CN1886500A - 磷酸激酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的磷酸激酶-RX50蛋白,编码RX50蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种RX50蛋白的方法。RX50蛋白可与p21和cyclin D3相互作用,并可抑制p53转录,因而可作为药物靶点筛选新药。
Description
磷酸激酶及其应用 技术领域
本发明属于生物技术和医学领域, 具体地说, 本发明涉及新的具有抗肿瘤功 能的磷酸激酶 - RX50蛋白以及编码 RX50蛋白的多核苷酸。 本发明还涉及此多核 苷酸和蛋白质的制法和用途, 以及含该 RX50蛋白的组合物。 背景技术
"高质量" 的药物靶点基因(简称药靶)是新药开发的源头。 人类基因组计划 的完成虽然为人类带来了治疗疾病的令人向往的前景, 但除大分子蛋白药外, 基 因本身并不一定是药靶。从基因到新药,这一链条仍然缺少许多必不可少的环节。 其中, 基因功能研究, 因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘, 寻找 出最重要的致病基因, 而成为确定基因能否成为药靶的关键步骤。
国外大型制药厂已发现, 单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大 量潜在药物靶点基因, 但这类基因只能被归类为 "低质量"药靶。 药物开发人员 面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从, 迫切需要大量的基因功能研究加以验 证, 才能筛选出新药开发可以依赖的 "高质量"靶点。 所以, 功能基因组学研究 蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。
在目前可以作为靶点的 5, 000个基因中, 磷酸激酶(kinase)的序列有很大的 保守性,是公认的药物筛选基因靶点,与磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶 (protease) 以及各类受体统称为一类靶点。 磷酸激酶(kinase)将 ATP或 GTP位的磷酯基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上, 催化蛋白质磷酸化。 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是 蛋白质调节其功能 /活性的一种重要方式。 如 MAPK和转录因子 CREB, Jun等, 在磷酸化状态时具有活性, 而在非磷酸化状态时没有活性; 而转录因子 Ι κ Β α等 则相反, 在磷酸化状态时没有活性, 而在非磷酸化状态时具有活性。
目前已发现的磷酸激酶的种类较多, 但已知的人磷酸激酶的种类很少。 由于 磷酸激酶与多种生理活动如细胞分裂等密切相关, 因此, 本领域迫切需要开发新 的磷酸激酶。 发明内容
本发明的目的是提供一种新的磷酸激酶 -RX50 蛋白以及其片段、 类似物和衍 生物。
本发明的另一目的是提供编码这些蛋白质的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些蛋白质的方法以及该蛋白质和编码序列的 用途。
- 1 - 确 认 本
在本发明的第一方面, 提供了一种分离的 X50蛋白, 它包含: 具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的蛋白质, 或其具有激酶活性的保守性变异蛋白质、 活性片段、 或活性衍生物。
较佳地, 该蛋白质选自下组:
(a)具有 SEQ ID NO : 2氨基酸序列的多肽;
(b)将 SEQ ID NO: 2氨基酸序列经过一个或多个(如 1-10, 较佳地 1-8个)氨基 酸残基的取代、 缺失或添加而形成的, 且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。 更 佳地, 该蛋白具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列。
在本发明的第二方面, 提供了一种分离的多核苷酸, 它编码上述的 RX50蛋 白。
较佳地, 所述的多核苷酸多核苷酸编码具有 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的 蛋白质。 更佳地, 该多核苷酸含有 SEQ ID NO: 1中 1-1353位的序列。
在本发明的第三方面, 提供了一种载体, 它含有上述编码 RX50蛋白的多核 苷酸, 以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导 的宿主细胞。
在本发明的第四方面, 提供了一种蛋白质的制备方法, 该方法包含步骤: (a)在表达条件下, 培养上述的宿主细胞;
(c)从培养物中分离出蛋白质, 所述蛋白质含有 SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。 在本发明的第五方面, 提供了一种能与上述的 RX50蛋白特异性结合的抗体。 在本发明的第六方面, 提供了一种药物组合物, 它含有安全有效量的上述的 RX50蛋白以及药学上可接受的载体。 附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案, 而不用于限定由权利要求书所界 定的本发明范围。
图 1显示了 RX50的序列分析结果。
图 2显示了 RX50与小鼠蛋白的同源性比对。
图 3显示了 RX50和内源性的 p21之间存在着相互作用。 其中, 泳道 a为对 照, 泳道 b为 RX50。
图 4显示了 RX50与 cyclin D3之间的作用。
在 293T细胞中转染 l)flag-RX50;2)flag- RX50和 HA-cyclinD3;3)flag-RX50和 myc-p21;4)flag-RX50,myc-p21和 HA-cyclinD3。 RX50和 cyclin D3之间相互结合 较弱 (*),而在 p21超量表达的情况下, RX50和 cyclin D3的相互结合变得非常强 (**)。
图 5显示了野生型和突变型 RX50的磷酸化活性。
图 6显示了 RX50对 p53转录的抑制作用。
图 7显示了 RX50对 TNF诱导的 NF-κΒ的转录活性的抑制作用。
图 8显示了所构建的 p21的不同截断体的确切位置。
图 9显示了 RX50与 p21的不同截断体的相互作用位点。 具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究, 首次分离出了新的人磷酸激酶 RX50的全 长 cDNA, 其编码含 451个氨基酸的 RX50蛋白。 RX50蛋白含有磷酸激酶的结构 域, 自身磷酸化实验证实 RX50确是磷酸激酶。 在此基础上完成了本发明。
酵母双杂交实验和免疫共沉淀实验结果证实了 RX50和 p21, RX50和 CyclinD3之间确实具有直接的相互作用,且共转染 p21可以加强 RX50和 CyclinD3 的结合。 此外, 还制备了 RX50和 p21的不同截断体, 进一步明确了 RX50和 p21 的 40aa-60aa之间有相互作用。 RX50还可抑制 p50的转录活性以及 TNF诱导的 NF-κΒ的转录活性。 , 在本发明中, 术语 "磷酸激酶 RX50" "RX50蛋白"或 "RX50多肽"可互 换使用, 都指基本上具有 RX50蛋白氨基酸序列 (SEQ ID NO:2)的多肽或 S白质。 它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的 RX50 蛋白。 这些术语还包括含有或不含有 信号肽的 RX50蛋白。
