CN106701912A - 一种Illumina Miseq测序平台检测奶粉中的益生菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及奶粉检测技术领域，尤其涉及一种Illumina Miseq测序平台检测奶粉中的益生菌的方法，所述方法包括如下步骤：(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心取上清，再进行第二次离心取沉淀，加入缓冲液震荡，再加入溶菌酶反应后进行基因组DNA的提取；(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1‑v3区，选用特异性引物进行PCR扩增；(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。Illumina MiSeq测序方法分析有效的避免了通量低、操作复杂和准确率低等缺陷，不仅可实现对多样品的多个可变区同时测序，而且在测序速度和测序通量上都有进一步提升，检测结果可信度高。
Description
技术领域
本发明涉及奶粉检测技术领域，涉及一种奶粉中益生菌的检测方法，尤其涉及一种Illumina Miseq测序平台检测奶粉中的益生菌的方法。
背景技术
肠道菌群的组成对人体营养、免疫、癌症和衰老等有着密切的关系，促进肠道中有益菌的增殖，抑制有害细菌的生长，对于预防由于生活习惯不善而导致的疾病有着重要意义。益生菌的应用也随着研究的深入越来越广泛，目前，用做益生菌的微生物均是来源于人或动物，益生菌制品多用乳酸菌和双歧杆菌这两个属的菌。随着益生菌研究的进行及知识普及，大众倾向于购买标明已添加益生菌的奶粉，食品中的微生物检测缺少快捷、准确的检测方式，且益生菌不同于其他的营养强化剂，对生产、保存环境要求相对严格。
近年来，随着微生态制剂相关研究的深入，微生态制剂已经被广泛应用于乳制品、功能性食品，作为膳食补充剂调节人体健康状态。益生菌类食品的产生及盛行，是微生态制剂发展及人们对生活水平追求的提高等多重因素引导下产生的结果。
根据卫生部公告2011年第25号《可用于婴幼儿食品的菌种名单》，目前可添加到婴幼儿食品中的菌种有嗜酸乳杆菌NCFM、动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌HN019、乳双歧杆菌Bi-07、鼠李糖乳杆菌HN001、鼠李糖乳杆菌LGG七种，其中嗜酸乳杆菌NCFM仅限用于1岁以上幼儿的食品。其中，动物双歧杆菌是人和许多哺乳动物肠道中的优势菌之一，由于具有抑制腐败菌和条件致病菌生长、合成维生素、提高机体免疫力及抗衰老等作用，因此被广泛应用。目前市场上的婴幼儿奶粉中，产品标示添加的益生菌菌种主要为动物双歧杆菌Bb-12。
此前研究微生物多样性通常使用Sanger第一代测序技术，主要以DNA单链为模板，加入荧光标记及核苷酸进行聚合酶链式反应扩增，通过凝胶电泳进行分离纯化后进行荧光检测，获得碱基组成序列，但其成本高、测序通量低、信息不精确。
中国酿造2014Vol.33No.5Serial No.267，焦晶凯等发表了“IllumniaMiSeq平台高覆盖率测定干酪中的细菌微生物多样性”采用第二代测序Illumina MiSeq方法测定了来自内蒙古4个不同地区的自然成熟干酪中的细菌微生物多样性。Illumnia MiSeq方法可以快速有效地测定微生物的组成结构及其分布。分析了4种干酪样品中菌种类别和丰度分布、群落组成、不同样品间物种差异及进化关系等，全面的展现了干酪中细菌微生物的多样性分布。但干酪和奶粉并不相同，奶粉生产上市后，益生菌的活菌数会逐渐下降，一般来说，益生菌的活菌数和储存温度及时间成反比关系。奶粉中的益生菌发挥保健效果的关键是必须保持产品中有足够的菌株数量。因此，需要检测奶粉中的益生菌含量。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种Illumina Miseq测序平台检测奶粉中的益生菌的方法，通过Illumina Miseq平台测定婴幼儿奶粉中的微生物组成，确认商品标识及食品实际含菌情况是否相符，探讨婴幼儿乳粉中益生菌的添加情况。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种检测奶粉中的益生菌的方法，尤其是一种利用IlluminaMiseq测序平台来检测奶粉中益生菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心取上清，再进行第二次离心取沉淀，加入缓冲液震荡，再加入溶菌酶反应后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物进行PCR扩增；
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
本发明中，所述特异性引物为可扩增出细菌16s rDNA的v1-v3区的通用引物，下文提到的引物都可用于扩增奶粉中细菌16s rDNA的v1-v3区。
优选地，步骤(1)所述第一次离心的转速为2000-5000r/min，例如可以是2000r/min、2300r/min、2500r/min、3000r/min、3200r/min、3500r/min、4000r/min、4300r/min、4500r/min或5000r/min，优选为3000-4500r/min，进一步优选为4000r/min。
优选地，步骤(1)所述第一次离心的时间为1-10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，优选为3-8min，进一步优选为5min。
优选地，步骤(1)所述第二次离心的转速为10000-15000r/min，例如可以是10000r/min、10500r/min、11000r/min、11500r/min、12000r/min、12500r/min、13000r/min、13500r/min、14000r/min、14500r/min或15000r/min，优选为11000-13000r/min，进一步优选为12000r/min。
优选地，步骤(1)所述第二次离心的时间为5-20min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，优选为8-15min，进一步优选为10min。
优选地，步骤(1)所述缓冲液为裂解缓冲液。
优选地，步骤(1)所述缓冲液加入的体积为100-500μL，例如可以是100μL、110μL、120μL、130μL、150μL、160μL、180μL、200μL、210μL、220μL、230μL、250μL、280μL、300μL、310μL、330μL、350μL、380μL、400μL、410μL、430μL、450μL、480μL或500μL，优选为150-300μL，进一步优选为200μL。
优选地，步骤(1)所述溶菌酶的加入量为3-20μL，例如可以是3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL或20μL，优选为8-15μL，进一步优选为10μL。
本发明中所加入的溶菌酶的浓度为20mg/mL。
优选地，步骤(1)所述加入溶菌酶的反应温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为36-38℃，进一步优选为37℃。
