CN109675020B - 一种口服glp-1多肽类纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种口服glp-1多肽类纳米制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种口服GLP‑1多肽类纳米制剂，按重量百分比计，包括0.1％～20％的GLP‑1多肽和10％～99.8％的辅料，所述的辅料包括多糖、含硫维生素、油脂、多聚氨基酸或两亲性高分子化合物中的一种或多种。上述口服GLP‑1多肽类纳米制剂可制成纳米粒、反相胶束、纳米制剂多糖溶液、油剂、W/O乳剂和胶囊等多种制剂，制备方法易于重复与实现，易于企业推广。本发明还公开了上述口服GLP‑1多肽类纳米制剂在制备改善II型糖尿病患者的胰岛素抵抗的药物组合物中的应用。

Description

一种口服GLP-1多肽类纳米制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种口服GLP-1多肽类纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着经济水平的提高和生活条件的改善，糖尿病的发病率和死亡率一直居高不下。糖尿病是一类由于胰岛素分泌不足或者胰岛素作用障碍引起的慢性疾病。国际糖尿病联盟统计在2017年糖尿病的患病人群已经将达到42490万人，预计在2045年糖尿病的患病人群将达到62860万人。全球的糖尿病患者中85％以上患有II型糖尿病。中国是世界上糖尿病患者人数最多的国家，而且每天增加至少1万名糖尿病患者。
艾塞那肽(Exenatide)、利鲁拉肽(Liraglutide)和索马鲁肽(Semaglutide)等GLP-1多肽类药物是最新的II型糖尿病治疗药物，不易被DPP-4酶降解，与GLP-1受体结合刺激胰岛素分泌，常用于血糖控制。
艾塞那肽为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物exendin-4的人工合成品，由39个氨基酸组成。艾塞那肽是第一个批准用于临床的GLP-1受体激动剂，是治疗II型糖尿病的首选药物之一。
2005年4月，艾塞那肽注射液被批准用于II型糖尿病的治疗。2012年1月，一周只需注射一次的艾塞那肽缓释微球(Byetta)上市，两者均可较好的控制血糖水平，而且不会引起低血糖症。
然而，艾塞那肽注射剂在体内循环时间短，需要频繁注射，且注射疼痛，导致患者顺应性较差；注射剂使用不便，需要由技术熟练的人注射，且制造过程复杂，要求一定的设备条件，生产成本高。如果可以通过口服给药，可以极大的提高患者顺应性，而且生产过程无菌要求比注射剂低，可以降低生产成本。
所以，为了扩大GLP-1多肽的临床应用，GLP-1多肽新型口服给药剂型的开发变得尤为重要。
现有文献中的GLP-1多肽类药物多采用与吸收促进剂或酶抑制剂联用，以避免胃酸及胃肠道酶类对GLP-1多肽类药物的破坏。蛋白酶抑制剂具有较强的专属性，它和胰蛋白酶形成1:1复合体，不可逆的覆盖活性部位起抑制作用。使用一定剂量的酶抑制剂与口服吸收促进剂，时常对机体有一定的毒副作用。
相对于常规口服制剂，纳米制剂结构较为稳定，聚合物组成和性质具有多样性,利用聚合物的这一特性可以制备出对pH值、温度敏感或者具有黏膜黏附性的纳米制剂，可以保持药物在胃肠道内的生物活性，具有缓控特性，可使药物缓慢释放，延长作用时间。
与常规纳米制剂水溶液相比，与多糖溶液进行配伍可进一步实现降低给药剂量达到血糖控制的目的。据有关文献报道，>300KDa的高分子量多糖提取物可减少高脂小鼠体重以及代谢障碍，其效果与脂肪组织中热发生蛋白标记物的表达增加、肠道完整性增强、肠道和全身炎症减少、胰岛素敏感性增加和脂代谢改善有关。使用纳米制剂多糖溶液，从而实现当日口服控制血糖，长期口服增强胰岛素敏感性，逆转II型糖尿病的胰岛素抵抗作用。
所以，GLP-1多肽类药物口服降血糖新剂型的开发与配伍应用，将是GLP-1多肽类药物非注射剂型研究的革命性突破，将会产生巨大的临床应用价值和商业价值。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种口服GLP-1多肽类纳米制剂及其制备方法和应用，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂在显示较佳的降血糖效果的同时，还能进一步改善II型糖尿病患者的胰岛素抵抗。
一种口服GLP-1多肽类纳米制剂，按重量百分比计，包括0.1％～20％的GLP-1多肽和10％～99.8％的辅料。