如本文所用, "分离的"是指物质从其原始环境中分离出来 (如果是天然的物 质, 原始环境即是天然环境)。 如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白质 是没有分离纯化的, 但同样的多聚核苷酸或蛋白质如从天然状态中与存在的其他 物质中分开, 则为分离纯化。
如本文所用, "分离的 RX50多肽蛋白质基本上不含天然与其相关的其它蛋 白、 脂类、 糖类或其它物质。 本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术 (尤其 是 FPLC)分离纯化出 RX50蛋白。
本发明的蛋白质可以是重组蛋白质、 天然蛋白质、 合成蛋白质, 优选重组蛋 白质。 本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物, 或是化学合成的产物, 或使用重 组技术从原核或真核宿主 (例如, 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞) 中产生。 根据重组生产方案所用的宿主, 本发明的蛋白质可以是糖基化的, 或可 以是非糖基化的。 本发明的蛋白质还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括 RX50蛋白的片段、 衍生物和类似物。 如本文所用, 术语 "片 段" 、 "衍生物"和 "类似物"是指基本上保持本发明的天然 RX50 蛋白相同的 生物学功能或活性的蛋白质。 本发明的蛋白质片段、 衍生物或类似物可以是 (i)有
一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白质, 而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的, 或 (ii)在一个或 多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白质, 或 (iii)成熟蛋白质与另一个化合物 (比 如延长蛋白质半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白质,或 (iv)附加的 氨基酸序列融合到此蛋白质序列而形成的蛋白质 (如前导序列或分泌序列或用来纯 化此蛋白质的序列或酶原序列, 或与抗原 IgG片段的形成的融合蛋白)。 根据本文 的教导, 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中, 术语 "RX50蛋白"指具有 RX50蛋白活性的 SEQ ID NO. 2序 列的蛋白质。 该术语还包括具有与 RX50蛋白相同功能的、 SEQ ID NO. 2序列的 变异形式。 这些变异形式包括 (但并不限于): 一个或多个 (通常为 1-50个, 较佳地 1-30个, 更佳地 1-20个, 最佳地 1-10个)氨基酸的缺失、 插入和 /或取代, 以及在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个 (通常为 20个以内,较佳地为 10个以内,更佳 地为 5个以内)氨基酸残基如, 在本领域中, 用性能相近或相似的氨基酸残基取代 时, 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如, 在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个 氨基酸残基也不会改变蛋白质的功能。 该术语还包括 RX50蛋白的活性片段和活 性衍生物。
该蛋白质的变异形式包括: 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突 变体、 诱导突变体、 在高或低的严紧度条件下能与 X50DNA 杂交的 DNA所编 码的蛋白质以及利用抗 RX50 蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白质。 本发明还提供 了其他蛋白质, 如包含 RX50 蛋白或其片段的融合蛋白。 除了几乎全长的蛋白质 夕卜, 本发明还包括了 RX50蛋白序列的可溶性片段。通常, 该片段具有 RX50蛋白 序列的至少约 10个连续氨基酸残基, 通常至少约 30个连续氨基酸残基, 较佳地 至少约 50个连续氨基酸残基, 更佳地至少约 80个连续氨基酸残基, 最佳地至少 约 100个连续氨基酸残基。
发明还提供 RX50蛋白的类似物。这些类似物与天然 RX50蛋白的差别可以是 氨基酸序列上的差异, 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异, 或者兼而有之。 这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。 诱导变异体可以通过各种技术得到, 如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变, 还可通过定点诱变法或其他已知分 子生物学的技术。 类似物还包括具有不同于天然 L-氨基酸残基 (如 D-氨基酸)的类 似物, 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸 (如 β、 Υ -氨基酸)的类似物。 应理 解, 本发明的蛋白质并不限于上述例举的代表性的蛋白质。
修饰 (通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如 乙酰化或羧基化。 修饰还包括糖基化, 如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步 加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。 这种修饰可以通过将蛋白质暴露于 进行糖基化的酶 (如晡乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具
有磷酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸, 磷酸丝氨酸, 磷酸苏氨酸)的序列。 还包括被 修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。
在本发明中, "RX50保守性变异蛋白质"指与 SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 相比, 有至多 10个, 较佳地至多 8个, 更佳地至多 5个, 最佳地至多 3个氨基酸 被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成蛋白质。 这些保守性变异蛋白质最 好根据表 1进行氨基酸替换而产生。 表 1
