CN102892887A - 改善发酵食品产品中风味生成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于改善发酵食品产品中风味生成的方法，本发明描述了一种嗜热链球菌株以及含有该菌株的食品产品，其中，嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。另外，本发明描述了一种用于鉴别具有改善的风味生成的嗜热链球菌株的方法，以及该菌株在改善发酵食品产品中风味生成中的应用。

Description

改善发酵食品产品中风味生成的方法
技术领域
本发明涉及使用微生物发酵的微生物学和食品加工领域，其中，使用改善食品产品中风味生成（flavor production）的嗜热链球菌株（Streptococcus thermophilus）。 
背景技术
嗜热链球菌是用于食品工业的重要的乳酸菌（LAB）。通过提高烹饪温度与德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）共同培养来生成酸乳酪，嗜热链球菌被用于生成意大利和瑞士奶酪。 
更进一步，嗜热链球菌（S.thermophilus）能够制备出不同的风味。不管怎样，由于嗜热链球菌的快速酸化能力而经常使用它。这表明存在着大量的氨基酸生物合成和转换途径。然而，根据基因组预测嗜热链球菌LMG18311不具有完整的戊糖磷酸途径。该戊糖磷酸途径满足所有的有机体对于NADPH源的需要以应用在还原性生物合成中。大多数LAB具有完整的戊糖磷酸途径。因为所有的生命有机体需要NADPH，所以嗜热链球菌需要替代途径来合成NADPH。 
根据可用的嗜热链球菌的基因组尺度模型（Pastink等.应用环境微生物.2009,卷75,号11:3627-3633）预测谷氨酸脱氢酶是产生NADPH最相似的途径。通常，显示谷氨酸脱氢酶（GDH）活性的菌株能够从谷氨酸（Glu）中产生α-酮戊二酸（α-KG），因而其能够在含有Glu的反应介质中降解氨基酸。 
发明内容
嗜热链球菌的基因组尺度模型表明不存在戊糖磷酸途径的氧化部分以及需要替代的产生NADPH的代谢途径。代谢模型（metabolic model）表明氨基酸代谢和特定的谷氨酸脱氢酶将提供这种NADPH。 
因而，本发明人着手找到嗜热链球菌使用哪种途径来产生NADPH。使用可用的嗜热链球菌（在上（supra））的基因组尺度模型且这种模型最初预测谷氨酸脱氢酶作为产生NADPH的最相似的途径。本发明人构造了这种基因的敲除（knock-out）且分析了由生长实验、发酵性能和基于转录水平获得的突变体。 
发现通过提高了的氨产量证明，嗜热链球菌中GDH的瓦解导致氨基酸代谢的活性升高。因为GDH产品α-酮戊二酸被视为氨基酸代谢中必要的因素，所以这一点是非常奇怪的。他们还发现具有非活性GDH的嗜热链球菌株与具有活性GDH的同种嗜热链球菌株相对比具有改善的风味口感（flavor profile）。 
本发明的一个目的是提供具有改善的风味生成能力的嗜热链球菌株。由嗜热链球菌利用的更多的氨基酸也将导致酸奶酪中共同培养的保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）的数量更少。因为保加利亚乳杆菌导致了酸奶酪发酵结束时的强酸化，这将导致酸奶酪中较少地发生后酸化，以及同样导致酸奶酪的口味平淡。 
因而，本发明的第一个方面涉及一种增强发酵液中风味生成的方法，所述方法包括使用嗜热链球菌株将发酵培养基发酵的步骤，其中，嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。 
本发明另一方面涉及一种嗜热链球菌株，其中，所述嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。 
本发明另一方面提供了一种含有嗜热链球菌株的发酵液，其中，所述嗜 热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。 
本发明进一步是针对含有嗜热链球菌株的食品产品，其中，所述嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的，或是针对含有嗜热链球菌株的发酵液，其中，所述嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。 
本发明也涉及一种用于鉴别具有增强风味生成的嗜热链球菌株的方法，所述方法包括在嗜热链球菌株中筛选GDH活性的步骤。 
本发明另一方面涉及嗜热链球菌株在改善发酵食品产品尤其是酸奶酪或乳酪中的风味生成中的应用，其中，嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。 
本发明最后一方面涉及与使用活性GDH的嗜热链球菌株制备的酸奶酪相对比，氨酸脱氢酶是非活性的嗜热链球菌株在获得酸奶酪中保加利亚乳杆菌的减少的CFU中的应用。 
附图说明
下面参考附图将详细解释本发明。 
图1表明在CDM上生长的发酵样品嗜热链球菌的顶部空间的GC-MS分析；样品是在指数生长期（OD600～1.3）结束时采集的。 
具体实施方式
