CN1302807C - 载有胰岛素的生物降解高分子微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包裹有胰岛素的可生物降解高分子微球及其制备方法。其中90～99%为包裹用高分子材料和1～10%为胰岛素。制备方法是：先把胰岛素制成50-200nm大小纳米颗粒，然后用两种不同聚合物的混合溶液对固体胰岛素纳米颗粒进行包裹。利用在有机溶剂挥发过程中两种聚合物之间发生的相分离，实现了胰岛素纳米颗粒的双层包裹，基本消除了释放初期的药物暴释现象。

Description

载有胰岛素的生物降解高分子微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种载有胰岛素的可生物降解高分子微球及制备方法。

背景技术

糖尿病是一种世界范围的疾病，主要表现为由内分泌失调引起的糖代谢紊乱。糖尿病的发病率正在逐年上升，已成为仅次于心血管疾病和癌症的第三致死性疾病。

糖尿病有两种类型，一种是胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，也称作I型糖尿病，大多出现在儿童和青年时期，可归因于一种遗传因素，或是一种不正常的免疫机理而引起的体内几乎不产生胰岛素。另一种就是非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，也称作II型糖尿病，是经常始于中年阶段的糖尿病。病人能分泌胰岛素，但它的功能不能正常发挥。

胰岛素是治疗糖尿病，特别是胰岛素依赖型糖尿病患者的首选药。它是脊椎动物胰脏中的胰岛β细胞所分泌的一种多肽类能量代谢激素，它的生理作用是调节碳水化合物、脂类、氨基酸的代谢，加速葡萄糖、氨基酸和钾离子穿过细胞膜，引起细胞内第二信使的释放，控制酶和其它蛋白质的活动。胰岛素单体由A、B两条肽链组成，A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸，两条肽链之间由两个二硫键连接。人、猪和牛的胰岛素的基本结构相同，仅A链和B链的个别氨基酸不同。胰脏内的胰岛素以六角形的结晶形式存在，由六个胰岛素单体通过两个Zn²⁺连接而成。

由于胰岛素是一种生物活性多肽，对酸、热及酶等敏感，口服后往往被胃肠道中的酸、碱以及蛋白酶破坏或降解，因而生物利用度低，甚至失效。因此临床上以针剂的形式给药。对于多数IDDM患者需要终身用药，即使长效针剂，也需要至少每隔36小时注射一次。这样长期频繁注射胰岛素会给病人身心带来相当大的压力和痛苦，常出现皮肤红肿、痛痒、硬结及感染，以及皮下脂肪萎缩或纤维化增生等严重的副作用。

鉴于上述情况，研制使用方便、疗效确切、安全可靠的新的胰岛素给药途径，是目前国际、国内的研究热点。近年来，有不少相关的报道，例如鼻腔内、眼内、皮下胰岛素植入泵、直肠和口服胰岛素等。其中因为口服是最方便和最易于接受的，因而最为人们关注。胰岛素的口服剂型需要避免被上消化道的各种蛋白酶分解消化，还需要克服肠黏膜上皮组织的吸收屏障。目前研究主要集中在以下几个方面：

[1]脂质体

脂质体(liposome)是将药物包封于磷脂、胆固醇等类脂质为膜材形成的双分子层膜中间所制成的超微形球状体。胰岛素脂质体由两种方法制得：溶剂蒸发脱水法和溶剂成球蒸发法。通过脂质体类脂双分子层控制胰岛素的缓慢释放，同时隔绝蛋白酶对于胰岛素的破坏。脂质体作为载体可以达到保护药物生物活性，提高稳定性，增强靶向性，延缓释放，提高疗效等作用。但是用脂质体作为载体不够稳定，易于聚集融合，使被包裹的药物的吸收变得困难。人们采取一些手段来克服这一缺点：在脂质体双分子膜上加入第二种表面活性剂；用带电荷的化学物质或化学基团修饰，因电荷相斥而增加稳定性；通过共价键将构成膜的类脂分子连接起来，产生聚合膜脂质体。

[2]乳剂

目前胰岛素药物乳剂的研究主要是W/O/W型复乳和可以在消化道内乳化的微乳。其内水相中含有胰岛素和蛋白酶抑制剂，油相中含胆固醇，磷脂和游离脂肪酸，口服后药物通过油相释放很慢，且有蛋白酶抑制剂，故在肠胃中受保护，再由肠内上皮细胞吸收。