本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、基 因组 DNA或人工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码 链或非编码链。 编码成熟蛋白质的编码区序列可以与 SEQ ID ΝΟ:1所示的编码区 序列相同或者是简并的变异体。 如本文所用, "简并的变异体"在本发明中是指 编码具有 SEQ ID NO:2的蛋白质, 但与 SEQ ID ΝΟ:1所示的编码区序列有差别的 核酸序列。
编码 SEQ ID NO:2的成熟蛋白质的多核苷酸包括: 只编码成熟蛋白质的编码 序列; 成熟蛋白质的编码序列和各种附加编码序列; 成熟蛋白质的编码序列 (和任 选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语 "编码蛋白质的多核苷酸"可以是包括编码此蛋白质的多核苷酸, 也可 以是还包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体, 其编码与本发明有相同的氨基酸序列 的多肽或蛋白质的片段、 类似物和衍生物。 此多核苷酸的变异体可以是天然发生 的等位变异体或非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失 变异体和插入变异体。 如本领域所知的, 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式, 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入, 但不会从实质上改变其编码的 蛋白质的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 60%, 较佳地至少 70%, 更佳地至少 80%, 最佳地至少 90%同源性的多核苷酸。 本发明特别涉及在 严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。 在本发明中, "严格条件" 是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱, 如 0.2 X SSC, 0.1%SDS, 60 V ; 或 (2)杂交时加有变性剂, 如 50%(v/v)甲酰胺, 0.1%小牛血清 /0.1% Ficoll, 42 Ό等;或 (3)仅在两条序列之间的同源性至少在 90%以上,更好是 95%以上时才发生 杂交。 并且, 可杂交的多核苷酸编码的蛋白质与 SEQ ID NO:2所示的成熟蛋白质 有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。 如本文所用, "核酸片段" 的 长度至少含 15个核苷酸, 较好是至少 30个核苷酸, 更好是至少 50个核苷酸, 最 好是至少 100个核苷酸以上。 核酸片段可用于核酸的扩增技术 (如 PCR)以确定和 / 或分离编码 RX50蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的蛋白质和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。 本发明的 RX50核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、 重组法或 人工合成的方法获得。对于 PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列, 尤其是开放阅读框序列来设计引物, 并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已 知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板, 扩增而得到有关序列。 也可直接通过 RT-PCR的方法扩增得到有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次 PCR 扩增, 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列, 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常 是将其克隆入载体, 再转入细胞, 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。
此外, 还可用人工合成的方法来合成有关序列, 尤其是片段长度较短时。 通 常, 通过先合成多个小片段, 然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前, 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白质 (或其片段, 或其 衍生物)的 DNA序列。然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA 分子 (或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白质序列
中。
应用 PCR技术扩增 DNA/RNA的方法 (Saiki, et al. Science 1985;230:1350-1354) 被优选用于获得本发明的基因。 特别是很难从文库中得到全长的 cDNA时, 可优 选使用 ΚΑςΕ法 (RACE-cDNA末端快速扩增法), 用于 PCR的引物可根据本文所 公开的本发明的序列信息适当地选择, 并可用常规方法合成。 可用常规方法如通 过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体, 以及用本发明的载体或 X50 蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞, 以及经重组技术产生本发明所述蛋白 质的方法。
通过常规的重组 DNA技术 (Science, 1984; 224: 1431), 可利用本发明的多 聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的 RX50蛋白。 一般来说有以下步骤:
(1) .用本发明的编码 RX50蛋白的多核苷酸 (或变异体), 或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。
本发明中, RX50蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表 达载体"指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动 物细胞病毒如腺病毒、 逆转录病毒或其他载体。 在本发明中适用的载体包括但不 限于: 在细菌中表达的基于 T7的表达载体; 在哺乳动物细胞中表达的 pMSXND 表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。 总之, 只要能在宿主体 内复制和稳定, 任何质粒和载体都可以用。 表达载体的一个重要特征是通常含有 复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含 RX50蛋白编码 DNA序列和合适 的转录 /翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成 技术、体内重组技术等。所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子 上, 以指导 niRNA合成。 这些启动子的代表性例子有: 大肠杆菌的 lac或 trp启动 子; λ噬菌体 PL启动子; 真核启动子包括 CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶 启动子、 早期和晚期 SV40启动子、 反转录病毒的 LTRs和其他一些已知的可控制 基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。 表达载体还包括翻译起始用的 核糖体结合位点和转录终止子。
