CN104178464A - 一种重组人血白蛋白-尿酸酶融合蛋白的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人血白蛋白-猪尿酸酶融合蛋白药物的制备。所述药物含有人血白蛋白、猪尿酸酶以及纯化标签。本融合蛋白生产制备工艺稳定，适合大规模生产。经过体外酶活性检测以及小白鼠体内初步药效学实验表明，本发明所述的重组尿酸酶具有明显的降低体内尿酸浓度的药效。

Description

一种重组人血白蛋白-尿酸酶融合蛋白的制备

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种尿酸酶的制备。具体地，利用基因重组技术，将人血白蛋白(HSA)与尿酸酶基因串联并克隆入载体，转化宿主菌，经过融合表达、纯化、制剂工艺制备，得到具有理想治疗效果的重组尿酸酶药物，用于治疗痛风、结节瘤、肾功能不全、器官移植和恶性疾病等病症中并发的高尿酸症。

背景技术

高尿酸血症不仅是痛风及相关疾病的直接原因，而且是某些肾脏和心血管疾病的独立危险因素(吴欣等，2007)。故降低血液和组织的尿酸水平是预防和治疗多种尿酸相关疾病的关键环节。人体不能合成尿酸氧化酶，因此降尿酸是长期甚至是终身治疗过程。痛风在欧洲、北美、日本等地区和国家的发病率较高。近年来，随着我国人民生活水平的提高、寿命的延长、饮食结构的改变(富含核蛋白的食物增多)、肥胖者的增加，以及对本病的重视程度加强等，痛风已不再是国人的罕见病，其患病率较15年前增长约15～30倍。不论在欧美的更发达国家还是在中国的医药界都对现有的治疗方式及效果不甚满意，急欲研究出疗效好、副作用小的短期降酸药及长期控酸药。

别嘌呤醇是至今唯一能有效减少尿酸生成、降低血及尿中尿酸的水平来治疗原发性痛风的药物，它在体内能竞争性地抑制次黄嘌呤醇的活性，使次黄嘌呤、黄嘌呤合成尿酸受阻，从而降低血尿酸的浓度。但是毒副作用主要是骨髓抑制，其引起的全血细胞减少症与用药剂量有关。使用别嘌呤醇治疗约2％的患者产生过敏反应，并且有0.4％的患者出现严重的超敏反应综合征，这种超敏反应综合征可引起危及生命的急性肾衰竭和肝衰竭，以及严重的皮肤损伤(毒性表皮坏死松懈、剥落性皮炎、多形红斑等)。而且嘌呤醇干扰用于白血病的药物和用于防止器官同种移植排斥的药物硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤的代谢，产生显著高尿酸血症，并可能引起严重的痛风或威胁肾功能，所以，肾功能不全者慎用别嘌呤药物(Schillinger，1990)。

尿酸酶可降低痛风病人体内的尿酸水平，消除痛风病人痛风性关节炎、痛风石沉积、尿酸肾结石的形成等症状。流行病学调查显示(Lee AC，1998；Bosly A，2003；Bomalaski JS，2004；Lee AC，2003；)。早在1974年(Current Rheumatology Reports2001，3：29～35)使用微生物提取的尿酸氧化酶治疗痛风，但是，由于当时使用的酶是从微生物Asperigellas flavus中提取的，纯度不高，难于控制，在使用中产生各种各样的副作用，2001年、2002年先后在欧洲和美国上市了基因重组的Asperigellas flavus尿酸氧化酶在高尿酸血症的预防和治疗(肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防)，和传统的治疗药物相比，有起效快、药效明显、副作用小、药物相互反应限制少、治疗周期短等特点。在痛风方面也有使用的报道，目前已经使用在器官移植引起的痛风治疗(Rev Rhum Engl Ed.1995May；62(5)：392-4.)，也有在其它因素引起的痛风中的使用(Annals of the Rheumatic Disease2005：64；516)。