辅料和GLP-1多肽通过物理吸附结合形成口服GLP-1多肽类纳米制剂，可以保护GLP-1多肽不被胃酸与胃肠道蛋白酶的破坏，提高纳米制剂的稳定性，增强其生物相容性。
到达肠道部位后，纳米制剂崩解释放药物，辅料能与小肠粘液层进行粘附，打开细胞间的紧密连接，调控M细胞，促进肠粘膜药物的摄取和吸收，以提高药物的口服生物利用度和疗效。
优选地，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂的粒径为50～10000nm。
优选地，所述的GLP-1多肽为艾塞那肽、利拉鲁肽或索马鲁肽中的一种或多种。
所述的辅料可选自多糖、磷脂、维生素或合成高分子多聚物中的一种或多种，重均分子量为1～1000KDa。
优选地，所述的辅料包括多糖、含硫维生素、油脂、多聚氨基酸或两亲性高分子化合物中的一种或多种。所述的两亲性指同时具有亲水性和亲油性。
所述的多糖包括甲壳素类、海藻酸类、黏多糖、透明质酸等多糖及其衍生物和中草药多糖及其修饰后产物。
所述的甲壳素类包括壳聚糖、壳寡糖、季铵盐壳聚糖和羟丙基壳聚糖等。
所述的海藻酸类包括海藻酸钠、海藻酸钾和海藻酸胺等。
所述的中草药多糖包括灵芝多糖、虫草多糖和黄芪多糖等，给药浓度为30～400mg/kg。
给药浓度指的是单位质量的实验动物被给予的药物的质量。
所述的含硫维生素包括生物素和硫胺素等，优选给药浓度为0.2～4mg/kg。II型糖尿病患者通常存在硫胺素的缺乏，血浆硫胺素较健康人群下降约75％。硫胺素缺乏可引起胰岛素合成和分泌的受损，反过来胰岛素缺乏可能加重硫胺素缺乏。
所述的油脂包括中链油、大豆油、玉米油和橄榄油等。
所述的多聚氨基酸包括多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚甘氨酸和多聚丙氨酸等。
优选地，所述的两亲性高分子化合物为磷脂、两亲性双嵌段聚合物或脂肪酸多元醇酯中的一种或多种。
所述的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸等磷酸甘油酯。
所述的磷脂酰胆碱包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和二棕榈酰基卵磷脂等。
所述的两亲性双嵌段聚合物包括聚乙二醇-ε-聚己内酯共聚物、聚乙二醇-α-羧基-ε-聚己内酯共聚物(PEG-PCCL)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物和聚乙二醇氯化聚乙烯共聚物等。
所述的脂肪酸多元醇酯包括脂肪酸甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯等。
优选地，口服GLP-1多肽类纳米制剂还包括交联剂，所述的交联剂占口服GLP-1多肽类纳米制剂的重量百分比为0.1％～50％。
所述的交联剂包括蛋白交联剂、外交联剂和内交联剂等，重均分子量为100～1000Da。
所述的蛋白交联剂包括马来酰亚胺及其衍生物、戊二醛、三聚磷酸钠和三偏磷酸钠等。
所述的外交联剂包括多异氰酸酯、多元胺类、多元醇类和丙烯酸酯类等。
所述的内交联剂包括丙烯酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、二乙烯基苯、N-羟甲基丙烯酰胺和双丙酮丙烯酰胺等。
作为一优选例，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂为由多聚赖氨酸通过马来酰亚胺及其衍生物交联生物素包载GLP-1多肽形成的纳米粒制剂，含巯基的化合物有利于于肠道黏液层的半胱氨酸区通过二硫键进行结合，增强滞留和打破小肠上皮细胞的紧密连接，有利于提高口服生物利用度和提高降血糖疗效。其中，多聚赖氨酸、马来酰亚胺及其衍生物以及生物素的摩尔比为2:(0.5～1.5):(0.5～1.5)。所述的多聚赖氨酸的分子量为5～1000KDa，所述的马来酰亚胺及其衍生物包括马来酰亚胺和N一取代马来酰亚胺衍生物等。
作为一优选例，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂为由壳聚糖通过三聚磷酸钠交联海藻酸钠包载GLP-1多肽形成纳米制剂。其中，壳聚糖、三聚磷酸钠以及海藻酸钠的摩尔比为1:(0.1～0.3):(1～5)。所述的壳聚糖可以被替换为三甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖或羧甲基壳聚糖等壳聚糖衍生物。所述的壳聚糖及其衍生物的分子量范围为1～1000KDa，脱乙酰度大于85％。