此外, 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因, 以提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状, 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以 及绿色荧光蛋白 (GFP), 或用于大肠杆茼的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转 化适当的宿主细胞, 以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞, 如细菌细胞; 或是低等真核细胞, 如酵母细胞; 或是高等真核细胞, 如哺乳动物细胞。 代表性例子有: 大肠杆菌, 链霉菌属; 鼠 伤寒沙门氏菌的细菌细胞; 真菌细胞如酵母; 植物细胞; 果蝇 S2或 Sf9的昆虫细 胞; CHO、 COS、 293细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时, 如果在载体中插入增强子序列 时将会使转录得到增强。 增强子是 DNA的顺式作用因子, 通常大约有 10到 300 个碱基对, 作用于启动子以增强基因的转录。 可举的例子包括在复制起始点晚期 一侧的 100到 270个碱基对的 SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子 以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细 胞。
用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主 为原核生物如大肠杆菌时, 能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获, 用 CaCI i处理, 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCl2。 如果需 要, 转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物, 可选用如下的 DNA转染 方法: 原生质体法磷酸钙共沉淀法, 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体 包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养, 表达本发明的基因所编码的蛋白质。 根 据所用的宿主细胞, 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细 胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法 (如 温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子, 将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白质可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细 胞外。 如果需要, 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和 纯化重组的蛋白质。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括 但并不限于: 常规的复性处理、用蛋白质沉淀剂处理 (盐析方法)、离心、渗透破菌、 超处理、 超离心、 分子筛层析 (凝胶过滤)、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层 析 (HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的 RX50蛋白有多方面的用途。这些用途包括 (但不限于): 用于筛选促进 或对抗 RX50蛋白功能的抗体、蛋白质或其它配体。用表达的重组 RX50蛋白筛选 蛋白质库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激 RX50蛋白功能的蛋白质分子。
另一方面, 本发明还包括对 RX50编码 DNA或是其片段编码的蛋白质具有 特异性的多克隆抗体和单克隆抗体, 尤其是单克隆抗体。 这里, "特异性"是指 抗体能结合于 RX50蛋白或片段。较佳地,指那些能与 RX50蛋白或片段结合但不 识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发明中抗体包括那些能够结合并抑 制 RX50蛋白的分子, 也包括那些并不影响 RX50蛋白功能的抗体。本发明还包括
那些能与修饰或未经修饰形式的 RX50蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体, 而且还包括具有免疫活性的抗 体片段, 如 Fab'或 (Fab)2片段; 抗体重链; 抗体轻链; 遗传工程改造的单链 Fv分 子; 或嵌合抗体, 如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。 例如, 纯化的 RX50 蛋白或者其具有抗原性的片段, 可被施用于动物以诱导多克隆抗体 的产生。 与之相似的, 表达 RX50 蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫 动物来生产抗体。 本发明的抗体也可以是单克隆抗体。 此类单克隆抗体可以利用 杂交瘤技术来制备。 本发明的各类抗体可以利用 RX50 蛋白的片段或功能区, 通 过常规免疫技术获得。 这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白质合 成仪合成。 与 RX50蛋白的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞 (例如 E. Coli) 中生产的基因产物来免疫动物而产生; 与翻译后修饰形式结合的抗体 (如糖基化或 磷酸化的蛋白或多肽), 可以用真核细胞 (例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物 来免疫动物而获得。
利用本发明 RX50蛋白, 通过各种常规筛选方法, 可筛选出与 RX50蛋白发生 相互作用的物质, 如受体、抑制剂、 激动剂或拮抗剂等。 通常, 建立适用于高通量 筛选的分子和细胞水平筛选模型并进行高通量筛选等相关研究工作。 应用 E. coli或 Bacula virus表达系统, 克隆与表达酪氨酸磷酸酯酶活性片断,分离纯化重组蛋白, 并应用这些重组酶, 建立适用于高通量筛选的分子水平筛选模型。通过对大量来源于 传统中草药的粗提物和纯化合物的筛选, 寻找有效的活性部位或纯化合物。活性指导 从有效的活性部位中分离单体。 应用高通量筛选获得小分子抑制剂, 检测对 RX50抑 制效果, 确定小分子抑制剂对 RX50的特异性。 并应用高通量筛选获得的小分子抑制 剂检测细胞水平抑制效果。