尿酸氧化酶是一种在嘌呤代谢过程中把尿酸分解为尿囊素的酶，在尿酸氧化酶基因的调控表达下合成。为尿酸代谢的关键酶。在研究人、猿等灵长类动物的尿酸氧化酶同源c DN A序列时，发现它由4个外显子组成，在第33和187位处2个无义突变(CGA/AGA+TGA)，导致编码区提前终止，这样，人类等灵长类动物体内便不能产生尿酸氧化酶，尿酸成为嘌呤在人体内代谢的终产物(Morisaki T，2008；Safra N，2005)。尿酸生成过多或排泄过少时则出现高尿酸血症。其浓度达到最大饱和度时，则析出结晶沉积在血管壁使血管内皮细胞损害，并能直接导致血小板原生长因子的表达和血管平滑肌的增殖，使血管硬化并形成高血压。如果在肾脏则出现肾小球和小管间质病变，尿酸结石，在关节则形成痛风性关节炎(GuarnerF，2003)。富嘌呤食物摄入过多、白血病和淋巴瘤及其化疗过程所引起的嘌呤代谢增加均可使人体内尿酸水平异常升高而形成高尿酸血症，而尿酸及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性，又使得高尿酸血症成为痛风等系列疾病和肿瘤治疗中出现急性肾衰竭的直接原因(Oda Metal，2002；Baeksgaard L etal，2003)。

微生物来源的尿酸氧化酶可用于临床诊断和治疗。但微生物产酶量较低，限制了其广泛应用。通过基因重组技术高效表达酶基因是一条提高产酶量的途径。迄今为止，已有多个物种的尿酸氧化酶基因被克隆[Legoux R等，1992；Oestreicher N，1993；KoyamaY等，1996；]。在法国和意大利，已用从黄曲霉制备的尿酸酶治疗与白血病化疗有关的严重高尿酸血症达20年以上(Patte C，2001)；并且在美国，已在近年的临床试验中将所述尿酸酶运用于白血病的治疗(Goldman SC，2001，Schumacher HR，2006)。结果证明尿酸酶比别嘌啉醇起效更快(PayS，2003)。在痛风患者方面，尿酸酶应用可以阻止急性发作，并减少痛风石的体积(Vogt B，2005)由于尿酸酶对人类有着较大的应用价值，许多不同来源的尿酸酶被研究(Huang SH，etal，2004；Saeed HM，2004)。

由于聚乙二醇是一种具有较好生物相容性高分子化合物，因此目前市场上销售的尿酸酶药物多为PEG化尿酸酶。多年来的临床使用结果表明，PEG化尿酸酶制剂由于其半衰期短、药效维持时间短、热稳定性不好、具有生物制剂的副反应而促使人们研究安全性和效果更好的尿酸酶药物(Imhoff RD，2003)。

2010年9月14日，美国FDA批准了Savient制药公司药物Krystexxa(PEG化尿酸氧化酶)用于那些对常规治疗药无应答的成人痛风患者。此前，为期6个月，受试者达212名的两项临床实验结果证实，Krystexxa效果显著；但FDA同时指出，每四个人当中就有一人用药后产生较为严重的过敏反应，医师在给患者用药时应向患者分发皮质甾类药和抗组胺剂药，将类似的风险降至最低。

人血白蛋白(HSA)是人体内含量最高的蛋白质，在维持血浆渗透压和运输小分子物质等方面都有十分重要的作用。作为小分子药物的载体，白蛋白能与药物可逆性结合，从而影响药物的分布和代谢(郭宾等，2005；Harald O，2004)。血清蛋白作为理想的载体具有安全无毒、生物降解、生物相容性好等优点，同时作为人类固有蛋白长期使用不会引起免疫原性反应(Sugio S，1999；Huang BX，2004)。2005年美国FDA批准白蛋白结合紫杉醇纳米颗粒注射悬液上市(Zu YG，2009；Iwao Y etal，2009)。

发明概述

本发明将猪尿酸酶和人血白蛋白联合后与纯化标签串联，在大肠杆菌中实现表达，经过发酵、纯化、制剂等工艺，获得具有理想治疗效果的重组尿酸酶药物。本发明提供的药物制备方法可保证有效地治疗因尿酸沉积过多引发痛风性关节炎、痛风石沉积、尿酸肾结石的痛风以及其他相关疾病。

本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于治疗因尿酸过多导致的痛风的相关疾病的药物多肽及其药物组合物。

