CN1172000C

CN1172000C - 一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂及其制备方法

Info

Publication number: CN1172000C
Application number: CNB02111322XA
Authority: CN
Inventors: 宋后燕; 张业民
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2002-04-10
Filing date: 2002-04-10
Publication date: 2004-10-20
Anticipated expiration: 2022-04-10
Also published as: CN1380416A

Abstract

本发明通过PCR的方法构建新型组织型纤溶酶原激活剂的基因，即去除编码天然组织型纤溶酶原激活剂分子结构中的指形区，表皮生长因子区和大部分的K₁三角区，但保留部分K₁三角区，K₂三角区和轻链区。再用酵母菌分泌表达，分离纯化，获取本发明的新型重组组织型纤溶酶原激活剂，生物活性测定证实其具有显著的纤溶活性，本发明可进一步制备新型的溶栓药物。

Description

一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂及其制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂及其制备方法。

背景技术

天然(亦称野生型)人组织型纤溶酶原激活剂(Tissue type plasminogenactivator，t-PA)，由527位氨基酸组成，是血液中纤溶系统的生理激活剂，能特异地激活纤溶酶原转变为纤溶酶。纤溶酶能溶解血栓中的纤维蛋白，从而使血栓溶解，血管再通。t-PA在临床上用于治疗急性心肌梗塞、脑梗塞、肺栓塞、肾动脉栓塞等多种血栓病的溶栓治疗，是目前比较好的溶栓药物。但其存在半衰期短、需在短时间内大量给药、价格昂贵，且会引起颅内出血等缺点(Smalling RW.Molecular biology of plasminogen activators：what are the clinicalimplications of drug design？Am J Cardiol.1996；78：2-7)。为了克服野生型t-PA的缺点，国内外致力于新型溶栓药物的开发和研究，目前已有数种基于野生型t-PA结构基础上改造而得到的t-PA突变体，如reteplase(r-PA)、TNK-tPA和n-PA等。r-PA是由t-PA中1-3位氨基酸和176-527位氨基酸拼接而成，利用基因工程技术在大肠杆菌中合成(Bode C，et al.Patency trials withreteplase(r-PA)：what do they tell us？Am J Cardiol.1996；78：9-16)。TNK-tPA是野生型t-PA的多位点突变体，即T103N、N117Q和KHRR(296-299)AAAA，该突变体在CHO细胞中表达(Stewart RJ，et al.Identification ofthe mechanism responsible for the increased fibrin specificity of TNK-tissue plasminogen activator relative to tissue plasminogen activator.JBiol Chem.2000 Apr 7；275(14)：10112-20)。n-PA缺失了野生型t-PA的F区和E区，加上N117Q，该突变体也在CHO细胞中表达(Nordt TK，et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of lanoteplase(n-PA).ThrombHaemost.1999 Sep；82 Suppl 1：121-3)。目前国内外多采用下述两种途径生产重组组织型纤溶酶原激活剂突变体：(1)在中国仓鼠卵巢CHO中表达；(2)在大肠杆菌E.coli中表达。在CHO细胞中表达，生产成本高，产品价格昂贵。而在大肠杆菌E.coli中表达，表达产物刚合成时没有活性，在必须在体外通过变性和复性使肽链重新折叠后才能具有活性，产量低且生产成本高。应用酵母表达重组蛋白，具有产量高、易纯化和以活性状态分泌等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂(Nr-PA)，其与目前国内外所报道的重组组织型纤溶酶原激活剂突变体在基因结构上均不同。另外，本发明还提供一种生产本发明新型重组组织型纤溶酶原激活剂的方法.

本发明设计了一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂分子，并通过酵母菌分泌表达，分离纯化，从而获取本发明的新型重组组织型纤溶酶原激活剂，可进一步获取新型的溶栓药物。

本发明利用甲醇营养型酵母(市售)(Pichia pastoris，亦称毕赤酵母)基因表达体系，该体系以醇氧化酶(AOX1)为启动子，新型重组组织型纤溶酶原激活剂(Nr-PA)基因经转化稳定地整合于酵母染色体上，该酵母可将有活性的表达产物直接分泌于细胞外培养上清中，而且自身的蛋白分泌却很少，从而有利于下游的纯化制备。

