CN111518719A - 一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，属于微生物培养技术领域。本发明先将大肠杆菌复苏培养；再将大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养，培养过程中，控制溶解氧含量为0.1～0.5％；随后将大肠杆菌和光合细菌于暗室和好氧条件下，混合培养；再将培养液分离纯化后，冷冻干燥，即得制得大肠杆菌冻干粉。本发明发酵和纯化工艺可有效提高菌种的发酵效率和存活率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体是一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺。
背景技术
大肠杆菌的生化代谢非常活跃，大肠杆菌可以发酵葡萄糖产酸、产气，个别菌株不产气，大肠杆菌还能发酵多种碳水化合物，也可以利用多种有机酸盐。大肠杆菌在常用的生化特性检测项目中，甲基红试验呈阳性，吲哚产生和乳糖发酵是阳性，个别菌株表现阴性。
高密度培养技术也被称为高密度发酵技术，是通过提高菌体发酵密度实现单位体积、时间内目标产物产量的增加。该技术具有减少培养体积、缩短生长周期、方便分离提取、降低生产成本等优点。
在工程菌种生长过程中，使用限制性基质是控制工程菌生长的常用方法。大肠杆菌在过量葡萄糖或缺氧状态下会因“葡萄糖效应”累积过量有机酸而影响细菌生长和外源蛋白的而有效表达。因此，根据工程菌种的生长特点以及目标产物的表达方式选择合适的发酵和纯化技术，是大肠杆菌高密度培养的重要保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，以解决现有技术中大肠杆菌的高密度培养时，菌种存活率低，代谢产物容易对菌种繁殖造成不良影响的弊端。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，具体发酵与纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养；
(3)大肠杆菌和光合细菌于暗室和好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
本发明技术方案通过先将大肠杆菌进行复苏培养，以提升作为菌源的活性，随后利用大肠杆菌和光合细菌在光照及厌氧条件下的混合培养，其中，光合细菌为厌氧型细菌，其在光照和厌氧环境下，可以利用二氧化碳以及培养基中成分合成大肠杆菌生长代谢所需营养成分；而大肠杆菌为兼性厌氧型细菌，即使在厌氧环境下仍然可以生长繁殖，随着培养的进行，体系中营养组分因为光合细菌的存在始终保持稳定，由此保障了高密度培养的条件；
本发明技术方案接着通过在暗室和好氧条件下培养，暗室和好氧条件下光合细菌逐渐死亡并解体，其体内残留营养成分继续维持大肠杆菌高密度发酵需求，另外，好氧环境下大肠杆菌进一步繁殖，使菌种得以纯化。
进一步的，所述具体发酵和纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养，培养过程中，控制溶解氧含量为0.1～0.5％；
(3)大肠杆菌和光合细菌于暗室和好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
进一步的，所述具体发酵和纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养，培养过程中，控制溶解氧含量为0.1～0.5％，控制光照强度为100～1000lx；
(3)大肠杆菌和光合细菌于暗室和好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
本发明技术方案进一步的通过控制光照强度和一定的氧含量，避免光合细菌过度繁殖而成为优势菌种，从而使其仅仅作为维持体系营养均衡的作用，而不会因为过度繁殖而影响大肠杆菌的生长繁殖。
进一步的，所述具体发酵和纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养，培养过程中，控制溶解氧含量为0.1～0.5％，控制光照强度为100～500lx；
(3)大肠杆菌和光合细菌于光照强度低于1lx的暗室和溶解氧含量为5％以上的好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
本发明技术方案通过进一步的控制暗室光照强度和培养基氧含量，使极少量的光合细菌存活，通过利用其在不利条件下释放的保护自身菌体的活性组分，来达到提高大肠杆菌活性和存活率的技术效果。
进一步的，所述光合细菌为不产氧光合细菌。
进一步的，所述不产氧光合细菌为紫色细菌或绿色细菌中的任意一种。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
将大肠杆菌菌株中从冰箱中取出，并将菌液接种至营养肉汤培养基中，于35～37℃条件下保温培养16～24h，得活化菌液；再将活化菌液接种至麦康凯培养基中，于35～37℃条件下保温培养16～24h，随后从麦康凯培养基中挑取红色单菌落；
将红色单菌落和光合细菌分别按接种量为2～5％和0.1～0.5％接种至牛肉汤培养基中，于溶解氧含量为0.1～0.5％，光照强度为100～500lx条件下，混合培养8～12h后，转移至光照强度低于1lx的暗室中，于溶解氧含量为5％以上的好氧条件下，混合培养10～12h，得富集菌液；
将所得富集菌液离心分离，收集下层沉淀物，并用去离子水洗涤3～5次，再将洗涤后的沉淀物转入真空冷冻干燥箱中，于温度为-20～-30℃，压力为80～100Pa条件下，真空冷冻干燥3～5h后，出料，封装，即得大肠杆菌冻干粉。