本发明涉及一种增强发酵液中风味生成尤其是由嗜热链球菌产生的风味生成的方法，所述方法包括使用嗜热链球菌株将发酵培养基发酵的步骤，其中，嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶已被灭活。 
本发明的方法可以包括以下步骤：a）提供发酵培养基；b）用至少一种嗜热链球菌株接种发酵培养基，其中，嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶已被灭活；c）进行发酵以获得发酵液；以及任选地d）使用全部或部分发酵液来制 备食品产品。 
发酵液本身可以作为提供风味的介质或可以从发酵液中离析出产生的风味化合物，以及随后可以被应用在食品产品、饲料产品等等的制备中。 
如本文中使用的术语“增强风味生成”是指对食品产品提供风味起重要作用的至少一种化合物的数量的增加的生成。含有非活性谷氨酸脱氢酶（下文也称作为“非活性GDH”）的嗜热链球菌株在风味生成上的改善，将在与具有显著的谷氨酸脱氢酶活性的谷氨酸脱氢酶（活性GDH）的同种嗜热链球菌株的对比中被确定。如本文所使用的，与具有显著的谷氨酸脱氢酶活性的谷氨酸脱氢酶（活性GDH）（“亲代菌株”）的同种嗜热链球菌株相对比，非活性GDH菌株将至多具有约为10%，例如约8%、约7%、约6%、约5%、约3%，优选约2%以及甚至更优选约为1%的残留的GDH活性。术语“具有显著的谷氨酸脱氢酶活性的谷氨酸脱氢酶（活性GDH）（“亲代菌株”）的同种嗜热链球菌株”用来表示该菌株是从其中得到非活性GDH的嗜热链球菌株的菌株。 
当非活性GDH菌株产生至少约5%、优选至少约10%或约15%的多于至少一种对风味生成起重要作用的化合物时，非活性GDH菌株中的风味生成将增强或改善。对风味生成起重要作用的化合物没有限定，所述化合物包括乙醛、甲硫醇、2-甲基丙醛、2-丁酮、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、二甲基二硫醚（DMDS）、3-甲基-2-丁醛、2-庚酮、甲硫基丙醛（methional）、庚醛、苯甲醛、二甲基三硫醚（DMTS）、2-壬酮、2-十一烷酮、丙酮、丁二酮以及乙酸乙酯。优选地，非活性GDH菌株增加乙醛和2-甲基丙醛中至少一种或乙醛和2-甲基丙醛二者的数量。 
在本文中也将含有非活性谷氨酸脱氢酶的嗜热链球菌株称作为非活性GDH菌株。该菌株优选为通过DNA重组技术制备的重组菌株。可以通过以下一种或多种将谷氨酸脱氢酶灭活：gdhA基因的敲除、插入或突变；用弱 启动子替代gdhA启动子；反义DNA或RNA；以及siRNA。非活性GDH菌株含有本质上非功能性的GDH。如在本文中使用的术语“本质上非功能性的GDH”意思是GDH活性是可忽略的，以及不足以提供足够的NADPH给嗜热链球菌株用来生长。 
氨基酸序列可以被改变以制备本质上非功能性的GDH。为这目的，可以将氨基酸残基敲除、插入或突变以产生非活性GDH。氨基酸序列的突变被理解为在期望位点上自然发生的氨基酸调换为另一种氨基酸。可以应用定点突变，例如，改变在GDH的催化位点的氨基酸残基，改变对底物结合（substrate binding）和辅因子结合（cofactor binding）起着重要作用的氨基酸残基，改变对GDH的正确折叠（correct folding）起着重要作用的或是GDH的结构上的重要域的氨基酸残基。可以使用定点突变将氨基酸序列突变，或可以使用随机突变，例如，使用紫外线辐照、化学突变方法或随机PCR方法选择性地将氨基酸序列突变。选择性地，可以使用熟知的敲除技术将gdhA基因部分地或全部地敲除或灭活。另一种供选择的是用弱的或非活性的启动子替代gdhA启动子，结果导致GDH的表达缺失。本领域技术人员知道如何去用另外一种启动子替代gdhA启动子。 
为了不获得活性GDH蛋白质的表达，本领域技术人员选择适当的策略引入gdhA基因的适当的突变（将谷氨酸脱氢酶编码）是常规的工作。例如，Sambrook等人描述的体外诱变（in vitro mutagenesis）的方法（分子克隆，实验室手册，第二版，1989年，美国纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社）。相应的方法在商业上也是可以以试剂盒的形式得到的（例如，美国拉由拉市，Stratagene公司的Quikchange定点突变试剂盒（Quikchange site-directed mutagenesis kit by Stratagene））。例如，可以通过本领域技术人员熟知的基因替代技术完成GDH-敲除。 
从公共数据库（例如见，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中得知嗜热链球 菌株CNRZ1066、LMG18311和LMD-9的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列。它们是完全相同的。GDH氨基酸序列含有450个氨基酸。GDH蛋白质在链球菌种（Streptococcus）中高度保守（与大多数链球菌株75%以上相同）。 
gdhA基因也可以使用反义DNA或(m)RNA或RNAi，优选siRNA，被沉默（或“被关闭”）。术语基因沉默通常用来描述通过机制而不是基因修饰的基因的关闭。也就是说，在正常环境下表达的基因通过细胞中的机制被关闭。本领域技术人员知道如何将基因沉默应用于本发明，以及如何选择和制备适当的基因沉默组建。 
