CN116162557A - 一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法。所述葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，株名SAMY‑9G；保藏至中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO:M 20221520。该菌株来源于反刍动物，具有耐高温特点，更有利于其在反刍动物瘤胃环境内繁殖并发挥益生作用。本发明提供的中药微生态制剂是在以乌梅、白头翁、马齿苋、五倍子、常山和黄芪组成的中药复方为底物的发酵培养基中，接种微生物复合发酵种子液进行发酵而得，有效活菌数为10.0～20.0×10⁸cfu/mL。该制剂对于细菌、病毒、寄生虫和应激引起的反刍动物综合性腹泻治愈效果优于单一治疗细菌性腹泻的抗生素，且大大减少了中药的使用量，同时还能够提高宿主动物的生长性能、抗氧化能力和免疫力。

Description

一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态 制剂及制备方法

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，尤其涉及一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法。

背景技术

发酵中药是随着科学技术的发展而成为重要的中药炮制方法之一。中药源于天然，含有多种营养成分和天然化学成分，具有抑制胃肠道运动、抑菌、抗病毒和抗寄生虫作用。中药在微生物发酵过程中与微生物所代谢的纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等物质产生协同作用；同时，中药微生态制剂中的微生物能够刺激免疫器官的发育，提高免疫球蛋白和抗体水平，产生天然的抗菌素，增强宿主动物的免疫力。其中酵母菌是必不可少的微生物，它不仅能够为其他益生菌提供营养物质，含有动物和人体所必需的多种氨基酸、蛋白质、糖类、矿物质元素，还能够使中药发酵后产生醇类物质和特有的香味。葡萄牙棒孢酵母是在发酵过程中产生醇类和酯类物质的酵母，可以产生许多对高品质白酒至关重要的风味化合物，将其用在发酵中药中，在改善发酵中药的风味和适口性方面具有潜在的应用价值。目前常用的活性酵母菌发酵最适pH 4.0～5.0，最适温度28～30℃。

随着经济的不断发展，人们对生活质量的追求也日益增高，同时也提升了对牛羊肉相关制品的要求，反刍动物的养殖越来越受到重视。目前反刍动物腹泻已成为养殖业中经济损失较为严重的疾病。反刍动物的腹泻，特别是犊牛腹泻，在全国各地一年四季均可发生，引起腹泻的原因主要包括感染性因素和非感染性因素。感染性因素是由细菌、寄生虫、病毒等感染集体引起，非感染性因素是饲养管理不当、环境因素、应激因素的给引起。其中细菌感染性腹泻在犊牛腹泻中比例为10％～70％，大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、巴氏杆菌、魏氏梭菌等是主要的病原菌。兽医面对牛羊的腹泻大部分使用广谱抗生素类药物进行治疗，导致耐药性非常严重。同时，使用抗生素治疗腹泻的效果并不是很理想，抗生素对于病毒和环境因素造成的腹泻，使用后不但没有效果，反而使肠道正常菌群紊乱致使腹泻严重。实际上，消费者既关心自身健康，又不想回到牛羊肉奶产品供不应求的年代。因此要求动物生产既要保证质量，又要保证数量供给。面对如此两难的问题，最有效的应对措施就是要找到饲用抗生素的替代技术，既能够治疗因细菌导致的腹泻，也能治疗由病毒、寄生虫和应激刺激引起的综合性腹泻。

与此同时，开发防治反刍动物腹泻的产品，必须符合反刍动物特殊的生理特征，其瘤胃可被视为一个可供兼性厌氧的微生物大量高效生产繁殖的发酵罐，健康的反刍动物体瘤胃pH恒定在5.0～6.5之间，温度通常39℃。所选用的益生菌的最适生长温度和pH要在瘤胃环境范围内才能够有效繁殖并起到相应作用。

发明内容

为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法。本发明从动物源，特别是反刍动物的瘤胃中筛选得到一株葡萄牙棒孢酵母，该菌株的最佳生长条件为35～42℃，pH值为5.0～6.0，将其返回到宿主中能够满足反刍动物的瘤胃环境及其有效繁殖。另外，本发明提供的用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂既能够治疗因细菌导致的腹泻，也能治疗由病毒、寄生虫和应激刺激引起的综合性腹泻，效率高、见效快、无副作用，能够替代抗生素用于反刍动物养殖业。