[3]聚α-氰基丙烯酸酯的胰岛素纳米胶囊

由界面乳液聚合法制备，直径小于300nm，给糖尿病老鼠口服，具有一次服用可以持续降糖20天左右的惊人效果。由于纳米颗粒能随着血液流动到身体的各个部位，所以能在体内长期将药物控制释放以保持血液中药物的浓度稳定，从而达到药物的最高疗效。其缺点是在聚合过程中引入的催化剂毒性和包裹材料不能在体内被吸收而引起的积聚问题。

[4]油相制剂

油相制剂的概念是由英国Cortecs公司的New于1997年提出的，即将亲水性的物质溶解在疏水性的溶剂中。为此，先将亲水性物质(如胰岛素)和双亲性物质分散在于水相中，双亲性分子聚集成小球，亲水的头部朝外，疏水的尾部指向球心，然后用油性的溶剂逐步取代水性的溶剂。由于分子间的相互作用总是朝向热力学最稳定的方向移动，双亲性物质亲水的头部就会逐步向亲水性分子靠近并与之结合，疏水的尾部会分散在油相中。最终在每个亲水性分子外都包裹上一层双亲性的物质。亲水性分子就以此种微团的形式溶解在油相中。

当然胰岛素的口服新剂型还有很多，但应用到治疗糖尿病的临床阶段的却很少。主要原因是口服制剂中胰岛素的生物利用度低，制剂的稳定性问题尚未解决。所以追求新的口服剂型一直是人们努力的方向。

近几年来，随着生物降解高分子研究的进展，特别是它们所具有的良好的生物相容性及可生物降解吸收性，使其在医用领域获得广泛的应用。在药物控制释放方面，用生物降解高分子作为包裹药物的载体，正成为一个新的热门研究领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种载有胰岛素的生物降解高分子微球；

本发明的另一目的是提供一种载有胰岛素的生物降解高分子微球的制备方法；

该微球具有核壳结构，核中含有纳米尺寸的胰岛素微晶，壳由可生物降解高分子材料构成；微球的直径在0.5～10μm范围；胰岛素在微球中的质量含量为1～10％。显然，这种高分子微球具有胰岛素脂质体和聚α-氰基丙烯酸酯的胰岛素纳米胶囊的优点，保护胰岛素免受消化系统中酸、碱和蛋白酶的侵袭，提高胰岛素的生物利用度，而它的稳定性比脂质体要好得多，它使用生物降解高分子作为包囊材料，将会克服聚α-氰基丙烯酸酯不能生物降解而在人体内积累的缺点。它的直径范围既适合于口服制剂，又适合于粘膜给药。

本发明用来包裹胰岛素的生物降解高分子是脂肪族聚酯，包括聚乳酸、聚(ε-己内酯)、乳酸和ε-己内酯、羟基乙酸酯的二元或三元共聚物，以及聚乳酸和聚乙二醇的嵌段共聚物、聚(ε-己内酯)和聚乙二醇的嵌段共聚物、乳酸和ε-己内酯、羟基乙酸酯的二元或三元共聚物与聚乙二醇的嵌段共聚物。它们已经证明是生物相容的，没有毒性，不引起免疫反应。改变脂肪族聚酯的组成，还可以调节生物降解的速度和药物释放的速度。

本发明除使用一般的脂肪族聚酯外，还使用聚乙二醇与脂肪族聚酯的嵌段聚合物，这些嵌段共聚物既可以是二嵌段的，也可以是三嵌段的，其中聚乙二醇嵌段的分子量，在400～5000范围。由于聚乙二醇易溶于水，这种嵌段聚合物形成胶束或微球时，聚乙二醇总处在最外层，从而赋予胶束或微球在水中的分散性，容易制成水性制剂。聚乙二醇本身的免疫原性很低，这种以聚乙二醇为外壳层的胶囊或微球，可免受人体免疫系统的侵袭，在循环系统中保留较长的时间，使药效持久。本发明使用400～5000分子量范围的聚乙二醇嵌段，目的是在脂肪族聚酯降解以后，它们能顺利地通过肾脏排出体外。

本发明所制备的包裹有胰岛素的可生物降解高分子微球的壳具有近似双层结构，分别由两种不同的生物降解高分子构成，外层聚合物的亲水性优于内层聚合物。这种结构能提高对胰岛素的包裹效率和致密程度，防止或减缓释放初期胰岛素的暴释。