优选地，步骤(1)所述加入溶菌酶的反应时间为10-60min，例如可以是10min、12min、13min、15min、18min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，优选为25-50min，进一步优选为40min。
优选地，步骤(2)所述特异性引物为27F和534R，27F和519R，27F和530R，优选为27F和534R。
本发明中，所述引物都能扩增出奶粉中细菌16s rDNA的v1-v3区。
优选地，步骤(2)所述PCR扩增的条件为：(a)50℃预变性2min，95℃预变性3min；(b)98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环。
优选地，所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心4000r/min离心5min，取上清，再进行第二次离心12000r/min离心10min，取沉淀，加入200μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶37℃反应40min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物27F和534R进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：(a)50℃预变性2min，95℃预变性3min；(b)98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
第二方面，本发明提供一种用于Illumina Miseq测序平台检测奶粉的特异性PCR扩增引物，所述PCR扩增引物的序列包括：SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列：AGRGTTYGATYCTGGCTCAG(上游引物)；
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：ATTACCGCGGCTGCTGG(下游引物)。
优选地，所述引物用于扩增奶粉中细菌的16s rDNA的v1-v3区。
本发明中，所述用第二方面所述的特异性PCR扩增引物的方法，包括如下步骤：(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心取上清，再进行第二次离心取沉淀，加入缓冲液震荡，再加入溶菌酶反应后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用第二方面所述特异性引物进行PCR扩增；
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
优选地，步骤(1)所述第一次离心的转速为2000-5000r/min，例如可以是2000r/min、2300r/min、2500r/min、3000r/min、3200r/min、3500r/min、4000r/min、4300r/min、4500r/min或5000r/min，优选为3000-45000r/min，进一步优选为4000r/min。
优选地，步骤(1)所述第一次离心的时间为1-10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，优选为3-8min，进一步优选为5min。
优选地，步骤(1)所述第二次离心的转速为10000-15000r/min，例如可以是10000r/min、10500r/min、11000r/min、11500r/min、12000r/min、12500r/min、13000r/min、13500r/min、14000r/min、14500r/min或15000r/min，优选为11000-13000r/min，进一步优选为12000r/min。
优选地，步骤(1)所述第二次离心的时间为5-20min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，优选为8-15min，进一步优选为10min。
优选地，步骤(1)所述缓冲液为裂解缓冲液。
优选地，步骤(1)所述缓冲液加入的体积为100-500μL，例如可以是100μL、110μL、120μL、130μL、150μL、160μL、180μL、200μL、210μL、220μL、230μL、250μL、280μL、300μL、310μL、330μL、350μL、380μL、400μL、410μL、430μL、450μL、480μL或500μL，优选为150-300μL，进一步优选为200μL。
优选地，步骤(1)所述溶菌酶的加入量为3-20μL，例如可以是3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL或20μL，优选为8-15μL，进一步优选为10μL。
本发明中所加入的溶菌酶的浓度为20mg/mL。。
优选地，步骤(1)所述加入溶菌酶的反应温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为36-38℃，进一步优选为37℃。
优选地，步骤(1)所述加入溶菌酶的反应时间为10-60min，例如可以是10min、12min、13min、15min、18min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，优选为25-50min，进一步优选为40min。
优选地，步骤(2)所述PCR扩增的条件为：(a)50℃预变性2min，95℃预变性3min；(b)98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环。
优选地，所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心4000r/min离心5min，取上清，再进行第二次离心12000r/min离心10min，取沉淀，加入200μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶37℃反应40min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物27F和534R进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：(a)50℃预变性2min，95℃预变性3min；(b)98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将Illumina Miseq测序用于奶粉中益生菌的检测，有效避免了通量低、操作复杂和准确率低等缺陷，直接从扩增高变区进行测序，避免了不可培养菌株的不可测性，客观还原菌群结构及丰度比例，测序结果更具可信度。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实验材料：
溶菌酶 上海励瑞生物科技有限公司；
蛋白酶k 上海励瑞生物科技有限公司；
TE缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；
缓冲液GA 天根生化科技(北京)有限公司。
实验仪器：
PTC-200PCR仪 美国BIO-RAD公司；