本发明人已经选择将全部的gdhA基因敲除（或敲除），如下文中实施例部分所示。 
发酵培养基可以是允许嗜热链球菌发酵的任何溶液培养基。“发酵”或“发酵培养”指的是用于细菌生长的生长培养，所述细菌通常（但不是必须地）在厌氧条件下，将碳水化合物转变为乙醇和/或酸。“发酵培养基”指的是用于建立发酵培养的生长培养基，而“发酵液”通常被用来指已发酵的培养基（例如，发酵期间和/或发酵后）。然而，这二个术语在本文中可以相互交换使用且从上下文中能清楚所述的意思。发酵培养基可以是含有糖源和蛋白质源的任何发酵培养基。糖源可以是能够由使用的嗜热链球菌株发酵的任何糖源，没有限定，包括乳糖、蔗糖、右旋糖、葡萄糖等。蛋白质源可以是任何蛋白质源，包括但不限于乳蛋白质、蔬菜蛋白质、鱼蛋白质、肉蛋白质等等。尤其用来制备发酵食品产品，蛋白质源优选选自乳蛋白质和蔬菜蛋白质。 
发酵液可以是任何发酵液，但也可以是发酵食品产品，例如，液体、半固体和/或固体食品产品（营养组合物），就本身而言适合于人类和/或动物消耗。 
嗜热链球菌通过发酵含有乳蛋白质（例如牛奶）的乳型基底发酵培养基 常规地来制备酸奶酪或乳酪。嗜热链球菌也使用含有0.5-10%（w/w）的大豆蛋白质（例如豆奶）的大豆型基底发酵培养基来常规地来制备大豆酸奶酪。嗜热链球菌进一步需要如碳水化合物的碳源和能源，例如，食用糖如乳糖。优选地，乳型基底培养基（也称作为“乳培养基（milk substrate）”）是天然或复原乳、脱脂的或其它，或乳基培养基（milk-based media）或基于乳源产品的培养基。 
所述乳培养基或大豆型基底培养基可以含有通常用于奶味甜点制备的原料，固体原料例如水果、巧克力薯片或麦片、但也含有甜类产品或液体巧克力。 
有利的是，本发明的菌株用于所有类型的发酵乳品和/或大豆产品的制备上。 
因而，本发明涉及发酵乳制品的制备工艺，其中，用本发明的至少一种嗜热链球菌株来发酵乳培养基。 
可选择地，本发明也涉及发酵豆制品的制备工艺，其中，用本发明的至少一种嗜热链球菌株发酵含有0.5-10%（w/w）的大豆蛋白质（例如豆奶）的大豆型基底发酵培养基。 
本工艺也可能提供了将本发明的嗜热链球菌株与一种或多种另外的（further）细菌菌株，尤其与其它的乳酸菌结合使用。“乳酸菌”（LAB）指制备作为发酵的最后产物的乳酸或另外的有机酸（例如丙酸）的细菌，例如，该细菌不限于，乳酸杆菌（Lactobacillus）、链球菌、乳球菌（Lactococcus）、酒球菌（Oenococcus）、明串球菌（Leuconostoc）、片球菌（Pediococcus）、肉杆菌（Carnobacterium）、丙酸杆菌（Propionibacterium）、肠道球（Enterococcus）以及双歧杆菌（Bifidobacterium）属的细菌。 
优选地，所述一种或多种另外的细菌菌株选自保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）和/或双 歧杆菌。 
本发明也关于一种非活性谷氨酸脱氢酶的嗜热链球菌株。所述菌株不含有全部功能性复制的谷氨酸脱氢酶。所述菌株可以是重组菌株或天然菌株（非转基因和非突变体）。优选地，所述菌株是重组菌株。所述嗜热链球菌株优选为食品级。“食品级”指的是例如，由相关的法规机构例如美国食品和药物管理局（FDA）认定的对人和/或动物消耗是安全的。所述菌株可以如上述所述来制备。在实施方式中，所述菌株为在布达佩斯条约（the Budapest treaty）的规定下在荷兰微生物菌种保藏中心（Centraalbureau voor Schimmelcultures）保藏（2009年10月22日收到）的嗜热链球菌株CBS125184。 
另外，本发明提供了含有非活性谷氨酸脱氢酶的嗜热链球菌株的发酵液。所述发酵液本身可以是发酵食品产品，例如酸奶酪或乳酪，或所述发酵液可以用来制备食品产品。“食品”或“食品产品”指的是液体、半固体和/或固体食品产品（营养组合物），适合于人类和/或动物消耗。所述食品或食品产品本身可以是发酵的（“发酵食品产品”），例如，酸奶酪、乳酪、发酵乳等等，或所述食品或食品产品可以含有使用本发明的方法制备的发酵食品产品或发酵液。 
例如，所述发酵液可以被用于其它的食品产品例如液体食品（例如，饮料、汤、酸奶酪或酸奶饮料、奶昔、清凉饮料、果汁饮料、发酵乳制品、膳食替代品、发酵水果和/或果汁制品等）上，或固体食品/饲料（膳食、膳食替代品、零食如糖果、动物饲料、发酵乳制品、发酵食品或饲料产品、冰品、冻干食品添加剂、奶酪等）上，或半固体食品（甜点等）上。所述发酵液可以在此种食品产品制备过程中被简单地添加或使用。 
可选择地，所述发酵液可以在用于制备食品成分之前被浓缩或稀释或预处理。预处理包括过滤和/或离心、消毒、冻干、冷冻等等。所述发酵液例如 和/或预处理发酵液本质上是上述方法的初级产品。这些初级产品可以被用作例如发酵食品产品，或可以被用作食品产品的原料，例如，当制备最终食品产品时，适当数量的初级产品可以被用作原料。根据本发明的食品成分含有或由适当数量的初级产品（发酵液，例如发酵液本身或预处理的发酵液）组成。 