本发明制备包裹有胰岛素的可生物降解高分子微球的方法，包括以下步骤：

(1)制备纳米尺寸的胰岛素微晶；

(2)将胰岛素微晶分散到生物降解高分子的溶液中，形成有机分散液；

(3)将有机分散液分散到含有稳定剂的二次蒸馏水中，制成水包油乳液；

(4)水包油乳液在室温下挥发有机溶剂；

(5)用高速离心法分离出载有胰岛素的聚合物微粒，用二次蒸馏水洗涤，除去残留的稳定剂，再冷冻干燥。

本发明不采用常见的W/O/W双乳液法制备胰岛素微球，也不采用一般的固体微粒乳液包裹法，而是采用了纳米微粒乳液包裹法。将胰岛素固体的尺寸减小到纳米尺度，既便于微胶囊的制备，使微胶囊的直径较小且均匀，胰岛素的包裹率高，又使胰岛素在胶囊内的分布均匀，使胰岛素的释放变得持续、均匀。

对于纳米微粒乳液包裹法，纳米微粒的制备至关重要。本发明中胰岛素纳米微晶的制备，利用了胰岛素的下列性质：胰岛素分子链在水溶液中的形态和尺寸在等当点附近会发生显著的变化，在等电点以下高度伸展，在等电点以上发生凝聚，形成微晶。其步骤是

(1)将胰岛素溶解在pH值调到2.4以下的二次蒸馏水中，浓度在1～50mg/100ml范围；

(2)逐滴加入NaOH溶液，调节胰岛素溶液的pH值到胰岛素的等电点以上，使胰岛素形成纳米微晶析出；

(3)离心分离胰岛素纳米微晶，冷冻干燥；

(4)离心后的清液作为溶解胰岛素的溶剂循环使用。

用这种方法制得的胰岛素微晶，粒径在50～200nm范围，见附图1，完全适合制备微胶囊的需要。由于结晶母液中仍含有相当比例的胰岛素，本发明将该母液循环使用，提高胰岛素的利用率，可达到90％以上。在上述蒸馏水或结晶母液中添加或保持适量的乳化剂，如吐温80或吐温60，将改善胰岛素结晶的效率和形态。

本发明在制备胰岛素微晶的有机分散液时，可以使用一种生物降解高分子的溶液，也可以使用两种生物降解高分子的混合溶液，使用的溶剂为二氯甲烷，高分子溶液的质量百分浓度为0.2～2％，胰岛素相对于聚合物的质量百分含量为1～10％。为了获得最佳的稳定效果，可加入适量的乳化剂，如司班80或司班60等。

在使用两种生物降解高分子的混合溶液时，选用亲水性不同的两种生物降解高分子进行搭配具有最佳的效果，其中一种选自聚乳酸、聚(ε-己内酯)、乳酸和ε-己内酯、羟基乙酸的二元或三元共聚物；另一种选自聚乳酸与聚乙二醇的嵌段共聚物、聚(ε-己内酯)与聚乙二醇的嵌段共聚物、乳酸和ε-己内酯、羟基乙酸的二元或三元共聚物与聚乙二醇的嵌段共聚物；这两种聚合物的相对质量比例为1∶0.5～1∶5。在这种情况下，水包油乳液在室温下挥发有机溶剂的过程中，两种聚合物发生相分离，亲水性差的聚合物先凝聚，亲水性好的聚合物后凝聚，从而形成双层壁结构，将纳米胰岛素微晶包裹在其中。这种双层结构，请见附图3。

本发明在将胰岛素有机分散液进一步分散到蒸馏水中，制备水包油乳液时，使用聚乙烯醇或明胶作为稳定剂，其水溶液质量浓度为1～10％；相对于有机分散液，稳定剂水溶液的用量为有机分散液体积的1～20倍。制备乳液的方法是高速搅拌乳化法或超声乳化法。具体的操作条件见相关实施例。

由本发明所制备的载有胰岛素的高分子微球的胰岛素释放行为得到了显著的改善。如附图4所示，由于采用双层包裹，大大减轻了初期的药物暴释现象，它的释放速度可以通过改变高分子材料的种类，改变高分子的分子量，改变两种聚合物之间的配比，以及通过改变其它制备条件来调节。

附图说明

图1：纳米胰岛素颗粒的透射电镜照片。

图2：包裹有胰岛素的微球的电镜照片。

图3：一些破损了的包裹有胰岛素的微球的电镜照片。

图4：双乳液法和固体粉末法制备的微球胰岛素体外释放行为的对照。(a)W/O/W双乳液法制成的微球；(b)本发明实施例2所制成的微球。

下面通过实施例对本发明提供的载有胰岛素的高分子微球及其制备方法给予进一步的说明，但它不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。

