CN114317360A - 固体培养基、液体培养基以及长双歧杆菌高密度培养方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及双歧杆菌的领域，具体公开了一种固体培养基、液体培养基以及长双歧杆菌高密度培养方法。固体培养基，包括辣木籽提取物、酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、无水乙酸钠、柠檬酸三铵、碳酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钾、吐温‑80、琼脂及水。液体培养基，包括鲜牛奶、牛肉粉、辣木籽提取物、蛋白胨、柠檬酸三铵、碳酸氢二钾、氯化钠、碳酸钾、吐温‑80、海藻酸钠及水。长双歧杆菌高密度培养方法，先将菌种接种到上述固体培养基上活化；再将菌种移种到上述液体培养基中进一步活化。本申请在培养基中引入富含营养物质的辣木籽提取物，通过其与培养基其他营养成分和矿物质成分的协同配合，有利于促进长双歧杆菌的生长，提高了菌液中长双歧杆菌的密度。
Description
技术领域
本申请涉及双歧杆菌的领域，更具体地说，它涉及一种固体培养基、液体培养基以及长双歧杆菌高密度培养方法。
背景技术
益生菌是能够给人体或动物带来有益作用的微生物，对于人体的健康有着重要的意义。双歧杆菌属（Bifidobacterium）是一种革兰氏阳性细菌属，是人体中常见的一种生理性益生菌，对于维持和调节人体内的肠道菌群十分重要。根据2004年伯杰细菌鉴定手册，双歧杆菌属共分成34个不同的种，包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等。
其中，长双歧杆菌（Bifidobacterium. Iongum）是双歧杆菌属中的重要一种，其取自健康的人体肠道，具有调节肠道健康的功效。因此，长双歧杆菌被广泛应用于益生菌产品的生产中。
为了获得更高的菌产量，提升益生菌的生产效率；如何更高效地培养长双歧杆菌成为了人们所关心的课题，因此，长双歧杆菌的高密度培养成为了研究的热点。
发明内容
为了提高菌液中长双歧杆菌的密度，本申请提供一种固体培养基、液体培养基以及长双歧杆菌高密度培养方法。
第一方面，提供了一种固体培养基，采用如下的技术方案：
固体培养基，包括辣木籽提取物4-8质量份、酵母浸粉5-9质量份、葡萄糖8-12质量份、蛋白胨8-13质量份、无水乙酸钠1-5质量份、柠檬酸三铵1-4质量份、碳酸氢二钾1-4质量份、硫酸镁0.1-0.5质量份、碳酸钾3-7质量份、吐温-80 0.8-1.2质量份、琼脂15-20质量份以及水1000质量份。
通过采用上述技术方案，辣木籽提取物具有丰富的营养成分，如维生素A、维生素B、维生素C、蛋白质、钙以及钾等；将辣木籽提取物引入固体培养基中，通过辣木籽提取物与其他营养成分和矿物质成分的协同作用，有利于促进长双歧杆菌的生长，提高菌液中长双歧杆菌的密度。
在一个具体的可实施方案中，还包括罗望子提取物2-5质量份。
通过采用上述技术方案，罗望子提取物含有丰富的葡萄糖、矿物质、单宁等物质，在固体培养基中与辣木籽、蛋白胨等配合，有利于提高菌液中长双歧杆菌的密度。
在一个具体的可实施方案中，包括辣木籽提取物6-8质量份、罗望子提取物3-4质量份、酵母浸粉7-8质量份、葡萄糖9-11质量份、蛋白胨10-11质量份、无水乙酸钠3-4质量份、柠檬酸三铵2-3质量份、碳酸氢二钾2-3质量份、硫酸镁0.2-0.4质量份、碳酸钾4-5质量份、吐温-80 0.9-1.0质量份、琼脂16-18质量份以及水1000质量份。
第二方面，提供了一种液体培养基，采用如下的技术方案：
液体培养基，包括鲜牛奶6-12质量份、牛肉粉3-7质量份、辣木籽提取物2-6质量份、蛋白胨8-13质量份、柠檬酸三铵1-5质量份、碳酸氢二钾1-5质量份、氯化钠0.2-0.8质量份、碳酸钾0.3-1质量份、吐温-80 0.8-1.2质量份、海藻酸钠1-4质量份以及水1000质量份。
通过采用上述技术方案，通过在液体培养基中引入辣木籽提取物，利用富含营养物质的辣木籽提取物与液体培养基中其他物质的协同配合，促进了长双歧杆菌的生长。
在一个具体的可实施方案中，还包括香豆提取物3-7质量份。
通过采用上述技术方案，香豆提取物富含多种氨基酸以及卵磷脂，将其引入液体培养基中与其他营养成分和矿物成分配合，能够促进长双歧杆菌的生长。