本发明的目的之二在于提供了所述多肽药物的构建及获得方法。

本发明的目的之三在于提供了能够共表达表达所述多肽药物的基因工程菌株。

本发明的目的之四在于提供了所述多肽药物的制备方法。

本发明的目的之五在于提供了所述多肽药物在治疗模型动物高尿酸症中的使用方法及疗效。

在第一方面，本发明提供了一种用于治疗高尿酸血症的药物多肽及其组合物。所述药物多肽包括主要结构蛋白尿酸酶以及人血白蛋白串联到一起所形成的多肽或药学上可接受的盐以及多肽蛋白所需要的载体。串联可以通过遗传工程方法进行，多肽药物中除了含有主要结构蛋白外，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各多肽的连接部分，不具有免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等；此外还有分子佐剂。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。

在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的治疗性药物多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式分别合成多抗原表位串联序列和分子佐剂序列，然后经过基因工程操作，将基因片段克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得重组尿酸酶多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切，连接等。核酸设计5’端和3’端均加入保护性碱基和酶切位点。

在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码药物多肽蛋白的核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的尿酸酶药物。

在第五方面，本发明提供了一种重组尿酸酶的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达药物多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续制剂工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、复性等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。

在第六方面，本发明提供了一种用于治疗高尿酸症的药物，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。配制注射用药剂可使用非赋形剂包括但不限制于磷酸盐缓冲液、水、多元醇和甘油等。用于肠胃外注射药剂的成分包括药学上可接受的注射溶液或非水剂、分散剂、悬浮液或乳剂以及现配现用的与无菌注射溶液或分散剂混合的无菌粉剂。这些制剂可以添加一些其他成分，例如防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液、抗氧化剂和稀释剂等。

在第七方面，本发明提供了第六方面所述的多肽药物的应用。药物可以通过静脉注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射或腹膜内等多种途径将尿酸酶注射到尿酸水平过高的哺乳动物体内。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书说界定的本发明范围。

图1为含有蛋白编码基因的表达载体pEVSCC-HSA-pUO示意图

图2为限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA marker，从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，泳道2为阴性对照，泳道3为BamH I和NheI双酶切片段，泳道4为未进行酶切的pEVSCC-HSA-pUO质粒，泳道5为Nhe I和Hind III双酶切片段；

图3为菌种表达和纯化后的SDS-PAGE分析结果，其中泳道1为蛋白分子量marker，从上至下依次为220kd、150kd、100kd、75kd、50kd、32kd、25kd、15kd，泳道2为诱导表达菌，泳道3为未诱导表达阴性对照菌，泳道4为纯化后的蛋白(箭头所指)；

图4为纯化蛋白WESTERNBLOT印记结果，其中泳道1为预染marker，分子量从上至下依次为165KD、105KD、76KD、64KD，泳道2为阴性对照，泳道3为纯化目的蛋白样品；

图5为PH与重组尿酸酶比活性关系曲线图；

图6为温度与重组尿酸酶比活性关系曲线图；

图7为小鼠体内重组尿酸酶药效学结果；

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本说明书的诸多变化为本领域的技术人员所熟知。

实施例一大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

将设计好的人血白蛋白HSA和猪尿酸酶(UrATe oxidase of swine，pUO)的编码基因由上海英俊生物技术公司合成，HSA基因片段两端分别设计了BamH I(5’端)和Nhe I(3’端)限制性内切酶位点，pUO基因片段两端分别设计了Nhe I(5’端)和Hind III(3’端)限制性内切酶位点。上海英俊生物技术公司把基因片段合成后克隆到pMD18T载体上，测序正确后，将含有重组质粒的大肠杆菌寄回本公司。

将含有HSA和pUO的编码基因的大肠杆菌菌株分别接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜培养，次日按照Qiagen质粒提取试剂盒使用手册提取重组质粒。将含HSA基因的质粒使用BamH I和Nhe I进行限制性内切酶处理，含猪尿酸酶的编码基因的，质粒使用Nhe I和Hind III进行限制性内切酶处理，大肠杆菌表达载体选用本公司在pBV220载体基础上自行优化构建的分泌表达载体pEVSCC，该载体使用BamH I和Hind III进行限制性内切酶处理，进行琼脂糖凝胶电泳，分别切取含目的基因片断和载体基因的胶条，再按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1∶2-3的比例将两个目的基因片断与分泌表达载体进行连接反应，反应体系15μl，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为pEVSCC-HSA-pUO(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

