CN114480184A - 超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法 - Google Patents

超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其包括以下步骤：1)使用污泥浸提液作为培养基基质；2)每升所述培养基基质中加入4‑6g酵母膏、2‑3g可溶性淀粉，3‑4g水酪合蛋白，混合并调节pH为7.0‑8.0，制作获得液体发酵培养基；3)将活化后的菌种接种至所述液体发酵培养基，进行富集培养；4)收集菌体，洗菌得到干净的菌泥；5)对所述干净的菌泥先进行预冻之后进行真空冷冻干燥，获得超嗜热菌冻干菌粉。所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其能够高效的培养超嗜热菌，以及将超嗜热菌制成超嗜热菌冻干菌粉，方便存储和运输，解决了当前规模化生产超嗜热菌所面临的问题。

Description

超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法
技术领域
本发明属于超嗜热菌生产技术领域，涉及一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法。
背景技术
超嗜热菌(Calditerricola.satsumensis)呈长杆状，革兰氏阴性菌，严格好氧，且不能形成孢子。超嗜热菌的生长温度为65-100℃，生长的pH值为6.5-8.5，在NaCl的浓度为0.3-4.0％的条件下生长，菌落呈奶油黄色。
超嗜热菌是一种新型的超嗜热细菌，作为好氧微生物参与有机固体废弃物的发酵，能够在不依靠外源热源加热的条件下，通过代谢分解有机物释放的生物产生极端高温，有效提高好氧堆肥的发酵温度，缩短发酵周期，并提高病原微生物的杀灭效率。
但是，超嗜热菌的生长条件严苛，在低于65℃的环境条件下会休眠，同时由于生长速度慢和存活率低等原因制约超嗜热菌的规模化生产应用；此外，培养出来的超嗜热菌还存在不容易存储和运输的问题。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法使其能够快速的制备高存活率的超嗜热菌冻干菌粉。
为了达到上述的目的，本发明提供了一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其包括以下步骤：
1)使用污泥浸提液作为培养基基质；
2)每升所述培养基基质中加入4-6g酵母膏、2-3g可溶性淀粉，3-4g水酪合蛋白，混合并调节pH为7.0-8.0，制作获得液体发酵培养基；
3)将活化后的菌种接种至所述液体发酵培养基，进行富集培养；
4)收集菌体，洗菌得到干净的菌泥；
5)对所述干净的菌泥先进行预冻之后进行真空冷冻干燥，获得超嗜热菌冻干菌粉。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其步骤1)中，将活性污泥装入去离子水中，经过离心沉淀，获得的上清液为所述污泥浸提液；
其中，制备所述污泥浸提液时所述活性污泥的质量为加入的所述去离子水质量的10-15％。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其步骤2)中每升所述培养基基质中加入5.2g酵母膏、2.7g可溶性淀粉，3.6g水酪合蛋白，混合并调节pH为7.0-8.0，制作获得所述液体发酵培养基。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其将制备的所述液体发酵培养基于121℃的高压蒸汽下灭菌处理20min，并冷却至60-80℃后进行使用。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其步骤3)还包括：菌种活化与转接，将超嗜热菌种接种到R2A固体培养基中活化，将活化后的菌种接种到所述液体发酵培养基中，培养16-24h，得到增殖的种子菌液，之后将所述种子菌液进行富集培养。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其步骤3)中设定70-90℃作为菌种的培养温度，以及使用摇床并设定转速为180-250rpm进行培养。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其步骤4)中将富集培养后的菌液离心处理，弃上清液，得到初步菌泥；所述初步菌泥用生理盐水清洗，得到干净的菌液，并离心得到所述干净的菌泥。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其步骤4)中离心处理的温度为15-20℃、转速为3000-6000rpm、离心时间为5-10min，清洗所述初步菌泥用的生理盐水浓度为0.1-1％。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其步骤5)进行预冻之前需要在所述干净的菌泥中加入保护剂；
