CN102703335B

CN102703335B - 一种酵母融合菌株及其发酵造纸污泥水解液得到乙醇的方法

Info

Publication number: CN102703335B
Application number: CN201110304975.XA
Authority: CN
Inventors: 朱明军; 祝智胜
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2011-10-10
Filing date: 2011-10-10
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2031-10-10
Also published as: CN102703335A

Abstract

本发明涉及一种酵母融合菌株及其发酵造纸污泥水解液得到乙醇的方法，该酵母融合菌株Saccharomycescerevisiae SHY07-1于2011年9月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2011337，具备较好的转化木糖为乙醇的能力。该酵母融合菌株发酵造纸污泥水解液得到乙醇的方法如下：以pH值3~6的造纸污泥水解液作为发酵培养基，不添加任何其他营养物质，在25-37℃下厌氧发酵24-96h，摇床的转速为100-300r/min，然后通过蒸馏可以得到乙醇。水解液中的木糖和葡萄糖能够较好的转化为乙醇。

Description

一种酵母融合菌株及其发酵造纸污泥水解液得到乙醇的方法

技术领域

本发明涉及一种菌株及其发酵方法，特别是一种酵母融合菌株及其发酵造纸污泥水解液得到乙醇的方法。

背景技术

传统乙醇发酵中酒精酵母仅仅可以将葡萄糖等己糖转化成乙醇，而对于木糖等戊糖却无法利用，这样纤维素糖化液中约30%左右的糖类就不能被转化成燃料乙醇，严重制约了纤维素燃料乙醇的产业化进程。自然界能发酵木糖产乙醇的微生物并不多，选育高效的木糖发酵菌株可有效提高对纤维素类可再生资源的利用率。工业上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能厌氧发酵葡萄糖产生酒精，且耐酒精能力较高，但不能发酵木糖产生酒精。自然界中存在的木糖发酵菌株，如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、管囊酵母(Pachysolen tannophil us)以及休哈塔假丝酵母(Candida shehatea)，多需要在微好氧条件下发酵木糖产生乙醇，其供氧条件难以精确控制，菌株的酒精耐受能力也较差，影响了其在实际生产中的应用。微生物原生质体融合技术始于20世纪70年代，由于这项技术与常规育种方法相比更容易实现基因交流和重组,，获得性状优良的杂种，因而该项技术受到了国内外广大学者的重视，已被广泛应用于育种领域。本专利通过使用原生质体融合技术，将毕赤酵母和工业酿酒酵母的优良性状融合起来，获得既能有效地厌氧发酵葡萄糖和木糖的混合液，又有较高的酒精耐受能力的酵母新菌株，为纤维素水解物特别是造纸污泥水解液的乙醇发酵奠定基础。

发明内容

本发明的目在于克服现有技术存在的上述不足，提供一株酵母融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1，该菌株能够将木糖转化为乙醇，具有较好的酒精耐受能力。

本发明的另一目的是通过利用该酵母融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1发酵造纸污泥水解液得到乙醇的方法。

本发明的酵母融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1是通过原生质体融合技术得到的一株树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)融合子，具有较好的木糖代谢能力和酒精耐受能力。并且通过长时间的在桉木抽提液中驯化而筛选得到的。本发明中所用的原生质体融合方法是传统的微生物菌种育种方法，包括原生质体的制备，原生质体的灭活以及聚乙二醇(PEG)诱导融合技术。

本发明中的酵母融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1于2011年9月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011337，保藏地址为中国武汉。该菌株的菌落质地均匀，表面光滑，边缘平整。

本发明以Saccharomyces sp.SHY07-1为发酵菌株，以pH值3～6的造纸污泥水解液作为发酵培养基，不添加任何其他营养物质，在25-37℃下厌氧发酵24-96h，摇床的转速为100-300r/min，然后通过蒸馏可以得到乙醇。