本发明 RX50蛋白及其抗体、 抑制剂、 激动剂、 或拮抗剂等, 当在治疗上进行 施用(给药)时, 可提供不同的效果。 通常, 可将这些物质配制于无毒的、 惰性的 和药学上可接受的水性载体介质中, 其中 pH通常约为 5-8, 较佳地 pH约为 6 - 8, 尽管 pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组 合物可以通过常规途径进行给药, 其中包括(但并不限于): 肌内、 腹膜内、 静脉 内 、 皮下、 皮内、 或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物, 它含有安全有效量的本发明 RX50蛋白以 及药学上可接受的载体或赋形剂。 这些组合物可用于抑制 p53 的转录活性。 这类 载体包括 (但并不限于): 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 药 物制剂应与给药方式相匹配。 本发明的药物组合物可以被制成针剂形式, 例如用 生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。 诸如片剂和 胶囊之类的药物组合物, 可通过常规方法进行制备。 药物组合物如针剂、 溶液、
片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量, 例如每天约
0.1纳克 /千克体重-约 10毫克 /千克体重。 此外, 本发明的蛋白质还可与其他治疗 剂一起使用。
使用药物组合物时, 是将安全有效量的 RX50蛋白施用于哺乳动物, 其中该 安全有效量通常至少约 1微克 /天, 而且在大多数情况下不超过约 10毫克 /千克体 重, 较佳地该剂量是约 1微克 /天-约 0.5毫克 /千克体重。 当然, 具体剂量还应考虑 给药途径、 病人健康状况等因素, 这些都是熟练医师技能范围之内的。
一种检测样品中是否存在 RX50蛋白的方法是利用 RX50蛋白的特异性抗体进 行检测,它包括:将样品与 RX50蛋白特异性抗体接触;观察是否形成抗体复合物, 形成了抗体复合物就表示样品中存在 RX50蛋白。 本发明的主要优点在于: 本发明的 RX50 是一种新的磷酸激酶, 与 p21 和 cyclin D3 有相互作用, 因此可作为药物靶点进行小分子化合物的筛选, 建立针 对 RX50的药物筛选模型, 寻找能调节 RX50激酶活性的小分子化合物, 从而提高 现有药物筛选的效率和针对性, 为肿瘤等多种疾病的诊断、 治疗带来新途径。 下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明。 应理解, 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常按照常规条件如 Sambrook等人,分子克隆:实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件, 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1、 RX50基因的筛选:
我们从已建立的由 Genbank中的 EST序列合成、没有任何功能注释或注释不 完全的 "新"基因的 cDNA文库中, 应用现代生物信息学 PFAM/Proflle模式对 磷酸激酶、 磷酸酶、 蛋白酶、 单过膜受体进行优先筛选, 预测到一个新的没有任 何功能注释的基因, 含有磷酸激酶结构域, 命名为 RX50。 实施例 2、 X50基因的获得:
为了获得 RX50基因的全长, 合成如下引物, 以常规方法抽提的人体组织混 合 RNA为模板, 通过常规 PCR方法进行扩增。
上游弓 I物: 5' ggccaatccg gccatgcacg gttactttgg ctgcaatgc 3' (SEQ ID NO:3) 下游引物: 5' ggcctctaag gcctcagtgc ttgctgtttg atagactttt gcc 3' (SEQ ID NO :4) 该对引物含有 Sf!I穿梭克隆位点、 起始密码子和终止密码子, 在该酶切位点 之间是 RX50的编码序列。
利用该对引物 PCR扩增获得了一个大小约为 1. 3kb的条带, 将此片段回收、
克隆入载体后测序得到 RX50基因的全长序列, 共 1356bp (SEQ ID NO : 1)。 实施例 3、 RX50序列分析和定位
实施例 1所克隆的 1356bp的序列中包含 RX50基因的完整编码区(第 1-1353 位),编码一个由 451个氨基酸组成的 RX50蛋白(SEQ ID NO : 2)。其中, SEQ ID N0 : 2 中第 123-146位的氨基酸 LGEGSYATVYKGKSKVNGKLVALK构成 ATP 结合位点, 第 117-401位氨基酸构成激酶结构域(图 1)。
根据 RX50的 EST信息, 将其定位于人染色体 7q21. 13。 将人 RX50进行同源 性比对, 发现与一未知功能的小鼠蛋白的同源性达 91% (图 2)。 实施例 4、 筛选与 RX50相互作用的蛋白
在本实施例中, 采用 clontech公司的 Gal4酵母双杂交系统进行筛选, 确定与 RX50具有相互作用的蛋白。方法如下: 将测序验证的 RX50基因通过 Sfil克隆位 点穿梭转移到改造过的融合质粒 pGBKT 7载体上, 以此作为诱饵 (bait), 先后通 过转化法 (transformation)和点阵法 (mating)对 Hela、淋巴和胎脑文库进行大规模的 筛选。 两种方法均获得了 p21以及 CyClinD3阳性克隆, 即酵母双杂交方法筛选出 与 RX50具有相互作用的已知蛋白 p21和 cyclinD3。
从 RX50基因核苷酸序列推导的蛋白序列看, 在其第 117-401位的氨基酸区 段,具有 Cdc2相关蛋白激酶的保守结构域。用酵母双杂交方法筛选到了 cyclinD3, 而已知 cyclin和特定的 CDK相结合, 调控细胞周期。 因此, 这提示 RX50是一个 新的与 p21调控机制相关的 CDK家族成员。
为了进一步确定与 RX50对应的特异 cydin,进一步在酵母双杂交系统验证了 RX50是否与其余的 cyclin有相互作用,包括 cyclin A, cyclin B, cyclin C, cyclin Dl, cyclin D2, cyclin El, cyclin E2, cyclin F, cyclin G, cyclin H, cyclin I, cyclin K等。 结 果表明 RX50只和 cyclinD3有相互作用,即 cyclinD3是 RX50的特异性周期蛋白。 实施例 5、 RX50的表达和用免疫共沉淀法验证 RX50与 p21, cyclin D3在哺 乳动物细胞中的相互关系
由于酵母双杂交系统本身可能产生假阳性, 因此利用免疫共沉淀技术进一步 在哺乳动物细胞中验证 RX50和 p21,cyclin D3的关系。 方法如下: 用常规方法在 pcDNA3.1(Invitrogen公司)的多克隆位点中添加 Sfil位点, 在分别将 flag-tag, myc-tag和 HA-tag引入 Sfil位点 N端, 获得分别带有上述 tag的 pcDNA3.1载体。 将 PCR扩增的 RX50(实施例 2), p21和 cydin D3基因通过 Sfil位点分别克隆入已 构建好的带有 flag-tag, myc-tag和 HA-tag的 pcDNA3.1真核表达载体。 分别利用 anti-flag,anti-myc和 anti-HA的单克隆抗体 (购自 Sigma公司), 通过 Western-blot