其中，所述保护剂由所述培养基基质、每升所述培养基基质中加入100-120g脱脂奶粉、30-50g海藻糖、90-100g甘油、30-40g谷氨酸钠混合而成；
所述保护剂经过121℃、20min高压蒸汽灭菌处理。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，所述预冻的温度为-80℃，所述预冻的时间为6h。
进一步地，其中所述超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其还包括：步骤6)复水存活率鉴定：将所述超嗜热菌冻干菌粉用生理盐水进行梯度稀释，于70-90℃条件下培养，计数有效活菌数。
与现有技术相比，本发明超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法具有以下有益效果：
本发明实施例的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其设定了超嗜热菌的最佳培养环境，保证超嗜热菌能够快速的生长，提高培养的效率，并且通过冻干的方式处理收集的菌体，得到的超嗜热菌冻干菌粉，冻干菌粉不仅方便存储还便于运输。进而故本发明实施例的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法解决了当前规模化生产超嗜热菌所面临的问题。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
下述实施例中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
本发明实施例提供的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法：包括：
1)使用污泥浸提液作为培养基基质。
具体地，污泥浸提液具有容易获得成本低廉的特点，故使用污泥浸提液制备培养基基质可以有效的降低成本，且得到的培养基基质还适合超嗜热菌的培养，一举两得。
其中，使用污泥浸提液获得培养基基质的具体方式为：将活性污泥装入去离子水中，经过离心沉淀，获得的上清液为所述污泥浸提液；制备所述污泥浸提液时所述活性污泥的质量为加入的所述去离子水质量的10-15％，例如为加入的去离子水质量的10％、11％、12％、13％、14％、15％等；离心的速度和时间以满足将上清液从污泥浸提液中提取出来为准，可以参考当前已知的技术参数。
2)每升所述培养基基质中加入4-6g酵母膏、2-3g可溶性淀粉，3-4g水酪合蛋白，混合并调节pH为7.0-8.0，制作获得液体发酵培养基。
具体地，在上述的加入培养基基质的营养成分的含量范围内，均可以得到优质的液体发酵培养基，其中优选的可以将每升所述培养基基质中加入5.2g酵母膏、2.7g可溶性淀粉，3.6g水酪合蛋白，混合并调节pH为7.0-8.0，制作获得优选的液体发酵培养基。
进一步地，为了得到无菌的纯净液体发酵培养基，配置好的液体发酵培养基需要在121℃的高压蒸汽下灭菌处理20min，并冷却至60-80℃后进行使用。
3)将活化后的菌种接种至所述液体发酵培养基，进行富集培养。
具体地，设定70-90℃作为菌种的培养温度，以及使用摇床并设定转速为180-250rpm进行培养。
此外，步骤3)还包括：菌种活化与转接，将超嗜热菌种接种到R2A固体培养基中活化，将活化后的菌种接种到所述液体发酵培养基中，设定70-90℃作为菌种的培养温度，以及使用摇床并设定转速为180-250rpm培养16-24h，得到增殖的种子菌液，之后将所述种子菌液进行富集培养。
4)收集菌体，洗菌得到干净的菌泥。
具体地，步骤4)中将富集培养后的菌液离心处理，弃上清液，得到初步菌泥；所述初步菌泥用生理盐水清洗，得到干净的菌液，并离心得到所述干净的菌泥。
进一步地，步骤4)中离心处理的温度为15-20℃、转速为3000-6000rpm、离心时间为5-10min，清洗所述初步菌泥用的生理盐水浓度为0.1-1.0％，例如浓度为0.85％。
5)对所述干净的菌泥先进行预冻之后进行真空冷冻干燥，获得超嗜热菌冻干菌粉。
具体地，为了使超嗜热菌具有更高的活菌数和更好的抗冻能力，可以在预冻和真空冷冻之前在干净的菌泥中加入保护剂。其中，保护剂由所述培养基基质、每升所述培养基基质中加入100-120g脱脂奶粉、30-50g海藻糖、90-100g甘油、30-40g谷氨酸钠混合而成；并且为了保证加入保护剂时不引入外部细菌，需要对保护剂预先灭菌处理，例如可以将保护剂在121℃下经20min高压蒸汽灭菌处理。
在具体实施中，其中为了实现速冻以及保证冻干后超嗜热菌的活性，设置的预冻的温度可以为-80℃，预冻的时间为6h。
进一步地，本发明实施例提供的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，还包括：
步骤6)复水存活率鉴定：将所述超嗜热菌冻干菌粉用生理盐水进行梯度稀释，于70-90℃条件下培养，计数有效活菌数。