本发明提供了一株葡萄牙棒孢酵母，该菌株的分类学命名为：葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，株名SAMY-9G；该菌株的26S rDNA序列已提交GenBank数据库，登录号为OP102543，并于2022年9月29日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏号为CCTCCNO:M 20221520。

本发明还提供了一种微生物复合发酵种子液，所述微生物复合发酵种子液由多粘类芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)SAMY-9G、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌的种子培养液按照体积比(1～2):(1～2):(0.75～1.5):(0.5～1):(0.5～1)混合而成，所述各菌种的种子培养液有效活菌数分别为5～10×10⁸cfu/mL。

本发明还提供了一种防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的制备方法，包括在以中药复方为底物的发酵培养基中，接种上述微生物复合发酵种子液进行发酵，所得发酵液即为防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂；其中，所述中药复方由以下重量份的原料制成：乌梅30～50份、白头翁10～20份、马齿苋15～30份、五倍子10～20份、常山1～5份、黄芪5～10份。

进一步的，所述发酵培养基为红糖50～100g/L、蔗糖10～50g/L、蜂蜜10～50g/L、酵母粉5～20g/L、磷酸氢二钾1～5g/L、乙酸钠1～5g/L、硫酸镁0.1～1g/L、L-半胱氨酸0.1～1g/L、Tween800.1～1g/L、硫酸锰0.05～0.3g/L、碳酸钙0.1～3g/L；pH 5.5～7.2。

进一步的，所述中药复方原料为粉剂；在以中药复方为底物的发酵培养基中，中药复方原料与水的质量比为1:2～3；在接种前，以中药复方为底物的发酵培养基经110～120℃高温灭菌30～40min，冷却至35～45℃。

进一步的，所述接种为按接种量5～10％无菌接种上述微生物复合发酵种子液。

进一步的，所述发酵过程为35～42℃下培养2～4天，维持pH值5.5～7.2，罐压0.1MPa。所述发酵过程采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：红糖、蔗糖；氮源为：酵母粉；培养过程包括两个阶段：

a.有氧培养阶段：起始24～48小时内，维持通气量60～180m³/h，间隔通气，搅拌转速130～180r/min，温度35～42℃；

b.厌氧培养阶段：48～96h，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，温度35～42℃。

本发明还提供了一种防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂。该中药微生态制剂可制备的剂型，包括散剂、颗粒剂、粉剂或溶液剂。

进一步地，所述中药微生态制剂总有效活菌数为10.0～20.0×10⁸cfu/mL。

本发明的有益效果为：

(1)本发明中，葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)SAMY-9G在生长过程中会产生碳源和氮源等营养成分，多粘类芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌利用葡萄牙棒孢酵母生长产生的营养成份和培养基中提供的生产基质快速繁殖，代谢产生的纤维素酶等酶类迅速分解转化中药复方中的纤维素、木质素、糖类和蛋白质等物质，同时形成厌氧环境供罗伊氏乳杆菌和丁酸梭菌生长。上述益生菌定殖到反刍动物体内能够快速繁殖，进一步改善瘤胃微生态环境、稳定瘤胃pH、维护瘤胃的厌氧环境。中药复方经该功能复合菌剂发酵后的抑菌能力是发酵的1.5～3倍，并且具有反刍动物喜好的特有醇香味。

(2)本发明提供的中药微生态制剂主要用于防治反刍动物腹泻，包括因大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、巴氏杆菌、魏氏梭菌等细菌导致的腹泻；由病毒、寄生虫和应激刺激引起的综合性腹泻，疗效确切。经过微生物的发酵，不仅大大减少了中药的使用量，节省养殖户的管理成本，而且对于反刍动物的腹泻治愈效果优于抗生素。

(3)本发明提供的中药微生态制剂还能够提高宿主动物的生长性能，将饲料中的纤维素降解，提高对蛋白物质的吸收，提高饲料利用率；提高宿主动物的抗氧化能力和免疫力。

除此之外，本发明提供的葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)SAMY-9G应用于反刍动物的技术方案尚未见报道。

保藏说明

葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，株名SAMY-9G；已于2022年9月29日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20221520。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，株名SAMM2-1G；已于2022年9月29日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20221521。