本发明采用下列技术方案和步骤：

(5)设计新型重组组织型纤溶酶原激活剂分子结构，去除天然组织型纤溶酶原激活剂(human tissue type plasminogen activator，t-PA)结构中1-173位氨基酸，保留174-527位氨基酸，即去除t-PA的指形区(F区)，表皮生长因子区(E区)和大部分的K₁三角区，保留部分K₁三角区，K₂三角区和轻链区(P区)。利用PCR技术，以质粒pcDNA3-tPA为模板，设计上游和下游引物进行PCR扩增，获得Nr-PA基因，然后与质粒pUC19(市售)重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证是否获得了与预先设计相符的Nr-PA基因。Nr-PA基因再与酵母表达载体pPIC9K(市售)重组，形成表达质粒pSTPA-G，表达质粒通过电转化转化酵母菌，酵母菌经筛选获得高表达的工程菌株。

(6)发酵和诱导表达：用酵母培养基扩增工程菌，诱导前用甘油溶液进行补料，到达一定的菌体浓度(OD₆₀₀约为200)后用甲醇溶液进行诱导表达。发酵参数为：温度30-32℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。

(7)以甲醇诱导酵母表达新型重组组织型纤溶酶原激活剂(Nr-PA)，表达产物以可溶的形式存在于表达上清中，工程菌发酵后离心收集上清，再通过超滤浓缩，凝胶过滤，离子交换，三步法纯化获得产品。

(8)产品经生物学活性测定，具有显著的纤溶活性。

具体实施方式

实施例：

1.Nr-PA基因的克隆及酵母表达质粒的构建：以质粒pcDNA3-tPA(含野生型t-PA分子全长序列)为模板，设计含NotI限制性核酸内切酶位点的上游和下游引物进行PCR扩增，获得Nr-PA基因，扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收，纯化后，产物经NotI限制性核酸内切酶酶解后与质粒pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实获得了与预先设计相符的新型重组组织型纤溶酶原激活剂(Nr-PA)基因。然后用NotI将Nr-PA基因切出，连接入酵母表达载体pPIC9K的相应NotI位点，目的基因与表达载体重组，获得表达质粒pSTPA-G，表达质粒转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应酶酶解鉴定，获得特征性的片段，证实获得了阳性克隆。

2.筛选高拷贝高效表达的工程菌株。

表达质粒通过电转化转化甲醇营养型酵母菌GS115，使目的基因与酵母染色体重组，用G418筛选高效表达的工程菌株，并用PCR的方法检测目的基因，检定阳性重组克隆菌，挑取上述阳性克隆菌接种于10ml低营养培养液BMG(含13.4g/L酵母氮源碱基(YNB)，4×10^-4g/L生物素，10g/L甘油，100mmol/L磷酸钾，pH 6.0)中，30℃快速振摇250r/min，至培养液中光密度OD₆₀₀＝2-6时，离心弃除BMG培液，无菌水洗涤1次，再加入BMM培液(含13.4g/L酵母氮源碱基(YNB)，4×10^-4g/L生物素，5g/L甲醇，100mmol/L磷酸钾，pH 6.0)，稀释至OD₆₀₀＝1，每天补加体积百分数为0.5％的甲醇，继续诱导培养3天，每隔12小时取样1ml，离心弃除沉淀，取培养上清液10μl，加到酪蛋白板上预先打好的孔内，测定其纤溶活性。结果表明表达产物具有显著的纤溶活性。

3.工程菌的发酵表达

按上法筛选的高拷贝高表达的工程菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵，从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，在室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划YPD平板，30℃温箱中培养2-3天，从YPD平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于10mlBMG培养液中，30℃培养过夜，此为一级种子液，再将一级种子液加入90mlBMG培液中，30℃培养直至OD₆₀₀≈6，此为二级种子液，再将二级种子液，接入5L发酵罐中自然增殖，待发酵罐中OD₆₀₀达到200左右，开始甲醇诱导，甲醇诱导30小时以后，停止发酵。离心沉淀菌体，收集上清进行纯化。发酵参数为：温度30-32℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。

4.超滤浓缩脱盐

将离心所获上清经超滤装置超滤浓缩且脱去无机盐。

5.Sephadex G-75及Q-Sepharose FF柱层析

超滤浓缩脱盐后先以Sephadex G-75凝胶过滤，然后以10倍柱体积PB缓冲液平衡Q-Sepharose FF色谱柱，凝胶过滤后溶液直接上柱，Waters色谱仪控制流速和检测蛋白峰。上样结束后，以PB缓冲液洗至基线，0-1mol/1NaCl梯度洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE法分析目的蛋白。