转化：将200μl感受态细胞置冰上融化，然后加入3μlDMSO，混匀，加入2μl链接反应液，再次混匀，置冰上30分钟，42℃45秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入2mlLB培养液，37℃，200rpm振荡培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液铺于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置30分钟，倒置于32℃恒温箱中培养12-16小时。筛选平板上的克隆，提取质粒，分别用BamH I和NheI、Nhe I和Hind III进行双酶切，含有能够分别切出与人血白蛋白(1815bp)和猪尿酸酶(925bp)基因片段大小相符的质粒的克隆，初步确定为阳性克隆见图2。

诱导表达：即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，37℃培养3小时后，加入0.2mM IPTG，30℃继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在103.5KD分子量处，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规western-blot进一步证实其表达准确性，见图3，图4；经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立及菌种保藏，菌种命名为pEVSCC-HSA-pUO/BL21(DE3，Plys)。

实施例二工程菌的发酵、纯化与制剂

发酵取生产用基础种子库菌种，开启后划种培养基(LB+Amp)平板2～3块，培养后挑取平板中典型集落8～10个，分别培养后保存，然后分别进行重组尿酸酶蛋白表达量测定，重复三次，选其中表达量最高的一份供生产制备种子液用。挑取单菌接种于试管LB液体培养基中，在摇床中32℃培养震荡12小时。将试管中的菌以1∶100的接种量接入摇瓶，32℃遥床培养至OD600＝3，即可以按10％比例接种发酵罐。发酵用培养基为改造的LB培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素，对发酵罐进行溶氧和pH值的校正，进行实罐灭菌。降温至30.0℃时，调整转数至300rpm，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为30.0±0.1℃，根据工程菌生长情况到后期可作必要的培养基成分添加，溶氧控制在30％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.2mM)诱导表达，连续诱导4个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况。

提取将收集到的菌体，每100g用提取液(10mMTris-cl pH8.0，1mM EDTA，0.1ug/ml重组溶菌酶)500ml，4-8℃温和搅拌(转速低于每分钟150转)提取30分钟。低温低速离心(3000-4000rpm)进行固液分离，上清备用，沉淀再用上述方法提取一次，合并提取上清，沉淀进入废物处理程序。

纯化提取液上清上经过，1金属螯合层析纯化：分离介质Chelating Sepharose FF，用平衡溶液I(10mMTris-HCl pH8.0，1M NaCl，20mM咪唑)充分平衡的层析柱，上样完毕后用平衡溶液再充分平衡，再用平衡溶液II(10mMTris-HCl pH8.0，20mM咪唑)平衡，然后用洗脱溶液(10mMTris-HCl pH8.0，500mM咪唑)释放目的蛋白，收集目的蛋白；2再用阴离子层析纯化：分离介质(复分离介质Q Sepharose FF，基本缓冲体系10mMTris-HCl pH8.0，0-1M NaCl线性梯度洗脱，收集目的蛋白峰；3再做酶切处理：将目的蛋白稀释到2-3mg/ml，加入CaCl2至1mM，调整溶液至pH8.0，加入重组肠激酶至0.01ug/ml，25℃作用12小时；4金属螯合层析纯化：分离介质Chelating Sepharose FF，用平衡溶液I(10mMTris-HCl pH8.0，1M NaCl，20mM咪唑)充分平衡的层析柱，上样完毕后用平衡溶液再充分平衡，收集被酶解的目的蛋白所在的穿出液，用洗脱溶液(10mMTris-HCl pH8.0，500mM咪唑)释放未被酶解的目的蛋白，收集目的蛋白储存或再酶解；5再进行疏水层析：层析介质Phenyl Sepharose High Performance，基本缓冲体系10mMTris-HCl pH8.0，1.5-0NaCl线性梯度洗脱，收集目的蛋白峰；6再进行SDS-PAGE以及WESTERNBLOT印记确定纯化产物为目标蛋白。阴离子层析纯化：分离介质(复分离介质SOURCE30Q，基本缓冲体系10mMTris-HCl pH8.0，0-1M NaCl线性梯度洗脱，收集目的蛋白峰；7进行凝胶过滤纯化：分离介质Sephacryl S-300HR，缓冲体系PBS(pH7.2)收集目的蛋白峰。8半成品检测、处理和储存：目的蛋白通过SDS-PAGE和HPLC分析，达到纯度≥98％的纯度要求，过滤除菌除热源，BCA法定量和半成品质控后冻存备用。