具体实施方式

实施例1：胰岛素纳米颗粒的制备

在100ml的pH＝2.6的二次蒸馏水中加入10滴吐温80，并加入20mg胰岛素，搅拌使其溶解。在搅拌下，往溶液里滴加氢氧化钠的稀溶液，中和溶液到中性，便得到胰岛素的纳米粒子溶液。在20,000rpm下离心得到胰岛素的纳米颗粒，并冷冻干燥。所得的胰岛素纳米颗粒的粒径为50-200nm，其透射电镜照片见图1。可见所得的纳米粒子都是较好的球形，其粒径在50-200nm范围。

实施例2：

将分子量为50,000的丙交酯-乙交酯共聚物(其中含丙交酯80％，乙交酯20％)50mg溶于5ml二氯甲烷，将两嵌段分子量分别为30,000和5000的聚丙交酯-聚乙二醇两嵌段共聚物(PLA-PEG)50mg溶于5ml二氯甲烷。把两溶液共混在一起，并加入4滴司班80，搅拌均匀。把10mg胰岛素纳米颗粒加入到聚合物溶液中，在10,000rpm下，高速搅拌乳化60秒，得到一悬乳液。把上述悬乳液加入到100ml含有2％聚乙烯醇的水溶液中，在8000rpm下，高速搅拌90秒，得到水包油包固体粉末乳液。然后在室温搅拌4小时，挥发溶剂，然后高速度离心分离包裹有胰岛素的微球，再用二次蒸馏水进行洗涤，将得到的微球进行冷冻干燥，得到包裹胰岛素的微球。

所得包裹有胰岛素的微球的电镜照片见图2。从中可以看出所制得的微包囊都是很好的球形，其尺寸大小在1-3μm。

包裹有胰岛素的微球的破损结构电镜照片见图3。可见所制备的微球具有核壳结构，而壳层本身又是分层的。这种分层是在溶剂挥发的过程中两种高分子发生相分离的结果。从高分子的溶解性推断，内层富含PLGA，外层富含PLA-PEG。

微球的胰岛素体外释放行为见图4(b)线。可见，同双乳液法制成的微球(图4(a)线)相比，胰岛素释放初期的暴释现象，得到了很大程度的缓解。

实施例3：

将分子量为20,000的丙交酯-乙交酯共聚物(其中含丙交酯80％，乙交酯20％)100mg溶于5ml二氯甲烷，将两嵌段分子量分别为50,000和2000的聚己内酯-聚乙二醇两嵌段共聚物(PCL-PEG)50mg溶于5ml二氯甲烷。把两溶液共混在一起，并加入5滴司班80，搅拌均匀。把15mg胰岛素纳米颗粒加入到聚合物溶液中，在10,000rpm下，高速搅拌乳化60秒，得到一悬乳液。把上述悬乳液加入到100ml含有5％明胶的水溶液中，在8000rpm下，高速搅拌90秒，得到水包油包固体粉末乳液。室温下搅拌4小时，挥发溶剂，然后高速度离心分离包裹有胰岛素的微球，再用二次蒸馏水洗涤，冷冻干燥，得到包裹胰岛素的微球。

实施例4：

将分子量为40,000的丙交酯-乙交酯共聚物(其中含丙交酯90％，乙交酯10％)50mg溶于5ml二氯甲烷，将三嵌段分子量分别为20,000-5000-20,000的聚丙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯三嵌段共聚物(PLA-PEG-PLA)50mg溶于5ml二氯甲烷。把两溶液共混在一起，并加入4滴司班80，搅拌均匀。把10mg胰岛素纳米颗粒加入到聚合物溶液中，在10,000rpm下，高速搅拌乳化60秒，得到一悬乳液。把上述悬乳液加入到100ml 3％的聚乙烯醇水溶液中，在8000rpm下，高速搅拌90秒，得到水包油包固体粉末乳液。然后在室温搅拌4小时，挥发溶剂，高速度离心分离包裹有胰岛素的微球，再用二次蒸馏水洗涤，冷冻干燥，得到包裹胰岛素的微球。

