CN107043731B - 一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法 - Google Patents

一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明特别涉及一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法。该乳酸菌杂交菌种，其特殊之处在于：通过保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种通过电融合得到乳酸菌杂交菌种。编号CGMCC NO：12911，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。本发明对生产中常用的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌进行了原生质体电融合，获得了子代稳定的融合菌株，品质优于亲本，简化了菌种保藏流程，将其用于发酵酸奶，大大改善了酸奶风味，简化了酸奶生产流程，而且保证了酸奶长期风味稳定。

Description

一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法
（一）技术领域
本发明涉及一种乳酸菌，特别涉及一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法。
（二）背景技术
市场上发酵酸奶所用乳酸菌有多种，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、嗜酸乳 杆菌等，主要用其中的2种、3种或4种菌种通过合适比例的添加来发酵酸奶，这些乳酸菌生 长特点各异，都需要厌氧高温培养。所以，对菌种的保藏、繁育是乳酸菌生产厂家比较繁重 的一项工作。另外，在酸奶发酵生产过程中，不同菌种配比的不同对最终酸奶的风味、口感 影响很大，配比一旦出现问题，会直接导致酸奶风味、口感的不稳定，影响市场销售和声誉。
要解决这些问题，可以对多种乳酸菌进行杂交，使多种菌的优良性状融合于一株菌上，这样，就可以省却很多菌种保藏的工作，也可以使得用这种杂合菌发酵所得的酸奶长期保持稳定的优良特性。
关于乳酸菌的杂交，张莉滟等做过双歧杆菌与乳杆菌原生质体的融合及筛选,改良了双歧杆菌严格厌氧的特性，陈军等做过产粘瑞士乳杆菌与保加利亚乳杆菌的融合实验，获得了表观粘度优于亲本的融合菌株。但通过融合后能够兼备亲株优点，提高发酵酸奶品质，简化酸奶制作流程的融合菌株却缺乏报道。
本专利就是针对这个问题，对生产中常用的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌进行了原生质体电融合，获得了子代稳定的融合菌株，用其发酵酸奶，品质优于亲本。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法，使多种 乳酸菌的优良性状融合于一株菌上，这样，就可以省却很多菌种保藏的工作，也可以使得用 这种杂合菌发酵所得的酸奶长期保持稳定的优良特性。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种乳酸菌杂交菌种，其特殊之处在于：利用保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种通 过电融合得到乳酸菌杂交菌种。
所述的乳酸菌杂交菌种，编号CGMCC NO：12911，保藏单位为CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2016年08月29日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述的乳酸菌杂交菌种的制备方法，包括以下步骤：
A)菌种活化：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种活化备用；
B)原生质体制备：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴；（2）取3-5mL菌液于离心管中，离 心，弃上清；（3）加3-5mL生理盐水，摇匀，离心，弃上清；（4）加3-5mL原生质体稳定液，摇匀， 离心，弃上清，该步骤重复n次；（5）加4-6 mL过滤酶液，32-42℃水浴，离心，弃上清；（6）加3- 5mL原生质体稳定液，摇匀，离心，弃上清，该步骤重复n次；（7）加3-5mL原生质体稳定液，制 成原生质体悬液，备用，
C)原生质体融合：（1）电击杯无菌处理；（2）取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致 死率刚好在100%的菌株悬液按1:0.8-1.2混合均匀，无菌操作；（3）设置好电击参数进行电 融合；（4）将电击融合的菌悬液倾注倒平板，36-46 ℃下培养，观察、分离纯化出融合菌种。
所述的乳酸菌杂交菌种的制备方法，优选方案：
A)菌种活化：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种活化若干次备用，活化条件 为：36-46℃厌氧培养24-72h；
B)原生质体制备：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴10-30 min；（2）取3-5mL菌液于离 心管中，1500-4500 r/min离心5-15 min，弃上清；（3）加3-5 mL生理盐水，摇匀，1500-4500 r/min离心5-15 min，弃上清；（4）加3-5mL原生质体稳定液，摇匀，1500-4500 r/min离心5- 15 min，弃上清，该步骤重复n次；（5）加4-6 mL过滤酶液，32-42℃水浴10-30min，2000-6000 r/min离心5-15 min，弃上清；（6）加3-5mL原生质体稳定液，摇匀，2000-6000 r/min离心5- 15 min，弃上清，该步骤重复n次；（7）加3-5mL原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用，
C)原生质体融合：（1）电击杯/0.1 cm无菌处理；（2）取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫 外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:0.8-1.2混合均匀，无菌操作加入电击杯0.2- 0.4mL；（3）设置好电击参数进行电融合，电压：2-3 KV，脉冲次数：1次，电击时间：1-3ms； （4）将电击融合的菌悬液倾注倒平板，36-46℃无氧条件下培养16-32 h，观察、分离纯化出 融合菌种。
所述的乳酸菌杂交菌种的制备方法，更有方案：
A)菌种活化：保藏菌种活化3次备用，活化条件为：36-46℃厌氧培养24-72h；
B)原生质体制备：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴20 min；（2）取4 mL菌液于离心管 中，3000 r/min离心10 min，弃上清；（3）加4 mL生理盐水，摇匀，3000 r/min离心10min，弃 上清；（4）加４mL原生质体稳定液，摇匀，3000 r/min 离心10 min，弃上清，再重复该步骤一 次；（5）加5 mL过滤酶液，37 ℃水浴20 min，4000 r/min 离心10 min，弃上清；（6）加４mL原 生质体稳定液，摇匀，4000 r/min 离心10 min，弃上清，再重复该步骤一次；（7）加４mL原生 质体稳定液，制成原生质体悬液，备用，