附图说明

图1为葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G的(a)菌落形态及(b)镜检(×400)形态。

图2为葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G菌株在不同温度下培养48h的有效活菌数。

图3为葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G菌株在不同pH，39℃条件下培养48h的有效活菌数。

具体实施方式

本发明提供了一株葡萄牙棒孢酵母和用于防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂及制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，中药复方和发酵菌种的加减，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实例1动物源耐高温葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G的筛选

1、菌株的分离

收集健康荷斯坦奶牛的牛瘤胃液于充满CO₂的装置中迅速带回实验室，将瘤胃液用4层无菌纱布过滤，取1mL过滤后的瘤胃液进行梯度稀释，分别将瘤胃液倍倍稀释后进行涂板，涂布好的麦芽汁琼脂培养基放入39℃的恒温培养箱中倒置好氧培养72h(麦芽汁琼脂培养基：蛋白胨4.0g，葡萄糖10.0g，酵母浸粉3.0g，麦芽粉10.0g，氯霉素0.1g，H₂O 1000mL，pH自然)，挑取单菌落进行反复多次纯化，直到获得菌株的形态完全一致后保存备用。

2、菌株的筛选

取分离获得的菌株在麦芽汁琼脂培养基中传代，放入39℃培养箱中厌氧培养48h，筛选能够在厌氧环境下生长的疑似酵母菌进行纯化，获得3株生长性能好的酵母菌进行耐酸性和抗氧能力筛选。

耐酸性筛选：将麦芽汁培养基pH调成5.0和6.5(麦芽汁培养基：麦芽浸粉130.0g，氯霉素0.1g，H₂O 1000mL)，接种能够兼性好氧的疑似酵母菌株，39℃好氧培养24h，活菌计数测定有效活菌数。

抗氧化能力筛选：在麦芽汁培养基(pH 5.0)中接种耐酸性好的兼性好氧的疑似酵母菌株，向培养基中通入CO₂至完全厌氧，然后分别通入相当于培养基体积的0％、1％、2％的氧气(以氧气占空气比例计算出添加的空气量)，通入后立即密封，39℃厌氧培养24h，活菌计数测定有效活菌数。

根据上述条件筛选出耐酸能力和抗氧化能力相对较强的疑似酵母菌株SAMY-9G。

3、形态学特征

待测葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G在麦芽汁琼脂培养基平板上菌落圆形突起，呈乳白色，表面湿润光滑；美蓝染色后于10×40显微镜下细胞为卵圆形，一端出芽，无菌丝体。根据菌株的菌落形态和细胞形态初步鉴定菌株SAMY-9G为酵母菌，见附图1。

4、分子生物学鉴定

对筛选得到的葡萄牙棒孢酵母菌株SAMY-9G进行分子鉴定，提取其基因组DNA，引物序列为NL1:GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL4:GGTCCGTGTTTCAAGACGG，扩增出26SrDNAD1/D2区后，交给生工生物工程(上海)测序。SAMY-9G序列全长为507bp，测序结果如SEQID No.1所示。SEQ ID No.1如下所示：

与NCBI的Gen-Bank(http://ncbi.nlm.nih.fov/BLAST)数据库和数据库中的葡萄牙棒孢酵母进行核苷酸同源性比对，序列同源性为100.00％。该菌为葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)，命名为葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G。该菌株的26SrDNA序列已提交GenBank数据库，登录号为OP102543，并于2022年9月29日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20221520。

5、菌株最适温度测定

将活化的葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G菌株分别在28℃、31℃、35℃、39℃、42℃、45℃六个不同温度下进行摇瓶发酵试验，在48h后测定有效活菌数。如附图2所示，得到最适培养温度为39℃。

6、菌株最适pH测定

用HCl和NaOH将活化的葡萄牙棒孢酵母SAMY-9G菌株的液体培养基的初始pH分别调至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5。39℃条件下培养48h后测定有效活菌数。如附图3所示，得到最适培养pH为5.5。

实例2中药组方的确定

1、中药复方

从具有抑菌功能的单味中药中筛选出对致病性大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、巴氏杆菌、魏氏梭菌抑菌能力强的几味中药并做成中药复方，具体见表1：