具体地，通过复水存活率鉴定，可以判定有效活菌数是否满足要求。通过验证，根据本发明方法制备的超嗜热菌冻干菌粉可使其冻干存活率最高可达89.13％，菌粉活菌数为8×1016cfu/g；常用的食品级乳酸菌冻干菌粉仅为10×1010cfu/g，可见活菌数是满足要求的。本发明更好地开发利用了超嗜热菌种，提高了超嗜热菌种在低温下的存活率，提供了一种可规模化生产超嗜热菌冻干菌粉的方法。
为了更好的示意本发明实施例提供的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，提供如下实施例和对比例。
实施例1：
提供了一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
1)污泥浸提液制作：将100g活性污泥装入1000mL去离子水中，在220rpm的摇床上振荡1h，经过6000rpm离心20min，用定性分析滤纸过滤，获得的上清液为培养基基质。
2)液体发酵培养基：液体发酵培养基成分以1L的培养基基质为基准，酵母膏5.2g/L，可溶性淀粉2.8g/L，水酪合蛋白3.6g/L，调节培养基的pH为7.35。在120℃下灭菌处理20min。
3)菌种的活化与转接：将4℃保存的超嗜热菌菌种在R2A固体培养基中在80℃的培养箱中培养12h，之后挑取单菌落至已灭菌的液体发酵培养基中，摇床转速为220rpm，于80℃条件下培养48h，此为种子液。
富集培养：将获得的种子液按照3％(v/v)的比例，接种至相同的液体发酵培养基中，摇床转速220rpm，于75℃条件下培养48h，此为富集培养液。
经检测，培养后的超嗜热菌种OD600nm值为1.97。经稀释涂布活菌数量为9×1016cfu/mL。
4)收集菌体，洗菌：将富集培养后的菌体离心处理，在0℃、5000rpm、10min条件下离心，弃尽上清液。用0.85％的生理盐水清洗，直至离心后上清液澄清得到菌泥。
5)预冻和真空冷冻干燥：制备浓度为11％的脱脂奶粉，将菌泥与脱脂奶粉均匀混合，并加入40g/L海藻糖、90g/L甘油以及30g/L谷氨酸钠于-80℃预冻6h。
真空冷冻干燥：将预冻的放入冻干机冷冻干燥36h，即得到超嗜热菌冻干菌粉。
6)复水率存活鉴定：将冷冻干燥后的冻干粉用脱脂奶粉37℃复水15-20min，用灭菌生理盐水进行梯度稀释。计数活菌数，试验重复三次，取其平均值。
经检测，超嗜热菌冻干菌粉中存在的活菌数量为6×1016cfu/mL，其冻干存活率为66.67％。
实施例2
提供了一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
1)污泥浸提液制作：将120g活性污泥装入1000mL去离子水中，在220rpm的摇床上振荡1h，经过6000rpm离心20min，用定性分析滤纸过滤，获得的上清液为培养基基质。
2)液体发酵培养基：液体发酵培养基成分以1L的培养基基质为基准，酵母膏5.2g/L，可溶性淀粉2.7g/L，水酪合蛋白3.6g/L，调节培养基的pH为7.35。在120℃下灭菌处理20min。
3)菌种的活化与转接：将4℃保存的超嗜热菌菌种在R2A固体培养基中在80℃的培养箱中培养12h，之后挑取单菌落至已灭菌的液体发酵培养基中，摇床转速为220rpm，于80℃条件下培养48h，此为种子液。
富集培养：将获得的种子液按照3％(v/v)的比例，接种至相同的液体发酵培养基中，摇床转速220rpm，于75℃条件下培养48h，此为富集培养液。
经检测，培养后的超嗜热菌种OD值为2.13。经稀释涂布活菌数量为9×1017cfu/mL。
4)收集菌体，洗菌：将富集培养后的菌体离心处理，在0℃、5000rpm、10min条件下离心，弃尽上清液。用0.85％的生理盐水清洗，直至离心后上清液澄清得到菌泥。
5)预冻和真空冷冻干燥：制备浓度为10％的脱脂奶粉，将菌泥与脱脂奶粉均匀混合，并加入30g/L海藻糖、95g/L甘油以及35g/L谷氨酸钠于-80℃预冻6h。
真空冷冻干燥：将预冻的放入冻干机冷冻干燥36h，即得到超嗜热菌冻干菌粉。
6)复水率存活鉴定：将冷冻干燥后的冻干粉用脱脂奶粉37℃复水15-20min，用灭菌生理盐水进行梯度稀释。计数活菌数，试验重复三次，取其平均值。
经检测，冻干菌粉中存在的活菌数量为8×1017cfu/mL。其冻干存活率为89.13％。
实施例3
提供了一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
1)污泥浸提液制作：将150g活性污泥装入1000mL去离子水中，在220rpm的摇床上振荡1h，经过6000rpm离心20min，用定性分析滤纸过滤，获得的上清液为培养基基质。
2)液体发酵培养基：液体发酵培养基成分以1L的培养基基质为基准，酵母膏5.56g/L，可溶性淀粉3g/L，水酪合蛋白3.8g/L，调节培养基的pH为7.35。在120℃下灭菌处理20min。
3)菌种的活化与转接：将4℃保存的超嗜热菌菌种在R2A固体培养基中在80℃的培养箱中培养12h，之后挑取单菌落至已灭菌的液体发酵培养基中，摇床转速为220rpm，于80℃条件下培养48h，此为种子液。
