CN111676166A - 一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用 - Google Patents

一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用，包括如下步骤：1)取粉碎大米和水按照混合并加入糖化酶、液化酶制备糖醪液；2)将酵母、乳酸菌RS1接入糖醪液进行酒精发酵2～4d，制得酒醪液；3)将2)中的酒醪液压滤除菌得酒醪液清液；4)按照0.5～5％的接种量接种醋酸菌至酒醪液清液中，并加入硫酸铵0.5～2g/L，发酵3～7d；5)醋酸发酵结束后调整总酸至50～70g/L，并加入葡萄糖，将乳酸菌RS1接入进行二次乳酸发酵，发酵3～7d后结束。本发明利用从固态发酵醋池中筛选的菌株并经育种、等离子束诱变的方式选育出的乳酸菌，和醋酸菌复配接种发酵进行液态酿醋，能够在保证总酸不受影响的情况下，提高乳酸含量，使得液态醋口感饱满柔和，提升液态醋品质。

Description

一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用。
背景技术
相比传统的固态发酵方式，液态发酵醋接种纯种的醋酸菌进行发酵，实现了清洁化、自 动化生产。固态醋有机酸组分丰富，除了醋酸以外，乳酸、琥珀酸等不挥发性酸占总酸比重 较大，使得固态醋口感丰富、体态饱满、滋味浓郁。但是，液态发酵醋中的有机酸基本只包 含醋酸，不挥发酸基本不能检出，导致口感尖酸、风味单一。发明专利一种猕猴桃果醋及其 制备方法(申请公布号：CN 105925461 A)，采用普通乳酸菌和醋酸菌复配接种的方式，虽 然产生了乳酸，但是最终仅获得了总酸为4.0-4.5g/100mL，乳酸为0.028-0.036g/100mL的果 醋，对于风味口感的提升十分有限。
发明内容
为了解决现有液态醋不含有不挥发酸、口感单一的问题，本发明提供一种新型乳酸菌及 其在液态醋酿造中的应用，利用从固态发酵醋池中筛选的菌株并经育种、等离子束诱变的方 式选育出的乳酸菌，和醋酸菌复配接种发酵进行液态酿醋，能够在保证总酸不受影响的情况 下，提高乳酸含量，使得液态醋口感饱满柔和，提升液态醋品质。
本发明通过下述技术方案实现：
本发明提供一种乳酸菌RS1，所述乳酸菌RS1的分类命名为：发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum，保藏编号为：CGMCC No.19739，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物菌种保藏中心，保藏日期为：2020年4月26日，保藏地址为：中国北京市朝阳 区北辰西路1号院3号。
进一步的，乳酸菌RS1的选育方法包括如下步骤：1)从固态发酵醋池中筛选乳酸菌株： 取发酵14天的醋醅在培养基上培养，选取乳酸含量最高的菌株，命名为FL菌株；2)取FL菌体测序确认为乳酸菌；3)RS1菌株的诱变选育：将出发菌株FL接种到MRS液体培养基 中，37℃静置培养3天；取2mL菌液离心，而后进行等离子束诱变，诱变结束后，将菌液涂 布到含有7％乙醇的pH为3.0的MRS固体培养基上，37℃培养5～7天后，挑出直径较大的 单菌落，接种到含有8％体积乙醇、6％体积乙酸的MRS液体培养基中，37℃静置培养5～7 天，培养结束后，测定发酵液中的乳酸含量和菌体量，选育出乳酸含量最高的菌株RS1。
一种新型乳酸菌在液态醋酿造中的应用，包括如下步骤：1)取粉碎大米和水按照混合并 加入糖化酶、液化酶制备糖醪液；2)将酵母按照0.1～0.5％的接种量，乳酸菌RS1按照0.5～5％ 的接种量接入糖醪液进行酒精发酵2～4d，制得酒醪液；3)将2)中的酒醪液压滤除菌得酒醪 液清液；4)按照0.5～5％的接种量接种醋酸菌至酒醪液清液中，并加入硫酸铵0.5～2g/L，发 酵3～7d；5)醋酸发酵结束后调整总酸至50～70g/L，并加入葡萄糖，将培养5～7d的乳酸菌 RS1按照0.5～5％的接种量接入进行二次乳酸发酵，发酵3～7d后结束。