所述营养肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：10～15份牛肉浸粉，3～8份乳糖，1～3份氯化钠，800～1000份水。
所述牛肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：8～10份牛肉浸粉，8～10份葡萄糖，1～3份氯化镁，1～3份硫酸铵，800～1000份水。
所述光合细菌为不产氧的紫色细菌或绿色细菌中的任意一种。
实施例1
将大肠杆菌菌株中从冰箱中取出，并将菌液接种至营养肉汤培养基中，于35℃条件下保温培养16h，得活化菌液；再将活化菌液接种至麦康凯培养基中，于35℃条件下保温培养16h，随后从麦康凯培养基中挑取红色单菌落；
将红色单菌落和光合细菌分别按接种量为2％和0.1％接种至牛肉汤培养基中，于溶解氧含量为0.1％，光照强度为100lx条件下，混合培养8h后，转移至光照强度为1lx的暗室中，于溶解氧含量为5％的好氧条件下，混合培养10h，得富集菌液；
将所得富集菌液离心分离，收集下层沉淀物，并用去离子水洗涤3次，再将洗涤后的沉淀物转入真空冷冻干燥箱中，于温度为-20℃，压力为80Pa条件下，真空冷冻干燥3h后，出料，封装，即得大肠杆菌冻干粉。
所述营养肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：10份牛肉浸粉，3份乳糖，1份氯化钠，800份水。
所述牛肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：8份牛肉浸粉，8份葡萄糖，1份氯化镁，1份硫酸铵，800份水。
所述光合细菌为不产氧的紫色细菌。
实施例2
将大肠杆菌菌株中从冰箱中取出，并将菌液接种至营养肉汤培养基中，于36℃条件下保温培养20h，得活化菌液；再将活化菌液接种至麦康凯培养基中，于36℃条件下保温培养20h，随后从麦康凯培养基中挑取红色单菌落；
将红色单菌落和光合细菌分别按接种量为3％和0.3％接种至牛肉汤培养基中，于溶解氧含量为0.3％，光照强度为300lx条件下，混合培养9h后，转移至光照强度为0.9lx的暗室中，于溶解氧含量为6％的好氧条件下，混合培养11h，得富集菌液；
将所得富集菌液离心分离，收集下层沉淀物，并用去离子水洗涤4次，再将洗涤后的沉淀物转入真空冷冻干燥箱中，于温度为-25℃，压力为90Pa条件下，真空冷冻干燥4h后，出料，封装，即得大肠杆菌冻干粉。
所述营养肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：12份牛肉浸粉，5份乳糖，2份氯化钠，900份水。
所述牛肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：9份牛肉浸粉，9份葡萄糖，2份氯化镁，2份硫酸铵，900份水。
所述光合细菌为不产氧的紫色细菌。
实施例3
将大肠杆菌菌株中从冰箱中取出，并将菌液接种至营养肉汤培养基中，于37℃条件下保温培养24h，得活化菌液；再将活化菌液接种至麦康凯培养基中，于37℃条件下保温培养24h，随后从麦康凯培养基中挑取红色单菌落；
将红色单菌落和光合细菌分别按接种量为5％和0.5％接种至牛肉汤培养基中，于溶解氧含量为0.5％，光照强度为500lx条件下，混合培养12h后，转移至光照强度为0.5lx的暗室中，于溶解氧含量为7％的好氧条件下，混合培养12h，得富集菌液；
将所得富集菌液离心分离，收集下层沉淀物，并用去离子水洗涤5次，再将洗涤后的沉淀物转入真空冷冻干燥箱中，于温度为-30℃，压力为100Pa条件下，真空冷冻干燥5h后，出料，封装，即得大肠杆菌冻干粉。
所述营养肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：15份牛肉浸粉，8份乳糖，3份氯化钠，1000份水。
所述牛肉汤培养基是由以下重量份数的原料组成：10份牛肉浸粉，10份葡萄糖，3份氯化镁，3份硫酸铵，1000份水。
所述光合细菌为不产氧的绿色细菌。
对比例1
本对比例相比于实施例1而言，区别在于：将暗室中光照强度调整为0.05lx，其余条件保持不变。
对比例2
本对比例相比于实施例1而言，区别在于：未加入光合细菌，其余条件保持不变。
对比例3
本对比例相比于实施例1而言，区别在于：厌氧培养时，将光照强度调节至1000lx，其余条件保持不变。
对实施例1-3及对比例1-3所得产品进行性能测试，具体测试方式和测试结果如下所述：
将产品冻干粉复苏培养至第三代，将第三代菌液10μL分别接种至10mL营养肉汤中进行37℃培养10h，倍比稀释8次后，使用平板菌落计数法测定菌液中的活菌数量，具体测试结果如表1所示：
表1：产品性能测试表
| 检测项目 | 活菌数10<sup>9</sup>个/mL |
| 实施例1 | 86.2 |
| 实施例2 | 88.3 |
| 实施例3 | 90.1 |
| 对比例1 | 30.2 |
| 对比例2 | 8.6 |
| 对比例3 | 9.2 |
由表1测试结果可知，本申请技术方案所得产品菌种活性较高，而对比例1由于暗室光照强度太弱，光合细菌无法存活而全部死亡，因此无法释放活性物质促进产品活性的提升；而对比例2由于未加入光合细菌，单一的大肠杆菌培养，产品活性最低；而对比例3在厌氧培养时，由于光照强度太强，光合细菌代谢过于旺盛成为优势菌种，在一定程度上也影响了产品的活性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (6)