表1中药及中药组方方案

2、抑菌能力分析

按照重量份准确称取各原料，分别进行提取后减压浓缩至1g/mL，此为待测药液。在灭菌的平板中倒入15mL相应鉴别性固体培养基，将过夜培养的致病性大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、巴氏杆菌、魏氏梭菌菌液与鉴别性固体培养基混匀，使其指示菌浓度稀释2×10⁷cfu/mL左右，取5mL倾注于制备好的固体培养基平板中。用镊子将牛津杯轻轻放置于平板上，吸取200μL药液加入牛津杯后静置30min，于37℃培养24～48h，用游标卡尺测量抑菌圈大小如表2所示，其中“+”表示抑菌圈直径≤10mm，“++”表示抑菌圈直径11-14mm，“+++”表示抑菌圈直径15-20mm，“++++”表示抑菌圈直径＞20mm，“-”无抑菌活性。确定后续中药组方。

表2中药及中药组方对反刍动物腹泻致病菌的抑制能力

反刍动物腹泻按中兽医理论一般为(1)湿热性腹泻：一般都是发生在高温高湿季节，湿热蕴结，体温升高，喜冷，排便腥臭味重。(2)寒湿性腹泻：寒证，怕冷，喜扎堆，粪便稀薄。(3)脾虚性泄泻：虚证，瘦弱，消化不良，粪便含有未消化饲料。本发明最终确定对致病性大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、巴氏杆菌、魏氏梭菌有良好抑制作用的组别11：乌梅30～50份、白头翁10～20份、马齿苋15～30份、五倍子10～20份、常山1～5份、黄芪5～10份为所选方剂，诸药合用具有清热解毒、燥湿止痢、温中散寒、益气健脾、固肠消积的功效。方中乌梅和白头翁为君药，主治久泻久痢，幼畜奶泻，蛔虫病等，乌梅含有多种挥发油、有机酸、氨基酸及多糖，具有抑菌和杀菌作用，能对革兰氏阳性、阴性菌起到很好的药理抑菌效果；具有抗病毒、增强免疫力、减轻肠黏膜损伤、抗氧化、止血等作用，同时有增加食欲，促进消化，收缩肠壁的作用，又能够治疗因蛔虫导致的各种疾病。白头翁能够清热解毒、凉血止痢，其有效成分白头翁皂苷和香豆素类，对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌有很好的抑菌效果。方中马齿苋为臣药，具有清热解毒、凉血消肿、止痢、抗菌、抗病毒、抗氧化等功效；用于治疗肠炎、热毒血痢；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌及赤霉素、黄曲霉素等霉菌均有明显抑制作用；其水煎液可抑制病毒与细胞结合、降低病毒载量。方中五倍子具有敛肺降火、涩肠固精、敛汗止血之功效，对金黄色葡萄球菌、弗氏痢疾杆菌、霍乱杆菌及大肠杆菌均有抑制作用，五倍子因含鞣酸对小肠具有收敛作用而减轻肠道炎症，可制止腹泻，敛肺降火，涩肠止泻，收敛止血，收湿敛疮。方中黄芪含有多种生物活性物质、氨基酸和微量元素，能增强机体免疫功能，提高抗病能力，并且能营卫气血、改善肠道内环境、扶正祛邪、平衡失调的菌群、清除氧自由基，使腹泻症状迅速改善。方中常山具有杀虫、除痰消积的功效，能够治疗球虫病及蓿草不转，添加常山并没有减弱其他组分的抑菌能力，还能够增加其对于球虫病引起的腹泻的治疗效果。

实例3中药发酵菌种的确定

1、乌梅30～50份、白头翁10～20份、马齿苋15～30份、五倍子10～20份、常山1～5份、黄芪5～10份。选取上述中药，原料分别于50～60℃下烘干2～3h，粉碎，按照重量份准确称取各原料，加入2～3倍水及各菌种的液体培养基(常规培养基)，110～120℃高温灭菌30～40min，冷却至35～45℃，无菌接入益生菌，进行液体摇瓶发酵，根据其在以中药复方为底物的培养基质中的生长情况，测定有效活菌数确定发酵菌种为：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CCTCC M 20221521、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CICC6119、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)CCTCC M 20221520、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCTCC M 2019722、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)CICC24498。