作为一优选例，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂为由聚谷氨酸(γ-PGA)交联壳聚糖包载GLP-1多肽形成的纳米制剂。其中，壳聚糖与γ-PGA的摩尔比为1:(0.2～0.8)。所述的γ-PGA的分子量范围为1～100KDa。所述的壳聚糖可替换为三甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖或羧甲基壳聚糖等壳聚糖衍生物。所述的壳聚糖及其衍生物的分子量范围为1～1000KDa，脱乙酰度大于85％。
作为一优选例，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂为由聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCCL)及其类似物包载GLP-1多肽形成的反相胶束。其中，PEG-PCCL及其类似物的重量百分比为20％～90％，艾塞那肽的重量百分比为0.1％～20％。所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂中所述的PEG-PCCL及其类似物包括PEG-PLLC和PEG-PCL等，分子量范围为1～1000KDa。
上述优选例的制备方法和原理如下：将GLP-1多肽和PEG-PCCL及其类似物先溶于极性溶剂中，旋转蒸发形成薄膜，待药物均匀分散后加入非极性溶剂，药物形成极性核区，PEG-PCCL及其类似物亲水性基团朝内，疏水性基团朝外，形成与正常胶束相反结构的反相胶束。
基于上述原理，所述的PEG-PCCL及其类似物可以被替换为磷脂或表面活性剂等两亲性高分子化合物。
作为一优选例，将上述形成的反相胶束再溶于壳聚糖水溶液中形成液体型口服GLP-1多肽类纳米制剂。所述的壳聚糖与PEG-PCCL及其类似物的摩尔比为1:(0.2～0.8)。所述的壳聚糖还可以替换为三甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖或羧甲基壳聚糖等壳聚糖衍生物。所述的壳聚糖及其衍生物的分子量范围为1～1000KDa，脱乙酰度大于85％。
本发明又提供了一种所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂的制备方法，包括：将GLP-1多肽和两亲性高分子化合物溶于极性溶剂中，旋转蒸干形成薄膜，加入非极性溶剂，溶解薄膜，旋转蒸干形成反相胶束，即为口服GLP-1多肽类纳米制剂。
优选地，所述的GLP-1多肽与两亲性高分子化合物的质量比为1:1～20。
上述方法得到的口服GLP-1多肽类纳米制剂可再溶于极性溶剂、脂质载体或自微乳载体中，得到口服GLP-1多肽类纳米液体制剂。
所述的脂质载体包括大豆油、中链油、蓖麻油和花生油等油。
优选地，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂占口服GLP-1多肽类纳米液体制剂的重量百分比为1％～20％。
本发明又提供了一种所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂的制备方法，包括：
(1)将两亲性高分子化合物和GLP-1多肽溶于有机溶剂中，得到第一溶液；
(2)将两亲性高分子化合物和油脂溶于有机溶剂中，得到第二溶液；
(3)将第一溶液和第二溶液混合，旋转蒸干，得到口服GLP-1多肽类纳米制剂油溶液；所述的第一溶液中的两亲性高分子化合物与第二溶液中的两亲性高分子化合物的质量比为1：(0.1～1)，两亲性高分子化合物的总质量与油脂质量之比为1：(10～50)。
优选地，所述的两亲性高分子化合物为大豆磷脂或卵磷脂等磷脂酰胆碱。大豆磷脂或卵磷脂等磷脂酰胆碱能增强胰脏功能，修复胰脏细胞，使其分泌充足的胰岛素，降低血糖，有效地将血液中的葡萄糖运送到细胞中，从而减轻糖尿病病情。
所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇或乙腈等极性有机溶剂中的一种或多种。
可在上述方法得到的口服GLP-1多肽类纳米制剂中加入超纯水，得到口服GLP-1多肽W/O乳剂。
优选地，所述的超纯水与GLP-1多肽油溶液的比例为1～50:1。
本发明又提供了一种所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂的制备方法，包括：
(1)将辅料和交联剂溶于水溶性溶剂中，将GLP-1多肽溶于去离子水中；
(2)将GLP-1多肽溶液缓慢滴加至溶有辅料和交联剂的溶液中，冻干得到口服GLP-1多肽类纳米制剂。