C)原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理；（2）取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外 诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:1混合均匀，无菌操作加入电击杯0.3mL；（3）设置好 电击参数进行电融合，电压：2.5 KV，脉冲次数：1次，电击时间：2 ms；（4）将电击融合的菌悬 液倾注倒平板，42 ℃无氧条件下培养24 h，观察、分离纯化出融合菌种。
其中，
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/PBS混合液，其中，甘露醇浓度为0.7-0.9mol/L，甘露醇浓度优选0.8 mol/L，
酶液：80-120 mg溶菌酶20000u/mg+20 mL磷酸盐缓冲液/PBS，微孔滤膜过滤后备用，优 选，100 mg溶菌酶20000 u/mg+20 mL0.2 moL/L的磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22 μm的微孔滤 膜过滤后备用。
磷酸盐缓冲液/PBS：磷酸盐缓冲液/PBS：565-935mL0.2mol/L NaH2PO4+65-435mL0.2mol/L Na2HPO4，pH5.7-6.7，优选，磷酸盐缓冲液/PBS：877mL 0.2mol/L NaH2PO4+123mL 0.2mol/LNa2HPO4，pH6。
菌种活化过程中，通过再生固体培养基培养。
原生质体融合过程步骤（4）中，将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上，观察、分离纯化出融合菌种，培养温度均为36-46℃，
其中，
再生固体培养基（1500 mL）：葡萄糖7-8 g，酵母浸粉7-8 g，胰蛋白胨7-8g，L-cys盐酸 盐0.4-0.8 g，乳糖6-7.5 g，乙酸钠14-16 g，琼脂22-23 g，KH2PO43-4.2 g， CaCl2·2H2O 5.5-6.5 g，MgCl2·6H2O 27-28g，pH6-7；
再生半固体培养基（1500 mL）：葡萄糖7-8 g，酵母浸粉7-8 g，胰蛋白胨7-8g，L-cys盐 酸盐0.4-0.8 g，乳糖6-7.5 g，乙酸钠14-16 g，琼脂11-16.5g，KH2PO4 3-4.2 g，CaCl2·2H2O 5.5-6.5 g，MgCl2·6H2O 27-28g，pH6-7。
一种乳酸菌杂交菌种制备酸奶的方法，包括以下步骤：将融合菌种接种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，36-46 ℃培养16-32 h制备酸奶。
一种酸奶酸度的测定方法，包括以下步骤：取10mL酸乳，用20mL蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5mL，以0.1mol/L NaOH溶液滴定至粉红色（30 s内不变色），将所消耗的NaOH毫升数乘以10，即为酸奶的酸度，所述酸奶的酸度用吉尔涅尔度°T表示。
本发明的有益效果：本发明对生产中常用的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌进行了原生质体电融合，获得了子代稳定的融合菌株，品质优于亲本，简化了菌种保藏流程，将其用于发酵酸奶，大大改善了酸奶风味，简化了酸奶生产流程，而且保证了酸奶长期风味稳定。
（四）具体实施方式
实施例1
1.菌种：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种。
2. 试剂
磷酸盐缓冲液/PBS(0.2 moL/L)：877mL0.2mol/L NaH2PO4+123mL0.2mol/LNa2HPO4， pH6。
原生质体稳定液：含 0.8mol/L甘露醇的0.2 moL/L的磷酸盐缓冲液/PBS。
酶液（5 mg/mL）：100 mg溶菌酶（20000 u/mg）+20 mL0.2 moL/L的磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22 μm的微孔滤膜过滤后备用。
蒙牛纯牛奶：制作酸奶用。
3. 仪器设备：MJX智能霉菌培养箱（MJX型，宁波江南仪器厂），全温振动器（HZQ-Y型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、高速台式离心机（TGL-16C，上海安亭科学仪器厂）、电穿孔仪GenePuLser（BIO-RAD型，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、电击杯（0.1cm）高压蒸汽灭菌器（MLS-3780，三洋电机株式会社）、双人垂直超净工作台（VJ-VS-2型，无锡一净净化设备有限公司）、电子精密天平（CAV4102C型，奥豪斯中国地区）、紫外可见分光光度计（TU-1810，）、移液枪（Brand Transferpette D-1000、D-5000型，普兰德（上海）贸易有限公司）、pH计（PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司）。
4. 培养基
（1）再生固体培养基（1500 mL） 葡萄糖7.5 g，酵母浸粉7.5 g，胰蛋白胨7.5 g，L-cys 盐酸盐0.6 g，乳糖6.75 g，乙酸钠15 g，琼脂22.5 g，KH2PO4 3.75 g， CaCl2·2H2O5.67 g， MgCl2·6H2O 27.5 g，pH6.5。
（2）再生半固体培养基：除琼脂减半外，其他成分同培养基（１），pH6.5。
（3）双层再生培养基：将菌液混入再生半固体培养基内，倾注倒平板至再生固体培养基上。
5. 方法
5.1菌种活化：保藏菌种活化3次，备用，活化条件：42 ℃厌氧培养48 h，通过再生固体 培养基培养。
5.2原生质体制备方法：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴20 min。（2）取4 mL菌液于离心管中，离心（3000 r/min）10 min，弃上清。（3）加4 mL生理盐水，摇匀，3000 r/min离心10min，弃上清，其中，生理盐水为0.9%的氯化钠水溶液。（4）加４mL原生质体稳定液，摇匀，3000 r/min 离心10 min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（5）加5 mL过滤酶液，37 ℃水浴20 min，4000 r/min 离心10 min，弃上清。（6）加４mL原生质体稳定液，摇匀，4000 r/min离心10 min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（7）加４mL原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用。