在一个具体的可实施方案中，包括鲜牛奶8-10质量份、牛肉粉4-6质量份、辣木籽提取物4-6质量份、香豆提取物4-5质量份、蛋白胨9-11质量份、柠檬酸三铵2-4质量份、碳酸氢二钾2-4质量份、氯化钠0.3-0.6质量份、碳酸钾0.5-0.8质量份、吐温-80 0.9-1.1质量份、海藻酸钠2-3质量份以及水1000质量份。
第三方面，提供了一种长双歧杆菌高密度培养方法，采用如下的技术方案：
长双歧杆菌高密度培养方法，包括：
将菌种接种到固体培养基上进行活化；所述固体培养基采用上述固体培养基；
将在固体培养基上活化的所述菌种移种到液体培养基中进一步活化，并扩培至少两次；所述液体培养基采用上述液体培养基。
通过采用上述技术方案，通过采用含有辣木籽提取物等营养成分的培养基，配合先在固体培养基上初活化后在液体培养基中进一步活化扩培的培养方式，有利于更加有效的促进长双歧杆菌的生长，从而实现了长双歧杆菌的高密度培养。
在一个具体的可实施方案中，所述固体培养基为固体斜面培养基。
通过采用上述技术方案，在斜面培养基上培养，受到污染的可能性小，不容易混入杂菌。
在一个具体的可实施方案中，包括：
S1、取保藏的长双歧杆菌菌种按照体积比为1：(8-12)的接种量接种到所述固体培养基上，在36.5-37.5℃无氧的环境下培养30-36h；
S2、将经过S1活化的长双歧杆菌菌种按照体积比为1：(8-12)的接种量移种到所述液体培养基中，在36.5-37.5℃无氧的环境下培养10-15h；
S3、将经过S2培养的长双歧杆菌菌种按照体积比为1：(8-12)的接种量移种到所述液体培养基中，在36.5-37.5℃无氧的环境下培养10-15h；
S4、重复S3过程若干次，并保持或调整培养时间，实现长双歧杆菌高密度生长。
在一个具体的可实施方案中，所述S1中，接种长双歧杆菌菌种后，在所述固体培养基上平铺融化的PTYG固体培养基；
所述S2-4中，接种长双歧杆菌菌种后，在所述液体培养基上平铺液体石蜡。
通过采用上述技术方案，通过在固体培养基上平铺融化的PTYG固体培养基或在液体培养基上平铺液液体石蜡，可以隔绝空气，为长双歧杆菌的生长提供合适的环境。
综上所述，本申请至少具有以下有益技术效果之一：
1、本申请在培养基中引入富含营养物质的辣木籽提取物，通过其与培养基其他营养成分和矿物质成分的协同配合，有利于促进长双歧杆菌的生长，提高菌液中长双歧杆菌的密度。
2、本申请通过在固体培养基中引入罗望子提取物，利用其在固体培养基中与辣木籽、蛋白胨等配合，有利于提高菌液中长双歧杆菌的密度。
3、本申请将香豆提取物引入液体培养基中与其他营养成分和矿物成分配合，能够促进长双歧杆菌的生长。
4、本申请通过采用含有辣木籽提取物等营养成分的培养基，配合先在固体培养基上初活化后在液体培养基中进一步活化扩培的培养方式，有利于更加有效的促进长双歧杆菌的生长，从而实现了长双歧杆菌的高密度培养。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例所用的材料中：
长双歧杆菌Bifidobacterium. Iongum保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心），保藏编号为CGMCC No .16573；保藏时间为2018.10.11；保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。中国普通微生物菌种保藏管理中心于2021.2.8出具报告：保藏的长双歧杆菌于2021.1.26再次检测为存活状态。
PTYG固体培养基购自山东拓普生物工程有限公司。
辣木籽提取物购自陕西晨希生物科技有限公司；罗望子提取物、香豆提取物均购自扶风斯诺特生物科技有限公司。
酵母浸粉购自山东萍聚生物科技有限公司；蛋白胨来源自马铃薯，品牌为Millipore；琼脂购自江苏采薇生物科技有限公司；牛肉粉购自临朐县永多饲料厂。
实施例1
本实施例公开了一种固体培养基，包括辣木籽提取物4g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-800.8g、琼脂20g以及水1000g。
上述固体培养基的制备方法为：取2L的三角烧瓶，准确称取1000g水加入其中；将水加热至40℃；之后准确称取辣木籽提取物4g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g加入水中，以120rpm的搅拌速度搅拌使上述物质溶解；之后准确称取无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g加入水中，以80rpm的搅拌速度搅拌使上述物质溶解；之后采用牛皮纸将三角烧瓶封口，置于高温高压下灭菌，控制压力为103.4kPa、温度为15℃、灭菌时间为30min；之后自然冷却至常温即可。