本发明是基于液态醋中基本不含乳酸、常规乳酸菌耐酸耐乙醇能力较弱等问题而开展的。 常规酵母在总酸超过4.5g/100mL后生长能力受到极大限制，常规的乳酸菌在酒精发酵阶段接 入时会因乙醇的大量生成而抑制乳酸的合成，大米和水的料液比虽然能够调节酒精产量，但 是料液比太大会降低设备利用率，增加生产成本；同时目前报道的乳酸菌在酒精度为8°以 上的酒醪液中生长缓慢、产酸能力太弱；此外，酒精发酵结束后进行醋酸发酵，在醋酸发酵 阶段，醋酸菌会利用酒精发酵阶段产生的乳酸，将乳酸分解为CO2和水或者其他代谢产物， 从而减少液态醋中的乳酸含量。
本发明选育的乳酸菌RS1具有优良的耐酸能力，通过在酒精发酵阶段加入乳酸菌RS1， 醋酸发酵后补糖并再次加入RS1进行二次乳酸发酵的方式，明显提高了液态醋乳酸、2,3-丁 二醇、乙偶姻、乳酸乙酯含量，弥补醋酸发酵阶段消耗的乳酸，最终获得高乳酸液态醋，使 得产品质量得到极大提升。
进一步的，大米和水的料液比1：5-6，液化酶、糖化酶的加入量为0.1％。
更进一步的，步骤2)中发酵培养温度为28～32℃。
更进一步的，步骤4)中，发酵罐中培养温度为30～33℃。
更进一步的，步骤5)中，二次乳酸发酵培养温度为35～38℃，葡萄糖加入量为20～40g/L。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用，利用从固态发酵醋池中筛选的菌 株并经育种、等离子束诱变的方式选育出的乳酸菌RS1，具有优良的耐酸能力，和醋酸菌复 配接种发酵进行液态酿醋，能够在保证总酸不受影响的情况下，提高了乳酸含量；
2、本发明一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用，通过在酒精发酵阶段加入乳酸菌 RS1，醋酸发酵后补糖并再次加入RS1进行二次乳酸发酵的方式，明显提高了液态醋乳酸、 2,3-丁二醇、四甲基吡嗪、乳酸乙酯含量，弥补醋酸发酵阶段消耗的乳酸，最终获得高乳酸液 态醋，使得产品质量得到极大提升。
附图说明
图1为本发明液态醋酸酿造路线图；
图2为本发明乳酸菌RS1选育流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一 步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的 限定。
实施例1
如图2所示，乳酸菌RS1的选育，包括高产乳酸FL出发菌株的获得和RS1菌株的诱变选育。
1.1高产乳酸FL出发菌株的获得
取发酵14天的醋醅5g，用100mL生理盐水混匀，过滤除渣，滤液按照一定比例稀释并 涂布到MRS固体培养基上，37℃培养5～7天；挑取平板上长出的单菌落至MRS液体培养基， 37℃静置培养5天；培养结束后，取培养液离心过滤用液相法测定培养液中的乳酸含量，选 取乳酸含量最高的菌株，命名为FL。从表1可知，从醋醅中筛选获得的乳酸菌中FL菌株产 酸能力最强，乳酸含量达到9.35g/L，因而选取该菌株命名为FL做进一步实验。
所述MRS液体培养基组分为(g/L):酵母浸粉5.0、胰酪蛋白胨10.0、磷酸二氢钾6.0、 硫酸亚铁0.034、硫酸镁0.575、葡萄糖20.0、乙酸钠25.0、柠檬酸铵2.0、硫酸锰0.12、琼脂 15.0、山梨酸1.0、pH值5.5。MRS固体培养基在液体培养基的基础上加入20g/L的琼脂粉和 1g/L的纳他霉素。
液态醋中乳酸含量检测采用高效液相法测定，样液经过0.22μm微孔滤膜过滤，Sep-Pak C18柱预处理柱，以NaH2PO4缓冲液(pH 2.7)为流动相，用高效液相色法在C18色谱柱上 分离，柱温40℃，流速0.8ml/L，于210nm处经紫外检测器检测，用峰高或峰面积标准曲线 测定有机酸的含量。液态醋中氨氮、总酸检测方法参加国标GB 2717-2018。
表1醋醅中筛选出不同乳酸菌发酵性能比较
菌株编号 乳酸(g/L)
FL 9.35
1 6.74
2 7.29
3 8.58
4 7.83
1.2FL菌株的分子生物学鉴定
将FL菌株在MRS培养基上培养完毕，取菌体并用试剂盒提取DNA，用细菌通用16S引物进行PCR扩增，将扩增产物连接到T载体上，送测序公司测序。
将得到的FL菌株16S序列经NCBI比对，确认该菌株为Lactobacillus.fermentum。
1.3乳酸菌RS1菌株的诱变选育