可将上述口服GLP-1多肽类纳米制剂包裹于肠溶胶囊，得到GLP-1多肽纳米制剂胶囊剂。
本发明又提供了一种所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂的制备方法，包括：
(1)将辅料和交联剂分别溶于水溶性溶剂中，混合反应得到沉淀后，离心、复溶、透析、冻干得到空白载体；
(2)将空白载体溶于去离子水，加入GLP-1多肽反应10min～8h，得到口服GLP-1多肽类纳米制剂。
本发明又提供了一种口服GLP-1多肽类纳米制剂多糖溶液，通过将所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂溶解于含有中草药多糖的极性溶剂中得到。
优选地，所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂占溶液的质量浓度为1％～20％。
优选地，所述的中草药多糖占溶液的质量浓度为1％～40％。
本发明还提供了一种所述的口服GLP-1多肽类纳米制剂在制备改善II型糖尿病患者的胰岛素抵抗的药物组合物中的应用。
同现有技术相比，本发明的主要优点有：
(1)得到的口服GLP-1多肽类纳米制剂，克服了传统GLP-1多肽类药物口服生物利用度差、药效低等缺点，提高了GLP-1多肽的口服生物利用度，使其发挥较好的降血糖疗效，可应用于临床，提高了患者顺应性。
(2)得到的口服GLP-1多肽类纳米制剂可制成纳米粒、反相胶束、纳米制剂多糖溶液、油剂、W/O乳剂和胶囊等多种制剂，所述的制备方法易于重复与实现，易于企业推广。
(3)得到的口服GLP-1多肽类纳米制剂性质稳定，单次给药能有效降低当日血糖浓度，与多糖配伍使用，长期给药可有效逆转II型糖尿病的胰岛素抵抗，使血糖下降至正常水平，从而提高生活质量。
附图说明
图1为实施例1中的多聚赖氨酸、马来酰亚胺衍生物、生物素和PLL-M-B的1H-NMR图；
图2为实施例1的PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂的粒径图；
图3为实施例1的PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂的电镜照片；
图4为实施例2的CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂的电镜照片；
图5为实施例3的γ-PGA-CS-利拉鲁肽纳米制剂的粒径图与电镜照片；
图6为应用例1的PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂对Caco-2细胞的细胞毒性图；
图7为应用例2的PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂在糖尿病大鼠体内的药效学结果图；
图8为应用例3的CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂对Caco-2细胞膜流动相影响实验结果图；
图9为应用例4的CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂药物体内滞留实验结果图；
图10为应用例5的艾塞那肽油溶液和艾塞那肽W/O乳剂在糖尿病大鼠体内药效学结果图；
图11为应用例6的CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂与CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液长期降血糖实验结果图；
图12为应用例6中CS-TPP-ALG艾塞那肽纳米制剂与CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液长期降血糖后OTCC结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1多聚赖氨酸-马来酰亚胺衍生物-生物素(PLL-M-B)-艾塞那肽纳米制剂
(1)称取76.8mg多聚赖氨酸，溶于5mL无水DMF中，加入同摩尔量的EDCI，反应活化2小时。
(2)称取48.8mg生物素和33.8mg马来酰亚胺衍生物，溶于5mL DMF中。
(3)将步骤(2)得到的溶液滴加至步骤(1)的多聚赖氨酸反应液中，反应过夜，用10倍体积乙醚进行沉淀，4000rpm离心5分钟，弃去上清液，得沉淀为粗产物PLL-M-B，挥干乙醚后加少量水复溶，于Mw:8000-14000透析袋透析24小时，产物冻干后得PLL-M-B空白载体，保存于-20℃。