实施例2
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例1基本相同，不同之处在于：辣木籽提取物的量为5g。
具体为：辣木籽提取物5g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
实施例3
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例1基本相同，不同之处在于：辣木籽提取物的量为6g。
具体为：辣木籽提取物6g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
实施例4
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例1基本相同，不同之处在于：辣木籽提取物的量为8g。
具体为：辣木籽提取物8g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
实施例5
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例3基本相同，不同之处在于：加入了罗望子提取物2g。
具体为：辣木籽提取物6g、罗望子提取物2g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
上述固体培养基的制备方法为：取2L的三角烧瓶，准确称取1000g水加入其中；将水加热至40℃；之后准确称取辣木籽提取物6g、罗望子提取物2g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g加入水中，以120rpm的搅拌速度搅拌使上述物质溶解；之后准确称取无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g加入水中，以80rpm的搅拌速度搅拌使上述物质溶解；之后采用牛皮纸将三角烧瓶封口，置于高温高压下灭菌，控制压力为103.4kPa、温度为15℃、灭菌时间为30min；之后自然冷却至常温即可。
实施例6
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例5基本相同，不同之处在于：罗望子提取物的量为3g。
具体为：辣木籽提取物6g、罗望子提取物3g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
实施例7
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例5基本相同，不同之处在于：罗望子提取物的量为4g。
具体为：辣木籽提取物6g、罗望子提取物4g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
实施例8
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例5基本相同，不同之处在于：罗望子提取物的量为5g。
具体为：辣木籽提取物6g、罗望子提取物5g、酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
实施例9
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例6基本相同，不同之处在于：除辣木籽提取物、罗望子提取物和水外，其余各组成发生变化。
具体为：辣木籽提取物6g、罗望子提取物3g、酵母浸粉7g、葡萄糖9g、蛋白胨11g、无水乙酸钠4g、柠檬酸三铵3g、碳酸氢二钾3g、硫酸镁0.2g、碳酸钾5g、吐温-80 0.9g、琼脂18g以及水1000g。
实施例10
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例6基本相同，不同之处在于：除辣木籽提取物、罗望子提取物和水外，其余各组成发生变化。
具体为：辣木籽提取物6g、罗望子提取物3g、酵母浸粉8g、葡萄糖11g、蛋白胨10g、无水乙酸钠3g、柠檬酸三铵2g、碳酸氢二钾2g、硫酸镁0.4g、碳酸钾4g、吐温-80 1.0g、琼脂16g以及水1000g。
实施例11
本实施例公开了一种固体培养基，其与实施例6基本相同，不同之处在于：除辣木籽提取物、罗望子提取物和水外，其余各组成发生变化。