所述食品产品或发酵液优选为发酵食品产品本身，包括但不限于发酵乳制品例如酸奶酪、乳酪、发酵乳、奶油、酸奶油、大豆酸奶酪等等。所述食品产品可以进一步含有用于制备乳制品甜点的常用原料，例如水果、巧克力薯片或麦片，但也含有甜类产品或液体巧克力。所述食品产品可以进一步含有常用的食品原料例如乳化剂、凝胶剂、稳定剂、甜味剂等等。本领域技术人员知道使用本发明的（发酵的）食品产品如何制备食品产品。 
在优选实施方式中，所述发酵食品产品选自酸奶酪或乳酪。为了制备酸奶酪，使用本发明的至少一种嗜热链球菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种来发酵乳培养基。可以添加其它细菌例如LAB来提供酸奶酪益生菌性质。为了制备乳酪，使用本发明的至少一种嗜热链球菌株并优选添加发酵剂，例如常规使用的发酵剂，以及选择性地添加附属发酵剂来发酵乳培养基用于制备乳酪。本发明的嗜热链球菌株也可以是乳酪发酵剂的一部分。 
本发明也提供了一种用于鉴别具有改善（或增强）风味生成的嗜热链球菌株的方法，所述方法包括在嗜热链球菌株中筛选GDH活性的步骤。更进一步，该步骤可能是选择一种或多种非活性GDH菌株，或鉴别这些非活性GDH菌株。具有改善风味生成的菌株被有利地应用在如上所述的发酵液、食品产品或发酵食品的制备上。使用本领域众所周知的方法来进行GDH活性的筛选，例如使用在下面实施例中阐明的这些方法。 
并且，本发明涉及使用非活性谷氨酸脱氢酶的嗜热链球菌株来改善发酵食品产品尤其是酸奶酪或乳酪中的风味生成。相对于同样的活性GDH菌株， 乙醛在非活性GDH菌株中是过量的，乙醛将它的品质风味提供给酸奶酪。2-甲基丙醛添加了果仁味，所述果仁味在某些类型乳酪例如，切达干酪上是迫切期望的。 
最后，本发明涉及与使用活性GDH的嗜热链球菌株制备的酸奶酪相对比，非活性谷氨酸脱氢酶的嗜热链球菌株在获得酸奶酪中保加利亚乳杆菌的减少的CFU中的应用。两种菌株优选在相似或相同条件下发酵，以公正对比风味生成。术语“菌落形成单位（CFU）”是对活菌或真菌数量的测定。 
在本文件和权利要求中，动词“含有”以及它的词形变化被用于它的没有限定的意思中意味着包括下面的词语在内，但没有具体提到的词语没有排除在外。另外，动词“由…组成”可以由“本质上由…组成”来替换，意味着本发明的组合物可以含有具体提到的组分之外的额外组分，所述额外组分没有改变本发明的独一无二的特性。 
当所述单词“接近于”或“大约”被用于与数值（接近于10，大约10）有关联时，优选指的是所述数值可以在所给出的数值10上加上或减去所述数值的1%。 
另外，关于在元素前的不定冠词“一个”或“一种”不排出存在着多于一个所述元素的这种可能，除非上下文清楚地要求有一个且仅仅有一个所述元素。因而，不定冠词“一个”或“一种”通常指的是“至少一个”。 
在本发明的说明书中所引用的专利和参考文献的全部内容被引入本申请中以作参考。 
上述描述和图形被包括用于解释本发明的一些实施方式是很清楚的，且没有限定保护范围。从公开开始，一些更多的实施方式对技术人员来说是显而易见的，这些实施方式在保护范围之内且是本发明的实质，以及明显是现有技术和本申请的公开内容的结合。 
实施例 
材料和方法 
菌株、培养基和生长条件 
本实验所用菌株是嗜热链球菌LMG18311、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）MG1363和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1。细胞厌氧地生长。乳酸乳球菌和嗜热链球菌在M17液体培养基（Difco,Detroit,MI,USA）中生长，分别在30℃和42℃添加葡萄糖（GM17）达到最后浓度1%（wt/vol）。嗜热链球菌ΔgdhA在氯霉素（10μg/ml）存在下生长。植物乳杆菌在Mann Rogosa Sharpe(MRS)液体培养基（Merck,Whitehouse Station,NY,USA）中生长，在37℃添加葡萄糖达到最后浓度1%（wt/vol）。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α（27）被用于酶法测定且在TYB培养基（Difco）上在37℃下有氧培养。 
为了发酵实验，细胞在化学限定的培养基（CDM）上生长。 
谷氨酸脱氢酶（gdhA）活性 
植物乳杆菌、乳酸乳球菌MG1363（负控制）和嗜热链球菌（两个都是野生型且gdh敲除）的培养生长直到OD600～1。培养物在50mM β-甘油磷酸盐（pH7）中被离心且冲洗两遍（4℃，5000rpm，15min）。在第二遍冲洗步骤之后，在同一缓冲剂中浓缩颗粒状物以达到OD600～200/ml。破碎仪（beat-beating）（4×30sec,速度4.0,Fastprep FP120）破碎细胞，随后，通过离心（13000rpm,10min,4℃,Eppendorf离心机5417R）去除细胞碎片。因为所述gdhA检测对本底噪声是敏感的，无细胞提取物在透析卡（slide-a-lizer）（Pierce,Rokcford,IL,USA）上被纯化且在50mM β-甘油磷酸盐（pH7）中在4℃下透析过夜。使用注射器从透析卡上去除无细胞提取物且立即用于酶 活性的测试。 