5.3原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理。（2）加入菌悬液，将不同乳酸菌的原生质体悬液浓度调到1×106个/mL进行混菌融合（取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:1混合均匀，无菌操作加入电击杯0.3mL。）（3）设置好电击参数进行电融合（电压：2.5 KV；脉冲次数：1次；电击时间：2 ms。）（4）将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上培养，观察、分离纯化出融合菌种，培养条件均为：42 ℃无氧条件下培养24 h。
5.4酸奶的制作
（1）分别将定量的亲本菌种和融合菌种（菌悬液浓度为1×106个/mL，接种量为10%，）接 种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，42 ℃培养24 h。从酸、涩、风味、酸度、pH值5个方面来比较 酸奶风味。
（2）酸奶酸度的测定：酸奶的酸度用吉尔涅尔度（°T）表示。
方法：取10mL酸乳，用20mL蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5mL，以0.1mol/L NaOH溶液滴定至粉红色（30 s内不变色），将所消耗的NaOH毫升数乘以10，即为酸奶的酸度。
（3）pH值测定：用pH计测定酸奶的pH值。
（4）对制作好的酸奶进行感官评定。
表1：感官评定标准
6. 结果
6.1 融合菌大小
二菌融合菌株呈链状，杆球混合链状，直径0.5-0.8μm，长2-6μm，宽0.4-0.7μm。
表2亲本菌株与融合菌大小比较
6.2. 发酵酸奶结果
表3：亲本菌株与融合菌发酵酸奶结果
6.3 对融合菌株及亲本菌株进行测序鉴定
结果如下：
（1）融合菌株（Fusant XU1 Lactobacillus Sp.）的16sDNA序列
ATGCAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATTGCATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGT
AACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCAT
GGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCT
CACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGG
AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCG
TAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCT
AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGG
TTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGA
CAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTA
ACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTA
GGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGA
AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAG
GTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA
GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACT
CTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAC
ACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACT
GTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGC
CTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACTCCTTTAGGGAGCGAGCCGT
CTAAGGTGACAAATT
（2）亲本菌株保加利亚乳杆菌的16sDNA序列
TATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATTGCATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGG
GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAA
CCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTA
ATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCC
TACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTC
GGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCC
ACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGC
AGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGA
AGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGG
TCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGA
ATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAA
GGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCT
TACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTG
TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTG
GGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG
CTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTT
CGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTC
CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTAGGGAGCGA
GCCGTCTAAGTGA
（3）亲本菌株嗜热链球菌的16sDNA序列
GCTATACATGCAGTCGAGCGAACAGATAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATA
ACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATATTGAACCGCATGGTTCAATAGTG
AAAGGCGGCTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACG
ATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
GAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTA
TCAGGGAAGAACAAATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTACCTGATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG
CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTG
ATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCA
TGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATG
TGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGT
TTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAAT
TGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCT
TTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGT
GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGTTGACT
GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAA
TGGACAATACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAA
CTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACAC
CGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGACA
AAGG
通过序列比对，融合菌株与两亲本菌株的16sDNA序列存在较大差异。
通过绘制发育树分析，融合菌株与两个亲本菌株相差甚大。说明亲本菌株发生了融合，产生了杂交的乳酸菌。
实施例2
1.菌种：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种。
2. 试剂
磷酸盐缓冲液/PBS：935mL 0.2mol/LNaH2PO4+65mL 0.2mol/LNa2HPO4，pH5.7。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/PBS混合液，甘露醇含 0.7mol/L。
酶液（4.5 mg/mL）：90 mg溶菌酶（20000 u/mg）+20 mL磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
蒙牛纯牛奶：制作酸奶用。
3. 仪器设备：MJX智能霉菌培养箱（MJX型，宁波江南仪器厂），全温振动器（HZQ-Y型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、高速台式离心机（TGL-16C，上海安亭科学仪器厂）、电穿孔仪GenePuLser（BIO-RAD型，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、电击杯（0.1cm）高压蒸汽灭菌器（MLS-3780，三洋电机株式会社）、双人垂直超净工作台（VJ-VS-2型，无锡一净净化设备有限公司）、电子精密天平（CAV4102C型，奥豪斯中国地区）、紫外可见分光光度计（TU-1810，）、移液枪（Brand Transferpette D-1000、D-5000型，普兰德（上海）贸易有限公司）,pH计（PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司）。
4. 培养基
（1）再生固体培养基（1500 mL） 葡萄糖7 g，酵母浸粉8g，胰蛋白胨7g，L-cys盐酸盐 0.8g，乳糖6 g，乙酸钠16 g，琼脂22 g，KH2PO4 4.2g，CaCl2·2H2O 5.5 g，MgCl2·6H2O28 g，pH6。
（2）再生半固体培养基：除琼脂减半外，其他成分同培养基（１），pH6。
（3）双层再生培养基：将菌液混入再生半固体培养基内，倾注倒平板至再生固体培养基上。
5. 方法
5.1菌种活化：保藏菌种活化3次，备用，活化条件：36℃厌氧培养72 h，通过再生固体培 养基培养。
5.2原生质体制备方法：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴10 min。（2）取3 mL菌液于离心管中，离心（4500 r/min）15 min，弃上清。（3）加3 mL生理盐水，摇匀，4500 r/min离心15min，弃上清。（4）加3mL原生质体稳定液，摇匀，1500 r/min 离心15 min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（5）加4 mL过滤酶液，42 ℃水浴10 min，2000 r/min 离心15 min，弃上清。（6）加3mL原生质体稳定液，摇匀，6000 r/min 离心5 min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（7）加3mL原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用。
5.3原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理。（2）加入菌悬液，将不同乳酸菌的原生质体悬液浓度调到1×106个/mL进行混菌融合（取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:0.8混合均匀，无菌操作加入电击杯0.2mL。）（3）设置好电击参数进行电融合（电压：3 KV；脉冲次数：1次；电击时间：3 ms。）（4）将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上培养，观察、分离纯化出融合菌种，培养条件均为：36 ℃无氧条件下培养32h。
5.4 酸奶的制作
（1）分别将定量的亲本菌种和融合菌种（菌悬液浓度为1×106个/mL，接种量为10%，）接 种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，36 ℃培养32 h。从酸、涩、风味、酸度、pH值5个方面来比较 酸奶风味。
（2）酸奶酸度的测定：酸奶的酸度用吉尔涅尔度（°T）表示。
方法：取10mL酸乳，用20mL蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5mL，以0.1mol/L NaOH溶液滴定至粉红色（30 s内不变色），将所消耗的NaOH毫升数乘以10，即为酸奶的酸度。
（3）pH值测定：用pH计测定酸奶的pH值。
（4）对制作好的酸奶进行感官评定，如表1所述。
实施例3
1.菌种：保藏的保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种。
2. 试剂
磷酸盐缓冲液/PBS：565mL 0.2mol/L NaH2PO4+435mL 0.2mol/LNa2HPO4，pH6.7。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/PBS混合液，含甘露醇 0.9mol/L。