法检测 RX50, p21和 cyclin D3蛋白的表达情况。
结果见图 3和图 4。 从图中可以看出, Flag-RX50, myc- p21和 HA-cyclin D3 蛋白表达情况良好、 表达量稳定。
首先在 293T细胞中转染 RX50, 培养 24小时后加细胞裂解液裂解, 离心收 集上清。 用 anti-p21抗体免疫沉淀后, 共沉淀产物经 SDS-PAGE电泳后电转移至 硝酸纤维膜上,用酶标 anti-flag抗体行蛋白免疫印迹杂交,可见约 50kDa处出现特 异性杂交带,其带型与 RX50表达蛋白一致,说明该沉淀带为表达的 RX50(见图 3)。 由此可见 RX50和内源性的 p21之间存在着相互作用。
为了明确 RX50、 p21和 cyclin D3之间的关系, 将 RX50和 cyclin D3同时转 染 293T细胞。 培养 24小时后, 裂解离心收集上清。 用 anti-flag抗体和 Protein G 免疫沉淀后, 共沉淀产物经 SDS-PAGE 电泳后电转移至硝酸纤维膜上,用酶标 anti-HA抗体行蛋白免疫印迹杂交。 可以看见 RX50和 cyclin D3之间相互结合较 弱(图 4, 泳道 2)。 共转染 RX50、 cyclin D3和 p21时, 可以看见在 p21超量表达 的情况下, RX50和 cyclin D3的相互结合大大增强 (泳道 4)。这一结果提示 RX50, cyclin D3和 p21之间存在着相互作用, 形成了一个三聚体。 同时再次证明 RX50 和 p21之间存在相互作用 (泳道 3)。 实施例 6. p21的截断体的获得
为了获得 p21的不同截断体, 用起点分别对应于 p21的第 20位 aa、 第 40位 aav第 60位 aa、第 91位 aa和第 89位 aa的引物和对应于羧基端的引物,通过 PCR 扩增获得扩增产物。将所得扩增片段分别克隆入带有 myc-tag的 pcDNA3真核表达 载体得到截断体 p21-D2、 p21-D3、 p21-C和 p21-N (见图 8)。 实施例 7.用免疫共沉淀法确定 RX50与 p21在晡乳动物细胞中的相互作用区域 为了确定 RX50和 p21之间的相互作用区域, 将 RX50和 p21、 RX50和 p21-
Dl、 RX50和 p21-D2、 RX50和 p21-D3、 RX50和 p21-C、 RX50和 p21- 分别同 时转染 293T细胞。培养 24小时后,裂解离心收集上清。用 anti-myc抗体和 Protein G免疫沉淀后, 共沉淀产物经 SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维膜上,用酶标 anti-flag抗体行蛋白免疫印迹杂交。结果显示 RX50和 p21、p21-Dl、p21-D2、p21-N 之间存在着相互作用(图 9, 泳道 1, 2, 3, 6),而 RX50和 p21-D3、 p21-C之间不 存在相互作用(图 9, 泳道 4, 5)。 因此可以推断, p21与 RX50发生相互作用的区 域位于 p21的 40aa至 60aa处。
此外, 还用类似方法构建了 RX50的截断体, 免疫共沉淀法结果表明, RX的 第 115-230位为与 p21的相互作用区域。
实施例 8. RX50的磷酸化作用
在本实施例中, 通过体外自身磷酸化实验证实了 RX50确实具有激酶的磷酸 化功能。
首先用常规的定点诱变法构建了 RX50将 SEQ ID ΝΟ:1中第 436、 437位 A、 A分别置换为 G、 C , 从而获得 ATP 结合位点中第 146位 K→A 的突变型 RX50(RX50mut), 将 RX50及其突变型都构建到带有 Flag-tag的 pcDNA3真核表 达载体,转染 293T细胞。 培养 24小时后, 裂解细胞, 收集上清。 用带有 anti-flag 抗体的 Protein G免疫沉淀后, 取一半用于 Western印迹法以鉴定 RX50的表达; 另一半用激酶反应缓冲液 (20 mM Tris/HCL pH=7.4, 150 mM NaCl,10 mM MnCl2, 50μΜ ATP, 10 mM MgCl2)平衡,然后加入 ΙΟμα r-32P ATP, 于 30°C反应 30 min。 加入等体积 2 X SDS-PAGE上样缓冲液, 95 ° C变性 5 min后, 离心将样品加入 15% SDS-PAGE梯度胶电泳。 电泳完毕, 经干胶后, 压 X光片放射自显影。
结果显示 RX50具有激酶的活性, 能够自身磷酸化。 当 ATP结合位点突变之 后, 激酶的活性也消失了(图 5)。 实施例 9.研究过量表达 RX50对有关报告基因的影响
将 RX50及其突变型转染不同的哺乳动物细胞,包括常用的 293T细胞、 Jurkat 细胞、 Saos细胞和 U20S细胞。 同时共同转染以下几个与癌症和炎症相关的报告 基因。
A.p53-luciferase报告基因
B. NFAT-luciferase报告基因
C . NF-kB-luciferase报告基因
D. AP1 -luciferase报告基因
在转染 24小时后检测 luciferase酶的活性。 由于 luciferase是一种很灵敏的方 法, 容易引入实验误差, 故每组实验数据都独立重复了三次以上并求得平均值。
结果表明, RX50在 Saos细胞中对 p53的转录活性抑制了 50%以上, 而这一 活性在 RX50的 ATP结合位点突变型 (K146A)却未见到(图 6)。同样, RX50在 293T 细胞中的结果显示它对 TNF诱导的 NF-κΒ的转录活性抑制了 60%以上, 而它的 ATP结合位点突变型 (K146A)却没有抑制作用(图 7)。
这提示, RX50可能与癌症以及炎症的发生, 调控机制相关。 实施例 10
兔抗 RX50蛋白抗体的制备
取体重为 2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只。 以 lmg RX50蛋白样品(实施 例 5)加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状, 在兔颈部多点注射。 伺养半个月后, 以 lmg
RX50蛋白样品加弗氏不完全佐剂研磨成乳胶状,再在兔颈部多点注射。一个月后, 用 1. 5mgRX50蛋白样品加弗氏不完全佐剂以同样的方法加强免疫。 半个月后, 再 用 lmgRX50蛋白样品加弗氏不完全佐剂再次加强免疫。 饲养半个月后, 颈动脉取 血, 4 °C静置过夜, 2, 000转离心 3分钟。 上层血清即为兔抗 RX50蛋白抗体。
杂交结果显示, 抗 RX50蛋白抗体可与 RX50蛋白与专一性地结合。 讨论
21是细胞增殖的关键性负调控因子, 为单拷贝基因, 位于第 6号染色体短 臂上 (6P21.2), DNA长度为 85kb, 有 3个长度分别为 68, 450, 1600bp的外显子, 且其启动区内含有 P53基因结合的特有序列, 因而, P21和 P53密切相关。