具体为：辣木籽提取物6g、罗望子提取物3g、酵母浸粉9g、葡萄糖12g、蛋白胨8g、无水乙酸钠1g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、碳酸钾3g、吐温-80 1.2g、琼脂15g以及水1000g。
实施例12
本实施例公开了一种液体培养基，包括鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物2g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
上述液体培养基的制备方法为：取2L的三角烧瓶，准确称取1000g水加入其中；将水加热至40℃；以100rpm的转速搅动水，之后准确称取牛肉粉3g、辣木籽提取物2g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、鲜牛奶12g、海藻酸钠1g并依次加入水中，搅拌至上述物质溶解；之后采用牛皮纸将三角烧瓶封口，置于高温高压下灭菌，控制压力为103.4kPa、温度为15℃、灭菌时间为30min；之后自然冷却至常温即可。
实施例13
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例12基本相同，不同之处在于：辣木籽提取物的量为3g。
具体为：鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物3g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
实施例14
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例12基本相同，不同之处在于：辣木籽提取物的量为4g。
具体为：鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物4g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
实施例15
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例12基本相同，不同之处在于：辣木籽提取物的量为6g。
具体为：鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物6g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
实施例16
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例14基本相同，不同之处在于：加入了香豆提取物3g。
具体为：鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物4g、香豆提取物3g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1 g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
实施例17
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例16基本相同，不同之处在于：香豆提取物的量为4g。
具体为：鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物4g、香豆提取物4g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
实施例18
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例16基本相同，不同之处在于：香豆提取物的量为5g。
具体为：鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物4g、香豆提取物5g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
实施例19
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例16基本相同，不同之处在于：香豆提取物的量为7g。
具体为：鲜牛奶12g、牛肉粉3g、辣木籽提取物4g、香豆提取物7g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