将出发菌株FL接种到MRS液体培养基中(装液量为100mL的250mL三角瓶)，37℃ 静置培养3天；取2mL菌液离心，用生理盐水洗涤两次，而后进行等离子束诱变；诱变结束 后，将菌液涂布到含有7％乙醇的pH为3.0的MRS固体培养基上，37℃培养5～7天后，挑 出直径较大的单菌落，按照1-100进行编号。
将挑出的菌落接种到含有8％体积乙醇、6％体积乙酸的MRS液体培养基中，37℃静置培 养5～7天，培养结束后，采用高效液相法测定发酵液中的乳酸含量和菌体量，选育出乳酸含 量最高的菌株RS1。筛选出的RS1菌株保藏到中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为 CGMCC No.19739。
1.4乳酸菌RS1菌株的乙醇和醋酸耐受能力测定
从活化斜面上将RS1菌株和FL出发菌株分别接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养 5天作为种子液；而后按照2％的接种量分别将种子液接种至含有6％乙醇和6％乙酸的MRS 液体培养基中，37℃静置培养7天，测定RS1菌株和FL出发菌株发酵液乳酸和生物量。如表2所示，RS1在高酸高醇条件下，乳酸含量最高，RS1对乙醇和乙酸的耐受力明显优于FL 出发菌株。
表2RS1菌株和FL出发菌株在高醇高酸条件下发酵性能比较
菌株 乳酸(g/L) 菌体量(g/L)
RS1 8.35 3.75
FL 2.48 1.39
实施例2
乳酸菌RS1在液态醋酿造中的应用，如图包括以下步骤：
(1)将活化好的新鲜斜面接种一环至酱油种子培养基，37℃静置培养5天；
(2)按照5％接种量将步骤(1)中的种子液再次在酱油种子培养基中活化一次，37℃静 置培养5天，待用；
(3)大米和水按照1：5的料液比(质量/体积比)混匀，然后进行液化、糖化，并调整初始pH至5.8；
(4)步骤(3)中的糖醪液按照1％(体积/体积比)和0.1％(质量/体积比)的比例分别 接种步骤(2)中的RS1和安琪活性干酵母，30℃培养3天；
(5)将步骤(4)中的液体滤出，除渣备用；
(6)将刚活化好的新鲜醋酸菌CGMCC 1.508按照5％的接种量接种至步骤(5)中酒醪 清液，37℃、200rpm培养2～3天，待乙醇消耗完毕之后，测定总酸，将总酸调整至65g/L后过滤除菌得醋酸液；
所述酱油种子培养基为：10％的酱油原油(体积/体积比)、40g/L葡萄糖、硫酸铵1g/L。
实施例3
乳酸菌RS1在液态醋酿造中的另一种应用，如图1所示，包括以下步骤：
(1)将活化好的新鲜斜面接种一环至酱油种子培养基，37℃静置培养5天；
(2)按照5％接种量将步骤(1)中的种子液再次在酱油种子培养基中活化一次，37℃静 置培养5天，待用；
(3)大米和水按照1：5的料液比(质量/体积比)混匀，然后进行液化、糖化，并调整初始pH至5.8；
(4)步骤(3)中的糖醪液按照1％(体积/体积比)和0.1％(质量/体积比)的比例分别 接种步骤(2)中的RS1和安琪活性干酵母，30℃培养3天；
(5)将步骤(4)中的液体滤出，除渣备用；
(6)将刚活化好的新鲜醋酸菌CGMCC 1.508按照5％的接种量接种至步骤(5)中酒醪 清液，37℃、200rpm培养3～7天，待乙醇消耗完毕之后，过滤除菌得醋酸清液；
(7)将步骤(6)中得醋酸清液醋酸稀释调整为乙酸浓度为65g/L，添加30g/L的葡萄糖、 0.1g/L的硫酸铵，按照5％的接种量接入步骤(2)中的乳酸菌，37℃静置培养5d。
所述酱油种子培养基为：10％的酱油原油(体积/体积比)、40g/L葡萄糖、硫酸铵1g/L。
实施例4
本实施例为空白对照实施例，发酵过程中不接种乳酸菌RS1，其余操作方式同实施例3。
对实施例2-4制得的液态醋中的总酸、乳酸、乳酸乙酯2，3-丁二醇、四甲基吡嗪的含量 进行测定，如表3所示。乳酸乙酯2，3-丁二醇和四甲基吡嗪测定方法如下：GC装配Agilent DB-wax毛细管色谱柱(30m*0.25mm*0.25μm)作为分离柱；程序升温：初温40℃，维持5min，后以5℃/min速率升温至60℃，再以10℃/min速率升温至230℃，并维持8min。 进样口温度230℃，不分流，载气为氦气，流速1.0mL/min。电离方式：电子电离(Electronicionization,EI)；电子能量：70eV；电压350V；连接口温度280℃；离子源温度230℃；四 极杆温度150℃；质量扫描范围m/z 33-450。