P53基因是人类恶性肿瘤中最常见的基因改变, 位于 17号染色体短臂 1区 4 带, 有两种构型。 野生型 P53是抗癌基因, 正常情况下, 致突变因子引起 DNA 破坏, 迅速诱导野生型 p53, 它激活 p21的转录, 从而阻滞细胞周期于 G1期, 并 结合增殖细胞核抗株 (PCNA)而抑制 DNA复制,使破坏的 DNA在复制之前有修复 的时间; 突变型 p53则丧失了 DNA破坏后细胞周期停顿的能力,还具有促进恶性 转化的活性。 缺乏野生型 p53的肿瘤细胞不能凋亡, 维持了肿瘤细胞的生存, 也 增加了对化疗和放疗的耐药性。 p53基因突变率高达 50%以上, 在大多数的人类 癌症如白血病、 淋巴瘤、 肉瘤、 脑瘤、 乳腺癌、 胃肠道癌及肺癌等癌症中常呈失 活状态。
P21 基因作为 P53 下游中介者, 执行着 P53 基因的部分功能,
P21 (Waf/Cip/Sid)蛋白直接与 CDK 或 cyclin-CDK 复合物结合, 抑制多种 CDK (CDK2、 4、 6)的活性, 造成细胞周期休止, 使细胞有机会修复损伤的 DNA 或 DNA 复制中所产生的错误。 在多种肿瘤组织的样品中, p21 (Waf/Cip/Sid)多有蛋 白的表达降低和缺失发生。 又由于 P21基因的多态性, p21 (Waf/Cip/Sid)也存在 着非依赖 P53途径而独立参与机体细胞内的各种作用, 如参与干细胞的分化, 并 能与众多的细胞转录因子如 E2F、 C/EBP-a, 蛋白激酶 Pim、 钙调蛋白、 GADD45等 存在相互作用。
鉴于 p21和 p53的密切关系, 进一步利用报告基因系统研究了 RX50对 p53 基因功能的影响。 结果显示野生型 RX50基因能明显降低 Soas细胞中 P53基因的 活性。由于 p53基因的部分功能通过激活 p21的转录而实现,因此,可能正是 RX50 与 p21的结合抑制了 p53的部分活性。 这提示, RX50参与 p21、 p53这两个细胞 周期中关键性负调控因子的调节, 从而可能在肿瘤等多种疾病的'发生、 发展、 诊 疗中具有重要价值。
本发明还验证了 RX50和 CyclinD3之间的直接作用, 并且 p21的存在能显著 增强 RX50和 CyclinD3的结合。 细胞周期素 (Cydin)是细胞周期中的关键性蛋白,
细胞周期的最主要任务是将其基因组 DNA在 DNA合成期 (S期)完整地复制成两 份拷贝, 而后在分裂期 (M期)将这两份拷贝正确无误地分配给两个子代细胞, 分 为 Gl、 S、 G2和 M期。 Cyclin负责调控细胞周期的正常进行, 其调控作用又受 到细胞周期依赖性蛋白激酶 (Cyclin dependent kinase, CDKs), 以及 p21、 pl6等对 抗蛋白的共同作用, 如果把 CDKs比作细胞周期的油门, p21、 pl6等就是细胞周 期的刹车。 Cyclin与 CDKs形成复合物, 激活 CDKs的激酶活性, 磷酸化特定的 蛋白质, 进而再影响其下游蛋白, 参与调控细胞周期 Gl-S、 G2-M的转换。 然而, 当 DNA损伤或 DNA复制出错时, 细胞周期则被 p21、 pl6等及时中断, 阻滞细 胞周期于 G1期, 待细胞修复后, 才恢复细胞周期运转。 如果 G1-S和 G2-M这两 个关键 "关卡" 失控, 就有可能使本来应停止增殖或生理性凋亡的细胞进入细胞 周期, 从而导致组织细胞的恶性增生, 引发多种疾病, 其中最重要的莫过于肿瘤 的发生。
从 RX50基因核苷酸序列推导的蛋白序列看,在其第 117- 401位的氨基酸区段, 具有 Cdc2相关蛋白激酶的保守结构域;而我们验证了 RX50和 CyclinD3之间的直 接作用, 并且 p21的存在能显著增强 RX50和 CyclinD3的结合。 这是一个令人振 奋的结果, 从国际公认的研究成果可知, Cyclin只有和特定的 CDK结合, 形成复 合体激活 CDK的激酶活性, 才能调控细胞周期; 每一个 Cyclin都只与特定的 CM 结合。 因此, 这提示 RX50极有可能是一个尚未被发现的与 p21调控机制相关的 CDK家族的一员。 由于 CDK可能是调控细胞周期装置的核心, 新激酶 RX50可能与 细胞周期增殖、凋亡乃至肿瘤的发生密切相关。在研究明确其作用机制的情况下, 可以作为药物靶点进行小分子化合物的筛选,建立针对 RX50的药物筛选模型,寻 找能调节 RX50 激酶活性的小分子化合物, 从而提高现有药物筛选的效率和针对 性, 为肿瘤等多种疾病的诊断、 治疗带来新途径。 ,
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考, 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解, 在阅读了本发明的上述讲授内容之后, 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改, 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。
Claims (1)
- 权 利 要 求1.一种分离的蛋白质, 其特征在于, 它包含: 具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的 蛋白质, 或其具有激酶活性的保守性变异蛋白质、 活性片段、 或活性衍生物。2.如权利要求 1所述的蛋白质, 其特征在于, 该蛋白质选自下组:(a)具有 SEQ ID NO : 2氨基酸序列的多肽;(b)将 SEQ ID N0 : 2氨基酸序列经过 1-10个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而 形成的, 且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。3.—种分离的多核苷酸, 其特征在于, 它编码权利要求 1所述的蛋白。4.如权利要求 3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白质。5.如权利要求 3所述的多核苷酸, 其特征在于, 该多核苷酸含有 SEQ ID NO: 1 中 1-1353位的序列。6.—种载体, 其特征在于, 它含有权利要求 3所述的多核苷酸。7.—种遗传工程化的宿主细胞, 其特征在于, 它含有权利要求 6所述的载体。8. 一种蛋白质的制备方法, 其特征在于, 该方法包含步骤:(a)在表达条件下, 培养权利要求 7所述的宿主细胞;(c)从培养物中分离出蛋白质, 所述蛋白质含有 SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。9.一种能与权利要求 1所述的蛋白质特异性结合的抗体。10.—种药物组合物,其特征在于,它含有安全有效量的权利要求 1所述的蛋白 质以及药学上可接受的载体。
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KR20090009241A (ko) | 2006-05-18 | 2009-01-22 | 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 | 포도필로톡신류의 고분자 결합체 |
KR20090057383A (ko) * | 2006-09-15 | 2009-06-05 | 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 | 다기능성 링커를 포함하는 표적화된 고분자 전구약물 |
US20090239782A1 (en) * | 2006-10-03 | 2009-09-24 | Masaharu Nakamura | High-molecular weight conjugate of resorcinol derivatives |