实施例20
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例17基本相同，不同之处在于：除辣木籽提取物、香豆提取物和水外，其余各组成发生变化。
具体为：鲜牛奶10g、牛肉粉4g、辣木籽提取物4g、香豆提取物4g、蛋白胨11g、柠檬酸三铵2g、碳酸氢二钾2g、氯化钠0.6g、碳酸钾0.8g、吐温-80 0.9g、海藻酸钠2g以及水1000g。
实施例21
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例17基本相同，不同之处在于：除辣木籽提取物、香豆提取物和水外，其余各组成发生变化。
具体为：鲜牛奶8g、牛肉粉6g、辣木籽提取物4g、香豆提取物4g、蛋白胨9g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、氯化钠0.3g、碳酸钾0.5g、吐温-80 1.1g、海藻酸钠3g以及水1000g。
实施例22
本实施例公开了一种液体培养基，其与实施例17基本相同，不同之处在于：除辣木籽提取物、香豆提取物和水外，其余各组成发生变化。
具体为：鲜牛奶6g、牛肉粉7g、辣木籽提取物4g、香豆提取物4g、蛋白胨8g、柠檬酸三铵5g、碳酸氢二钾5g、氯化钠0.2g、碳酸钾0.3g、吐温-80 1.2g、海藻酸钠4g以及水1000g。
实施例23
本实施例公开了一种长双歧杆菌高密度培养方法，具体包括以下步骤：
S1、取保藏的长双歧杆菌菌种DD98稀释到原菌浓度的10-6-10-7倍；取1mL长双歧杆菌菌种DD98接种到8mL实施例1所公开的固体培养基上；之后将加热融化并降温至50℃的PTYG固体培养基8mL平铺到接种了长双歧杆菌菌种DD98的固体培养基上以隔离氧气；置于37℃的环境下培养30h，使菌种活化。
需要说明的是：在其他的一些实施例中，本步骤的培养温度也可以选择36.5-37.5℃的任意值。
S2、将经过S1活化的长双歧杆菌菌种DD98按照体积比为1：8的接种量移种到实施例12所公开的液体培养基中，充分混匀；之后在培养基上加入灭菌的液体石蜡，以隔离氧气；37℃的环境下培养10h，使菌种进一步活化扩培。
需要说明的是：在其他的一些实施例中，本步骤的培养温度也可以选择36.5-37.5℃的任意值。另外，在其他的一些实施方案中，可以用卵磷脂替代液体石蜡。
S3、对菌种进行进一步扩培；即将经过S2培养的长双歧杆菌菌种DD98按照体积比为1：8的接种量移种到实施例12所公开的液体培养基中，充分混匀；之后在培养基上加入灭菌的液体石蜡，以隔离氧气；37℃的环境下培养10h。
S4、重复S3过程一次，与S3不同之处在于，培养时间为24h。
通过上述四个步骤，实现长双歧杆菌高密度生长。
实施例24
本实施例公开了一种长双歧杆菌高密度培养方法，与实施例23基本相同，不同之处在于：培养时的工艺参数改变。
具体包括以下步骤：
S1、取保藏的长双歧杆菌菌种DD98稀释到原菌浓度的10-6-10-7倍；取1mL长双歧杆菌菌种DD98接种到10mL实施例1所公开的固体培养基上；之后将加热融化并降温至50℃的PTYG固体培养基10mL平铺到接种了长双歧杆菌菌种DD98的固体培养基上以隔离氧气；置于37℃的环境下培养32h，使菌种活化。
S2、将经过S1活化的长双歧杆菌菌种DD98按照体积比为1：10的接种量移种到实施例12所公开的液体培养基中，充分混匀；之后在培养基上加入灭菌的液体石蜡，以隔离氧气；37℃的环境下培养12h，使菌种进一步活化扩培。
S3、对菌种进行进一步扩培；即将经过S2培养的长双歧杆菌菌种DD98按照体积比为1：10的接种量移种到实施例12所公开的液体培养基中，充分混匀；之后在培养基上加入灭菌的液体石蜡，以隔离氧气；37℃的环境下培养12h。
S4、重复S3过程一次，与S3不同之处在于，培养时间为24h。
通过上述四个步骤，实现长双歧杆菌高密度生长。
实施例25
本实施例公开了一种长双歧杆菌高密度培养方法，与实施例23基本相同，不同之处在于：培养时的工艺参数改变。
S1、取保藏的长双歧杆菌菌种DD98稀释到原菌浓度的10-6-10-7倍；取1mL长双歧杆菌菌种DD98接种到12mL实施例1所公开的固体培养基上；之后将加热融化并降温至50℃的PTYG固体培养基12mL平铺到接种了长双歧杆菌菌种DD98的固体培养基上以隔离氧气；置于37℃的环境下培养36h，使菌种活化。