gdhA活性用谷氨酸测定比色法（colorimetric glutamate assay）（Boehringer,Mannheim,Germany,Cat.No.10 139 092 035）检测。在37℃下培养反应混合物且反应混合物含有50mM磷酸钾/TEA缓冲剂pH9（溶液1，试剂盒）、1.76U/ml心肌黄酶+NAD（溶液2，试剂盒）、2mM INT（溶液3，试剂盒）、100mM谷氨酸盐、13.8mM NADP+或NAD+和无细胞提取物。通过监测在492nm处吸光度的增长分光光度地跟踪NADPH的形成。 
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）活性 
植物乳杆菌（正控制）和嗜热链球菌的培养生长直到OD600～1。培养物在55mM Tris/HCl缓冲剂（pH7.8）中在离心机1.0R（Heraeus Instruments,德国）中被离心且冲洗两遍（5000rpm，15min，4℃）。在第二遍冲洗步骤之后，在1ml 55mM Tris/HCl缓冲剂（pH7.8）中浓缩颗粒状物并破碎（4×30sec,速度4.0,Fastprep FP120）且离心（13000rpm,10min,4℃,Eppendorf Centrifuge 5417R）。如Honjoh（Honjoh et al.2003.Biosci.Biotechnol.Biochem.67:1888-1896）所描述的测试G6PDH活性。在25℃下培养反应混合物且反应混合物含有55mM Tris/HCl缓冲剂（pH7.8）、3.3mM MgCl2、0.2mM NADP+、3.3mM葡萄糖-6-磷酸和无细胞提取物。通过监测在340nm处吸光度的增长分光光度地跟踪NADPH或NADH的形成。 
异柠檬酸脱氢酶（ICDH）活性 
大肠杆菌DH5α（被用作正控制）和嗜热链球菌（两个都是野生型且gdhA突变体）的培养生长直到OD600～1。通过离心（5000rpm，15min，4℃）和在35mM Tris/HCl缓冲剂（pH7.5）中冲洗两遍获得细胞。在1ml 35mM Tris/HCl缓冲剂（pH7.5）中浓缩细胞颗粒状物并破碎（4×30sec，速度4.0， Fastprep FP120）。如Cvitkovitch等人（Cvitkovitch et al.1997.J.Bacteriol.179:650-655）所描述的测试ICDH活性。在37℃下培养反应混合物且反应混合物含有35mM Tris/HCl缓冲剂（pH7.5）、5mM异柠檬酸、3.5mM MgCl2或MnCl2、0.35mM NADP+和无细胞提取物。通过监测在340nm处吸光度的增长分光光度地跟踪NADPH的形成。 
嗜热链球菌用于gdhA敲除组建 
与标准实验室程序一致下开展分子克隆技术。使用如Biomqvist等人（Biomqvis et al.2006.Appl.Environ.Microbiol.72:6751-6756）所描述的重叠的PCR产品的自然转换将野生型菌株嗜热链球菌LMG18311用于功能性gdhA基因（ΔgdhA）缺失的突变体的组建。 
植物乳杆菌用于gdhA/glnA敲除的组建 
在植物乳杆菌中，按照以前曾描述过的策略（Goffin et al.2006.Appl.Environ.Microbiol.72:7933-7940）已经组建了两种gdhA和glnA（谷氨酰胺合成酶）的双敲除。通过单一交叉使用插入有基因周围600bp的内部片段的自杀质粒（suicide plasmids）（pGIM008和pJDC9）将这两种基因灭活。红霉素和氯霉素的结合确保插入的稳定性。这种突变体在功能性上与嗜热链球菌gdhA突变体相一致。 
分批培养 
在1L生物反应器（Applikon Biotechnology BV，The Netherlands）中重复进行发酵。所述发酵由生物控制器ADI 1010和生物控制台ADI 1025（Applikon Biotechnology BV，The Netherlands）来控制。嗜热链球菌的野生型和△gdhA在CDM中生长过夜且被用作1000ml的pH控制的CDM的接种 体，所述培养基被接种1%。用氯霉素（10μg/ml）补充用于gdhA敲除的培养基。菌株在42℃下生长，在生长期间通过添加2.5M的NaOH使pH值保持不变pH=6.5。 
植物乳杆菌野生型和△gdhA在CDM上生长过夜且被用作1000ml的pH控制的CDM的接种体，培养基被接种1%。用氯霉素（10μg/ml）和红霉素（10μg/ml）补充用于gdhA敲除的培养基。菌株在37℃下生长，在生长期间通过添加2.5M的NaOH使pH值保持不变pH=5.5。 
在恒速率100rpm下搅拌培养。在600nm每隔30min通过测量细胞密度来跟踪生长。在指数期结束时采集用于HPLC和RNA离析的样品（2×25ml）。在半指数期和稳定期采集用于GC-MS分析的样品（3ml）。 
全基因组mRNA转录水平分析 
RNA离析 