2、发酵菌株复配

能够在中药复方发酵培养基质中生长的5株菌做相互拮抗试验，挑取固体平板上的多粘类芽孢杆菌单菌落在固体培养基上划1条竖线和4条横线，然后分别挑取罗伊氏乳杆菌、葡萄牙棒孢酵母、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌的单菌落在平板上划线，每一株菌方向均有一个与多粘类芽孢杆菌所画线垂直相交，其余4条为平行线，将平板置于，35～42℃培养箱中好氧或厌氧培养1～2天。观察相交处是否连续，实验结果表明上述各菌株之间没有拮抗，可以共培养。

实例4防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂制备

1、制备微生物复合发酵种子液

菌种活化：将实例3确定的各菌种接种于对应的斜面培养基上培养；灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，35～42℃下培养1～3天；

种子液制备：将上述活化后的各菌种分别接种于各菌种对应的液体培养基中，摇床振荡培养，种子有效活菌数分别为5～10×10⁸cfu/mL，收集种子培养液；

接种比例的确定：以菌体生长量为指标，确定各菌种接种比例。将各菌种种子液，按比例混合均匀，得复合发酵种子液；在复合发酵菌液中：多粘类芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、葡萄牙棒孢酵母、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌种子培养液按照体积比(1-2):(1-2):(0.75-1.5):(0.5-1):(0.5-1)混合。

2、发酵工艺

选取乌梅30～50份、白头翁10～20份、马齿苋15～30份、五倍子10～20份、常山1～5份、黄芪5～10份中药原料，分别于50～60℃下烘干2～3h，粉碎，按照重量份准确称取各原料，加入2～3倍水及定量发酵培养基，110～120℃高压灭菌30～40min，冷却至35～45℃，按接种量5～10％无菌接种微生物复合发酵种子液，35～42℃下培养2～4天，罐压0.1M Pa，在发酵过程中用HCl或氨水维持pH值5.5～7.2。使发酵液中有效活菌数达到10.0～20.0×10⁸cfu/mL，即得到防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂。高密度液体深层发酵过程采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：红糖、蔗糖；氮源为：酵母粉。发酵培养过程包括：a、有氧培养阶段：起始24～48小时内，通过空气压缩机维持通气量60～180m³/h，间隔通气，搅拌转速130～180r/min，温度35～42℃；b、厌氧培养阶段：48～96h，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，温度35～42℃。在上述制备方法中，所述的以中药复方为底物的发酵培养基为：红糖50～100g/L、蔗糖10～50g/L、蜂蜜10～50g/L、酵母粉5～20g/L、磷酸氢二钾1～5g/L、乙酸钠1～5g/L、硫酸镁0.1～1g/L、L-半胱氨酸0.1～1g/L、Tween800.1～1g/L，硫酸锰0.05～0.3g/L、碳酸钙0.1～3g/L；pH 5.5～7.2。取1mL活菌计数，该中药微生态制剂总有效活菌数为10.0～20.0×10⁸cfu/mL。

实例5防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的最小抑菌浓度

防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的最小抑菌浓度(MIC)测定方法见表3：

表3中药微生态制剂最小抑菌浓度(MIC)的测定方法

结果表明该中药微生态制剂对大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌的MIC均为62.5mg/mL，对弯曲杆菌、巴氏杆菌的MIC均为125mg/mL属中敏药物。

应用例1：防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂在体外对常见致病菌的抑菌效果。

1、试验药品：实例4得到的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂。

2、试验菌株：鸡大肠杆菌标准血清型(O78)、犊牛腹泻大肠杆菌(K99)、仔猪痢疾大肠杆菌(K88)、奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌CVCC3057、牛致病性沙门氏菌(沙门_牛)、羊致病性沙门氏菌(沙门_羊)、弯曲杆菌CICC 22937、巴氏杆菌BNCC270568、魏氏梭菌CICC 22949。

3、试验结果与分析

防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂在体外对常见致病菌的抑菌效果见表4：

表4中药微生态制剂对反刍动物腹泻常见致病菌的体外抑菌能力

体外抑菌试验是检测药物对各种致病菌的抑菌能力，是进行临床治疗的前提和基础，从侧面体现了药物的治疗效果，通过反刍动物腹泻的中药微生态制剂对引起腹泻常见致病菌的体外抑菌试验，与硫酸新霉素临床用量的抑菌圈比较，抑菌能力均显著增大，且仅用中药复方的三分之一用量，经过益生菌发酵后就达到了等同效果。说明此中药微生态制剂对反刍动物腹泻的致病菌抑菌能力非常好。