表3发酵指标测定
Figure BDA0002557901330000051
从表3中可以看出，实施例2和实施例3接入了发明的乳酸菌RS1，实施例4的液态醋生产过程中则没有接入本发明的乳酸菌RS1，和实施例4相比，实施例2和实施例3在总酸 含量相当的情况下，乳酸含量显著增加，提高了20倍左右，而乳酸乙酯则提高了50-60倍， 2,3-丁二醇也增加了一倍，同时实施例4并未检测出四甲基吡嗪，而实施例2和实施例3中则含有大量的四甲基吡嗪，即加入本发明的乳酸菌RS1，大大提高了了液态醋中乳酸、2,3-丁二 醇、四甲基吡嗪、乳酸乙酯的含量。
实施例2和实施例3相比，实施例2中只在醋酸发酵过程中加入了乳酸菌RS1，实施例3 则在醋酸发酵阶段后补糖并再次加入乳酸菌RS1进行二次乳酸发酵，可以看出实施例3液态 醋中乳酸、2,3-丁二醇、四甲基吡嗪、乳酸乙酯的含量均略高于实施例2，说明二次乳酸发弥 补了醋酸发酵阶段消耗的乳酸，最终获得高乳酸液态醋，使得产品质量得到极大提升。
本发明的乳酸菌RS1在高浓度乙醇和乙酸条件下发酵性能优良，通过在制备酒醪液时接 种RS1、醋酸发酵结束后再次补糖和接种乳酸菌RS1的方式，极大提高了液态醋中乳酸含量， 乳酸最高含量达到3.57g/L，并且液态醋中的乳酸乙酯、2,3-丁二醇、四甲基吡嗪都有了明显 提升，明显改善了液态醋风味口感。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种新型乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸菌RS1，保藏编号为：CGMCCNo.19739，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心。
2.根据权利要求1所述的一种新型乳酸菌，其特征在于，乳酸菌RS1的选育方法包括如下步骤：1)从固态发酵醋池中筛选乳酸菌株：取发酵14天的醋醅在培养基上培养，选取乳酸含量最高的菌株，命名为FL菌株；2)取FL菌体测序确认为乳酸菌；3)RS1菌株的诱变选育：将出发菌株FL接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养3天；取2mL菌液离心，而后进行等离子束诱变，诱变结束后，将菌液涂布到含有7％乙醇的pH为3.0的MRS固体培养基上，37℃培养5～7天后，挑出直径较大的单菌落，接种到含有8％体积乙醇、6％体积乙酸的MRS液体培养基中，37℃静置培养5～7天，培养结束后，测定发酵液中的乳酸含量和菌体量，选育出乳酸含量最高的菌株RS1。
3.一种新型乳酸菌在液态醋酿造中的应用，其特征在于，包括如下步骤：1)取粉碎大米和水按照混合并加入糖化酶、液化酶制备糖醪液；2)将酵母按照0.1～0.5％的接种量，乳酸菌RS1按照0.5～5％的接种量接入糖醪液进行酒精发酵2～4d，制得酒醪液；3)将2)中的酒醪液压滤除菌得酒醪液清液；4)按照0.5～5％的接种量接种醋酸菌至酒醪液清液中，并加入硫酸铵0.5～2g/L，发酵3～7d；5)醋酸发酵结束后调整总酸至50～70g/L，并加入葡萄糖，将培养5～7d的乳酸菌RS1按照0.5～5％的接种量接入进行二次乳酸发酵，发酵3～7d后结束。
4.根据权利要求3所述的一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用，其特征在于，大米和水的料液比1：5-6，液化酶、糖化酶的加入量为0.1％。
5.根据权利要求3所述的一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用，其特征在于，步骤2)中发酵培养温度为28～32℃。
6.根据权利要求3所述的一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用，其特征在于，步骤4)中，发酵罐中培养温度为30～33℃。
7.根据权利要求3所述的一种新型乳酸菌及其在液态醋酿造中的应用，其特征在于，步骤5)中，二次乳酸发酵培养温度为35～38℃，葡萄糖加入量为20～40g/L。
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