像别处（Sperandio et al.2005.J.Bacteriol.187:3762-3778）所描述的内容一样带有少量修饰来离析RNA。在半指数期，通过在室温下以14000rpm离心2min（Herolab,Unicen MR,Germany），将每一个发酵罐（复制样品用于限制和完全培养基）中的25ml培养液立即颗粒化。颗粒状物在液氮中被快速冷冻且在-80℃下保存直至再使用。冷冻的颗粒状物在400μl TE中复苏且被转移到旋塞筒（screw cap tube）中，旋塞筒含有500μl苯酚-氯仿（5:1），20%十二烷基硫酸钠15μl，3M pH4.8的乙酸钠30μl和锆玻璃珠0.6g。在研磨器（Fastprep）（Savant,FP120）中在速度5.0下破碎细胞40sec，且离心（13000rpm,20min,4℃）混合物以除去微珠。随后，将500μl冷氯仿添加到上清液中，然后进行离心步骤（13000rpm，10min，4℃）。离心之后，按照制造协定，用高纯RNA离析试剂盒（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）使用0.5ml液相用于RNA提取，不用于在37℃下改变成30min的DNAse I 处理。在60μl洗脱缓冲剂（在试剂盒中备有）中洗脱RNA且在-80℃下保存样品。 
RNA的浓度用ND-1000分光光度计（NanoDrop Technologies,Inc.,USA）来检测且其质量用2100生化分析仪（Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA）来检测。只有23S/16S比率高于1.6的样品被用于标记。 
cDNA合成和标记 
按照以前（Sarlnier et al.2007.Appl Environ Microbiol 73:1753-1765;Serrano et al.2007.Microb.Cell Fact.6:29）描述的内容从5μg的RNA中进行第一链cDNA的合成。合成的cDNA被纯化且用花色素苷3和花色素苷5标记所有样品。所标记的cDNA的质量及其浓度用ND-1000分光光度计（NanoDrop Technologies,Inc.,USA）来检测。 
杂交 
按照以前（Saulnier et al.2007.Appl Environ Microbiol 73:1753-1765;Serrano et al.2007.Microb.Cell Fact.6:29）描述的内容进行所标记的cDNA（每个样品0.3μg）的杂交。使用安捷伦60-mer寡核苷酸微阵列工艺协定版本4.1（Saulnier et al.2007.Appl Environ Microbiol 73:1753-1765），样品在特制设计的安捷伦科技（Agilent Technologies）寡核苷酸微阵列（oligo microarrays）上杂交。 
扫描和数据分析 
用分辨率为5μm带有扫描阵列的扫描仪扫描切片。按照在别处（Saulnier et al.2007.Appl Environ Microbiol 73:1753-1765;Serrano et al.2007.Microb.Cell Fact.6:29）所描述的内容进行数据分析和工艺过程。倍性变化（FC）被 定义为2M，其中，M=2log(cy5强度/cy3强度)（Serrano et al.2007.Microb.Cell Fact.6:29）。显著调控基因被定义为平均假定值（p-value）少于5%且应变速率敏感性值（M-value）等于或高于1.5的基因。 
按照在别处（Blom et al.2008.BMC Genomics.9:495）所描述的内容实施扫描强度、规范化、标度、Cyber-T和错误发现率（FDR）的选择。为了用在不通过单个基因的fdr标准的微阵列数据中来描述更多的微妙的差异表达，用所遵守的下列标准计算多基因的FDRs的几何平均数：（i）基因是同一操纵子的一部分，（ii）它们显示出类似的差异表达（例如，gdhA突变体中所有的上调表达），（iii）它们涉及随后的代谢转化（因而是相同代谢途径的一部分）。 
遵循这些标准，我们发现由共同表达的基因组成的2种不同的途径，每一途径被组织在一个操纵子中（柠檬酸途径和感受态基因）。 
比较基因组学 
所述ERGO生物信息学系列（http://ergo.integratedgenomics.com/ERGO/）被用来在基因组水平上对比嗜热链球菌与其它序列的LAB。尤其是测试和在可获得的的53LAB基因组之中对比戊糖磷酸途径的存在。 
氨测试 
从氨试剂盒（R-biopharm AG，Darmstadt,Germany）中使用紫外线的方法测定发酵样品的上清液中氨的浓度。 
蛋白质浓度 
用二辛可宁酸蛋白质检测试剂（Pierce,Rockford,Il.USA）测定无细胞提取物中蛋白质的浓度。 
代谢分析 
为了鉴别样品中的挥发性组分，按照以前（Engels.1997.PhD thesis Wageningen University;Smit et al.2004.Appl.Microbiol.Biotechnol.64:396-402）所描述的内容使用冷阱气相色谱法清洗和分离热脱附。在Fisons MFA815冷阱（CE Instruments,Milan,Italy）的上面浓缩顶部空间样品，随后，在装备有CIP-SIL 5CB毛细（low-bleed）管柱（Chrompack,Middelburg,The Netherlands）的GC-8000top气相色谱（CE Instruments）上分离顶部空间样品并通过火焰电离检测器检测。 
按照在别处（Starrenburg and Hugenholtz.1991.Appl.Environ.Microbiol.57:3535-3540）所描述的内容测试发酵样品的上清液中存在的胞外代谢产物。 
结果 