6.纯度鉴定及分子量测定

样品进行15％SDS-PAGE，考马斯亮兰R-250染色后，PharmaciaImagemaster VDS扫描测定纯度，分子量。目的蛋白纯度＞95％，分子量约为39KD。

7.生物活性鉴定：

(3)酪蛋白板溶圈法：

取经甲醇诱导的酵母菌培养上清液10μl，直接加到酪蛋白板上孔内，37℃湿盒过夜，观察溶圈的大小，与标准t-PA溶圈进行比较，测定表达产物的纤溶活性。结果表明，表达产物具有纤溶活性，培液中纤溶活性大于3000IU/ml。

(4)翻转板法：

SDS-PAGE分析表达产物，电泳结束以后，将凝胶分为两半，一半进行考马斯亮兰R-250染色，可见诱导后酵母菌培养上清在分子量约为39KD处有一浓集条带，另一半洗去SDS后，贴在酪蛋白凝胶板上，37℃湿盒过夜后，相当于39KD处有一明显的透亮区，即此部位的酪蛋白已降解，表明表达产物具有纤溶活性。

附图说明：

图1是本发明pcDNA3-tPA质粒图谱。

图2是本发明表达质粒pSTPA-G图谱。

图3是本发明表达质粒pSTPA-G经酶切鉴定分析图谱。

其中1：标准核酸分子量(λDNA/HindIII+EcoR I)；

2：pSTPA-G用Not I酶切所产生的片段：(1.0kb，9.3kb)；

3：pSTPA-G用EcoR I酶切所产生的片段：(0.47kb，9.8kb)

4：pSTPA-G用Xhol I和Sal I酶切所产生的片(2.5kb+3.0 kb+4.8kb)；

图4是本发明酪蛋白板溶圈法测定表达产物纤溶活性

其中1-5.t-PA标准品的纤溶活性(100IU/ml，50IU/ml，25IU/ml，12.5IU/ml，6IU/ml)

6.阴性对照品

7.工程菌酵母发酵诱导前的表达上清液

8-13.工程菌发酵诱导后1-6天的表达上清液的纤溶活性

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂及其制备方法

<130> 无

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 354

<212> PRT

<213> 重组蛋白质

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(354)

<223>

<400> 1

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phc Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn

20 25 30

Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala

35 40 45

Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly

50 55 60

Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp

65 70 75 80

Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr

85 90 95

Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala

100 105 110

Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro

115 120 125

Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile

130 135 140

Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu

145 150 155 160

Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu

165 170 175

Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp

180 185 190

Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser

195 200 205

Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro

210 215 220

Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys

245 250 255

Glu Ala llis Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His

260 265 270

Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr

275 280 285

Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp

290 295 300

Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val

305 310 315 320

Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly

325 330 335

Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met

340 345 350

Arg Pro

核苷酸序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂及其制备方法

<130> 无

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 核苷酸

<400> 1

gcggccgcct ctgagggaaa cagt 24

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 核苷酸

<400> 2

atagcggccg ctcacggtcg catgttgtca cgaat 35

Claims

1、一种新型重组组织型纤溶酶原激活剂，其特征在于去除天然t-PA多肽链中1-173位氨基酸，保留174-527位氨基酸，即去除天然t-PA的指形区(F区)，表皮生长因子区(E区)和大部分的K₁三角区，而保留部分K₁三角区，K₂三角区和轻链区(P区)。

2、权利要求1的新型重组组织型纤溶酶原激活剂的制备方法，其特征在于采用下列步骤：

(1)以质粒pcDN3-tPA为模板，设计上游和下游引物通过PCR扩增构建新型重组组织型纤溶酶原激活剂基因，与质粒pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证；

(2)新型重组组织型纤溶酶原激活剂基因与酵母菌表达质粒载体重组，构建表达质粒pSTPA-G，转化酵母菌，筛选高表达的工程菌；

(3)发酵和诱导表达：用低盐培养基扩增工程菌，菌体浓度达到OD₆₀₀为200后用甲醇溶液进行诱导表达，发酵参数为：温度30-32℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动；

(4)甲醇诱导酵母菌表达新型重组组织型纤溶酶原激活剂，工程菌发酵后，经离心，收集上清，超滤浓缩，凝胶过滤和离子交换三步法纯化，获得终产物新型重组组织型纤溶酶原激活剂。