取10mg PLL-M-B溶于10mL去离子水中，加入2mg艾塞那肽反应过夜，得PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂。
将本实施例的多聚赖氨酸、马来酰亚胺衍生物、生物素和PLL-M-B均用DMSO作为溶剂溶解，进行1H-NMR分析。
如图1所示，1H-NMR结果表明：马来酰亚胺吡咯环上的氢的特征峰在7.0ppm处，咪唑酮环和噻吩环连接处的氢的特征峰为4.0～4.2ppm之间，PLL-M-B的核磁结果显示，除却多聚赖氨酸本身具有的特征峰所在位移，7.0ppm处出现了马来酰亚胺衍生物的特征峰，4.0～4.2ppm处出现了生物素的特征峰，证明了PLL-M-B的成功合成。
对本实施例的PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂进行粒径考察，采用MalvernZetasizer Nano ZS90系列激光粒径分析仪表征。
如图2所示，粒径分析结果表明PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂的粒径为348.4±8.5nm，PDI为0.208±0.124，纳米粒均一且分散度好。
本实施例的PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂的透射电镜表征如图3所示，结果表明纳米粒结构圆整，均一性与分散性较好。
实施例2壳聚糖-三聚磷酸钠-海藻酸钠(CS-TPP-ALG)-艾塞那肽纳米制剂及其多糖溶液
取2mg艾塞那肽溶液溶于100μL超纯水中，加入10mL 1mg/mL的壳聚糖1％醋酸水溶液，搅拌过夜，加入2mL 0.7mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，搅拌30分钟，按照CS:ALG＝5:1的比例加入0.3mg/mL的海藻酸钠溶液，搅拌60分钟，冻干得壳聚糖-三聚磷酸钠-海藻酸钠(CS-TPP-ALG)-艾塞那肽纳米制剂。
本实施例的CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂的透射电镜表征如图4所示，结果表明CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂形状圆整，粒径约300nm，粒径较为均一，分散性较好。
将上述壳聚糖-三聚磷酸钠-海藻酸钠(CS-TPP-ALG)-艾塞那肽纳米制剂溶于50mg/mL的虫草多糖水溶液中，制备得到艾塞那肽纳米制剂多糖溶液。
实施例3聚谷氨酸-壳聚糖(γ-PGA-CS)-利拉鲁肽纳米制剂
配置2mg/mL的利拉鲁肽溶液，调节pH＝7.4，取250μL加至1.2mg/mL的壳聚糖2％醋酸溶液中，在磁力搅拌下于4℃过夜，然后调节混合物的pH＝6。吸取250μL浓度为2mg/mL的γ-PGA(Mw：700KDa)水溶液加入到上述混合物中在室温下形成γ-PGA-CS-利拉鲁肽纳米制剂。4℃2000rpm离心10分钟收集γ-PGA-CS-利拉鲁肽纳米制剂，并在4℃下储存直至使用。
对本实施例的γ-PGA-CS-利拉鲁肽纳米制剂采用Malvern Zetasizer Nano ZS90系列激光粒径分析仪表征粒径，采用透射电镜表征形貌。
如图5所示，粒径分析和电镜测试结果表明γ-PGA-CS-利拉鲁肽纳米制剂粒子较为圆整，粒径约为300nm，均一性、分散性都较好。
实施例4聚乙二醇-聚己内酯-壳聚糖(PEG-PCCL-CS)-索马鲁肽纳米制剂
取35mg PEG-PCCL和7mg索马鲁肽溶于5mL丙酮中，30℃旋蒸30分钟形成薄膜，加10mL三氯甲烷溶解得到的薄膜，35℃旋蒸2小时，形成载有索马鲁肽的反相胶束。向反相胶束中加入5mL 2mg/mL的壳聚糖水溶液，反应30分钟，冻干得PEG-PCCL-CS-索马鲁肽纳米制剂。
实施例5艾塞那肽油溶液
取100mg大豆磷脂S100溶于5mL甲醇中，缓慢加入25mg艾塞那肽形成A溶液。取25mg大豆磷脂S100溶于2mL乙醇中，加入5mL Labrafac Lipophile WL 1349形成B溶液。将A溶液和B溶液混合，旋蒸1小时，挥去有机溶剂，得到艾塞那肽油溶液。
实施例6艾塞那肽W/O乳剂
取2.5mL实施例5的艾塞那肽油溶液，加入7.5mL超纯水，制备得到艾塞那肽W/O乳剂。
应用例1 PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂对Caco-2细胞的细胞毒性实验