NADPH产生的预测和gdhA敲除的组建 
如在介绍中所述，我们使用以前研发的嗜热链球菌基因组尺度模型（Pastink et al.2009.Appl.Environ.Microbiol.75:3627-3633）用以寻找NADPH的生长途径。嗜热链球菌被预测为不具有完整的戊糖磷酸途径且不能通过这种途径产生NADPH。所述模型预测异柠檬酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶可能是产生NADPH的酶。这些酶编码的途径通过一种重要的生物化合物α-酮戊二酸盐来连接。通过检测酶活性实验测试所述模型的预测。另外，通过测试PPP的第一种酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性来证实所预测的PPP的缺少。 
检测植物乳杆菌和嗜热链球菌的无细胞提取物用于G6PDH活性。植物乳杆菌被用作正控制，因为众所周知这种菌株具有完整的戊糖磷酸途径。所述酶检测事实上表明植物乳杆菌具有G6PDH活性且嗜热链球菌不具有 G6PDH活性（表1）。 
检测植物乳杆菌、乳酸菌以及嗜热链球菌的野生型和ΔgdhA的无细胞提取物用于GDH活性。乳酸菌被用作负控制。植物乳杆菌和野生型嗜热链球菌具有GDH活性（表1）。如所预期的，所述gdhA敲除不具有GDH活性。 
表1.本研究测试的不同酶的活性。注：不是所有的有机体都包括在每一项检测中。 
Figure DEST_PATH_GDA00001991877100181
a酶活性表达为1nmol NADPH（min mg蛋白质）-1，两次复制的平均值。 
b-,没有做。 
检测嗜热链球菌的野生型和ΔgdhA以及大肠杆菌DH5α的无细胞提取物用于异柠檬酸脱氢酶活性。大肠杆菌被用作正控制且确实具有ICDH活性。大肠杆菌的ICDH在TCA循环中是重要的调节酶，因而观测到这种酶的活性较高。野生型嗜热链球菌没有观测到ICDH活性，而所述gdhA突变体具有ICDH活性（表1）。 
根据这种了解和观测，野生型的嗜热链球菌能够使用谷氨酸（Tanous et al.2002.Antonie Van Leeuwenhoe k.82:271-278），按照Blomqvist等人(supra)所描述的内容使用重叠的PCR产品的自然转换组建谷氨酸脱氢酶突变体。通过具有抗氯霉素的P32-cat盒交换gdhA开放阅读框。本研究中使用的引物在表2中列出，且用Fhusion聚合酶（New England Biolabs Inc,Ipswich,MA,USA）进行所有的PCR反应。 
表2.本研究使用的用于嗜热链球菌中gdhA敲除的组建的引物 
Figure DEST_PATH_GDA00001991877100182
Figure DEST_PATH_GDA00001991877100191
a加重和加下划线的序列是互补的 
分别使用UpDelgdhA1/UpDelgdhA2和DnDelgdhA1/DnDelgdhA1引物对通过PCR扩增gdhA的上流和下流重组片段（1.5kb）。使用Upcat and Dncat引物通过PCR扩增pNZ5320（pNZ5318衍生物,去除了lp291片段）（Lambert et al.2007.Appl.Environ.Microbiol.73:1126-1135）中的所述P32-cat盒。以等摩尔浓度混合这三种重叠PCR产品，使用UpDelgdhA1/DnDelgdhA2引物通过PCR连接在一起，然后，使用PCR混合用于自然转换。用位于重组区域的上流和下流的引物通过PCR证实所述突变体基因型。我们使用戊糖磷酸途径正LAB、植物乳杆菌作为对照，用于组建相似的gdhA突变体。用于组建这种突变体的引物在表3中列出。 
表3.本研究使用的用于在植物乳杆菌中gdhA敲除的组建的引物 
Figure DEST_PATH_GDA00001991877100201
代谢反应 
在HPLC上分析发酵样品（表4）。所述野生型表明纯乳酸的生长，如以前（Hols et al.2005.FEMS Microbiol.Rev.29:435-463）所描述和观测的一样。所述gdhA突变体也主要是产生乳酸和少量甲酸，且该突变体消耗柠檬酸。在相同的生长速率下，该突变体比所述野生型消耗的葡萄糖少，这种情况可能表明更有效的生长。 
表4.发酵细胞上清液的HPLC分析。嗜热链球菌和植物乳杆菌在CDM上生长；在指数生长期末采集样品 
Figure DEST_PATH_GDA00001991877100202
a两次复制的平均值,N.D.没有测试。 
用于两种菌株的挥发物物质是相似的（图1）；然而，gdhA突变体比野生型产生更多的乙醛、丙酮和2-甲基丙醛。 
gdhA也消耗更多的苏氨酸，且能够通过苏氨酸醛缩酶从苏氨酸转换中产生乙醛。并且，gdhA突变体比野生型产生更多的丙酮，能够形成丙酮作为糖酵解的一部分。在来自gdhA突变体的样品的增加的浓度中发现一些醛 类例如2-甲基丙醛和3-甲基丁醛。分别在缬氨酸和亮氨酸代谢期间产生这些醛，以及HPLC数据确实表明突变体对比于野生型提高了支链氨基酸的消耗。在同一样品中氨基酸的HPLC分析（表5）表明gdhA突变体比野生型消耗更多的总氨基酸。 
表5.发酵细胞上清液的HPLC分析（氨基酸）。嗜热链球菌在CDM上生长；在指数生长期末采集样品(相同的生物量). 
