg。
实施例3
水相采用0.5ml浓度为10mg/ml的牛胰岛素(分子量为5800)的水溶液，油相为4.0ml浓度为50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为50∶50，重均分子量为40000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有5.0％(重量/体积)司盘20的石油醚(沸程：60-90℃)溶液，制备时将水相在4000转/分搅拌下乳化于油相中，形成的油包水初乳，在相同的搅拌速度下将10ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为10.0ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入50ml的石油醚(沸程：60-90℃)中以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌45分钟，待微球硬化后，离心分离，正庚烷洗涤，冷冻干燥即可。所得微球牛胰岛素包埋率为90.5％，微球收率为85％，微球数均粒径为4.0μm。溶剂残留量为0.15μl/mg。
实施例4
水相采用0.5ml浓度为5.0mg/ml的人绒毛膜促性腺激素(HCG，免疫活性为14000IU/mg)的磷酸缓冲盐溶液(0.1M，pH7.4)，油相为4.0ml浓度为50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为50∶50，重均分子量为30000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有10.0％(重量/体积)司盘80的石油醚(沸程：30-60℃)溶液，制备时将水相在3000转/分搅拌下乳化于油相中，形成的油包水初乳，在相同的搅拌速度下将10ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为2.0ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入50ml的石油醚(沸程：30-60℃)中以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌60分钟，待微球硬化后，离心分离，正己烷洗涤，冷冻干燥即可。所得微球HCG包埋率为90.3％，微球收率为95％，微球数均粒径为2.5μm。溶剂残留量为0.06μl/mg。
实施例5
水相采用0.5ml浓度为50mg/ml的牛血清白蛋白(BSA，Mw＝67000)的水溶液，油相为5.0ml浓度为的40mg/ml的聚(丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)(摩尔比为80∶20，重均分子量为28000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有5.0％(重量/体积)司盘80的石油醚(沸程：30-60℃)溶液，制备时将水相在2800转/分搅拌下乳化于油相中，形成的油包水初乳，在相同的搅拌速度下将12.5ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为2.5ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入100ml的石油醚(沸程：30-60℃)中以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌60分钟，待微球硬化后，离心分离，石油醚(沸程：30-60℃)洗涤，冷冻干燥即可。所得微球BSA包埋率为99.0％，微球收率为90％，微球数均粒径为8.5μm。溶剂残留量为0.1μl/mg。
实施例6
水相采用0.5ml浓度为50mg/ml的人血清白蛋白(HSA)的水溶液，油相为4.0ml浓度为的50mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为75∶25，重均分子量为38000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有10.0％(重量/体积)司盘80的石油醚(沸程：30-60℃)溶液，制备时将水相在2800转/分搅拌下乳化于油相中，形成的油包水初乳，在相同的搅拌速度下将7.5ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为7.5ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入50ml的石油醚(沸程：30-60℃)中以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌60分钟，待微球硬化后，离心分离，石油醚(沸程：30-60℃)洗涤，冷冻干燥即可。所得微球HSA包埋率为90.5％，微球收率为85％，微球数均粒径为4.5μm。溶剂残留量为0.12μl/mg。
实施例7
水相采用0.5ml浓度为50mg/ml的人血清白蛋白(HSA)的水溶液，油相为5.0ml浓度为的40mg/ml的聚(丙交酯-共-乙交酯)(摩尔比为50∶50，重均分子量为58000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有10.0％(重量/体积)司盘80的正庚烷溶液，制备时将水相在10000转/分搅拌下乳化于油相中，形成的油包水初乳，在相同的搅拌速度下将10ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为10.0ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入75ml的石油醚(沸程：30-60℃)中以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌60分钟，待微球硬化后，离心分离，正己烷洗涤，冷冻干燥即可。所得微球HSA包埋率为77.6％，微球收率为75％，微球数均粒径为500nm。溶剂残留量为0.17μl/mg。
实施例8
水相采用0.5ml破伤风杆菌疫苗的水溶液(15000IU/ml)，油相为5.0ml浓度为的50mg/ml的聚乳酸(重均分子量为36000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有0.1％(重量/体积)卵磷脂的正己烷溶液，制备时将水相在5600转/分搅拌下乳化于油相中，形成的油包水初乳，在相同的搅拌速度下将7.5ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为4.0ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入200ml的石油醚中(沸程：30-60℃)以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌60分钟，待微球硬化后，离心分离，石油醚洗涤，冷冻干燥即可。破伤风杆菌疫苗的包埋率为85.7％，微球收率为80％，微球数均粒径为3.5μm。溶剂残留量为0.12μl/mg。
实施例9
水相采用0.5ml阿霉素的水溶液(10mg/ml)，油相为4.0ml浓度为的50mg/ml的聚乳酸(重均分子量为36000)的二氯甲烷溶液，凝聚剂为含有5.0％(重量/体积)司盘80的石油醚(沸程：60-90℃)溶液，制备时将水相在超声波作用(150w，15s)下乳化于油相中，形成的油包水初乳，然后2800转/分搅拌下将10ml凝聚剂加入到该初乳中，其滴加速度为5.0ml/min，得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液在机械搅拌下加入100ml的石油醚中(沸程：60-90℃)以提取去除油相溶剂，室温下磁力搅拌30分钟，待微球硬化后，离心分离，石油醚洗涤，冷冻干燥即可。所得微球中阿霉素的包埋率为86.7％，微球收率为90％，微球数均粒径为9.5μm。溶剂残留量为0.23μl/mg。
Claims (6)
1.一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于：首先将水溶性药物或疫苗溶解在水溶液或缓冲盐溶液中得到水相，可降解性高分子聚合物溶解在二氯甲烷或氯仿中得到油相，司盘类或磷脂类乳化剂与石油醚或正己烷、正庚烷组成的溶液作为凝聚剂或非溶剂，然后在冰浴中和以每分钟500-40000转高速搅拌下或超声波作用下将水相乳化于油相中形成油包水乳液，在500-40000转/分搅拌下将凝聚剂或非溶剂滴加于该乳液中得到含有半固化微球的多相悬浮液体系，再将该悬浮液加入到石油醚中以完全固化微球，并在室温下磁力搅拌30-60分钟以提取去除油相的有机溶剂，待微球硬化后，离心分离，石油醚或正庚烷洗涤，冷冻干燥，其中，凝聚剂或非溶剂为司盘类或磷脂类乳化剂与石油醚或正己烷、正庚烷组成的溶液，司盘类或磷脂类乳化剂的浓度按重量体积比表示为0.05-20％。
2.根据权利要求1所述的一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的石油醚的沸程为30-60℃、60-90℃或90-120℃。
3.根据权利要求1所述的一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的凝聚剂或非溶剂的体积为油相体积的0.5-5倍。
4.根据权利要求1所述的一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的凝聚剂或非溶剂的滴加速度为每分钟0.5-20毫升。
5.根据权利要求1所述的一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的固化步骤中使用的石油醚的体积为油相体积的1-50倍。
6.根据权利要求1所述的一种改进的包埋水溶性药物或疫苗的高分子微球的制备方法，其特征在于所说的水溶性药物或疫苗为5-氟尿嘧啶、阿霉素、胰岛素、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人绒毛膜促性腺激素或破伤风杆菌疫苗。
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