CN101168594B (zh) * | 2006-10-24 | 2011-07-27 | 北京键凯科技有限公司 | 寡肽为骨架的聚乙二醇活性衍生物、其制备方法及与药物分子的结合物 |
US8334364B2 (en) | 2006-11-06 | 2012-12-18 | Nipon Kayaku Kabushiki Kaisha | High-molecular weight derivative of nucleic acid antimetabolite |
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WO2009136572A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 日本化薬株式会社 | 葉酸若しくは葉酸誘導体の高分子結合体 |
JP2011162569A (ja) * | 2008-05-23 | 2011-08-25 | Nano Career Kk | カンプトテシン高分子誘導体及びその用途 |
ITRM20080551A1 (it) * | 2008-10-15 | 2010-04-16 | Univ Catania | Derivati anfifilici del poliossietilenglicole (peg), procedimento di preparazione e loro usi nella preparazione di sistemi farmaceutici. |
EP2431403B1 (en) * | 2009-05-15 | 2016-09-28 | Nipponkayaku Kabushikikaisha | Polymer conjugate of bioactive substance having hydroxy group |
JP2013234207A (ja) * | 2010-08-31 | 2013-11-21 | Jsr Corp | 新規重合体及び新規n−カルボキシアミノ酸無水物、ならびにそれらの製造方法 |
CN103221054A (zh) | 2010-11-17 | 2013-07-24 | 日本化药株式会社 | 新的胞苷类代谢拮抗剂的高分子衍生物 |
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US9919059B2 (en) * | 2012-12-10 | 2018-03-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Multistage nanoparticle drug delivery system for the treatment of solid tumors |
US9700633B2 (en) | 2013-01-28 | 2017-07-11 | Jenkem Technology Co., Ltd., Tianjin Branch | Conjugates of water soluble polymer-amino acid oligopeptide-drug, preparation method and use thereof |
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WO2015081821A1 (zh) * | 2013-12-02 | 2015-06-11 | 北京键凯科技有限公司 | 聚乙二醇-多爪寡肽键合的雷帕霉素衍生物 |
CN107033305B (zh) * | 2017-05-20 | 2019-03-01 | 西南大学 | 一种还原性响应的两亲性蠕虫状单分子前药的制备方法 |
CN114948850B (zh) * | 2022-05-26 | 2024-02-27 | 中国药科大学 | 可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6096605A (ja) * | 1983-10-31 | 1985-05-30 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 低分子量の水溶性物質の分離方法 |
DE3730797A1 (de) * | 1987-09-14 | 1989-03-23 | Siegel Rolf | Materialien mit nicht-thrombogener oberflaeche |
US5879923A (en) * | 1995-06-26 | 1999-03-09 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Stable plasmin solution |
US5672662A (en) * | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
BR9710646A (pt) * | 1996-03-12 | 2000-01-11 | Pg Txl Co Lp | Pródrogas de paclitaxel solúveis em água. |
CN1110681C (zh) * | 1996-04-10 | 2003-06-04 | 丰田自动车株式会社 | 有色金属熔化保持炉与有色金属熔液保持炉 |
US6824766B2 (en) * | 1998-04-17 | 2004-11-30 | Enzon, Inc. | Biodegradable high molecular weight polymeric linkers and their conjugates |
US7060708B2 (en) * | 1999-03-10 | 2006-06-13 | New River Pharmaceuticals Inc. | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
US6733755B2 (en) * | 2000-02-04 | 2004-05-11 | Supratek Pharma, Inc. | Ligand for vascular endothelial growth factor receptor |
CN1376785A (zh) * | 2001-03-22 | 2002-10-30 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种多肽——硫氨焦磷酸激酶-26.73和编码这种多肽的多核苷酸 |
US6489153B1 (en) * | 2001-10-31 | 2002-12-03 | Pe Corporation (Ny) | Isolated human kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human kinase proteins, and uses thereof |
KR101057102B1 (ko) * | 2002-10-31 | 2011-08-16 | 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 | 캄프토테신의 고분자량 유도체 |
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