制剂在符合GMP标准的环境中进行制剂操作，制剂配方：rHSA-pUO10mg/ml，蔗糖10g/L，甘露醇20/L，溶媒PBS(pH7.2)，剂型：冻干粉针，冻干曲线：-35℃预冻3h，-35℃真空冻干5h，-25℃真空冻干4h，-15℃真空冻干3h，30℃真空干燥2h。成品检测合格后包装储存。

实施例三酶活性的测定

参照Koyama等(1996)的方法，在37℃，取3ml pH7.5硼酸缓冲液中溶解的120μmol/L尿酸溶液，于1cm石英比色杯中，加入适量尿酸酶溶液，充分混匀后置UV-1601PC紫外分光光度计，准确反应5min，以硼酸缓冲液做空白，在293nm处测定吸光值的减少量。活力单位定义为，该条件下1min内催化1μmol尿酸成尿囊素所需要的酶量。其计算公式为：

U/ml＝(ΔA×VT×df)/(12.6×VE)，式中：U＝每ml尿酸酶活力单位数；ΔA＝每分钟293nm波长下的光密度下降值；VT＝反应液总体积(ml)；df＝稀释倍数；12.6为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数；VE＝酶液体积(ml)。

相对活力(Relative Activity)(％)＝UE/Umax×100，式中：UE＝不同反应条件下测得的酶活力单位；Umax＝同组实验中测得的最大酶活力单位。

实施例四重组酶的最适作用pH

在尿酸酶最适反应温度条件下，分别于pH3～10缓冲体系中测定尿酸酶样品溶液的酶活力，得到pH-酶活曲线图，见图5。尿酸酶在pH7.0时的反应能力最强。pH高于或者低于7.0，尿酸酶的反应能力都会降低。可见，该重组尿酸酶的最适反应pH为7.0。

实施例五重组尿酸酶的热稳定性

尿酸酶样品溶液分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃的水浴条件下精确保温20min，冰水浴迅速冷却后，在酶最适反应条件下测定各个样品的剩余酶活性。将尿酸酶样品溶液在不同的温度下水浴精确保温20min，然后用冰水浴迅速冷却，在40℃pH7.0的反应体系中测定尿酸酶样品溶液中的剩余酶活性，得到尿酸酶温度稳定曲线图，见图6。由图可知，尿酸酶在30～50℃范围内稳定性较好，当温度超过50℃时，酶活力直线下降。

实施例六重组尿酸酶体内药效学试验

将22-25g昆明小鼠12只随即分为2组，试验组(HAS-UA)尾静脉注射无菌尿酸酶溶液(0.75U/ml)，空白对照组(NS)注射生理盐水。预给药后立即腹腔注射尿酸溶液，10min后摘眼球取血测定血清中尿酸含量。分离血清后，用磷钨酸法测定血清中的尿酸水平(按试剂盒说明书操作)。结果如图7。NS对照组小鼠体内血尿酸含量为(41.5±1.9)mg/L；尿酸酶给药组小鼠体内血尿酸含量为(8.3±5.2)mg/L，接近小鼠的正常水平约5mg/L。NS对照组和尿酸酶给药组的血尿酸含量相差很大，存在显著性差异(P＜0.01)。实验结果显示，尿酸酶使造模形成的高尿酸血症显著缓解，血尿酸含量有大幅度下降。

序列表

 

Claims (7)

1.一种用于治疗高尿酸血症的重组尿酸酶药物蛋白。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述药物蛋白序列。

3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。

5.权利要求1所述的药物蛋白，其具体核酸序列组合为：SEQ ID No.1。

6.权利要求1所述的药物蛋白，其具体氨基酸序列组合为：SEQ ID No.2

7.一种用于治疗高尿酸血症的药物，其包括权利要求6所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。