应用例2：防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的动物安全性试验

试验动物：昆明种小鼠，雌雄各半共30只，体重18～22g。基础日粮预饲1周后随机分为5组，其中1组为对照组，其余4组为试验组。根据小鼠最大灌胃量灌胃原药液进行限量试验，试验组小鼠每只给予0.5mL中药微生态制剂，灌胃药物次数分别为1次/天、2次/天、3次/天、4次/天，不灌药的各组灌胃生理盐水。连续观察两周，试验区封闭，保持清洁，记录期间每只小鼠症状以及是否死亡。试验结束时解剖小鼠心脏、肝脏、肾脏和脾脏，观察有无病变。

结果显示：试验组小鼠均未死亡，与对照组相比并未表现出明显毒性反应，外观、行为活动和精神状态各组间无显著差异，且体重增长与对照组差异不显著。对各组小鼠进行解剖，肉眼观察各组小鼠脏器并未有明显变化。说明此中药微生态制剂对小鼠脏器的生长发育并未有明显影响。小鼠按2.0mL/天灌服此中药微生态制剂并未造成小鼠死亡且未见明显的毒副作用，具有较高的安全性。

应用例3：防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂对犊牛腹泻疾病的治疗效果。

1、试验药品：实例4得到的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂。

2、试验方法：试验选用150头自然分娩的新生荷斯坦犊牛(公母各半)，按照出生胎次、出生重和出生时间相近的原则分为5组，每组30头且公母对半，分3个重复。A组：对照组，添加基础饲粮+20mL/(d·头)生理盐水；B组：试验组，添加中药微生态制剂组(20mL/(d·头)，15×10⁸cfu/mL)+基础饲粮；C组：对比例1组，与实例4的区别在于中药复方不经过微生物复合发酵种子液发酵，其余过程相同，20mL/(d·头)+基础饲粮。D组：对比例2组，白头翁散(中药对照，稀释在20mL生理盐水中)+基础饲粮。E组：对比例3，硫酸新霉素(西药组)，饲喂基础饲粮+20mL/(d·头)生理盐水，出现腹泻立即使用。预饲期3天，正式期56天。基础饲粮(常乳及开食料)营养水平见表5。

表5常乳及开食料的营养水平(干物质基础)％

3、饲养管理：采用犊牛岛单独培养。出生2h内灌服初乳，至少连续3天吃三次初乳，此后吃常乳至7d，饲喂量为出生重8％，8～13日龄为代乳品过渡期，每日分3次饲喂，每餐过度量为1/5，14日龄时全部换成代乳品。代乳品按干物质占12.5％比例冲泡成乳液，40℃左右饲喂犊牛，饲喂量为犊牛体重的11％；3日龄开始补饲开食料，4周龄后补饲苜蓿和精料，自由采食。试验用制剂在每日早晚2次口服灌喂，保持圈内清洁干燥，定期进行消毒。试验饲粮经全混合日粮搅拌机搅拌后饲喂，自由采食和饮水。

4、考察指标与方法

1)腹泻率：试验期间，每天早、晚观察各组犊牛的分辨情况，采用表6中的4分制粪便评分标准进行评分，犊牛连续2d粪便评分≥3为腹泻。腹泻率＝腹泻头数/总头数×100％。

2)疗效判断标准：治愈：临床腹泻消失，精神、食欲、粪便等各项生理指标恢复正常。显效：粪便基本成型，排粪次数减少，精神状态、食欲、饮水等基本正常。有效：治愈和显效均判定为有效。无效：腹泻症状未减轻，或者动物死亡。

3)生长性能：正式试验的第1d和最后1d早晨称量未腹泻过的健康试验荷斯坦犊牛空腹12h的体重；每天准确记录各组荷斯坦犊牛的采食量，计算平均日增重和平均日采食量。

平均日增重(ADG)＝全期增重(kg)/天数(d)

日均采食量(ADFI)＝全期采食量(kg)/天数(d)