酶液（5.5 mg/mL）：110 mg溶菌酶（20000 u/mg）+20mL磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。
蒙牛纯牛奶：制作酸奶用。
3. 仪器设备：MJX智能霉菌培养箱（MJX型，宁波江南仪器厂），全温振动器（HZQ-Y型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、高速台式离心机（TGL-16C，上海安亭科学仪器厂）、电穿孔仪GenePuLser（BIO-RAD型，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、电击杯（0.1cm）高压蒸汽灭菌器（MLS-3780，三洋电机株式会社）、双人垂直超净工作台（VJ-VS-2型，无锡一净净化设备有限公司）、电子精密天平（CAV4102C型，奥豪斯中国地区）、紫外可见分光光度计（TU-1810，）、移液枪（Brand Transferpette D-1000、D-5000型，普兰德（上海）贸易有限公司）、pH计（PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司）。
4. 培养基
（1）再生固体培养基（1500 mL） 葡萄糖8 g，酵母浸粉7g，胰蛋白胨8 g，L-cys盐酸盐 0.4 g，乳糖7.5g，乙酸钠14 g，琼脂23g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 6.5 g，MgCl2·6H2O 27g，pH7。
（2）再生半固体培养基：除琼脂减半外，其他成分同培养基（１），pH7。
（3）双层再生培养基：将菌液混入再生半固体培养基内，倾注倒平板至再生固体培养基上。
5. 方法
5.1菌种活化：保藏菌种活化3次，备用，活化条件：46 ℃厌氧培养24h，通过再生固体培 养基培养。
5.2原生质体制备方法：（1）取培养至对数期的菌液，冰水浴30min。（2）取5mL菌液于离心管中，离心（1500 r/min）5 min，弃上清。（3）加5 mL生理盐水，摇匀，1500 r/min离心5min，弃上清。（4）加5mL原生质体稳定液，摇匀，4500 r/min 离心5 min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（5）加6mL过滤酶液，32℃水浴30 min，6000 r/min 离心5 min，弃上清。（6）加5mL原生质体稳定液，摇匀，2000 r/min 离心15min，弃上清。（该步骤再重复一次）。（7）加5mL原生质体稳定液，制成原生质体悬液，备用。
5.3原生质体融合：（1）电击杯/0.１cm无菌处理。（2）加入菌悬液，将不同乳酸菌的原生质体悬液浓度调到1×106个/mL进行混菌融合（取保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌紫外诱变致死率刚好在100%的菌株悬液按1:1.2混合均匀，无菌操作加入电击杯0.4mL。）（3）设置好电击参数进行电融合（电压：2KV；脉冲次数：1次；电击时间：1ms。）（4）将电击融合的菌悬液先混入再生半固体培养基内，然后再倾注倒平板至再生固体培养基上培养，观察、分离纯化出融合菌种，培养条件均为：46 ℃无氧条件下培养16 h。
5.4 酸奶的制作
（1）分别将定量的亲本菌种和融合菌种（菌悬液浓度为1×106个/mL，接种量为10%，）接 种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，46 ℃培养16 h。从酸、涩、风味、酸度、pH值5个方面来比较 酸奶风味。
（2）酸奶酸度的测定：酸奶的酸度用吉尔涅尔度（°T）表示。
方法：取10mL酸乳，用20mL蒸馏水稀释。加入0.5%的中性酚酞指示剂0.5mL，以0.1mol/L NaOH溶液滴定至粉红色（30 s内不变色），将所消耗的NaOH毫升数乘以10，即为酸奶的酸度。
（3）pH值测定：用pH计测定酸奶的pH值。
（4）对制作好的酸奶进行感官评定，如表1所述。
实施例4
磷酸盐缓冲液/PBS：815 mL0.2 mol/L NaH2PO4+185 mL0.2 mol/LNa2HPO4，pH6.2。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/PBS混合液，其含甘露醇0.8mol/L。
酶液（4 mg/mL）：80mg溶菌酶（20000 u/mg）+20 mL磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22 μm的微孔滤膜过滤后备用。
实施例5
磷酸盐缓冲液/PBS：900 mL0.2 mol/L NaH2PO4+100 mL0.2 mol/LNa2HPO4，pH5.9。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/PBS混合液，其含甘露醇0.82mol/L。
酶液（5 mg/mL）：100mg溶菌酶（20000 u/mg）+20mL磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22 μm的微孔滤膜过滤后备用。
实施例6
磷酸盐缓冲液/PBS：735 mL 0.2mol/L NaH2PO4+265 mL 0.2 mol/LNa2HPO4，pH6.4。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/PBS混合液，其含甘露醇0.78mol/L。
酶液（5 mg/mL）：100mg溶菌酶（20000 u/mg）+20mL磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22 μm的微孔滤膜过滤后备用。
实施例7
磷酸盐缓冲液/PBS：900 mL 0.2mol/L NaH2PO4+100mL 0.2 mol/LNa2HPO4，pH5.9。
原生质体稳定液：甘露醇与磷酸盐缓冲液/PBS混合液，其含甘露醇0.78mol/L。
酶液（6 mg/mL）：120mg溶菌酶（20000 u/mg）+20mL磷酸盐缓冲液/PBS，用0.22 μm的微孔滤膜过滤后备用。
SEQUENCE LISTING
<110> 菏泽学院
<120> 一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 乳杆菌
<400> 1
atgcagtcga acgagttctc gttgattgca tcggtgcttg caccgagatt caacatggaa 60
cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ttaagtgggg gataacattt 120
ggaaacagat gctaataccg catagatcca agaaccgcat ggttcttggc tgaaagatgg 180
cgtaagctat cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc tagttggtga ggtaatggct 240
caccaaggcg atgatacgta gccgaactga gaggttgatc ggccacattg ggactgagac 300
acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg 360
atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttggaga 420
agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat ccaaccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg 540
cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg 600
aagcgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag 660
cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta 720
actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat 780
gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc gcagctaacg 840
cattaagcat tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960
gtcttgacat cttttgatca cctgagagat caggtttccc cttcgggggc aaaatgacag1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc1080
gcaaccctta tgactagttg ccagcattta gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac1200
acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa1260
agccattctc agttcggact gtaggctgca actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt1320
aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca1380
caccatgaga gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac tcctttaggg agcgagccgt1440
ctaaggtgac aaatt 1455
SEQUENCE LISTING
<110> 菏泽学院
<120> 一种乳酸菌杂交菌种及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 乳杆菌
<400> 1
atgcagtcga acgagttctc gttgattgca tcggtgcttg caccgagatt caacatggaa 60
cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ttaagtgggg gataacattt 120
ggaaacagat gctaataccg catagatcca agaaccgcat ggttcttggc tgaaagatgg 180
cgtaagctat cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc tagttggtga ggtaatggct 240
caccaaggcg atgatacgta gccgaactga gaggttgatc ggccacattg ggactgagac 300
acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg 360
atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttggaga 420
agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat ccaaccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg 540
cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg 600
aagcgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag 660
cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta 720
actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat 780
gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc gcagctaacg 840
cattaagcat tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960
gtcttgacat cttttgatca cctgagagat caggtttccc cttcgggggc aaaatgacag1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc1080
gcaaccctta tgactagttg ccagcattta gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac1200
acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa1260
agccattctc agttcggact gtaggctgca actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt1320
aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca1380
caccatgaga gtttgtaaca cccgaagccg gtggcgtaac tcctttaggg agcgagccgt1440
ctaaggtgac aaatt 1455

Claims (2)

1.一种乳酸菌杂交菌种，其特征在于：利用保加利亚乳杆菌菌种、嗜热链球菌菌种通过电融合得到乳酸菌杂交菌种；编号CGMCC NO：12911，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.一种根据权利要求1所述的乳酸菌杂交菌种在制备酸奶中的应用，其特征在于：将权利要求1中所述乳酸菌杂交菌种接种至装有无菌纯奶的锥形瓶中，36-46℃培养16-32h制备酸奶。
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乳酸菌融合菌株的构建及其特性研究;贾建波等;《食品科学》;20091101;第30卷(第21期);第309-311页 *
保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株的原生质体制备及融合;王慕华等;《食品科学》;20150424;第36卷(第23期);第189-194页 *

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