取对数生长期的Caco-2细胞以每孔5×103个细胞的数量接种于96孔板上，在37℃，5％CO2条件下培养48h后，除去培养液，加入150μL含PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂的培养液，使得最终的PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂浓度分别为100、50、25、12.5、6、3μg/mL，然后置于培养箱内孵育4h后，每孔加入20μL 5mg/mL的四甲基偶氮唑蓝溶液，继续孵育4h后弃去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，放置在振荡器上振荡10min，使用酶标仪于570nm下测定OD值。采用以下公式计算细胞生存百分率以评价细胞毒性：
Figure BDA0001942555130000111
如图6所示，PLL-M-B空白载体、PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂和游离艾塞那肽在给药剂量低于25μg/mL时，对Caco-2细胞基本没有杀伤作用，在给药剂量高于25μg/mL时，PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂对Caco-2细胞的损伤作用较小，安全性较高。
因此，PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂较为安全。
应用例2 PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂在糖尿病大鼠体内的药效学实验
取成模的糖尿病大鼠18只分为3组，每组6只，分别标记为：空白对照组、皮下注射艾塞那肽溶液组和口服PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂溶液组，其中空白对照组不进行艾塞那肽治疗，皮下注射艾塞那肽组按照165μg/kg的给药剂量注射，口服PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂溶液组按照165μg/kg灌胃给药，定时尾尖取血测定血糖值的变化。
图7的药效学结果显示，空白对照组动物血糖在6小时内一直处于高血糖水平，皮下注射165μg/kg艾塞那肽的皮下注射艾塞那肽溶液组在3小时内血糖降至低点，后续血糖缓慢回升，并慢慢恢复至高血糖状态，口服PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂溶液组血糖在前一小时下降缓慢，后期持续下降，并在10小时以后血糖还是呈现下降趋势，但也仍处于正常血糖范围内。
由此可见，口服PLL-M-B-艾塞那肽纳米制剂具有较好的降血糖疗效。
应用例3 CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂对Caco-2细胞膜流动相影响实验
取对数生长期的Caco-2细胞以2×105个细胞/mL的密度接种在共聚焦皿中。第一周培养基每隔一天更换一次，第二周开始每天更换培养基。在37℃，5％CO2条件下培养14天后，除去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤Caco-2细胞三次，用Hoechst 33342染色30分钟，并与Dil一起温育15分钟以荧光标记细胞膜。将染色的细胞样品分成2组，空白对照组和实验组，其中实验组与CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂一起孵育。对于FRAP实验，在光漂白之前拍摄了三张图像。然后，在543nm的激光波长下使用100％透射率漂白质膜上的圆形区域。漂白后，拍摄一系列图像，并测量漂白区域中荧光强度的相应恢复。
如图8所示，相比空白对照组，实验组CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂显现出使细胞膜流动减慢的趋势，证实CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂能通过增强与细胞膜的粘附性以促进药物制剂吸收。
应用例4 CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂药物体内滞留实验
取SD大鼠，随机分为3组，分别口服PBS、游离罗丹明B(Rho)组和Rho-CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂组。其中，罗丹明B的给药浓度为1μg/mL。口服PBS的组为对照组。