a两次复制的平均值 
另外，突变体表明氨产量比野生型增长（约3倍）（表6）并且这种增长与氨基酸消耗的增长很好地吻合。这可能表明氨基酸降解。 
表6.发酵细胞上清液中氨浓度的测试。嗜热链球菌在CDM上生长；在指数生长期末采集样品（相同的生物量）。 
Figure DEST_PATH_GDA00001991877100212
如植物乳杆菌，按照用于嗜热链球菌的相同程序分析发酵样品（表4）。 gdh/glnA突变体和野生型在初始代谢阶段没有显现出不同；乳酸、甲酸和乙酸以相似的数量生成。更进一步，氨基酸测试表明除了天冬氨酸外，由不同的氨基酸的突变体的应用相似（表5）。野生型和gdh/glnA突变体的挥发性物质几乎是一致的（数据未示出）。 
转录分析 
用微阵列研究缺失ghdA基因对基因表达的影响。为了差异调控，我们仅仅选择满足下列标准的这些基因（i）比率≥1.25以及（ii）FDR-值<0.05。用这些标准，我们发现具有差异表达的142种基因（表S1）。从逻辑上，在gdhA突变体中谷氨酸脱氢酶是严重下调的。ΔgdhA需要改变途径以产生NADPH；从最近研发的Simpheny模型（Pastink et al.2009.Appl.Environ.Microbiol.75:3627-3633）预测是异柠檬酸脱氢酶。阵列数据表明柠檬酸代谢（几何平均值FDR<0.05；平均比率≥1.25）、甲基柠檬酸合酶、乌头酸合酶和异柠檬酸脱氢酶是上调的。这种上调也与柠檬酸的消耗（HPLC分析）以及提高的ICDH活性相一致，且这种上调可表明用于NADPH的异柠檬酸脱氢酶的重要性。更进一步，在gdhA突变体中氨基酸代谢的许多部分受到影响；在突变体中一些氨基酸转运蛋白是上调的而支链氨基酸的输出是下调的。组氨酸氨裂合酶是下调的，这种酶是氮代谢的一部分。磷酸丝氨酸转氨酶在gdhA突变体中是高度上调的；这种酶催化来自O-磷-L-丝氨酸（O-phospho-L-serine）和2-酮戊二酸（2-oxoglutarate）中的膦酰氧基丙酮酸酯（phosphonooxypyruvate）和谷氨酸的形成。 
在突变体中，涉及能力的共同表达的基因（几何平均值FDR<0.05；平均比率≥1.25）相对于野生型是下调的。 
比较的基因组 
在缺乏戊糖磷酸途径下，用ERGO生物信息软件来比较可得到的LAB序列。嗜热链球菌不是唯一的带有不完整的PPP的LAB。实际上，除了少数的猪链球菌（S.suis）和肺炎链球菌（S.pneumonia）菌株外，几乎所有的链球菌在嗜热链球菌的PPP中缺少132gdhA突变的氧化部分。所有的链球菌共享相同的共同原型，但是这种原型以不同的分支分开。在大多数链球菌中，可能会相对应地发生PPP基因的基因缺失事件和由于功能性的原因。嗜热链球菌以它快速生长而闻名，且在不同种类的链球菌中基因缺失事件似乎不是独一无二的且没有导致生长延迟。 
Figure IDA00001605240600011
Figure IDA00001605240600021
Figure IDA00001605240600041
Figure IDA00001605240600051

Claims (14)

1.一种增强发酵液中风味生成的方法，所述方法包括使用嗜热链球菌株（S.thermophilus strain）将发酵培养基发酵的步骤，其中，嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过以下一种或多种将谷氨酸脱氢酶灭活：
-gdhA基因的敲除、插入或突变；
-用弱启动子替代gdhA启动子；
-反义DNA或RNA；以及
-siRNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述发酵液是食品产品。
4.根据上述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述发酵液是发酵食品产品。
5.嗜热链球菌株（S.thermophilus strain），其中，所述嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。
6.根据权利要求5所述的菌株，其中，所述嗜热链球菌株是食品级的。
7.嗜热链球菌株（S.thermophilus strain）CBS 125184。
8.一种含有由权利要求5-7中任意一项所定义的嗜热链球菌株（S.thermophilus strain）的发酵液。
9.根据权利要求8所述的发酵液，其中，所述发酵液是发酵食品产品。
10.根据权利要求9所述的发酵液，其中，所述发酵食品产品选自酸奶酪和乳酪。
11.一种含有由权利要求5-7中任意一项所定义的嗜热链球菌株（S.thermophilus strain）或由权利要求8或9中所定义的发酵液的食品产品。
12.一种用于鉴别具有改善风味生成的嗜热链球菌株（S.thermophilusstrain）的方法，所述方法包括在嗜热链球菌株中筛选GDH活性的步骤。
13.嗜热链球菌株（S.thermophilus strain）在改善发酵食品产品尤其是酸奶酪或乳酪中的风味生成中的应用，其中，嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。
14.嗜热链球菌株（S.thermophilus strain）在获得酸奶酪中保加利亚乳杆菌（L.bulgarieus）的减少的菌落形成单位中的应用，其中，相对于使用活性GDH的嗜热链球菌株制备的酸奶酪，在获得酸奶酪中保加利亚乳杆菌的减少的菌落形成单位中应用的嗜热链球菌株的谷氨酸脱氢酶是非活性的。
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