本发明通过厌氧发酵技术，提供一种利用纤维素废弃物（造纸污泥）水解液，以融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1为生产菌株，通过工艺优化发酵生产乙醇。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：（1）构建的融合菌株能够较好利用混合糖中的木糖，混合糖（10g/L纤维二糖，60g/L葡萄糖和40g/L木糖，20g/L酵母粉,10g/L蛋白胨和3g/L玉米浆）中木糖在24h内能被完全利用，乙醇浓度达到45g/L以上，且具有较好的乙醇耐受能力；（2）驯化的融合菌株能够以造纸污泥水解液为原料，无需添加营养物，无需脱毒，直接发酵得到乙醇，乙醇浓度达到40g/L以上。

附图说明

图1为融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1（CCTCC M2011337）利用混合糖液进行酒精发酵的曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1的构建和筛选

融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1的构建和筛选按照以下步骤进行：

1、单倍体细胞分离。在生孢培养基（其中按质量体积比g/ml计，醋酸钠0.82%，氯化钾1.86%，硫酸镁0.022%，葡萄糖0.1%，琼脂2%，pH6.0，115℃灭菌30min）上诱导酵母形成子囊,，用1.5%(以培养基为基准，按质量体积比g/ml计)蜗牛酶破壁后，分离由子囊孢子形成的单倍体细胞小菌落。回涂生孢培养基，培养14d以上无孢子形成的即确认为单倍体。

2、原生质体的制备。培养至对数生长期的菌体中加入0.2%(以培养基为基准，按质量体积比g/ml计)β-巯基乙醇进行预处理，处理15min后再用PB缓冲溶液（0.2mol/L Na₂HPO₄12.3ml，0.2mol/L NaH₂PO₄87.7ml,混匀，pH5.8）洗涤，加入2%(以培养基为基准，按质量体积比g/ml计)蜗牛酶-PBS溶液（在PB缓冲液中添加KCl至浓度为0.7mol/L）,振荡酶解,定时检查酶解情况。当观察到的酵母绝大多数转为原生质体时,停止酶解,离心去酶,然后用PBS溶液洗涤2次,加入PBS溶液,使菌体恢复到原来的细胞浓度。

3、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的紫外灭活。将制备好的原生质体菌液用PBS缓冲溶液稀释成10⁷个/ml,取3ml于无菌平皿中,并放置于磁力搅拌器上进行不同时间的紫外线照射处理(紫外灯的功率为30W,照射的距离为30cm),用PBS溶液进行适当稀释后涂于YEPDS（以培养基为基准，按质量体积比g/ml计，葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，15%的蔗糖，2%琼脂，115℃灭菌30min）平板上。同时以未经照射的原生质体以同样的倍数稀释后涂于YEPDS平板上,作为对照。28℃条件下避光培养2～3d,待长出菌落后,计算原生质体致死率及确定最佳诱变时间。

4、工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生质体的高温灭活。取原生质体菌悬液3mL于试管中,分别于50、60、70℃水浴维持30、40和50min,取1mL样品适当稀释后涂布于YEPDS液体培养基平板上,28℃培养3～5d,观察原生质体的灭活效果。

5、双灭活原生质体的融合及再生。将灭活的原生质体等量混合,1000r/min离心5min后,加入聚乙二醇(PEG),30℃恒温40min,用PBS离心洗涤两次,再用PBS稀释涂布于YEPDS培养基上,28℃培养5～7d,使融合子再生。

6、融合子的筛选及鉴定。将再生平板上长出的菌落接种到YEPDS培养基上,28℃培养待长出菌落后倒入10mL氯化三苯基四氮唑盐酸盐（TTC）培养基（TTC0.5g,葡萄糖5g,琼脂15g,蒸馏水1000ml，115℃灭菌30min），覆盖菌落,避光保温2h，从平板中挑出颜色较深的菌株，经活化后，以8%的接种量接种到混合糖发酵培养基中,30℃,150r/min厌氧发酵72h。发酵结束后,测定其酒精度、木糖含量等重要指标。融合子的鉴定采用酯酶同工酶法鉴定。

7、融合子的驯化。将融合子从YEPD液体培养基（以培养基为基准，按质量体积比g/ml计，葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，15℃灭菌30min）转接入混合糖培养基（以培养基为基准，按质量体积比g/ml计，葡萄糖2%，木糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，115℃灭菌30min），连续转接10天后接入桉木抽提液培养基（以培养基为基准，按质量体积比g/ml计主要成分为1%木糖，0.5%酵母膏）中，进行长时间（155天）的连续驯化。