在给药4小时后，空气针处死大鼠，取出大鼠的心、肝、脾、肺、肾、食管、胃、十二指肠、小肠、盲肠、大肠和直肠等主要脏器，用生理盐水洗去表面浮血，吸干，之后立刻将离体脏器置于活体成像仪中观察，曝光时间为873ms。操作过程注意避光。
如图9所示，小动物荧光成像实验显示对照组大鼠各脏器自体存在一定荧光，但是其自体荧光较弱，故可作为参考，游离罗丹明B组可以看到在结肠处荧光较强，说明药物已经代谢进入结肠部位，但由于取点为4小时，故符合机体代谢规律，CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂在小肠处具有荧光，与对照组与游离罗丹明B组相比，具有一定的滞留效果。荧光最亮处由白色箭头标出。
应用例5艾塞那肽油溶液和艾塞那肽W/O乳剂在糖尿病大鼠体内药效学实验
取成模的糖尿病大鼠24只分为4组，每组6只，分别标记为：空白对照组、皮下注射艾塞那肽组、口服艾塞那肽油溶液组和口服艾塞那肽乳剂溶液组，其中空白对照组不进行艾塞那肽治疗，皮下注射艾塞那肽组按照150μg/kg的剂量注射，口服的两组按照650μg/kg剂量灌胃给药，给药后定时尾尖取血测定其血糖值的变化。
如图10所示，油溶液和乳剂在一定程度上都体现了较好的降血糖疗效，且根据T检验发现，与空白对照组相比，都具有较为显著的差异，P<0.01，说明油溶液与乳剂具有较好的应用前景。
应用例6 CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂与CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液长期降血糖实验
取成模的糖尿病大鼠18只分为3组，每组6只，分别标记为：空白对照组、口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂、口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液组，其中空白对照组不进行艾塞那肽治疗，每日给与一定体积的PBS，口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂组，按照65μg/kg剂量灌胃给药，口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液组按照艾塞那肽剂量32.5μg/kg剂量合并虫草多糖200mg/kg剂量灌胃给药，每日给药，不限制饮食，给药前定时尾尖取血测定其血糖值的变化。
如图11所示，相对于空白对照组，一个月后口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂和口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液组大鼠的血糖都呈现了下降的趋势，且与空白对照组相比具有显著性差异。
如图12所示，给药一个月以后，通过OTCC实验发现，口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂和口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液组给与相同剂量葡萄糖之后，血糖浓度上升的较空白对照组较少且慢，说明口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂和口服CS-TPP-ALG-艾塞那肽纳米制剂多糖溶液在一定程度上对II型糖尿病的胰岛素抵抗具有一定的逆转功能，具有较好的应用前景。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

1.一种口服GLP-1多肽类纳米制剂，其特征在于，按重量百分比计，包括0.1%~20%的GLP-1多肽和10%~99.8%的辅料，所述的辅料包括油脂和两亲性高分子化合物；
所述口服GLP-1多肽类纳米制剂的制备方法包括：
（1）将两亲性高分子化合物B和GLP-1多肽溶于有机溶剂甲醇中，得到第一溶液；
（2）将两亲性高分子化合物C和油脂溶于有机溶剂乙醇中，得到第二溶液；
（3）将第一溶液和第二溶液混合，旋转蒸干，得到口服GLP-1多肽类纳米制剂油溶液；所述的第一溶液中的两亲性高分子化合物B与第二溶液中的两亲性高分子化合物C的质量比为1：0.1~1，两亲性高分子化合物B和C的总质量与油脂质量之比为1：10~50；所述的两亲性高分子化合物B和C为大豆磷脂；所述的油脂为中链油。
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