耗料增重比(F/G)＝饲料消耗/增重

表6粪便评分标准

5、结果与分析

1)不同试验组对犊牛腹泻的影响如表7所示。

表7反刍用中药微生态制剂对犊牛腹泻的影响

临床治疗试验结果表明，本实例的中药微生态制剂对犊牛腹泻有很好的预防作用，与对照组相比，腹泻率下降了50％；对犊牛腹泻疗效显著，治愈率为85.71％，有效率为100％。与抗生素组相比，治愈率提高了44.04％，有效率提高了25％。本实例中的中药复方经过粘类芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、葡萄牙棒孢酵母、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌发酵后有效率达到100％。进一步说明了经过益生菌发酵后，不仅减少了中药添加剂量，而且药效也明显提高。值得说明的是，在继续饲养过程中发现，经该中药微生态制剂治疗后的犊牛要比抗生素组和其他对比组康复的快，这与该药的综合特点分不开。

该中药微生态制剂除实例2中所阐述的中药组方理论外，多粘类芽孢杆菌能够有效防治犊牛的腹泻，该菌代谢所产生的肽类杀菌物质能够作用到致病菌的细胞膜上，从而使致病菌内含物流失致其死亡；代谢产生的拮抗蛋白质能够抑制真菌的生长和增值，从而降低饲料中霉菌毒素等真菌引起的腹泻；能够通过触杀、抑制卵孵化、熏杀等模式抑制线虫，能够有效防治因线虫引起的腹泻。罗伊氏乳杆菌代谢产生的罗伊式菌素是非蛋白质类广谱抗菌物质，抑菌活性不会被蛋白酶破坏，具有更强的稳定性，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长；代谢产生的有机酸，能够有效调节肠道微环境，提高宿主抗病能力。葡萄牙棒孢酵母CCTCC M 20221520进入到犊牛胃肠道后能够刺激有益菌的增殖，同时酵母细胞壁的甘露糖成分可以影响动物的免疫系统，通过吸附和吸收侵入体内的致病菌和病毒来提高宿主的免疫机能，降低血浆内毒素的水平，从而降低犊牛腹泻。凝结芽孢杆菌具有良好的耐酸耐胆盐等抗逆性，还能够产生大量的乳酸，协助并提高中药对致病菌的抑制作用。丁酸梭菌增加肠道中丁酸的含量，对肠道上皮组织具有再生和修复作用。各菌种混合发酵中药复方提取物，在发酵过程中产生的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等物质对中草药的细胞进行破壁是有效物质溶出，同时中药成分经过微生物物的转化，大分子物质转变成易吸收的小分子物质，使血液中的有效成分迅速达到有效浓度，使发酵过的中药复方进入人体后直接起到药效。

由此可见，在本发明的中药微生态制剂的各菌种中，只有葡萄牙棒孢酵母是需要采用指定保藏编号为CCTCC M 20221520的菌株。其他的菌种如多粘类芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌都可以采用标准菌株或商业纯菌粉进行替代，只要满足上述各菌种的功能性要求即可。

犊牛腹泻疾病是犊牛诸多传染性疾病当中发病率和死亡率最高的一类疾病。引起犊牛腹泻的原因复杂，主要包括细菌感染、病毒感染、寄生虫感染，以及滥用抗生素、应激刺激等。经过血清抗体检测、细菌分离培养、寄生虫卵镜检和病毒核酸检测方法对临床试验的58头腹泻犊牛的血样和粪便进行了检查：细菌感染率为43.10％、寄生虫感染率为24.14％，病毒感染率为29.31％，其他3.45％。其中单一病原感染12头，占腹泻总数20.69％，混合病原感染44头，占腹泻总数75.86％，其他(应激)腹泻2头，占腹泻总数3.45％。进一步说明该中药微生态制剂对细菌、病毒、寄生虫和应激引起的腹泻均具有很好的治疗效果。

2)不同试验组对犊牛生长性能的影响如表8所示。

表8反刍用中药微生态制剂对犊牛生长性能的影响

与对照组相比，本应用例的中药微生态制剂能够增加犊牛的体重，ADG和ADFI显著高于对照组和对比例组，F/G有所降低。该中药微生态制剂经过葡萄牙棒孢酵母发酵后，使产品具有特有的醇香味，增加犊牛的饮食欲望，微生物代谢产生的胞外多糖能够提高宿主动物的免疫力，从而增加采食量、代谢产生纤维素酶能够有效的分解苜蓿等粗饲料中的纤维素，提高饲料利用率的转化率和利用率。