Stratos冷冻高速离心机 美国赛默飞世尔科技公司；
ULT-1786-6V超低温冰箱 美国赛默飞世尔科技公司；
Illumina Miseq测序仪 美国Illumina公司；
细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)天根生化科技(北京)有限公司；
Simplicity超纯水仪 德国Merck Millipore公司。
检测的奶粉样品及品牌为雅培、雀巢、麦蔻、英氏思美乐、蜜儿乐儿、赐多利佑蓓、美素佳儿、升倍和纳乐。
实施例1：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心4000r/min离心5min，取上清，再进行第二次离心12000r/min离心10min，取沉淀，加入200μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶37℃反应40min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物27F和534R进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例2：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心2000r/min离心10min，取上清，再进行第二次离心15000r/min离心5min，取沉淀，加入100μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶35℃反应60min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物27F和519R，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例3：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心5000r/min离心1min，取上清，再进行第二次离心10000r/min离心5min，取沉淀，加入500μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶40℃反应10min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物27F和530R，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例4：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心3500r/min离心8min，取上清，再进行第二次离心13000r/min离心12min，取沉淀，加入300μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶36℃反应50min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物27F和534R，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例5：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心4000r/min离心5min，取上清，再进行第二次离心12000r/min离心10min，取沉淀，加入200μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶37℃反应40min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，进行PCR扩增，
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列：AGRGTTYGATYCTGGCTCAG(上游引物)；
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：ATTACCGCGGCTGCTGG(下游引物)。
PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例6：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心2000r/min离心10min，取上清，再进行第二次离心15000r/min离心5min，取沉淀，加入100μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶35℃反应60min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物选用特异性引物SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，进行PCR扩增，
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列：AGRGTTYGATYCTGGCTCAG(上游引物)；
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：ATTACCGCGGCTGCTGG(下游引物)。
进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例7：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心5000r/min离心1min，取上清，再进行第二次离心10000r/min离心5min，取沉淀，加入500μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶40℃反应10min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物选用特异性引物SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，进行PCR扩增，
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列：AGRGTTYGATYCTGGCTCAG(上游引物)；
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：ATTACCGCGGCTGCTGG(下游引物)。
进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例8：准备检测奶粉样品
所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心3500r/min离心8min，取上清，再进行第二次离心13000r/min离心12min，取沉淀，加入300μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶36℃反应50min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物选用特异性引物SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，进行PCR扩增，