1.一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，其特征在于具体发酵与纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养；
(3)大肠杆菌和光合细菌于暗室和好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，其特征在于，所述具体发酵和纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养，培养过程中，控制溶解氧含量为0.1～0.5％；
(3)大肠杆菌和光合细菌于暗室和好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，其特征在于，所述具体发酵和纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养，培养过程中，控制溶解氧含量为0.1～0.5％，控制光照强度为100～1000lx；
(3)大肠杆菌和光合细菌于暗室和好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，其特征在于，所述具体发酵和纯化步骤为：
(1)大肠杆菌的复苏培养；
(2)大肠杆菌和光合细菌于光照和厌氧条件下，混合培养，培养过程中，控制溶解氧含量为0.1～0.5％，控制光照强度为100～500lx；
(3)大肠杆菌和光合细菌于光照强度低于1lx的暗室和溶解氧含量为5％以上的好氧条件下，混合培养；
(4)分离纯化；
(5)冷冻干燥，得大肠杆菌冻干粉。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，其特征在于，所述光合细菌为不产氧光合细菌。
6.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌菌种发酵与纯化工艺，其特征在于，所述不产氧光合细菌为紫色细菌或绿色细菌中的任意一种。
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| CN (1) | CN111518719A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103122324A (zh) * | 2012-06-18 | 2013-05-29 | 山东华宏生物工程有限公司 | 鸡大肠杆菌培养方法 |
| CN106244489A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-12-21 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种金藻与光合细菌混合发酵的方法 |
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2020
- 2020-04-29 CN CN202010356873.1A patent/CN111518719A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103122324A (zh) * | 2012-06-18 | 2013-05-29 | 山东华宏生物工程有限公司 | 鸡大肠杆菌培养方法 |
| CN106244489A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-12-21 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种金藻与光合细菌混合发酵的方法 |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| 叶旭红等: "提高光合细菌应用效果的技术发展", 《杭州医学高等专科学校学报》 * |
| 叶旭红等: "提高光合细菌应用效果的技术发展", 《杭州医学高等专科学校学报》, vol. 22, no. 01, 25 February 2001 (2001-02-25), pages 52 - 54 * |
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| 宋卉等: "禽大肠杆菌高密度发酵与溶氧关系的研究", 《黑龙江畜牧兽医》, no. 01, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 1 - 1 * |
| 曹希亮等: "微生态制剂培养技术――正交法研究光合细菌的混合培养", 《饲料工业》 * |
| 曹希亮等: "微生态制剂培养技术――正交法研究光合细菌的混合培养", 《饲料工业》, vol. 28, no. 04, 20 February 2007 (2007-02-20), pages 31 - 33 * |
| 苟维超等: "光合细菌产氢研究进展与问题", 《可再生能源》 * |
| 苟维超等: "光合细菌产氢研究进展与问题", 《可再生能源》, vol. 31, no. 09, 20 September 2013 (2013-09-20), pages 94 - 101 * |
| 马博远等: "光照混菌培养应用研究进展", 《中国生物工程杂志》 * |
| 马博远等: "光照混菌培养应用研究进展", 《中国生物工程杂志》, vol. 36, no. 08, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 117 * |
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