S2、将经过S1活化的长双歧杆菌菌种DD98按照体积比为1：12的接种量移种到实施例12所公开的液体培养基中，充分混匀；之后在培养基上加入灭菌的液体石蜡，以隔离氧气；37℃的环境下培养15h，使菌种进一步活化扩培。
S3、对菌种进行进一步扩培；即将经过S2培养的长双歧杆菌菌种DD98按照体积比为1：12的接种量移种到实施例12所公开的液体培养基中，充分混匀；之后在培养基上加入灭菌的液体石蜡，以隔离氧气；37℃的环境下培养15h。
S4、重复S3过程一次，与S3不同之处在于，培养时间为24h。
通过上述四个步骤，实现长双歧杆菌高密度生长。
实施例26-35
实施例26-35与实施例24基本相同，不同之处在于：固体培养基的来源不同。具体见表1。
表1 实施例26-35中固体培养基的来源
| 项目 | 固体培养基 | 项目 | 固体培养基 |
| 实施例26 | 实施例2公开 | 实施例31 | 实施例7公开 |
| 实施例27 | 实施例3公开 | 实施例32 | 实施例8公开 |
| 实施例28 | 实施例4公开 | 实施例33 | 实施例9公开 |
| 实施例29 | 实施例5公开 | 实施例34 | 实施例10公开 |
| 实施例30 | 实施例6公开 | 实施例35 | 实施例11公开 |
实施例36-45
实施例36-45与实施例33基本相同，不同之处在于：液体培养基的来源不同。具体见表2。
表2 实施例36-45中液体培养基的来源
| 项目 | 液体培养基 | 项目 | 液体培养基 |
| 实施例36 | 实施例13公开 | 实施例41 | 实施例18公开 |
| 实施例37 | 实施例14公开 | 实施例42 | 实施例19公开 |
| 实施例38 | 实施例15公开 | 实施例43 | 实施例20公开 |
| 实施例39 | 实施例16公开 | 实施例44 | 实施例21公开 |
| 实施例40 | 实施例17公开 | 实施例45 | 实施例22公开 |
对比例1
本对比例公开了一种长双歧杆菌高密度培养方法，和实施例24的不同之处在于：采用的固体培养基中不含有辣木籽提取物。
固体培养基，包括酵母浸粉5g、葡萄糖8g、蛋白胨13g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三铵4g、碳酸氢二钾4g、硫酸镁0.1g、碳酸钾7g、吐温-80 0.8g、琼脂20g以及水1000g。
对比例2
本对比例公开了一种长双歧杆菌高密度培养方法，和实施例24的不同之处在于：采用的液体培养基中不含有辣木籽提取物。
液体培养基，包括鲜牛奶12g、牛肉粉3g、蛋白胨13g、柠檬酸三铵1g、碳酸氢二钾1g、氯化钠0.8g、碳酸钾1g、吐温-80 0.8g、海藻酸钠1g以及水1000g。
性能检测
取实施例23-45和对比例1-2培养所得菌液进行测试；检测结果列于表3中。
1、吸光度（OD值）测定：取各菌液200μL到96孔酶标板中，在600nm条件下测定菌液的吸光度。吸光度越高，代表菌液中长双歧杆菌的密度越高。
2、pH值测定：采用pH计PHS-25测定。
表3 实施例23-45及对比例1-2所得菌液的性质
| 项目 | OD值 | pH值 |
| 实施例23 | 1.30 | 4.5 |
| 实施例24 | 1.35 | 4.4 |
| 实施例25 | 1.37 | 4.4 |
| 实施例26 | 1.40 | 4.3 |
| 实施例27 | 1.48 | 4.2 |
| 实施例28 | 1.50 | 4.2 |
| 实施例29 | 1.55 | 4.3 |
| 实施例30 | 1.60 | 4.2 |
| 实施例31 | 1.61 | 4.2 |
| 实施例32 | 1.60 | 4.1 |
| 实施例33 | 1.64 | 4.1 |
| 实施例34 | 1.62 | 4.1 |
| 实施例35 | 1.61 | 4.2 |
| 实施例36 | 1.69 | 4.1 |
| 实施例37 | 1.72 | 3.9 |
| 实施例38 | 1.73 | 3.9 |
| 实施例39 | 1.78 | 4.0 |
| 实施例40 | 1.80 | 3.8 |
| 实施例41 | 1.79 | 3.8 |
| 实施例42 | 1.81 | 3.9 |
| 实施例43 | 1.84 | 3.7 |
| 实施例44 | 1.83 | 3.7 |
| 实施例45 | 1.82 | 3.8 |
| 对比例1 | 1.22 | 4.8 |
| 对比例2 | 1.25 | 4.9 |
参见表3，由实施例23-45的检测结果可以发现：本申请各个实施例培养所得的菌液中，长双歧杆菌的密度均较高，对于含菌产品的生产具有积极的意义。同时，菌液pH小于4.5符合长双歧杆菌产酸菌的特性。