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列：AGRGTTYGATYCTGGCTCAG(上游引物)；
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：ATTACCGCGGCTGCTGG(下游引物)。
进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
一组以水为样本的阴性对照。
反应条件如下：
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
实施例7：测序结果
本实验共测序样品15个，其中雅培为1和13号样品、雀巢为2号样品、麦蔻为3号样品、英氏思美乐为4和5号样品、蜜儿乐儿为6和7号样品、赐多利佑蓓为8和15号样品、美素佳儿为9、10和12号样品、升倍为11号样品和纳乐为14号样品。
每个样本获得的原始测序reads数目(raw-Reads)和去除嵌合体后每个样本获得的测序reads(clean-Reads)数目见表1，各样本数据量已达到可继续分析的测序深度。样品1和样品13分别测序3次，其余样品测序1次。
表1
实施例8：奶粉中微生物含量
样品测序后，测得的菌种数为12种，可分为3属，如表2所示，分别为链球菌属(Streptococcus、59.90％)、乳杆菌属(Lactobacillus、31.36％)、双歧杆菌属(Bifidobacterium、10.85％。
15个样品中，8个样品中的链球菌属所占百分比超过50％，仅9号样品中链球菌属所占比例低于20％；乳杆菌属与双歧杆菌属在各样品中百分比差异较大，其中，双歧杆菌属在11个样品中百分比低于10％。
表2
菌种相对丰度较低且所占比例低于1％的菌种合并为其他进行表示，样品测序后所得到的菌种结果与商品标示进行比较，如表3所示，15个样品的商品菌种标示均与实际检测结果不符，13个样品标示菌种的实际百分比不超过15％，仅12号样品标示菌种的实际百分比超过50％，且13号样品的商品标示不规范，将乳双歧杆菌Bi-07写为乳双歧杆菌bi-07，嗜酸乳杆菌没有标明具体菌株名称。8个样品的链球菌属百分比超过50％，但商品均无标示。同一品牌的样品1号及13号中均标注添加了嗜酸乳杆菌NCFM，却没有明确标识1岁以上幼儿才可食用。15个样品中允许用于婴幼儿食品中的菌种平均占比为23.63％，未被允许用于婴幼儿食品的嗜热链球菌及植物乳杆菌平均占比分别为57.79％、17.89％，其中只有3个样品的植物乳杆菌占比低于5％，仅1个样品的嗜热链球菌占比低于20％。由此看出，产品的商品标示与菌种添加存在不规范的现象。
表3
奶粉生产上市后，益生菌的活菌数会逐渐下降，一般来说，益生菌的活菌数和储存温度及时间成反比关系。在研究中我们发现，样品中商品标示添加的益生菌虽以双歧杆菌为主，但双歧杆菌属的菌种相对含量最低，嗜热链球菌所占比例最高，此种情况可能有以下原因，一是因为在生产加工过程中双歧杆菌的添加量本就偏少，二是由于奶粉的储存时间的增长，与氧气的接触导致专性厌氧的双歧杆菌大量失活，三是因为奶粉的储存环境不是双歧杆菌的最适生长条件，多种微生物同时存在，嗜热链球菌在奶粉中更易占据生长优势等。
检测的15个样品中，分别来自9个不同的品牌，不同品牌的各菌种相对丰度不同，来自同一品牌的产品在菌种比例上区别也较大，表示益生菌奶粉在生产过程中益生菌的含量难以严格控制，储存方式也会对其益生菌组成造成影响。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心取上清，再进行第二次离心取沉淀，加入缓冲液震荡，再加入溶菌酶反应后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物进行PCR扩增；
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一次离心的转速为2000-5000r/min，优选为3000-4500r/min，进一步优选为4000r/min；
优选地，步骤(1)所述第一次离心的时间为1-10min，优选为3-8min，进一步优选为5min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第二次离心的转速为10000-15000r/min，优选为11000-13000r/min，进一步优选为12000r/min；
优选地，步骤(1)所述第二次离心的时间为5-20min，优选为8-15min，进一步优选为10min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲液为裂解缓冲液；
优选地，步骤(1)所述缓冲液加入的体积为100-500μL，优选为150-300μL，进一步优选为200μL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述溶菌酶的加入量为3-20μL，优选为8-15μL，进一步优选为10μL；
优选地，步骤(1)所述加入溶菌酶的反应温度为35-40℃，优选为36-38℃，进一步优选为37℃；
优选地，步骤(1)所述加入溶菌酶的反应时间为10-60min，优选为25-50min，进一步优选为40min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述特异性引物为27F和534R，27F和519R，27F和530R，优选为27F和534R。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的条件为：(a)50℃预变性2min，95℃预变性3min；(b)98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的利用Illumina Miseq测序平台检测奶粉中益生菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)奶粉基因组DNA的提取：将奶粉冲泡后，进行第一次离心4000r/min离心5min，取上清，再进行第二次离心12000r/min离心10min，取沉淀，加入200μL裂解缓冲液震荡至菌体彻底悬浮，再加入溶菌酶37℃反应40min后进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增：针对细菌16s rDNA的v1-v3区，选用特异性引物27F和534R进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：(a)50℃预变性2min，95℃预变性3min；(b)98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；
(3)Illumina Miseq测序：将PCR产物进行Illumina Miseq测序。
9.用于Illumina Miseq测序平台检测奶粉的特异性PCR扩增引物，其特征在于，所述PCR扩增引物的序列包括：SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物。
10.根据权利要求8所述的特异性PCR扩增引物，其特征在于，所述引物用于扩增奶粉中细菌的16s rDNA的v1-v3区。
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