8、融合酵母的酒精发酵。通过上述方法得到的融合菌株Saccharomyces sp.SHY07-1表现出较好的木糖代谢能力。表1是融合酵母在不同pH条件下对造纸污泥酶解液（纤维二糖7.6g/L,葡萄糖56.3g/L,木糖21.7g/L）进行酒精发酵的结果（葡萄糖、木糖、乙醇生成速率为发酵6h后取样测定值），表明融合酵母在pH5.5条件下能够较好的利用木糖。

表1

表2是融合酵母在不同温度条件下对造纸污泥酶解液进行酒精发酵的结果（葡萄糖、木糖、乙醇生成速率为发酵6h后取样测定值），表明融合酵母在35℃条件下能够较好的利用木糖。

表2

实施例2：融合酵母利用混合糖液进行酒精发酵

以模拟造纸污泥水解液的混合糖液（10g/L纤维二糖，60g/L葡萄糖和40g/L木糖，20g/L酵母粉,10g/L蛋白胨和3g/L玉米浆）进行酒精发酵。结果见附图1。由图中可以看出，葡萄糖在12h就被完全消耗，虽然木糖消耗速率比葡萄糖消耗速率慢，但是24h时木糖也被完全消耗，表明融合菌株具有良好的转化木糖的能力。发酵效率达到98.73%。发酵醪通过蒸馏，可以得到乙醇。

实施例3：融合酵母利用造纸污泥酶水解液进行酒精发酵

以pH值3～6的造纸污泥水解液作为发酵培养基，在25-37℃下厌氧发酵24-96h，摇床的转速为100-300r/min，然后通过蒸馏得到乙醇（以下仅为一种实例不用于限制本发明的实施）。

本例中以初始底物浓度为10%(g/ml，以总的碳水化合物的浓度来表示)的造纸污泥水解液作为发酵培养基(水解液中纤维二糖8.4g/L,葡萄糖71.3g/L,木糖27.3g/L;其中包含酶的添加引入的还原糖),在没有脱毒和外加营养物质补充的条件下,利用融合酵母在35℃,pH5.5,接种量为6%条件下进行酒精发酵。

由表3可知,初始底物浓度为10%的造纸污泥水解液中还原糖浓度高达107g/L,其理论乙醇浓度为53.45g/L。发酵24h后,葡萄糖浓度降低到21.3g/L,而木糖比葡萄糖同化速度慢,此时发酵液中木糖仍残留有22.7g/L；融合酵母对葡萄糖和木糖的利用率分别为70.2%、16.9%。说明融合酵母在葡萄糖/木糖混合物中生长会优先消耗葡萄糖,而木糖的消耗受到葡萄糖竞争抑制。利用融合酵母发酵96h后,产生0.42g乙醇/g总糖,乙醇生成速率为0.43g/(L·h),获得的最大的酒精浓度为41.6g/L,达到商业纤维乙醇所要求的基准浓度——40g/L；但最终的发酵效率为77.86%。结果表明融合酵母即使在没有添加营养物质和脱毒的造纸污泥水解液中也表现出较好的发酵木糖为乙醇的能力。发酵醪通过蒸馏，可以得到乙醇。

表3

综上所述，通过融合菌株发酵混合糖液、低浓度造纸污泥水解液的结果说明构建的融合菌株具有较好的代谢混合液中木糖为乙醇的能力，虽然在高难度造纸污泥水解液中木糖的代谢能力受到部分抑制，但仍然表现出较好的转化混合糖为乙醇的能力。

Claims

1.一种酵母融合菌株Saccharomyces sp. SHY07-1，于2011年9月 29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC M 2011337。

2.一种利用权利要求1所述的酵母融合菌株发酵造纸污泥水解液得到乙醇的方法，其特征在于，以pH值3~6的造纸污泥水解液作为发酵培养基，在25-37℃下厌氧发酵24-96 h，摇床的转速为100-300r/min，然后通过蒸馏得到乙醇。