富集培养：将获得的种子液按照3％(v/v)的比例，接种至相同的液体发酵培养基中，摇床转速220rpm，于75℃条件下培养48h，此为富集培养液。
经检测，培养后的超嗜热菌种OD值为2.01。经稀释涂布活菌数量为7×1016cfu/mL。
4)收集菌体，洗菌：将富集培养后的菌体离心处理，在0℃、5000rpm、10min条件下离心，弃尽上清液。用0.85％的生理盐水清洗，直至离心后上清液澄清得到菌泥。
5)预冻和真空冷冻干燥：制备浓度为12％的脱脂奶粉，将菌泥与脱脂奶粉均匀混合，并加入50g/L海藻糖、100g/L甘油以及40g/L谷氨酸钠于-80℃预冻6h。
真空冷冻干燥：将预冻的放入冻干机冷冻干燥36h，即得到超嗜热菌冻干菌粉。
6)复水率存活鉴定：将冷冻干燥后的冻干粉用脱脂奶粉37℃复水15-20min，用灭菌生理盐水进行梯度稀释。计数活菌数，试验重复三次，取其平均值。
经检测，冻干菌粉中存在的活菌数量为4×1016cfu/mL。其冻干存活率为57.14％。
通过上述实施例1-3可以得知，使用本发明实施例提供的方法以及配方制备的超嗜热菌冻干菌粉，其冻干存活率具有较高的数值，同时生产效率高，可以满足大规模的工业化生产。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)使用污泥浸提液作为培养基基质；
2)每升所述培养基基质中加入4-6g酵母膏、2-3g可溶性淀粉，3-4g水酪合蛋白，混合并调节pH为7.0-8.0，制作获得液体发酵培养基；
3)将活化后的菌种接种至所述液体发酵培养基，进行富集培养；
4)收集菌体，洗菌得到干净的菌泥；
5)对所述干净的菌泥先进行预冻之后进行真空冷冻干燥，获得超嗜热菌冻干菌粉。
2.根据权利要求1所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
步骤1)中，将活性污泥装入去离子水中，经过离心沉淀，获得的上清液为所述污泥浸提液；
其中，制备所述污泥浸提液时所述活性污泥的质量为加入的所述去离子水质量的10-15％。
3.根据权利要求1所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
步骤2)中每升所述培养基基质中加入5.2g酵母膏、2.7g可溶性淀粉，3.6g水酪合蛋白，混合并调节pH为7.0-8.0，制作获得所述液体发酵培养基。
4.根据权利要求1所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
将制备的所述液体发酵培养基于121℃的高压蒸汽下灭菌处理20min，并冷却至60-80℃后进行使用。
5.根据权利要求1所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
步骤3)还包括：菌种活化与转接，将超嗜热菌种接种到R2A固体培养基中活化，将活化后的菌种接种到所述液体发酵培养基中，培养16-24h，得到增殖的种子菌液，之后将所述种子菌液进行富集培养。
6.根据权利要求1或5所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
步骤3)中设定70-90℃作为菌种的培养温度，以及使用摇床并设定转速为180-250rpm进行培养。
7.根据权利要求1所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
步骤4)中将富集培养后的菌液离心处理，弃上清液，得到初步菌泥；所述初步菌泥用生理盐水清洗，得到干净的菌液，并离心得到所述干净的菌泥。
8.根据权利要求7所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
步骤4)中离心处理的温度为15-20℃、转速为3000-6000rpm、离心时间为5-10min，清洗所述初步菌泥用的生理盐水浓度为0.1-1.0％。
9.根据权利要求1所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
步骤5)进行预冻之前需要在所述干净的菌泥中加入保护剂；
其中，所述保护剂由所述培养基基质、每升所述培养基基质中加入100-120g脱脂奶粉、30-50g海藻糖、90-100g甘油、30-40g谷氨酸钠混合而成；
所述保护剂经过121℃、20min高压蒸汽灭菌处理。
10.根据权利要求1或9所述的超嗜热菌的培养和冻干菌粉的制备方法，其特征在于，
所述预冻的温度为-80℃，所述预冻的时间为6h。
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韦丹等: "《超嗜热菌Calditerricola satsumensis FAFU012的发酵优化及其发酵菌剂的制备》", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》, no. 1, 15 January 2018 (2018-01-15) *

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