由实施例24和对比例1和2的检测结果可以发现：当固体培养基含有辣木籽提取物时，所得菌液的OD值明显更高，即培养所得的长双歧杆菌的密度更高；同样的，当液体培养基含有辣木籽提取物时，所得菌液的OD值也有比较明显的提高。上述结果说明：辣木籽提取物有利于长双歧杆菌的培养。
由实施例24，26-28的检测结果可以发现：随着固体培养基中辣木籽提取物加入量的增加，培养所得的菌液中长双歧杆菌的密度不断提高并趋于平衡。类似的，由实施例33，36-38的检测结果可以发现：随着液体培养基中辣木籽提取物加入量的增加，培养所得的菌液中长双歧杆菌的密度呈增加的趋势。
分析实施例27，29-32的检测结果可知：随着罗望子提取物的加入，培养得到的菌液中长双歧杆菌的密度呈增加的趋势，说明罗望子提取物对于长双歧杆菌的培养具有积极意义。
分析实施例37，39-42的检测结果可知：随着香豆提取物的加入，所得菌液中长双歧杆菌的密度不断增加，说明培养基中采用香豆提取物有助于长双歧杆菌的培养。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.固体培养基，其特征在于：包括辣木籽提取物4-8质量份、酵母浸粉5-9质量份、葡萄糖8-12质量份、蛋白胨8-13质量份、无水乙酸钠1-5质量份、柠檬酸三铵1-4质量份、碳酸氢二钾1-4质量份、硫酸镁0.1-0.5质量份、碳酸钾3-7质量份、吐温-80 0.8-1.2质量份、琼脂15-20质量份以及水1000质量份。
2.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于：还包括罗望子提取物2-5质量份。
3. 根据权利要求2所述的固体培养基，其特征在于：包括辣木籽提取物6-8质量份、罗望子提取物3-4质量份、酵母浸粉7-8质量份、葡萄糖9-11质量份、蛋白胨10-11质量份、无水乙酸钠3-4质量份、柠檬酸三铵2-3质量份、碳酸氢二钾2-3质量份、硫酸镁0.2-0.4质量份、碳酸钾4-5质量份、吐温-80 0.9-1.0质量份、琼脂16-18质量份以及水1000质量份。
4. 液体培养基，其特征在于：包括鲜牛奶6-12质量份、牛肉粉3-7质量份、辣木籽提取物2-6质量份、蛋白胨8-13质量份、柠檬酸三铵1-5质量份、碳酸氢二钾1-5质量份、氯化钠0.2-0.8质量份、碳酸钾0.3-1质量份、吐温-80 0.8-1.2质量份、海藻酸钠1-4质量份以及水1000质量份。
5.根据权利要求4所述的液体培养基，其特征在于：还包括香豆提取物3-7质量份。
6. 根据权利要求5所述的液体培养基，其特征在于：包括鲜牛奶8-10质量份、牛肉粉4-6质量份、辣木籽提取物4-6质量份、香豆提取物4-5质量份、蛋白胨9-11质量份、柠檬酸三铵2-4质量份、碳酸氢二钾2-4质量份、氯化钠0.3-0.6质量份、碳酸钾0.5-0.8质量份、吐温-800.9-1.1质量份、海藻酸钠2-3质量份以及水1000质量份。
7.长双歧杆菌高密度培养方法，其特征在于：包括：
将菌种接种到固体培养基上进行活化；所述固体培养基采用权利要求1-3任一所述的固体培养基；
将在固体培养基上活化的所述菌种移种到液体培养基中进一步活化，扩培至少两次；所述液体培养基采用权利要求4-6任一所述的液体培养基。
8.根据权利要求7所述的长双歧杆菌高密度培养方法，其特征在于：所述固体培养基为固体斜面培养基。
9.根据权利要求7所述的长双歧杆菌高密度培养方法，其特征在于：包括：
S1、取保藏的长双歧杆菌菌种按照体积比为1：(8-12)的接种量接种到所述固体培养基上，在36.5-37.5℃无氧的环境下培养30-36h；
S2、将经过S1活化的长双歧杆菌菌种按照体积比为1：(8-12)的接种量移种到所述液体培养基中，在36.5-37.5℃无氧的环境下培养10-15h；
S3、将经过S2培养的长双歧杆菌菌种按照体积比为1：(8-12)的接种量移种到所述液体培养基中，在36.5-37.5℃无氧的环境下培养10-15h；
S4、重复S3过程若干次，并保持或调整培养时间，实现长双歧杆菌高密度生长。
10.根据权利要求9所述的长双歧杆菌高密度培养方法，其特征在于：所述S1中，接种长双歧杆菌菌种后，在所述固体培养基上平铺融化的PTYG固体培养基；
所述S2-4中，接种长双歧杆菌菌种后，在所述液体培养基上平铺液体石蜡。
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