实施例5：

将分子量为20,000的丙交酯-乙交酯共聚物(其中含丙交酯80％，乙交酯20％)100mg溶于5ml二氯甲烷，将三嵌段分子量分别为10,000-5000-10,000的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯三嵌段共聚物(PCL-PEG-PCL)50mg溶于5ml二氯甲烷。把两溶液共混在一起，并加入6滴司班60，搅拌均匀。把14mg胰岛素纳米颗粒加入到聚合物溶液中，在10,000rpm下，高速搅拌乳化60秒，得到一悬乳液。把上述悬乳液加入到100ml含有2％聚乙烯醇的水溶液中，在8000rpm下，高速搅拌90秒，得到水包油包固体粉末乳液。然后在室温搅拌4小时，挥发溶剂，高速度离心分离包裹有胰岛素的微球，再用二次蒸馏水洗涤，冷冻干燥，得到包裹胰岛素的微球。

实施例6：

将两嵌段分子量分别为50,000-2000的聚己内酯一聚乙二醇两嵌段共聚物(PCL-PEG)100mg溶于10ml二氯甲烷，并加入6滴司班80，搅拌均匀。把15mg胰岛素纳米颗粒加入到聚合物溶液中，在10,000rpm下，高速搅拌乳化60秒，得到一悬乳液。把上述悬乳液加入到100ml含有5％明胶的水溶液中，在8000rpm下，高速搅拌90秒，得到水包油包固体粉末乳液。然后在室温搅拌4小时，挥发溶剂，高速度离心分离包裹有胰岛素的微球，再用二次蒸馏水洗涤，冷冻干燥，得到包裹胰岛素的微球。

Claims (6)

1、一种载有胰岛素的可生物降解高分子微球，该微球具有核壳结构，核中含有纳米尺寸的胰岛素微晶，壳层由聚乳酸、聚(ε-己内酯)、乳酸和羟基乙酸的共聚物，以及聚乳酸和聚乙二醇的嵌段共聚物、聚(ε-己内酯)和聚乙二醇的嵌段共聚物构成；微球的直径在0.5～10μm范围；胰岛素在微球中的质量百分含量为1～10％。

2、如权利要求1所述载有胰岛素的可生物降解高分子微球，其特征在于所使用的聚乙二醇的嵌段聚合物，是二嵌段聚合物或三嵌段聚合物，聚乙二醇嵌段的分子量，在400～5000范围。

3、如权利要求1所述载有胰岛素的可生物降解高分子微球，其特征在于微球的壳具有近似双层结构，使用亲水性不同的两种生物降解高分子，其中一种选自聚乳酸、聚(ε-己内酯)、乳酸和羟基乙酸的共聚物；另一种选自聚乳酸与聚乙二醇的嵌段共聚物、聚(ε-己内酯)与聚乙二醇的嵌段共聚物；这两种聚合物的相对质量比例为1∶0.5～1∶5。

4、制备权利要求1所述载有胰岛素的可生物降解高分子纳米微球的方法，制备步骤如下：

(1)使用溶解—结晶的方法制备胰岛素纳米微晶：

a)将胰岛素溶解在pH值调到2.4以下的二次蒸馏水中，浓度在1～50mg/100ml范围；

b)逐滴加入NaOH溶液，调节胰岛素溶液的pH值到胰岛素的等电点以上，使胰岛素形成纳米微晶析出；

c)离心分离胰岛素纳米微晶，冷冻干燥；

d)离心后的清液作为溶解胰岛素的溶剂循环使用；

(2)将胰岛素微晶分散到生物降解高分子的溶液中，形成有机分散液；将有机分散液分散到含有稳定剂的二次蒸馏水中，制成水包油乳液；水包油乳液的稳定剂为聚乙烯醇或明胶，其水溶液质量百分浓度为1～10％；相对于有机分散液，稳定剂水溶液的用量为有机分散液体积的1～20倍，采用高速搅拌乳化法或超声乳化法；

(3)水包油乳液在室温下挥发有机溶剂；

(4)用高速离心法分离出载有胰岛素的聚合物微粒，用二次蒸馏水洗涤，除去残留的稳定剂，再冷冻干燥。

5、权利要求1、4所述载有胰岛素的可生物降解高分子微球的制备方法，其特征在于使用的溶剂为二氯甲烷，高分子溶液的质量百分浓度为0.2～2％，胰岛素相对于聚合物的质量百分含量为1～10％。

6、权利要求4所述载有胰岛素的可生物降解高分子微球的制备方法，其特征在于将胰岛素溶解在含乳化剂的水中；乳化剂为吐温80或吐温60；乳化剂用量为在100ml水中加1滴至数滴。

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