应用例4：防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂对羔羊腹泻疾病的治疗效果。

1、试验药品：实例4得到的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂。

2、试验方法：随机抽取确诊为腹泻的羔羊120只，分为4组，每组30只，分3个重复，各组在平均体重、性别比例、日龄方面无明显组间差异。A组：试验组，添加中药微生态制剂组(20mL/(d·头)，15×10⁸cfu/mL)+基础饲粮；B组：对比例1组，与实施例4的区别在于中药复方不经过微生物复合发酵种子液发酵，其余过程相同，20mL/(d·头)+基础饲粮；C组：对比例2组，白头翁散(中药对照，稀释在20mL生理盐水中)+基础饲粮。D组：对比例3，硫酸新霉素(西药组)，饲喂基础饲粮+20mL/(d·头)生理盐水。饲喂10天，再观察10天，试验结果如表9所示：

表9反刍用中药微生态制剂对羔羊腹泻的影响

临床治疗试验结果表明，本应用例的中药微生态制剂对羔羊腹泻有很好的治疗作用，治愈率为90.00％，有效率为100％。与抗生素组相比，治愈率提高了26.67％，有效率提高了13.33％。与未经发酵的中药组方组相比，治愈率提高了36.67％，有效率提高了13.33％。本发明的中药组方，在30％的添加量基础上(试验B组，未发酵，30％中药组方+培养基质)治疗腹泻羔羊，有效率能够与白头翁散相当，从而进一步说明该中药组方的有效性。

Claims (10)

1.葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)SAMY-9G，其保藏编号为CCTCC NO:M20221520。

2.一种微生物复合发酵种子液，其特征在于，所述微生物复合发酵种子液由多粘类芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、权利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母、凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌的种子培养液按照体积比(1～2):(1～2):(0.75～1.5):(0.5～1):(0.5～1)混合而成，所述各菌种的种子培养液有效活菌数分别为5～10×10⁸cfu/mL。

3.一种防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括在以中药复方为底物的发酵培养基中，接种权利要求2所述的微生物复合发酵种子液进行发酵，所得发酵液即为防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂；其中，所述中药复方由以下重量份的原料制成：乌梅30～50份、白头翁10～20份、马齿苋15～30份、五倍子10～20份、常山1～5份、黄芪5～10份。

4.根据权利要求3所述的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为红糖50～100g/L、蔗糖10～50g/L、蜂蜜10～50g/L、酵母粉5～20g/L、磷酸氢二钾1～5g/L、乙酸钠1～5g/L、硫酸镁0.1～1g/L、L-半胱氨酸0.1～1g/L、Tween800.1～1g/L、硫酸锰0.05～0.3g/L、碳酸钙0.1～3g/L；pH 5.5～7.2。

5.根据权利要求3所述的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述中药复方原料为粉剂；在以中药复方为底物的发酵培养基中，中药复方原料与水的质量比为1:2～3；在接种前，以中药复方为底物的发酵培养基经110～120℃高温灭菌30～40min，冷却至35～45℃。

6.根据权利要求3所述的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述接种为按接种量5～10％无菌接种权利要求2所述的微生物复合发酵种子液。

7.根据权利要求3所述的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵过程为35～42℃下培养2～4天，维持pH值5.5～7.2，罐压0.1MPa。

8.根据权利要求7所述的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵过程采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：红糖、蔗糖；氮源为：酵母粉；培养过程包括两个阶段：

a.有氧培养阶段：起始24～48小时内，维持通气量60～180m³/h，间隔通气，搅拌转速130～180r/min，温度35～42℃；

b.厌氧培养阶段：48～96h，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，温度35～42℃。

9.权利要求3-8任一所述方法制备的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂，其特征在于，该中药微生态制剂可制备的剂型，包括散剂、颗粒剂、粉剂或溶液剂。

10.根据权利要求9所述的防治反刍动物腹泻的中药微生态制剂，其特征在于，该中药微生态制剂总有效活菌数为10.0～20.0×10⁸cfu/mL。

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